范文一:引物设计
PCR 基本原理
引物 是一段寡聚核苷酸序列引物的种类,大概分为:
1、 PCR 引物; 2、测序引物; 3、杂交探针; 4、简并引物; 5、其他引物
引物的作用(基因获得、测序、检测等)
引物设计软件 ( Primer 、 Oligo 、 codehop 、 FastPCR 、 Generunner 、 Vector NTISuit 、 Dnasis 、 Omiga 、 Dnastar 等)
引物分析软件( Oligo 、 Primer 、 Blast 等)
引物设计需考虑的问题:
1、引物长度(primer length)
2、产物长度(product length)
3、序列 Tm 值 (melting temperature)
4、ΔG 值 (internal stability)
5、引物本身和引物之间二聚体及发夹结构(duplex formation and hairpin)
6、错误引发位点(false priming site)
7、引物及产物 GC 含量(composition )
PCR 引物设计原则:
1. 引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计 DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列 的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如 DNAman )比对(Alignment ),各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2. 引物长度一般在 15~30碱基之间。 引物长度 (primer length ) 常用的是 18-27 bp , 但不应大于 38,因为过长会导致其延伸温度大于 74℃,不适于 Taq DNA 聚合酶进 行反应。
3. 引物 GC 含量在 40%~60%之间, Tm 值最好接近 72℃ GC 含量 (composition ) 过高或 过低都不利于引发反应。 上下游引物的 GC 含量不能相差太大。 另外, 上下游引物 的 Tm 值 (meltingtemperature ) 是寡核苷酸的解链温度, 即在一定盐浓度条件下, 50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于 Tm 值 5~10℃。若按公式 Tm= 4(G+C) +2(A+T)估计引物的 Tm 值,则有效引物的 Tm 为 55~80℃,其 Tm 值最 好接近 72℃以使复性条件最佳。
4. 引物 3′端要避开密码子的第 3位。如扩增编码区域,引物 3′端不要终止于密 码子的第 3位,因密码子的第 3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。 5. 引物 3′端不能选择 A 。引物 3′端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差 异,当末位的碱基为 A 时,即使在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末 位链为 T 时,错配的引发效率大大降低, G 、 C 错配的引发效率介于 A 、 T 之间,所 以 3′端最好选择 T 。
6. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高, 尤其是 3’ 端相似 性较高的序列,否则容易导致错误引发(False priming)。降低引物与模板相 似性的一种方法是, 引物中四种碱基的分布最好是随机的, 不要有聚嘌呤或聚嘧 啶的存在。 尤其 3′端不应超过 3个连续的 G 或 C , 因这样会使引物在 GC 富集序列区 错误引发。
7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列,否则 引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin )使引物本身复性。这种二级结构会因空 间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续 4个碱基的互补。两
引物之间也不应具有互补性,尤其应避免 3′端的互补重叠以防止引物二聚体 (Dimer 与 Crossdimer ) 的形成。 引物之间不能有连续 4个碱基的互补。 引物二聚 体及发夹结构如果不可避免的话,应尽量使其△ G 值不要过高(应小于
4.5kcal/mol) 。 否则易导致产生引物二聚体带, 并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行。
8. 引物 5′ 端和中间△ G 值应该相对较高,而 3′ 端△ G 值较低。△ G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能,它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,△ G 值越 大, 则双链越稳定。 应当选用 5端和中间△ G 值相对较高,而 3′端△ G 值较低 (绝 对值不超过 9) 的引物。 引物 3′端的△ G 值过高, 容易在错配位点形成双链结构 并引发 DNA 聚合反应。(不同位置的△ G 值可以用 Oligo 6软件进行分析)
9. 引物的 5′端可以修饰,而 3′端不可修饰。引物的 5′端决定着 PCR 产物的长 度, 它对扩增特异性影响不大。 因此, 可以被修饰而不影响扩增的特异性。 引物 5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、 Eu3+等;引入蛋白 质结合 DNA 序列;引入点突变、插入突变、缺失突变序列;引入启动子序列等。 10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。 某些引物无效的主要原因是扩增产物单 链二级结构的影响, 选择扩增片段时最好避开二级结构区域。 用有关软件 (比如 RNAstructure ) 可以预测估计 mRNA 的稳定二级结构, 有助于选择模板。 实验表明, 待扩区域自由能(△ G °)小于 58.6l kJ/mol时,扩增往往不能成功。若不能避 开这一区域时,用 7-deaza-2′ -脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的。 11. 引物应具有特异性。引物设计完成以后,应对其进行 BLAST 检测。如果与其 它基因不具有互补性,就可以进行下一步的实验了。
PCR 设计引物时酶切位点的保护碱基表
来源:高慧的日志
PCR 设计引物时酶切位点的保护碱基表 1
PCR 设计引物时酶切位点的保护碱基表 4
酶切位点保护碱基表 6
酶切位点保护碱基表 7
AUG 开始设计引物 ,不是每个基因都可以的 。引物扩增时头几个容 易错,在 上游序序列就 没关系了。
加 Kozark sequence(GCCACC)是用来增强真核基因的翻 译效率的。是最 优化的 AUG 环境,避免 ribosome (核糖体)出现 leaky scan。
总的来 说, 引物设计 时的原则:保护碱基 +酶切位点 +Kozark sequence+引物起 始端 +3·端 +酶 切位点 +保护碱基
范文二:PCR引物设计
PCR引物设计
ORIGIN
1 atgcgtaact ttgatttatc cccgctttac cgttctgcta ttggatttga ccgtttgttt
61 aaccacttag aaaacaacca gagccagagt aatggcggct accctccgta taacgttgaa
121 ctggtagacg aaaaccatta ccgcattgct atcgctgtgg ctggttttgc tgagagcgaa
181 ctggaaatta ccgcccagga taatctgctg gtggtgaaag gtgctcatgc cgacgaacaa
241 aaagagcgca cctatctgta ccagggcatc gctgaacgca actttgaacg caaattccag
301 ttagctgaga acattcatgt tcgtggtgct aacctggtaa atggtttgct gtatatcgat
361 ctcgaacgcg tgattccgga agcgaaaaaa ccgcgccgta tcgaaatcaa ctaa
Non Cut Enzymes
AatII Acc65I AcyI AflII AgeI AhaIII
Alw26I Alw44I AlwNI ApaBI ApaI ApaLI AscI Asp718I AsuI AsuII AvaI AvaII AvrII BalI BamHI BanI BanII BbeI BbvI BbvII BclI BglI BglII Bpu1102I
BsaHI BsaOI Bsc91I BsiI BsmI Bsp1407I
BspHI BspMI BssHII Bst71I BstD102I BstEII
Bsu36I Cfr10I CfrI Csp45I CspI CvnI DraI DraII DraIII DrdI EagI Eam1105I
Ecl136II Eco31I Eco47III Eco52I Eco56I Eco57I
Eco72I EcoHI EcoICRI EcoNI EcoRI EcoRV EheI EspI FokI FseI HaeII HaeIII
HgaI HindII HindIII HpaI I-PpoI KpnI MaeI MboII MfeI Mlu113I MscI MspA1I
MstI MstII NaeI NarI NcoI NdeI NheI NlaIV NotI NruI NsiI NspBII
NspI PacI PflMI PinAI PleI PmaCI PmeI PpuMI PssI PstI PvuI PvuII RleAI SacI SacII SalI SapI SauI ScaI SciI SfiI SgrAI SmaI SnaBI SpeI SphI SplI SpoI SrfI SspI SstI SstII StuI StyI SunI SwaI
Tth111I Tth111II VspI XbaI XcmI XhoI XhoII XmaI XmaIII XmnI XorII
PET-28a Cut Enzymes
XhoI NotI EagI HindIII SalI SacI EcoRI BamHI NheI NdeI NcoI
Common Cut Enzymes
XhoI NotI EagI HindIII SalI SacI
EcoRI BamHI NheI NdeI NcoI
EcoRI :GAATTC
HindIII :AAGCTT
P1:GAATTC atgcgtaact ttgatttatc
P2:AAGCTT ttagttgatt tcgatacggc
范文三:PCR引物设计
一、物设引st计e py sbte
p1、N在CIB搜上索到目的因基找,该基因的到mNA,R在CSD项中,找到选编区所在位置,码下在面o的igirn中C,po该编码y序作列软件为查询列序的选对象候。
2、用Pimrer remPire5索搜物引①
打开Pirmre rePime5r,点击iFle-ew-NNDAseque nce,出 现入序输列窗,口oCpy的目序在输列入框内(选As择)此,口内,序列窗也可直以翻接成译白。蛋击点rPmeir进入,引窗口。物
此②窗口以链可接到“物引索”搜“、引编物辑”以“及索结搜果选”,点击项eSacrh钮,进按入引物搜框,选索择“CRPpri ems”,“Prais”,r定设索搜区域引物和长和度产物长度在S。erach Parametres里,面可设以相定参应数一般。若特殊无要,需参数选择认即可默但产物,长可度以适变当化因为100~,002b的p物产泳电得跑较,所散可以选以 择300~50bp0.③点
击OK,件软即始自开动索引搜,物搜索完成后会,动自出结果窗口,搜索跳结默果按照认分(评aRtnig)序排,点击其中一任搜个结果索,以可在“物窗引”中,显示出口该引物的综情况,合括上游包物和下游引物引序的和列位,引物的各置信息等种。
对④引物于序的,列以简单查可看下,一避出免现下情列况:3’ 要不现出续的连个碱3相基连的况,比情如GGG 或CCC,否容易则引起错配此。窗口需要着重中查看的包括:T应m该55~在7度之0,GC间应该%在45~%5%间5,上引游和下游引物的物Tm最值好要不相差多,大太概在度2以下好。较窗该口最下的面列出两条了物的二级引结信构,息包括发卡,二聚,体引,物间叉二聚交和体错引误发置位。按若显示钮为色,表红存在示二该级结构,击该红色点按,钮即可到相看二应结构级置位图。示理最的引物想,该应都存在不些这级结构二,这几个按即都钮示显为No“e”为好。但有时很n难找各个到件都满足条的引,物以所求可要以适放宽当,如引比存物错配的在,话可以具体情就况察该考配错效的率如,何是否会明显响产物。对影于物引体具详细评的价需要助借于Oigol来完成,Olgoi身自虽然带引物搜有索功能但其,索搜出引物的质感量不觉Pr如mir5e.
在Prim⑤er5窗口,中若觉得一对引物某适合可以在,搜索结果口窗中点击,该引,然后在物单栏菜选,择ilF-ePrni-turCenr tpira,用使PD虚拟打印F,机即转换可为dP文档f里,有该面引物的详细息信。
3用O、liog证评验引估物
①
在Olgio软件面,界ilFe菜下单选择,pOn,定e到位的cD目A序N列在(rpmie中r,该列序已经被存保为Se文q件),会跳来两出窗口,分别为个nIetnar ltaSibiltyDe(tla G窗口)T和窗口。在Tmm口窗,中击最左下点角按的,会出钮来物定引对话框位
,输入选的候游上物引列序置(位rPmei5已经给r出)即,而引可物度可长以过点击C通hnageCu-rrnteo lioglengt 来h变。改定后,点位击T窗m口的Uppr按钮,确e上定引游物同,样法方定位游下物位置,点引L击oerw钮,确按下定引物。游物引确定后即,可充分利用Anal以yz菜e单各种强中大引物的析功分了。
能
②nAlyaz中e第一,项为Ky infoe,点击eleStec drpimres会给,两出条引的概括性信息,其中包括物物引的T值m此值,Olgi是采用oneraet snieghbo rmteoh计d,算会比Prmir5中引e物Tm的略高,此窗口值中还给出物引D的lea tG和’端的D3ela tG3.’的端eltD G过a,会在高错配点位形成链双结构引并D起A聚合N应,反此此因绝对项值应该一些,小好最不超要9过。
③nAalyez第二项为D中uplxeForm tioa,n即聚二体形分析成可,选择以游引上物下游引物,或析上游引分物间聚二体成情形况和下游物引的二聚体情况,还间以可择选Uppe/rLowr ,e即上下游引物间之二聚体形成的情况引物。二体是影响聚CP反应异R常重的要因,素因此该避免设应计引的存物二聚体在至少,要使也计设的物引形的二成体聚是稳不的定,其即Dlta eG应该值低,偏般一要不其超使4过.5kac/lolm,合结碱基不要对过3个。超Oilog此的分析窗口中分项给出别了3’端和整个引物的聚二图示和D体etalG 。
值④
Aanylez中三项第H为arpiniF orationm,即夹结发构分析。可以选上游择者或游引物,同下样,eDlt aG不要值超4过.5cka/lmlo,碱基对不要超过个3。
A
alnyze中四项为Co第mpsotioina d Tnm,会给出上引物、下游游物和引产的物个各碱的组基成比和T例m。上下游引值物的C%G要需制在控04~60%,%且上下游而引之间的GC% 不要物差相太。Tm值共大3有个,别分采用三方种计算法出来包括,earest neinghob rethmdo%G、 Cmtehd和2oA+()T+(4+C)Gmteodh,最一后种应是P该imre5所r采的方法用,m 值T以控制可在0~705之间度。
第五项为alFseP rmiing itesS即,错引误位点,发P在imrr5e中然也有Fals虽 premiing析分,但不如oiglo细,并且o详igl会给o我确正引发率和效误引发错率,一般的原效则使误要发引效率100以在下,然有当时候确位点的引正发效很率高的话比如达到40,05~00,错引误发效率过1超00幅若度大的话,也不以可接受
。
⑤nAaylze中有,考参值的价最后一项“PC是”R,在此窗口中,基是此于引对的物PR反应CSummar,y并给且了此反出应最的退佳火温,度外另提,供对了于对引物此简的短评。若该引价有不利物P于C反R的二级应构结在存,且Del并ta 值偏G的话,Ol大iog在最的后评价会中注,若没明有注此项,表明明级二构能值结小较,基本可以接。受
⑥引物价完毕评后可以,选
择Fie-Plritn打印,为PF文D保件,文存中件将包会括有所Oilog软件已中经打开窗的所口包括的信,多达息数页。因此打印前,最关掉Tm好窗口和Dlta G窗口e可以,保引留物信窗口息、二结构分级窗析口若存在可疑的(常异的)话PC和窗R。口
、引4确物后定对于上,游和游引物下分进别行lasB分t,析一般来说,多少都会找一到些其他基的因同序源,此时,可以列上游引对物和下游引的b物alst果进结行对分比析,只要没有交的叉其他基因同源序列就的可。
以
范文四:PCR引物设计
一. 聚合酶链式反应
(一) 聚合酶链式反应基本原理
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)用于
扩增位于两段已知序列之间的DNA 区段。在PCR反应中使
用了两段寡核苷酸作为反应的引物。PCR反应分为三步:?
变性,通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离形成单
链DNA。?退火,当温度突然降低时,由于模板分子结构较
引物要复杂得多,而且反应体系中引物DNA量大大多于模板
8DNA ,一般要求引物:模板=10 到1:1 ?延伸:在DNA
2+聚合酶和四种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg存在的条件
下,,’? 3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸
反应。以上三步为一个循环,每一循环的产物可以作为下一
个循环的模板,数小时后,介于两个引物之间的特异性DNA
,,,片段得到了大量复制,数量可达2×10 拷贝。
(二) PCR反应的组分和作用
1. 缓冲液: 10—50mmol/L Tris.HCl 2. dNTP: 母液:10mmol/L dNTP, 终浓度200umol/L 3. 酶:Klenow酶(0.5-5.0u)
Taq 酶, Pfu, Tth, Tfl 4. 引物:引物浓度一般为:0.1-0.5umol/L (三) PCR反应条件的优化
2+1. Mg 浓度: 0.5mmol/L 到 5mmol/L
2(退火温度: Tm=4(G+C)+2(A+T)
Tm-5?
3. 循环数 再扩增
45 一般在30—35个 cyeles 再扩增时需将模板稀释10—10
4. 热启动 (hot start)
(四)引物的设计
PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计。所选的引物序列将决定PCR产物的大小、位置,以及扩增区域的Tm值,Tm值和扩增物产量和特异性有关。
1.引物设计的一般原则:
A.引物长度:一般要求 18-30个碱基
小于15个碱基:随机引物(6个碱基)、武断引物
若额外的序列信息要加到引物中,例如TRNA聚合酶结合位点,,
限制酶切位点,可以使用加长的引物。一般来说,引物5′端添加了大量与模板不配对的碱基,可以在较低温度的条件下进行4到5个扩增循环,然后在假定引物5′端序列已经加入到模板中,计算得出的退火温度下进行其余的循环。
B.引物的末端核苷酸:
3′末端对于控制错误引发非常关键。
※3′末端的碱基要尽量与模板互补配对,尽量避免错配。
※ 避免3′端引物与引物之间的互补配对,形成引物二聚体。
C.GC的合理含量和Tm 值:
GC含量控制在40—60%之间, Tm值在56-62?之间
D. PCR 产物长度和在靶序列内的位置
一般来说,PCR产物长度对扩增效率有影响。对于检测为目的的PCR扩增,长度在120-300bp为最好,具有好的特异性和高的扩增效率。
若在cDNA序列内部设计PCR引物,需要特别注意两点:首先,尽力将引物和产物保持在mRNA的编码区内,因为这是生成蛋白质的独特序列,不像3’末端非编码区域与许多其它mRNA有同源性。第二,尽量把引物放到不同的外显子上,以便使mRNA特异的PCR产物于从污染DNA中产生的产物在大小上相区别。
若PCR的目的是克隆一个基因或cDNA的特异序列,产物的大小是根据具体应用预选的。如 我们要克隆并在真核中表达的Delta阿片受体。
E.引物的质量控制
避免引物之间互补,形成引物二聚体,引物内部互补,形成发夹结构(Loop).
5’agtcgcatccgactacgtagcatg 3
引物二聚体’
5’tgctactcggctgagcagctacg 3’
5’agctaactgcattaggctagcta 3’ 发夹结构
F:引物的特异性
G:引物中最好不要有一连串的同聚物。
2(多种引物的设计和应用:
A. 错配引物。
B. 简并引物。
C. 诱变引物
3(引物的书写形式:
5’端引物: 5’---------------- 3’跟模板上的序列完全相同。 3’端引物:5‘------------------ 3’与模板上的序列倒转互补。 (五)引物设计步骤
1( 获取待扩增的序列或有关信息:
A. 发表的论文。
B. 从公用数据库中获取:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
a. 通过GenBank号查询。
b. 通过主题词查询。
C.我们自己克隆基因后测序所获得的序列,BG662484-BG673712.
2( 明确PCR扩增的目的。
3( 引物设计:
利用软件设计首先要将序列输入,设定参数,主要参数有: 引物长度,GC含量,Tm值,扩增产物长度,模板范围。 4( 加酶切位点或其他修饰序列:
酶切位点要选择基因内部没有的酶切位点,同时又要考虑到克隆时多克隆位点区域内的酶切位点。
5( 引物而聚体和发夹结构的检测。 6( 引物特异性的检测:
可用Blastn.
7.引物的书写、打印和合成。
(六)引物的稀释和保存
, OD A260,,,ug dNTP 的平均分子量,,,
引物的母液:,,,pmol/ul 引物的使用液:,,,,,pmol/ul 贮存温度 ,,,?C
二、原位杂交寡核苷酸探针的设计
探针的种类:
1. 双链cDNA探针。
2. 单链cDNA探针。
3. 合成的寡核甘酸探针。 4. RNA探针。
寡核苷酸探针设计的一般原则: 1. 长度,,,,,个碱基。 2. GC含量在,,,,,,,。 3. 避免loop结构。
4. 同检测基因的同源性要高,同其他基因的同源性应控制
在,,,以下。
5. 不要一连串的同聚物。 6. 在编码区域内。
寡核苷酸探针的合成和保存。
1. 书写格式:反转互补(Reverse and
complementary)
2. 稀释:
母液:,,,ng/ul
使用液:,,ng/ul
三( 新基因克隆
1(筛选cDNA 文库
2(电子克隆:
利用已有公共数据库的EST序列,根据同源性向5’端或3’端延伸,直到获得完整的编码阅读框(ORF). 完整ORF的定义:在一段序列中,介于两个终止子之间的最长的一个编码阅读框。在脊椎动物中,有一部分基因第一个ATG有Kodak结构,(GCC)GCCA(G)CCATGG,可以帮助判定获得的基因是否为全长基因,但也有例外,Kodak结构也可在基因的非第一个ATG。
获得基因序列后,需要设计引物用LD-PCR去扩增,克隆和测序,最终拿到基因的cDNA。
注意的问题:a.从公共数据库中拿到的EST序列的可靠性,如果是几个实验室同时获得的序列,可靠性较高。B. 要注意阅读框的正确与否,可借助于同源基因进行比较。如无同源基因,只有通过cDNA的克隆才能最终确定。
3(末端快速扩增(RACE, rapid amplification of cDNA end)
A.基本原理
B.基本流程:
C.引物设计:
长度23,28个核苷酸,GC含量50,70,,Tm值?65?。需要设计两对引物,进行巢式PCR,提高PCR产物的特异性。
D.初步的筛选:
1( 根据Northern blot的大小进行初步判定。
2( 用两对巢式引物进行PCR鉴定。
3. Southern blot鉴定。
4. LD-PCR:
根据同源基因,设计PCR引物。
范文五:PCR引物设计
PCR 引物设计
设计的目的是在两个目标间取得平衡:扩增特异性和扩增效率。 引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个 目标间取得平衡。
设计引用有一些需要注意的基本原理:
① 引物长度 :一般引物长度为 18-30碱基。总的说来,决定引物退 火温度(Tm 值)最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以 用于粗略计算引物的退火温度。 在引物长度小于 20bp 时: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃ 在引物长度大于 20bp 时:62.3℃ +0.41℃ (%G-C)-500/length-5℃ 另外有许多软件也可以对退火温度进 行计算,其计算原理会各有不同,因此有时计算出的数值可能会 有少量差距。为了优化 PCR 反应,使用确保退火温度不低于 54℃ 的最短的引物可获得最好的效率和特异性。总的说来,每增加一 个核苷酸引物特异性提高 4倍,这样,大多数应用的最短引物长 度为 18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要,主要与反应效率 有关。由于熵的原因,引物越长,它退火结合到靶 DNA 上形成供 DNA 聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。
② GC 含量 :一般引物序列中 G+C含量一般为 40%~60%,一对引物的 GC 含量和 Tm 值应该协调。 若是引物存在严重的 GC 倾向或 AT 倾向 则可以在引物 5’端加适量的 A 、 T 或 G 、 C 尾巴。
③ 退火温度 :退火温度需要比解链温度低 5℃, 如果引物碱基数较少, 可以适当提高退火温度,这样可以使 PCR 的特异性增加;如果碱 基数较多,那么可以适当减低退火温度,是 DNA 双链结合。一对 引物的退火温度相差 4℃~6℃不会影响 PCR 的产率,但是理想情 况下一对引物的退火温度是一样的,可以在 55℃~75℃间变 化。
④ 避免扩增模板的二级结构区域 :选择扩增片段时最好避开模板的 二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定 二级结构,有助于选择模板。实验表明,待扩区域自由能(△ G ) 小于 58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功。若不能避开这一区域 时,用 7-deaza-2’ -脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助 的。
⑤ 与靶 DNA 的错配 :当被扩增的靶 DNA 序列较大的时候,一个引物 就有可能与靶 DNA 的多个地方结合, 造成结果中有多个条带出现。 这个时候有必要先使用 BLAST 软件进行检测,网址:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。
选 择 Align two sequences (bl2seq), 如 下 图 图 。
BLAST的 使 用 方 法 也 十 分 简 单 , 如 下 图 所 示 。
将 引
物序列粘贴到 1区,将靶 DNA 序列粘贴到 2区,这两者可以互换 的,并且 BLAST 会计算互补、反义链等多种可能,所以不需要用 户注意两条链是否都是有义链。如果知道序列在数据库中的 GI
号
也可以直接输入 GI 号,这样就不用粘贴一大段的序列了。最后在 3处点击 Align 就可以查看引物在靶 DNA 中是否有多个同源位点了。 可是使用 BLAST 还是有其不方便的地方。因为它一次只能比较两 条序列,那么一对引物就需要分开进行比对。如果存在错配,还 需要自己计算由于错配形成的片段长度有多大。
引物末端 :引物 3’ 端是延伸开始的地方, 因此要防止错配就从这 里开始。 3’ 端不应超过 3个连续的 G 或 C , 因这样会使引物在 G+C富集序列区错误引发。 3′端也不能有形成任何二级结构可能,除 在特殊的 PCR (AS-PCR )反应中,引物 3′端不能发生错配。如扩 增编码区域, 引物 3′端不要终止于密码子的第 3位, 因密码子的 第 3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。
⑥ 引物的二级结构 :引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会 折叠成发夹状结构,这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模 板的复性结合。若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于 3bp 。两引物之间不应该存在互补性,尤应避免 3′端的互补重叠 以防引物二聚体的形成。一般情况下,一对引物间不应多于 4个 连续碱基的同源性或互补性。
⑦ 为了下一步操作而产生的不完全匹配: 5’端对扩增特异性影响 不大, 因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物 5′端修饰 包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、 Eu3+等;引入 蛋白质结合 DNA 序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引 入一启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率,还
加大引物二聚体形成的几率,但是为了下一步的操作就要作出适 当的“牺牲” 。多时候 PCR 只是初步克隆,之后我们还需要将目的 片段亚克隆到各种载体上,那么就需要在 PCR 这个步骤为下一步 的操作设计额外的碱基。以下总结一些为了亚克隆所要设计的序 列。 a 添加限制性内切酶酶切位点 添加酶切位点是将 PCR 产 物进行亚克隆使用得最多的手段。一般酶切位点是六个碱基,另 外在酶切位点的 5’端还需要加 2~3个保护碱基。但是不同的酶 需要的保护碱基数目是不相同的,例如:Sal Ⅰ不需要保护碱基, EcoR Ⅴ需要 1个, Not Ⅰ需要 2个, Hind Ⅲ 3个。其中,在原核 表达设计引物时还有一些小技巧,大家可以参考:《原核表达之实 验前的分析》 。里面一些规则是所有表达都通用的。 有一种做 法是在进行 PCR 反应的同时进行酶切,这样就需要注意一些内切 酶在 PCR 反应中的酶切反应率,见附录。不过这种方法虽然方便 但并不推荐。有时候,就是把 PCR 产物回收后酶切再与载体连接 效果都不尽理想,同步进行会使出现问题的原因变得更加复杂。 一旦出现问题,分析起来更麻烦。 b LIC添加尾巴 LIC的全 称是 Ligation-Independent cloning,它是 Navogen 公司专门为 其部分的 pET 载体而发明的一种克隆方法。用 LIC 法制备的 pET 载体有不互补的 12– 15 碱基单链粘端, 与目的插入片段上相应粘 端互补。扩增目的插入片段的引物 5' 序列要与 LIC 载体互补。 T4 DNA 聚合酶的 3' → 5' 外切活性经短时间即可在插入片段上形成单 链粘端。 由于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产物,
这种方法非常快速高效,而且为定向克隆。 c 定向 TA 克隆添 加尾巴 在 T 载体刚出的时候大家都拍手称赞,真是方便,哪个小 子脑子这么聪明想出来的。 但是后来人们发现 TA 克隆无法将片段 定向克隆到载体中,所以后来 Invitrogen 推出了可以定向克隆的 载体,它的一端含有四个突出的碱基 GTGG 。因此在 PCR 引物设计 时也要相应的加上与之互补的序列,这样片段就可以“有方向” 了。 d In-Fusion克隆方法 这项技术是 Clontech 还属于 BD 的时候推出的, 2004年在生物通可着实风光了一把,不但当选年 度创新试剂还被大家投票为最受大家欢迎的试剂。此技术就其步 骤来说是及其方便的,不需连接酶,不需长时间的反应。只要在 设计引物的时候引入一段线性化载体两端的序列,然后将 PCR 产 物和线性化的载体加入到含有 BSA 的 In-Fusion 酶溶液中,在室 温下放置半个小时就可以进行转化了。这种方法特别适合大批量 的转化。