范文一:大熊猫精清血小板激活因子乙酰水解酶(PAF-AH)活性影响因素的初步探讨
大熊猫精清血小板激活因子乙酰水解酶
(PAF-AH)活性影响因素的初步探讨 glJIl动物2006年第25卷第1期Siehuan.IournalofZoologyVo1.25No.12006
大熊猫精清血小板激活因子乙酰水解酶(PAF.AH)
活性影响因素的初步探讨
鲜红l,侯蓉,郑鸿培
(1.四川农业大学动物科技学院,四川雅安625014;2.成都大熊猫繁育研究基地) 摘要:在2004年度2-5月大熊猫繁殖季节,对5只不同年龄雄性大熊猫的精液使用酶免法检测精清中的
PAF-AH含量,并初步探讨了其含量高低的影响因素.结果在所有受检样品中均检测到PAF.AH活性的存在,
浓度最低仅12.96mmol/min?mL,最高达275.42nmlol/min?mL,大熊猫年龄不同,采精时间不同,精清PAF-
AH含量存在一定差异;同时PAF-AH的含量表现出与精子活力呈极显着负相关(R=一0.73.P<0.001).与
精子运动状态呈显着负相关(R=0.58,P<0.05);与精子形态完整性也有一定相关性但差异不显着(R=
一
0.42,P>0.05).结果表明,大熊猫精清中含有一AH,其含量高低与大熊猫年龄,采精季节及精液质量
有关.
关键词:大熊猫;精清;PAF.AH;年龄;季节;精液质量
中图分类号:Q959.8文献标识码:A文章编号:1000
SomeFactorsInfluencingPlatelet-ActivatingFactorAcetylhydrolase(PAF-AH)
ActivityinGiantPandaSeminalPlasma XIANHong,HOURong2,ZHENGHong—pet
(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,SichuanAgriculturalUniversity,Yaan,Sichu
an625(315;
2.ChengduResearchBaseOfGiantPandaBreeding) Abstract.Theobjectiveofthisstudyistodeterminetheactivityofplatelet—
activatingfactoracetylhydrolase(-AH) ingiantpandaSeminalplasmathroughEIAandtodeterminetherelationshipamongPAF-AH
contentandage.seasonor
spermquality.Results:SeminalPAF-AHconentrangedfrom12.96mmol/min'mIto275.42
mmol/rnin'mL.the
PAF-AHcontentvariedindifferentgiantpandaandmonth.Linearregressionanalysisreveal
cdsignificant(P<0.001,
P<0,05)relationshipbetweenPAF.AHcontentinsemenandspermmotilityandspermmo
vingcharacter.Fhedata
confimlsthepre.senceofPM:-AHingiantpandasemenanditscontentlevelsareage—
dependentandseasonalchanged,also
relatedtospermquality.
Keywords:giantpanda;seminalplasma;PAF—AH:age;season;spermquality 血小板活化因子(platelet—activatingfactor,
PAF)是一种具有广泛生物学活性的乙酰化的甘油
磷脂,自20世纪70年代被发现以来,已被证明与
哺乳动物的多种生殖过程有关,其中包括排卵,受
精,附植前胚胎的发育,植入乃至分娩等,在雄性
则主要影响精子功能,包括对精子活力,顶体反
应,获能和受精等多方面的作用[3,4,7-9,12].PAF—
AH是PAF在体内代谢失活的主要限速酶llJ,其
可以通过调节PAF水平进而调节精子的功能.有
资料显示,PAF—AH有助于维持精子质膜的稳定
性,射精后,精浆中的PAF—AH可转移至精子表
面,使PAF维持一定的水平,以保护精子,避免
收稿日期:2005一(/4—22基金项目:大熊猫繁育研究基金会项目
作者简介:鲜红(1978,),女,硕士,研究方面:动物繁殖. 精子的活力受到损害,也避免精子在成熟时受到触 发而过早地发生顶体反应,被认为是与精子获能有 关的去获能因子【12j.目前,该酶已被发现存在于 牛,猪,马,兔,鼠等多种动物和人类精清当 中l2?4.1Ul,表现出与雄性生殖功能的相关 性-ll,?J本研究旨在对大熊猫精清中是否存在 PAFAH进行检测,并初步探讨影响其含量水平的 相关因素,包括年龄,季节以及精液质最等,以期 对PAF.AH与大熊猫繁育能力的关系作一定的探 索,并为大熊猫生殖生理的研究提供一定的参考. 1材料与方法
55
四川动物2006年第25卷第l期SichuanJournalof/~JologyVo1.25No.12006
1.1受试大熊猫
受试大熊猫为成都大熊猫繁育研究基地的5只 成年雄性大熊猫,其基本情况见表1.
表1受试大熊猫基本-隋况
1.2大熊猫精液的采集与精清的制备
在2004年2,5月大熊猫的发情繁殖季节,通 过电刺激直肠采精法采集大熊猫精液.将采得的精 液稀释后离心分离精清,将所得的精清再3000 rpm离心10分钟,取卜清液分装后置一20?保存 待用同时作大熊猫的常规精液品质分析,检测其 密度,活力,运动状态,形态等指标.
1.3精清中PAF.AH的测定
精清中PAFAH的测定采用ELISA法进行, 所使用的PAI{一AII酶免检测试剂盒为Cayman产品
(LoL.No.98835),测定步骤参照试剂盒说明书 进行.
2结果与分析
2.1大熊猫精清样品中PAF.AH浓度的检测 对5只大熊猫共成功采得精液l9次,取得精 清样品19份,各样品中PA,_AH的浓度检测结果 见表2
表2不同个体大熊猫精清PAF-AtI浓度检测结果 PAFAH对磷脂具有很高的选择性,能够识别 位于磷脂SN一2位置很短的酰基,并且和脂蛋白相 联.本检测使用了2一thio,它能够作为所有 PAF—AH作用的底物.P八FAH使位于SN一2位置 的乙酰基硫脂水解,水解下来的自由的硫醇通过使 用DrI-NB(Ellman'sreagent)探测.25?『,.1单 位酶每分钟能够水解lumol2一thio.所以. PAFAH的浓度可以用umol/min?mL米表示.从 以上检测结果可以看出,从所有获取的大熊猫精清 样品中,均检测到了PAF—AH的活性变化,浓度 最低仅l2.96mmol/min?ml,最高达275.42 mmoVmin?mL,其平均含量为56.76?60.86 mmol/min?mL.
2.2年龄及采精时间对精清PAF.AH浓度的影响 不同个体大熊猫及不同月份精清PAF—AH浓 度变化结果见图表1和图表2.
从图表巾可以看出,精清IAF—AH的含量高 低在个体上和精液采集时间上是有?定程度差异的 (罔1)..年龄较小的3号和4号熊猫个体(<l0 岁)精清PAFAH含量较低,l0,20岁的熊猫个 56
体精清PAFAH含黾较高,大于20岁的熊猫个体 PAH—AH活性较10,2()岁的熊猫个体PAF—AH活 性有所下降,但差异不显着.从时间来看(图l, 2),在大熊猫发情旺盛季节(2,3,4月份)精清 PAF—AH浓度相对较低,伴随繁殖季节的结束,精 清中PAF—AH浓度开始上升,这与其后I~AF-AH 浓度卜了精液质晕关系分析中表现出的负相关具有一 致性.但由于受试验动物样本数量的限制,浚结果 尚需进一步的验证.
5
月
134125垌月月月号号号
月份熊猫个体
图1不同年龄大熊猫同月份精清PAF.AH浓度差异 ?加
四川动物2006年第25卷第1期SichuanJournalofZoologyVo1.25No.12006
图2不同年龄大熊猫繁殖季精清PAF—AH变化图 2.3精清中PAF.AH含量与大熊猫精液质量指标 的相关性分析
将成功采集的19次大熊猫精液在进行冷冻保 存以前进行精液质量的常规检测,检测指标包括: 精子密度,活力,运动状态和精子形态,同时分离 精清检测PAF—AM浓度.所得数据进行线性相关 分析,结果见表3.
表3PAF-AH含量与大熊猫精液各质量指标的相关分析 精子密度精子活力精于运动状态精子形态 PAFAH浓度
0.I40.73一0.58一0.42
(nunol/min?mL)
从上表分析得到的相关系数结果来看,精清中 PAF—AH的含量高低与精子活力存在极显着的负相 关(R=0.73,P<0.001),即精清中PAF—AH 的浓度越高,精子活力越差;同时精清PAF—AH 浓度也呈现出与精子运动状态的显着负相关(R= 0.58,P<0.05),与精子密度和精子形态有一 定的相关性,但差异不显着.
3讨论与分析
精液由精子和精清组成.精清是精液的无形成 分,由睾丸液,附睾液和几种副性腺的分泌物混合 而成.精清内含有的各种成分是射精后精子生存的 微环境,对调节精子的生成,成熟以及为精子提供 能量和营养物质具有重要意义.由生殖小泡腺和前 列腺分泌的PAF—AH6是存在于精清中的一类水解 酶类,其含量高低与动物年龄,季节及精液质量等 有关.Kordan等(2003)发现猪在37周龄以前随 年龄的增长精清PAF—AH活性变化不大,在3l, 36周龄时出现一个峰值,在37,42周龄后活性开 始下降,并认为这种变化可能与动物的性成熟有 关.从季节上看,夏季是猪精清PAF—AH表现较 高活性的时期,而此时动物精液的质量也较差.此 后,Roudebush等(2003)和Zhu等(2004)对精 液中PAF—AH含量与精子活力的关系进行了研究, 结果都发现,精液中PAF—AH的含量与精子活力 呈现显着的负相关(P<0.001),即精清中PAF— AH的活性越低,精子活力越高,但他们对这一现 象的作用机制未能作进一步的研究.在本次试验当 中,精清PAF—AH活性也表现出与大熊猫年龄, 采精时间以及精液质量的相关性,特别是其与精子
活力等质量指标的显着负相关说明,PAFAH这一
存在于大熊猫精清中的水解酶类,有可能在大熊猫
的生殖过程中扮演了一定的角色,但它对于精子活
力的影响作用及其机制以及它在雄性生殖过程中的
具体功能还需要我们更进一步的研究.
4参考文献
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四川动物2006年第25卷第1期SichuanJournalofZoologyVo1.25No.12006 猪白细胞介素4,6融合基因对小鼠免疫的影响
李化,谢塑,高荣,武梅,孟民杰,章欢,程驰,
杨毅.刘狄广,王泽洲,王秀英,沈翼,王红宁
(生物资源与生态环境教育部重点实验室,四川大学生命科学学院,成都610064)
摘要:日的:研究猪白细胞介素11.4,IL6融合基冈(PIIA6)对小鼠免疫应答的反应.
方法:以壳聚糖纳
米颗粒包裹融合基因(PIL46)的真核表达质粒(VPIIA6)接种昆明小鼠,免疫后28日
以口服攻毒实验小鼠,
观察其体液和细胞免疫水平指标的变化和病变情况.实验结果发现:CNP包裹
VPIL46接种小鼠体液免疫和细胞
免疫指标不同程度地增多,均显着高T-xqN组(P<o.05);与CNI包裹VPIIA+6免
疫效果相近.免疫后28日
以口服攻毒实验小鼠,检测结果发现:CNP包裹VPIIA6组和CNP包裹VPIL4+6
组小鼠的上述免疫指标除中
性粒细胞外均显酱:多于对照小鼠,免疫小鼠兀症状和病变,健康存活;而对照小鼠
均发病,消化道组织器官呈
现明显出血病变.结论:PIL46基具有着增强小鼠体液和细胞免疫机能,提高对大肠
4:r菌感染抵抗的免疫
调节效应,可作为有效的抗感染免疫调节剂.
关键词:猪IL4和l1.6;融合荩因;壳聚糖纳米颗粒;免疫;小鼠
中图分类号:Q34文献标识码:A文章编号:1000—7083(2006)0l0058—06
EffectofFusionGeneofPorcineInterleukin6and4ontheImmunityofMice
LIHua,XIEZhao,GAORong,WUMei,MEN(;Min—
jie,ZHANGHuan,CHENChi,YANGYi,
LIUDiguang,WANGZe—zhou,WANGKit,ying,SHENYi,WANGHongning
(KeyLabforBiologicalResourceandEcologicalEnviromnentofEducationMinistry,{~llegeofLifeSciences,
SichuanUniversity,Chengdu610064)
Abstract:ObjectiveToresearchtheimmunopotentiationofanovelfusiongeneofporcineintcrleukin一6and一4onim-
munityofnfice.MethodsThecukaryotieexpressionplasmidoffusiongeneofporcineinterleukin一6and一4wasentrapped
withchitosan—
nanopartiele(CNP)preparedbythemethodofionicC1~)SSlinkagetoirmnunizeKunmingmiceattheageof
21days,andthenlheexperimentalmieewereorallychallengedwilhvirulentE,colibacteria28dayspost—inoculation,
TheperipheralbloodwereweeklycollectedfrcthelailveirlofinoculatedmicetodetectthecontentofIgG,IgA,IgM
andspecificantibodyagainstE,coliaswel1asthelevelsofimerlcukin2(IL2),IL4andIL6bytheSABC-ELISA,i'he
numberoflymphocyms,men{~:ytes.granulocyt~sandwhiteblK】cellswereal?
countedoutasthcroutinemethod.Re-
suitsThehumoraIlandcellularimmunevalueswererespectivelyelevatcdtodifferelitextentinthemicevaccinatedwith
VPIL46orVPII+6.Fhein~nunizedmiceallsurvivedwithoutsynlptomsandlesionsafterchal
lenge.whilethecentrel
miceappearedc,ident,symptomsandhemorrhagicl)!rlNmainlyindigestivetissuc,sandorgans.ConclusionTheI】II.46
fusiongenecouldsignificantlypromotethehumora1andcellularinununityandresistanceof
nlouseagalnstE.coliinfec
tlon,andwouldbeutilizedasaneffectiw:adjuvanttoimprovetheinmmnityandresistanceofa
nimalsagainstinfectious
dis凹s.
Keywords:1)(}rcineIL6andIL4;fusiongone;ehitosan.nanoparticle(CNt);immunlty;mousece
收稿日期:2005—12—26基金项目:四川计青年科技基金资助项目
作者简介:李化(1978,),男,硕士研究生,研究方向:生态工程,E.nla
通讯作者,gaomng96@163.colD_
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范文二:土壤氧化还原酶和水解酶活性的测定
尿酶活性的测定
试剂:甲苯,10%尿素,柠檬酸,氢氧化钾,氢氧化钠,苯酚,乙醇,甲醇,
丙酮,次氯酸钠,硫酸铵,
溶液配制:
A:柠檬酸盐缓冲液:368g柠檬酸溶于600ml蒸馏水,295g氢氧化钾溶于水。
将两溶液合并,用1N氢氧化钠将pH调至6.7,用水稀释至2000ml
B:苯酚钠溶液:a液:62.5g苯酚溶于少量乙醇,加2ml甲醇和18.5nl丙酮,
用乙醇稀释至100ml;b液:27g氢氧化钠溶于100ml水。将a、b两溶液
保存在冰箱里。使用前将两溶液各20ml混合,用蒸馏水稀释至100ml
C:次氯酸钠溶液:用水稀释试剂,至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定
D:标准溶液:a液:0.4717g硫酸铵溶于水,稀释至1000ml(1ml含100微克
氮);b液:往500ml容量瓶中分别注入10、25、40、60、75及90ml溶
液a,并用蒸馏水稀释至刻度。在10ml每一溶液b中,分别含有20、50、
80、120、150及180微克的铵态氮,用于绘制标准曲线。 仪器: 500ml容量瓶(7个),2000ml容量瓶(1个),100ml容量瓶,50ml容量瓶,
恒温培养箱或恒温水浴锅,分光光度计
测定步骤:
1. 取10g过1mm筛的风干土样,至于100ml容量瓶,加2ml甲苯; 2. 甲苯处理15min后,往瓶中注入10ml10%的尿素溶液和20ml柠檬酸盐缓冲
液(pH6.7),仔细混匀;
3. 将瓶在38摄氏度恒温箱中放置24h;
4. 培养3h后,用热至38摄氏度的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应付在刻度以上),
摇荡,将悬液过滤,滤液备用。
5. 取滤液1ml置于50ml容量瓶,用蒸馏水稀释至10ml,然后加入4ml苯酚钠
溶液,并立即加入3ml次氯酸钠溶液,加入每一试剂后,立即将混合物仔细
混匀;
6. 混合后20min,将混合物体积稀释至刻度;用1cm比色槽,在比色计上于波
长578nm处测定(1h内测完)。
7. 整个实验设置无土壤对照,每一土样设置用水代替基质的对照。
蛋白酶活性测定(加勒斯江法)
试剂:甲苯, 白明胶, 甘氨酸,浓硫酸,硫酸钠,茚三酮
仪器:分光光度计,50ml三角瓶,50ml容量瓶,恒温培养箱或水浴锅 试剂配制:
1磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)配制:a:0.2mol磷酸二氢钠溶液:称取27.6g
NaHPO?HO溶至1L,0.2mol磷酸氢二钠溶液:53.65gNaHPO?7HO或242242
71.7gNaHPO?12HO溶至1L;取19ml0.2mol磷酸二氢钠溶液加81ml0.2mol242
磷酸氢二钠溶液,稀释至200ml。
2. 1%白明胶溶液:称取1g白明胶用磷酸盐缓冲液溶至100ml;0.05mol/L硫酸:
将1ml浓硫酸(比重1.84)稀释至360ml,
3. 2%的茚三酮溶液:称取2g茚三酮溶于100ml丙酮中为原液,使用时将95ml
原液加1ml乙酸和4ml蒸馏水混合制成工作液(该工作液不稳定,现用现配); 4. 20%硫酸钠溶液:称取20g硫酸钠用蒸馏水溶至100ml;
5. 甘氨酸标准液:称取100mg甘氨酸用蒸馏水溶至1L(100微克/ml) 步骤:
1. 2g土样两份置于三角瓶,加0.5ml甲苯,混匀放置15min,另取一三角瓶不
加土样和甲苯作为无土对照;
2. 将其中一土样试管加10ml1%白明胶,另一瓶加10ml蒸馏水代替明胶溶液作
为无基质对照。盖好瓶盖,小心摇匀,在30摄氏度恒温水浴锅培养24h后过
滤;
3. 吸取滤液5ml于试管中,加0.5ml0.05mol/L硫酸和3ml20%硫酸钠沉淀蛋白
质,再次过滤;
4. 取滤液2ml加1ml2%的茚三酮溶液在试管中,于沸水浴上加热10min,将显
色液稀释至50ml。
5. 560nm比色测定
6. 甘氨酸标准曲线的制作:分别吸取0、0.1、0.2、0.5、1.2和5ml甘氨酸标准
液置试管中,加蒸馏水至5ml,各加入1ml 2%的茚三酮溶液摇匀,在沸水浴
上加热10min,将显色液转入50ml容量瓶,稀释至刻度,560nm以不含甘氨
酸的溶液为对照比色测定。
转化酶活性测定(3,5-二硝基水杨酸法)
试剂:3,5-二硝基水杨酸,酒石酸钾钠,磷酸氢二钠,磷酸二氢钾,蔗糖,甲苯,葡萄糖,苯甲酸
试剂配制:
1. 3,5-二硝基水杨酸溶液:称取0.5g二硝基水杨酸,溶于20ml2N的氢氧化钠
和50ml蒸馏水中,再加30g酒石酸钾钠,用水稀释至100ml(不超过7天); 2. pH5.5磷酸缓冲液:1/15M磷酸氢二钠(11.867g两水磷酸氢二钠溶于1L蒸馏
水)0.5ml加1/15M磷酸二氢钾(9.078g磷酸二氢钾溶于1L蒸馏水中),9.5ml
即成;8%蔗糖溶液;
3. 标准葡萄糖溶液:葡萄糖在50-58?条件下,真空干燥至恒重。然后取500mg
溶于100ml苯甲酸溶液中(5mg还原糖/ml),即成标准葡萄糖溶液。再用标准
液制成1ml含0.01-0.5mg葡萄糖的工作溶液。
仪器:50ml三角瓶,移液管,恒温培养箱,水浴锅,比色计,1000ml容量瓶,
100ml容量瓶
步骤:
1. 称取5g风干土样,置于50ml三角瓶中,注入15ml8%蔗糖溶液,5ml pH5.5
磷酸缓冲液和5滴甲苯,摇匀混合物;
2. 放入恒温箱,在37?下培养24h,到时取出,迅速过滤。
3. 从中吸取滤液1ml,注入50ml容量瓶中,
4. 加3ml3,5-二硝基水杨酸溶液,并在沸水浴中加热5min,随即将容量瓶移至
自来水下冷却3min。
5. 溶液呈橙黄色,最后用蒸馏水稀释至50ml,于508nm处进行比色。 6. 为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差,每一土样需做无基质对
照,整个实验需做无土壤对照。
7. 计算:转化酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的mg数表示,葡萄糖(mg)=a*4,
a:从标准曲线查的葡萄糖mg数,4:换算成1g土的系数 8. 标准曲线的制作:取1ml不同浓度的工作液,并按与测定转化酶活性同样的
方法进行显色,于508nm测定吸光度。横坐标浓度,纵坐标吸光度,计算方
程。
过氧化氢酶活性测定(高锰酸钾滴定法) 试剂:
0.3%HO:按1:100将30% HO用水稀释;3mol/l硫酸:16.043ml浓硫酸加2222
500ml水;0.1mol/l高锰酸钾溶液
仪器:
150ml三角瓶,容量瓶
步骤:
1. 称取5g风干土样,置于150ml三角瓶,注入40ml蒸馏水和5ml0.3%过氧化
氢;
2. 同时设置对照,即三角瓶中注入40ml蒸馏水和5ml0.3%的过氧化氢,而不加
土样。塞进瓶塞,置于120次/min往复式摇床上,振荡30min,随即注入5ml3M
硫酸以终止反应,过滤;
3. 取滤液25ml,用0.1M高锰酸钾溶液滴定至微红色。
4. 过氧化氢酶活性以ml高锰酸钾/g土样
脱氢酶活性测定
试剂:
1. 0.5M三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.6):2M三(羟甲基)氨基甲烷溶液与1N盐酸75ml混合,加蒸馏水75ml,定容至200ml;
2. 0.5%TTC:TTC0.5g溶于0.5M的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.6)中,定容至100ml;
3. 甲醇;
3. 三苯基甲噆标准液:三苯基甲噆30mg,置于100ml容量瓶,用甲醇定容至100ml,此溶液浓度即为1微克分子/ml。再用甲醇稀释该溶液,配制成25、50、75、100、150微克分子/ml的标准溶液。
步骤:
1. 称取5g土样于50ml三角瓶(具塞试管),加TTC溶液5ml,充分混匀; 2. 同时设置对照,即在试管内加入0.5M三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液
(pH7.6)5ml以代替土壤与TTC;
3. 将以上试管置于暗处30?下保温培养6h,
4. 培养结束后,分次少量加入甲醇100ml,移入带塞三角瓶,振荡30min,过
滤。
5. 滤液于485nm测定吸光度。以甲醇为空白。
6. 工作曲线:用上述同样方法测定不同浓度三苯基甲噆标准液的吸光度。即
可。
微生物篇
-4-5细菌培养:牛肉膏蛋白胨培养基(10~10)
牛肉膏:5.0g;蛋白胨:10.0g, 氯化钠:5g,水1L;琼脂:18g;pH 7.2-7.4
-3-4真菌培养:马丁氏(Martin)培养基(10~10)
KHPO 1 g;MgSO ? 7HO 0.5 g;蛋白胨 5.0 g;葡萄糖 10.0 3442
g;琼脂 18 g;水 1000 mL。
每1000 mL培养基加1%的孟加拉红(Rose Bebgal)水溶液3.3 mL,临用时加乳酸2 mL/500 mL以抑止细菌和霉菌的生长。
-3-4放线菌培养基:改良高氏一号培养基(10~10)
KNO 1.0 g;FeSO ? 7HO 0.01 g;KHPO 0.5 g;MgSO ? 7HO 34224420.5 g;NaCl 0.5 g;淀粉 20 g;琼脂 18 g; 水 1000 mL。
临用时在已融化的培养基中加入3%重铬酸钾溶液1 mL/300 mL,以抑止细菌和霉菌的生长。
范文三:MUC2反义核酸对胃癌细胞蛋白水解酶表达的影响
MUC2反义核酸对胃癌细胞蛋白水解酶表
达的影响
498
第29卷第6期第三军医大学Vo1.29,No?6
2007年3月ACTAACADEMIAEMEDICINAEMILITARISTERTIAEMar?2007
MUC2反义核酸对胃癌细胞蛋白水解酶表达的影响
文章编号:1000-5404(2007)06?0498?05 罗文军,易永芬,张晓艳,林晓(重庆医科大学:附属第二医院普通外科,基础医学院病理学教研室,重庆
400016;山东省临沂市中心医院,临沂276000)
提要:目的探讨MUC2反义脱氧寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide,ASODN)
抑制人胃癌细胞株SGC7901
黏蛋白MUC2的表达及其对癌细胞蛋白水解酶表达的影响.方法采用脂质体作为载体,将载体与MUC2基因的串联重
复区互补,经硫代磷酸修饰的反义寡核苷酸(ASODN)导入MUG2蛋白高表达的胃癌细胞株SGC7901,采用RT?PCR,流式
细胞仪,免疫组织化学等方法检测MUC2ASODN对胃癌细胞凋亡和蛋白水解酶的表达.结果RT.PCR结果显示,
SGC7901细胞转染MUC2ASODN48h后,MUC2的mRNA表达与对照组相比明显降低(P<0.O1).流式细胞仪分析
MUC2ASODN处理SGC7901细胞48h后,G0/G.期细胞百分比下降,s期细胞百分比明显增加,且能诱导细胞凋亡,凋亡
细胞占4.38%,与对照组比较(P<0.01).免疫组化S.P法检测转染MUC2ASODN胃癌细胞,组织蛋白酶D,MMP-2表达
显着下降(P<0.05).结论MUC2可促进癌细胞产生蛋白水解酶,使用人工合成MUC2ASODN在体外能有效抑制胃癌
细胞株SGC790l蛋白水解酶的表达,并能诱导凋亡.
关键词:MUC2;反义寡核苷酸;细胞凋亡;蛋白水解酶;胃癌
中图法分类号:R73.354;R730.23;R735.2文献标识码:A
Effectoncellproliferationandproteolyticenzymeofhumangastriccarcinomaby MUC2antisenseoligodeoxynucleotide/nvitro
LUOWen-jun,YIYong-fen,ZHANGXiao.yah,LINXiao(DepartmentofGeneralSury,TheSecondAffiliatedHo叩ital,
DepartmentofPathology,CollegeofBasicMedicine,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,LinyiCentralHospitalofShah.
dongProvince,Linyi276000,China)
Abstract:0bjectiveToinvestigatetheinhibitioneffectinvitroofmucingeneMUC2antisenseoligode.
oxynucleotide(ASODN)onitsgeneexpressionandproteolyticenzymeongastriccancercellline.Methods
PhosphorothioatedMUC2ASODNweresynthesizedandtransfectedtoSGC7901cellsmediatedbylipofectin.
MUC2mRNAandMUC2proteinexpressedonSGC7901cellswasdetectedbyRT.PCRandimmunohistochemi.
calmethod.inhibitoryeffectsofASODNonproteolyticenzyme,suchascathepsinD.MMP-2andMMP-9
proteinweredetectedbyimmunohistochemicalstaining.Thecellcycleandapoptosisweredeterminedbyflow
c~ometry(FCM).ResultsTheinhibitioneffectspeakedat48thhouraftertransfection.andtheinhibition
ratereached55%whentheconcentrationofASODNwas0.5ixmol/L.Thenumberofthecellstreatedwith
MUC2ASODNwasdecreasedascomparedtothecontrolcells.MUC2ASODNtransfectioncouldinhibitthe
transitionperiodofSphasetoG2/Mphase,andG2/Mdidnotchangemuch.I1leapoptosisratewasabout
4.38%.Ascomparedwithblankcontrolgroup.MUC2ASODNcouldsignificanflyinhibitM
UC2mRNAex.
pressionofSGC7901cells.AS0DNcoulddownregulatetheexpressionlevelsofMUC2prote
in.MMP-2andca.
thepsinDprotein.ConclusionMUC2ASODNtransfectioncouldspecificallyinhibitSGC79
01cellsbvdown.
regulatingtheexpressionlevelsofproteolyticenzyme. Keywords:MUC2;antisenseoligodeoxynucleotid;apoptosis;proteolyticenzyme;gastricc
~cinoma
基金硬目:重庆市卫生局科研基金(渝卫科教2000-48)
SupportedbytheFoundationfortheScientificResearchProjectofChongqingBureauofPubl
icHealth(2000-48)
作者筒介:罗文军(1954一).男.四川省洪雅县人,副教授.主要从事血管外科和胃肠
肿瘤方面的研究.电话:(023)6669187
通讯作者:易永芬.电话:(023)68012697.E—mail.*yiyongien1953@yahoo.com.cn 收稿日期:200~一08—02;修回日期:2OO6—10—16
第6期史军.普.MLC2反义核陵对胃癌细胞蛋白水解腓表达的影响499
胃癌组织中高表达黏蛋白MUC2者其浸润程度
深.淋巴结转移较早本研究采Hj脂质体作为载
体.将硫代磷酸修饰的MUC2反义寡核苷酸导人
MUC2蛋白高表达的胃癌细胞株SGC7901.观察blUC2
反义寡核苷酸对胃癌细胞蛋白水解酶表达的影响,旨
在进一步探讨黏蛋白与胃癌细胞水解酶表达的关系及
在胃癌发生及演进中的作用及机制.以期为肿瘤的基
因治疗提供一定的参考
1材料与方法
1l主要试剂
胃膑癌细胞蚌SGC7901由本控病理学教研室提供小牛
血清,RPMII640十粉及胰蛋闩酶购自北京巾山公司;Triz~,l(总
RNA提取试剂)和阳离子脂质体赌Ilnvitrf~gen公司:RNA酶 抑制剂,PCR试剂盒,DNA标准哟自美国Pr,-不-a公可.Omnis— trip/Re'verseTranseriptase畸自美周Qiagen公司:MUC2 MMP-2,MMP9和组织噩白酶D单克隆抗体及S-P试剂盒等 晌臼稿卅I迈新公司.
1.2合成硫代寡脱氧核苷酸
委托上海生工台戒MUC2反义寡脱氧核苷酸【??lsli— gndeoxynucleotide.A~JDN),其正义谜为51_GTG(;TGGTGGr— GA代G(-3.,反殳链序列为5-ACCCATCACCACCACCAC一3. 反义链均碗代硫酸修饰一
1.3脂质体一ASODN复合物的制备
阳离子脂质体Lipofectin购自Invltrogen公司.制备前将 ASODN稀释于100"l无m清无抗生索的RPMI1640培非液中. 加^稀释的脂质侔,混匀成脂质伴.ASODN复台枷井立即Hj 于细胞处理.脂质体翌ASODN阁量参考说明书
1.4RT—PcR捡测MUC2ASOI)N作用前后MUC2 mRNA的袁达
引物的设计与台l哦:根据GenBank的资料I笠什ML,C2和B— actin的引物(委托上海牛丁台成)MUC2引物序列:上游5.- CGGAGCTGAAGTrGGAAGAC一3,下游5一GGCAGAGCAGAAG— CACTCAC?3,其产物长度为502-hp;B—actin引物序列:上精5'. ATAAACCTGGCAAqTGTCTCC一3.下游5'-CCTGAGT'I'GAAAA— TGGATFC一3,其产物1_乏度为845bp实验升为空H对照组及 0.5b~md/L骀质体一ASODN处理组各取对数生i乏期细咆不】 无血清无抗生素I~.PMI1640稀释.将密腰为【×10/ml的细胞 液10ml接种到100n1_培养瓶中:转染时,处理绀将细胞与总 俸积为5ml的脂质体一ASODN复台物充分混匀,空白对照组加 ^同等体积的无血清无抗生素RPMI1640培养液:48舌.常规 胰酶消化.离心.弃上清,用4?戊二醛同定细胞匪l块.细胞
RNA的提取:RNA的提取方法根据Trizol操作说明书井结合文 献[3,4]进行操作;逆转录合成cDNA第1链.PCR扩增MUC2 片段;RT-PCR反应产物的凝胶电泳检测,计算MUC2产物与B. actin产物的兜密度积分比例
1.5免疫组化S-P法测定MUC2,MMP.2,MMP-9和 组织蛋白酶D蛋白的表达
取对数生长期细胞用尤血清无抗生素RPMI1640稀释.将 tx10/mI浓度的细胞500接种于预置无菌小盖玻片的 L饭Ll_1;细吁色片时分为两组:窀白对照组,0.5【I脂质 体一ASODN处理组转染时.处理鲥将细胞与总体积为250 ASODN脂质体复台物充舒混匀.守白对照组^同等体积的 无血清无抗生索RI'M116,40培莽液培养5h后.漆加含血清 RPMIt640250O.I培养液继续培养;48_1嫩tl{盖玻片,PBS液 漂冼3次.4丙酮同定5mil;滴加0.3%H:O:.窄温作用3O min;滴加正常山羊血清.室滥作30rain;仆制滴加组织蛋白 酶DMUC2MMl.2,MMP一9蛋白单克隆抗体,同时?PBS代替 一
抗做阴性x,j-!tV,:滴J?辣根过氧化物酶标}己的链霉素物素1二 作液;DAB显色5,10min,叶?研胶封片
免疫组化结果判定:高倍镑下随机现察5个视野先将染 色强度i芒圩:无乜记为0,淡黄色记为i.棕黄色记为2,稼褐色 记为3;再"阳性细胞数占射一瘤细胞总数舯百分比来记分.当阳 性细胞数?教的5%时i为.讣.6%,25%为1分.26%, 50%为2丹>50%为3分;每个视野单独记舒,染色强度得分 与阳性细胞数得竹相乘再卡H加取平均值.得讣0为阴性 (一),I一3分'己为弱lr(.),4—5分为中度性(十十) ?6丹时己】^J强阳性(什+)
1.6流式细胞仪进行细胞周期的分析
取对数生【乏期细胞H{无清尤抗生素RPM【_640稀释.将
密睦l为l×I()'/ml的细胞液l0?接种到100rnl培养瓶-l1I实 驻分为空白对照组厦05oL,L脂质体一ASC)DN处理组空 白对照组加入I口1等体积的无血清无抗生素RPM11640上}}养液: 转染时.处理组将细咆与总体积为5mI5旨质体.^SODN复合物 充分混匀,48}l后+常规胰蕊消化.离心,弃12清:州4?预净 70%乙醇固定收集的细胞;行流式细胞他分析. I.7统计学处理
数据?袁示,秉HJsAs80统计软件,行单吲素方差 分折,f检验
2结果
2.1RT—PCR检测MUC2ASODN作用前后MUC2 mRNA的表达
MUC2ASODN作川SGC7901细胞48Ii后.^I)处理组 《I.238?010I9)计照组(I8I3?0.165I)卡日比.MUC2的表 达在mRNg水平明垃降低fP(0.i)IH罔I)
…
一5《?】bDixl1)bp5t11)bp200bp 1__I)bp
I:?LIC20.5州,1,1】^t1)N特染蛆如聘R'I—IrH产特:2:时照 蛆细胞RT—PCR特:3:I)X,A标准
图1SGC7901细胞eDNART?PCR扩增产橱电泳田
旃-军医k学'咎
22免疽组化染色鲒果
22IM….2黹I『岫J?川?5一I/I^ll】作川
sfI27901铷Il抱48hJ.饱痤川化潦邑结小乜幔. 盹廊均q柠菏荇色.^Jl处哩i尤明腿匝菏包.
1兑叫转ML(:2ASODN,I:7I胞…l小^的泽受刮
州川MI1酱II是J水下叫啦降骶II)
'ML0^s0挪莆?Ut2自解酶…
222组织蛋酶l1边州纵Il【】丧逃他J细H世 硪龟症组1t乜对姒}}I纵益n酶"丧』如悱l+ ?lf罔2^)?o5~1111,I/I^I作liJI7细性48h 并.^ll】N处耻1蛆腑D牲1为什f+}(211). 兰掉持(,(005).说转染MLC2r)l1N组!蛋_酶 i)帕丧达水释低《I)
,:"II:^s【l_,m{4Hhl
目2ASODN组目自酶【】的表
II'*'*?x400j
223MM9一%IMP-2盔lrln0坫MM9/MM?_2fl丧 选位r刿臆脏川05…"I/IAS{)DN作用S{;C7901胞 h.MMp-9健痘n化色结j.对照组&MI12 ^I)址组均为Ij'度"悱《….州肯12盟晕异{,,) 【】05j}n叫转M2A山肝MMP-g是水平尢州 差拌M?1'2龟庇组化色示埘J[1为唾mr# (_}jll3A).盯lj^?处蛹lII?+)謦肆嚣c, (I)f)(阿311).城叫转MI(:!cII?Ml1_2省蠢j 水阱低lIl
,一II,IJ,tc4HJJ
目3AS()I)N前MMP2鸾cI.x4【J?
23丘艾抑制M【.【.2时细胞周期的影响 '计盟绸较.M_f2^Il1N址胖川I一,{l'峰t删? 现叫0亚(峰f1(1,期绑针li~.{--M删】? 耐打扪近刺细什比叫垧加lW慨黼r!cIj件 …J1剐JJ{4f)
3讨论
琴^:m.Il-,hI,mrh
目42组式细胞特测
ML[C2周屉苗宅从小脑鼎腱的D^史库_f_也 隆…柬的黏液基.其编码的MLI'2蜚内星种分泌 _l一
第6期罗文军,等.MUC2反义核酸对胃癌细胞蛋白水解酶表达的影响501
型糖蛋白].MUC2在正常的胃黏膜没有表达,而胃 黏膜肠型化生后的杯状细胞及吸收细胞和不成熟的柱 状细胞中有表达,在肿瘤细胞中呈高表达趋势.Sono? da等的研究表明MUC2在82%的胃癌组织中都有 表达,同时在早期胃癌患者,肿块周围的淋巴结中既可 检测出MUC2的表达,而在正常淋巴结中并无表达. 在胃癌中,特别是肠型胃癌MUC2的表达明显上调. 因此MUC2在检测早期胃癌的淋巴结微转移中具有相 当重要的作用.Leteurtre等采用免疫组化和原位杂 交技术研究了MUC2,MUC5AC,MUC5B和MUC6在胃 癌组织中的表达情况,结果显示高表达MUC2的胃癌 患者预后最差.我们采用脂质体作为载体,将与 MUC2基因的串联重复区互补的经硫代磷酸修饰的反 义寡核苷酸导人MUC2蛋白高表达的胃癌细胞株 SGC7901,以抑制MUC2蛋白表达,探讨其在胃癌细胞 中的作用及机制.前期研究表明,用脂质体介导的 MUC2ASODN转染SGC7901细胞后,可有效降低 MUC2蛋白的表达,明显抑制胃癌细胞株SGC7901的 增殖.本研究进一步用流式细胞仪,RT-PCR及免 疫组化法深入研究了MUC2与细胞凋亡和蛋白水解酶 表达的关系.流式细胞仪结果显示反义抑制MUC2 能诱导细胞凋亡,G期峰左侧出现明显的亚G期峰, 与对照组相比较,S期细胞百分比明显增加,G./G.期 细胞百分比下降,G:/M期细胞两者相近,细胞滞留于
S期,处理组出现凋亡细胞(4.38%).这说明抑制 MUC2的表达后,使细胞停止于DNA合成期不能进入 分裂期,同时可以促使细胞凋亡.细胞凋亡是机体为 调控发育,维持内环境稳定,由基因调控的细胞程序性 死亡的过程.细胞凋亡与胃癌的发生密切相关. 胃癌细胞在侵袭和转移过程中必需破坏基底膜和 细胞外基质组成的屏障结构.癌细胞可合成及分泌多 种基质降解酶,降解细胞外基质是肿瘤细胞侵袭,转移 的重要步骤.基质金属蛋白酶类(metalloproteinase,
MMP)是一类需锌,铜等金属离子作辅基的蛋白酶,包 括I,?,?型胶原酶(间质胶原酶),IV型胶原酶及基 质溶解素.?型胶原酶能降解基底膜的?型胶原,此 外还可降解V,?,?,X胶原及纤连蛋白,弹性蛋白 等.已知?型胶原酶的2个亚型(MMP-2,MMP-9)为 不同基因所编码,均以无活性的酶原形式分泌,可被纤 溶酶,胰酶等激活,该酶降解的部位是在?型胶原分子 羧基端1/4处,它将?型胶原分解为1/4和3/4两个 片段.?型胶原是宿主天然屏障——基底膜的主要成 分,肿瘤细胞产生的MMP-2,MMP-9在肿瘤细胞突破 基底膜屏障而发生侵袭转移中起着重要作用.体内, 外侵袭实验均证实肿瘤细胞的高侵袭能力与?型胶原 酶的活性增强有关.有学者研究MMP-2蛋白表达变 化在胃癌侵袭和淋巴结转移中的作用,发现MMP-2的 过表达与胃癌的侵袭深度和淋巴结转移具有显着的相 关性.故该酶可作为预测癌细胞侵袭,转移的重要 标记.本研究结果显示,SGC7901细胞表达MMP-2较 强.用脂质体介导的MUC2ASODN转染后,可有效抑 制MUC2的表达,而MMP-2的表达亦明显减弱.表明 MUC2可上调胃癌细胞基质金属酶的合成和分泌,有
利于癌细胞的浸润和转移.组织蛋白酶D是一种广 泛分布于动物和人体组织细胞中的溶酶体天冬氨酸蛋 白酶和自分泌丝裂原.组织蛋白酶D能直接降解基 底膜和细胞外基质,并可激活组织蛋白酶B,继而激活 尿激酶型纤溶酶原激活剂,使其转变为纤溶酶….而 组织蛋白酶B和纤溶酶均参与细胞外间质水解,从而 促进肿瘤侵袭转移.另外,它还可作为促有丝分裂剂, 促进肿瘤细胞增殖.研究表明,子宫内膜癌,乳腺癌等 恶性肿瘤组织蛋白酶D表达水平与肿瘤大小,分化程 度,转移和预后密切相关,组织蛋白酶D高表达的恶 性肿瘤多生长快,分化程度差,易发生转移及预后差. 组织蛋白酶D还可通过内吞作用降解细胞外基质,释 放血管生成因子,如碱性纤维母细胞生长因子(bF. GF).bFGF能刺激新生血管形成,为肿瘤生长和转移 所必需.总之组织蛋白酶D可通过多途径影响肿瘤 的发展,故在肿瘤侵袭,转移中起重要作用Ll.组织 蛋白酶D的表达与胃癌的生长方式及胃癌组织脉管 内有无癌栓密切相关,同时它的阳性表达者5年生存 率明显低于阴性表达者.本研究结果显示, SGC7901细胞表达组织蛋白酶D较强,但用脂质体介 导的MUC2ASODN转染后,组织蛋白酶D的表达明显 减弱,即MUC2经反义核酸有效抑制其表达后,组织蛋 白酶D的表达相继减弱.因此抑制MUC2的表达.可 下调肿瘤细胞组织蛋白酶D的表达,降低肿瘤细胞的 侵袭,转移能力.由此可见,MUC2在一定程度上可上 调胃癌细胞水解酶的活性,促进其浸润和转移.以上 结果说明,MUC2可促进癌细胞产生MMP-2和组织蛋 白酶D等蛋白水解酶,破坏基底膜及细胞外间质屏 障,使癌细胞容易发生侵袭及转移,这可能是高表达
MUC2的胃患者预后最差的原因之一.
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(编辑王小寒)
越.&.
(上接493页)
裹l所有观察病例基本情况
a.-P<0.O1,与粉尘螨比较;b:P<0.O1,与屋尘比较
裹2粉尘螨阳性的哮喘儿童年龄百分率分布情况
3讨论
本资料所检测的18种变应原中,粉尘螨和屋尘(主要含屋
尘螨)阳性率最高,提示螨变应原是哮喘常见的诱发因素.
Liam等报道二者的阳性率分别达81.4%和93.6%.而我
市哮喘儿童阳性率分别为9o.45%和89.16%,居国内之首.
原因可能是由于重庆地处内陆,终年空气湿度大,气温高,适宜
螨生长.本资料多因素Logistic回归分析提示随年龄增长,螨
和蟑螂越来越成为诱发哮喘的重要诱因.虽有研究认为小年
龄出现哮喘是吸入变应原皮试阳性的独立危险因素,而与患者
现在的年龄无关J.但他们观察的对象均在l2岁以上,而我
们观察的对象80%都在2个月至l8岁之间.粉尘螨皮试阳性
的哮喘儿童年龄,人数百分率分布说明2—10岁是哮喘儿童粉
尘螨过敏的主要年龄,3—5岁是粉尘螨过敏的高发年龄.
由此可见,螨是重庆市4,JL哮喘的最重要变应原.由于
"螨无处不在",因此,哮喘患者除了应改善室内居住环境,避
免暴露于螨的环境外,对明确螨过敏者B应提倡进行以螨为主
的标准化脱敏治疗.
关键词:哮喘;变应原;螨;年龄
中图法分类号:R562.25文献标识码:B
参考文献:
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(编辑陈聪连)
1{1J.=.
范文四:6种糖基化合物对台湾乳白蚁糖基水解酶分泌的影响
do 10.3969 / j. ssn. 1674 , 0858. 2011. 01. i:i
006
6 种 糖 基 化 合 物 对 台 湾 乳 白 蚁 糖 基 水 解 酶 分 泌 的 影
响
1 1 1 1 1 2 1 *,,,,,,曾文慧刘瑞娴李志强刘炳荣李秋剑陈来泉钟俊鸿
( 1. 510260; 2. 510630),,广东省昆虫研究所广州 广东韶能集团股份有限公司韶关
1% 、: 。摘要白蚁自身及其后肠共生微生物可以 分 泌 多 种 糖 基 水 解 酶 用 于 分 解 木 质 纤 维 素本 研 究 选 用 木 质 素
1% 、1% 、1% 、1% 1% 6 ,羧甲基纤维素钠山梨糖果糖葡萄糖及 半乳糖 种糖基化合物溶液诱导台湾乳白蚁
Coptotermes formosanus ,。, ,FPA 、EG、糖基水解酶的分泌进行了酶活测定结果显示活力内切葡聚糖酶 β 葡萄
BG、CBH 1% 149%, 0. 750 U / mg) ,EX ( 糖苷酶 纤维二糖水解酶 和内切木聚糖酶 的最佳诱导物分别为 木质素
1% 126%, 1. 538 U / mg) ,1% 178%, 5. 170 U / mg) ,1% 265%, 1. 201U / mg) ,1%( ( ( 山梨糖 木质素 木质素
( 341%, 5. 146 U / mg) 。4 :6 d,9. 356 U / mg ) , B G ( 2 d,EX ( 果糖 整头 白 蚁 种 酶 的 诱 导 最 大 值 顺 序 为
3. 313U / mg) , E G ( 2 d,1. 541 U / mg) , CB H ( 6 d,1. 476 U / mg) 。,、研究表明木质素果糖和山梨糖对其
,6 。内源性糖基水解酶诱导作用明显而 种化合物对台湾乳白蚁后肠微生物来源的糖基水解基本为抑制作用
关键词: 台湾乳白蚁; 糖基水解酶; 糖基化合物; 木质纤维素
Q9661674, 0858 ( 2011) 01 , 0030, 06A:::中图分类号 文章编号 文献标识码
Induction effect of six glycosides on glycosyl hydrolase secretion of Copto -
termes formosanus
1 1 1 1 1 2 ZENG Wen-Hui,LIU Rui-Xian,LI Zhi-Qiang,LIU Bing-Rong,LI Qiu-Jian,CHEN Lai-Quan,
1 * ZHONG Jun-Hong( 1. GuangdongEn tomological Institute,Guangzhou 510260,China; 2. Guangdong Shaoneng
Group Co. ,Ltd. ,Shaoguan 51063,G0uangdong Pr ovince,China)
Abstract: Termite lignocellulose digestion is achieved through cao llaboration of vraies glycosyl
hydrolase
of hostp lus hindgut symbionts. In the stud,ywe selected 1% lignin,1% CMC-Na,1% L-sorbose,1%
D-fructose,1% glucose and 1% D-galactose,6 kinds of glycoside solutions to induce the glycosyl
hydro- induction substances fFPorA activity,endo--1,4-glucanases ( EG) ,-glucosidase( BG) ,ββ
lase secretion of Coptotermes formosanus,and performed the enzcytmiev iaty measurements. oTpheti mal cellobilo- hydrolase ( CBH)and endo--1,4-xylanohydrolaseare 1% li gnin ( 149% ,0. 750 U / mg ) ,( EX) β
1% sorbos(e 12 6% ,1. 538 U / mg ) ,1% lignin ( 178% ,5. 170 U / mg ) ,1% lignin ( 265% ,
1. 201U / mg) and 1% fructo(s 34e 1 % ,5. 146 U / mg) r espectively. The ordersi ze of enzymec tiavity
maximum values for 4 kinds of glycosyl hydrolase of whole body termite is EX ( 6 d,9. 356 U / mg) ,
BG ( 2 d,3. 313 U / mg) , E G ( 2 d,1. 541 U / mg) , CB H ( 6 d,1. 476 U / mg) . Ther esearch
revealed that lignin,D-fructose and L-sorbose appeared ai gnsificant secretory effect to the
endogenouse
glycosyl hydrolase of C. f ormosanus,but six compoundsal l played the inbibitional effect to the
glycosyl hydrolase of hindgut symbionts.
基金项目: 广东省科技厅院地合作项目 ( 092009B09130014) 7 ; 广东省科学院优秀青年科技人才基金 Key words: Coptotermes formosanus; glycosyl hydrolase; glycoside; lignocelluloses
: 1984 ,,,E ,m a: a6309s2003@ yahoo. comc.n ,,ili作者简介曾文慧女年生硕士研究方向为微生物学
* Author for corresponde,ncEe ,m ail: zhong@ dgei. gd. cn通讯作者
2010-08-16;2010-10-09收稿时间 Received:Accepted:接受时间
lignocellulos( 木质纤维素是植物细胞壁的
e) Ohkum,a2003) ,( 主要组成成分 是一类由纤维素1 材料与方法
( cellulose) 、( hemicellulose 等 多 聚 糖半 纤 维
)素 1. 1 ( lignin实验材料以及无定形态聚合物木质素结合在一起
) ( Arakawa eatl . ,2009) , 1. 1. 1 形成的混合物 是地球上实验白蚁
。 , 含量最丰富的可再生资源 供试虫源 采 自 广 州 龙 洞 的 白 蚁 诱 捕 箱带 回
, ( gly-实验室饲 养挑 取 活 力 较 好 的 台 湾 乳 白 蚁 工 蚁 进纤维素和半纤维素酶均属于糖基水解酶
。 cosyl hydrolase)行试验。 蛋白 家 族低 等 白 蚁 的 木 质 纤 维
1. 1. 2 : 素水解酶 系 统 包 含 三 种 不 同 类 型 的 纤 维 素 酶外 实验试剂
ignin,( L( cellobilo, : 切 葡 聚 糖 酶包 括 纤 维 二 糖 水 解 酶 本实 验 选 用 的 诱 导 试 剂木 质 素
- low sulfonatecontent, Sigma ) , hydrolase,1,4 , ,D ,g lucan 羧 甲 基 纤 维 素 钠β cellobiohydrolase, CBH)和 外 葡 萄 糖 水 解 酶( exoglucohydrolase,( CMC ,N a,) , L , 天 津 福 晨 化 学 试 剂 厂 山 梨 糖 1,4 , ,D ,g lucan exoglucohydrolase) 2 ,β 种成份,s orbose,Genview) ,D , ,F ructose,( L ( D 果 糖
( endo, ,1 ,4 ,g lucanases,EG,Genview) ,( Glucose,) ,内切葡聚糖酶 β 葡 萄 糖 广 州 化 学 试 剂 厂 EC3. 2. 1.4 ), , , ,G alactose,Genview) ;( D ( D 其 它 化 学葡 萄 糖 苷 酶 β 半 乳 糖以 及 β
glucosi- dase,BG,EC3. 2. 1.2 1)et al. ,2010) 。,: ( ) ,D , ,( Li ( D 同时试剂滤纸 双 圈 定 性 滤 纸水 杨 苷
( endo , ,1 ,4 ,D ,x ylan,xyla-Salicin,) ,, 8 内切木聚糖 酶 β 上海晶纯试剂有限公司对硝基苯
, nohydrolase,EX,EC3. 2. 1.8 )y-( XD , ,N PC,Sigma) ,( p 是 低 等 白 蚁 重 要 的纤维二糖苷 木聚糖
( Li and Su,n2001) 。lan fromBirchwood,Sigma ) , D , , X y-( D 木 糖一类半纤维素水解酶
,N P,Genview) ,( p lose,Genview) ,研究发现 低 等 白 蚁 拥 有 两 个 纤 维 素 水 解 酶 系对硝基苯酚
( Foregut ) /SalivaryBSA,Albumin,Fraction V,( V( : 牛清 血 蛋 白 组 分 统一 个 在 前 肠 唾 液 腺
gland) +Midgut) ,;Genview) ,3, 5, DNS, Gen-( ( 为 内 源 性 水 解 酶 系 统二 硝 基 水 杨 酸中肠
view) ,G ,250 ( Hindgut) ,考 马 斯 亮 蓝 Coomassie ( 另一个在后肠 为后肠共生微生物水解
brilliant blue G , 250,Genview) 。( Nakashima et al. , 2002; Zhou eat l . ,酶 系 统
2007) 。,,1. 2 但是至今为止低等白蚁的两个纤维素实验方法
1. 2. 1 。 乳白蚁诱导培养酶 水 解 系 统 的 调 控 机 制 还 未 有 相 关 的 研 究 报 道
, , 相较而言在 丝 状 真 菌 中 已 经 发 现 了 木 聚 糖 酶 和采用蛭石 作 为 保 湿 材 料用 灭 菌 蒸 馏 水 湿 润
Xyrl、ACEI10 cm ,的培养皿中每个培养皿后均匀铺到直径为 纤维素酶启 动 子 结 合 型 转 录 调 控 因 子
X1nR ing et al. ,2009; 150 6 ( L,。等及转录激活因子 放入 头供试乳白蚁工蚁加盖培养将 种诱
Stric- ker eat l. ,2008;Saloheimo et al. ,2000 ) 。1%W / V)( , 研究发导试剂分别 配 成 浓 度 溶 液各 取 约
300 L , ,( sopho-μ湿 润 滤 纸再 放 入 加 有 白 蚁 的 培 养 皿 中现真菌 木 质 纤 维 素 酶 可 以 通 过 添 加 槐 糖
。28? rose) 、 ( cellobiose 及 乳 糖( lactose 共六组将装 有 白 蚁 的 培 养 皿 放 入 恒 温 培 养纤 维 二 糖
)) ( ,WMK ,02 ) ,箱 南京实 验 仪 器 厂型每 天 添 加等寡聚糖至 培 养 基 中 作 为 调 节 因 子 来 调 节 其 分 泌 ( Morikawa et al. ,1995) 。。 一次诱导 试 剂 保 持 湿 润 状 态在 乳 白 蚁 接 触 到 含量
4 h、8 h、24h 、本实验通 过 借 鉴 真 菌 纤 维 素 酶 和 半 纤 维 素 酶有各种诱导试剂 的 滤 纸 开 始 后 的
2 d、3 d、4 d、d6 9 d 。,和 取样将乳白蚁肠道解分泌的调 节 因 子利 用 各 种 糖 基 化 合 物 活 体 诱 导
/ + 。Coptotermes formosanus,剖成乳白蚁的前肠 唾液腺 中肠及后肠两部份台湾乳白蚁 研究它们对台
/ + 4 。前肠 唾液腺 中肠部分用于检测白蚁内源性糖基湾乳白蚁 种 糖 基 水 解 酶 分 泌 的 影 响通 过 测 定 EG、BG 3 1 , CBH EX 和 种纤维素酶及 种半纤维素 酶水解酶活 性 变 化后 肠 部 分 用 于 检 测 白 蚁 共 生 微
,,。生物来源 糖 基 水 解 酶 活 性 变 化整 头 白 蚁 酶 活 力 活力来 检 测 诱 导 效 果这 些 研 究 将 给 白 蚁 木
,。 质纤维素 酶 系 的 调 控 机 制提 供 重 要 的 实 验 数 据 测定用 作 指 示 各 种 酶 活 性 大 小 之 间 的 比 例 变 化
, 。以接触诱 导 物 之 前 的 同 批 次 乳 白 蚁 作 为 参 照参 和理论依据
。100%照活性设定为
1. 2. 2 1. 2. 6 ( CBH)粗酶制备纤维二糖水解酶活力测定
1. 5 mL 120 1 mmol pNPCL 15 离心管仲加入 μ在 每次取样选取各组中活力好的乳白蚁约 头
0. 9%W / V ),5 min,12 L,37? ( ,置于 底物预热 然后加入酶液 μ准灭 菌 生 理 盐 水 中 反 复 漂 洗
,60 min,120 NaCO( 0. 6mol / L )L 之后用滤 纸 吸 干 表 面 水 分放 入 已 灭 菌 的 干 净 培 加入 μ确反应 2 3
。, 养皿中在 实 体 解 剖 镜 下 将 白 蚁 肠 道 解 剖分 成 405 nm OD,p ,,,溶液终止反应比色测定 从 405
/ + 5 ,NP p ,N P ,。前肠 唾液腺 中肠和后肠两部分与 头未解剖 标准曲线 求 得 含 量计 算 酶 活 力 单 位
3 500 ,CBH 37? ,pHL HAC U : 的乳白蚁共分成 组分别放入装有 μ 酶活力 定义为每毫克蛋白质在
= 5. 6 pNPC, pSAB,0. 1 M,pH5. 6)( NaAC 反应 条 件 下 分 解 每 分 钟 可 以 产 生 的离心管中缓冲液
,N P ,U / mg。 , ; 的 量表 示 为 每 个 酶 切 反 应 重 复再转移至 玻 璃 组 织 匀 浆 器冰 浴 研 磨研 磨 完 毕
500L,3 。将 匀 浆 液 吸 至 离 心 管 后 定 容 至μ次
12000 rmp,4? ( Sigma,3K15 ) 15 min,冷冻离心
12000 rmp,4? 5 min,,取上清再次 冷冻离心 取2 结果与分析
, 20? 。上清即为粗酶液于 保存待用
1. 2. 3 2. 1 蛋白质浓度的测定不同糖基化合物对台湾乳白蚁内源性以及共
。生微生物来源的糖基水解酶分泌量的影响采用考马斯亮蓝法进行测定将粗酶液按一定
,50 L ,选取用于对台湾乳白蚁进行活体诱导 的 化 合的比 例 进 行 稀 释取 μ稀 释 后 粗 酶 液加 入
2 ,: 350 , 250 L G ,μ考马斯亮蓝 显色试剂多功能酶标物分为 类第 一 类 为 大 分 子 聚 合 物木 质 素 和
PerkinElmer,1420 ,01 2 victor3) ,( 595 nm ,: ,,仪 比 色 羧甲基纤维素钠第二类为单糖山梨糖果糖
2 。, OD,。葡萄糖酶活 力 测 定 结 果 表 明这 类 物 质 对 乳测定 用蛋白质标准曲线求蛋白质含量 595
1. 2. 4 , , 1,4 , , ,白蚁后肠共 生 微 生 物 来 源 的 糖 基 水 解 酶 的 分 泌 与内切 β 葡聚糖酶β 葡萄糖苷
, , 1,4 , 。 酶及内切 β 木聚糖酶活力的测定它们对内 源 性 糖 基 水 解 酶 的 分 泌 作 用 相 反后 肠
, ,1 ,4 , , ( EG) ,6 G, BG, CBH,: E内切 β 葡 聚 糖 酶 β 葡 萄部分种 化 合 物 对 乳 白 蚁 后 肠
4 EX 糖苷 酶( BG ), ,1 ,4 , 种酶在整个实验时间内起到的基本为抑制分 以 及 内 切 β 木 聚 糖 酶 ( EX), MilleMiller( , 泌的作用其 中 对 后 肠 抑 制 作 用 最 大 的 物 质 为 果方 法活 力 的 测 定参 照
r, 1959) ,。1. 5 mL 1% , 4 h,135% ,( 均采用 还 原 糖 法 测 定在 离 心 管糖 及 山 梨 糖只 有 半 乳 糖
0. 540U / mg) 1( ,120 1%CMC ,N a,Salicin,Xy-对滤纸分解有微弱的促进作用 图 L 中分别加入 μ lan,5 min,12 L,37? 预热 然后加入酶液 μ准确f :j ) 。/ + : 前肠 唾液腺 中肠部分一方面山梨糖
6day,126%, 1. 538 U / mg )( 60 min,120 DNS L ,EG和反应 立刻加入 μ溶液终止反应果 糖 分 别 是 为
5 min, 540 nm, 6day,341%, 5. 146U / mg ),EX ( 沸水 浴 冰 浴 冷 却比 色测 定与 的 最 佳 诱 导
OD。EG BG 6day,147% ,4. 282 U / mg),BG( 和 从葡萄糖标准曲线求得葡萄糖含物同时山梨糖对 540
,; XE EX ( 6day,258%, 3. 892 U / mg) ,CBH量计算酶活力单位用木糖标准曲线求木糖和 果糖对
,。EG,BG, EX U含量计 算 酶 活 力 单 位酶 活 力 ( 6day,249% ,1. 128 U / mg)也 有 较 好 的 诱 导 效
,37? ,pH = 5. 6 定义为每毫 克 蛋 白 质 在 反 应 条。果另一方 面 半 乳 糖 和 葡 萄 糖 对 内 源 性 糖 基 水 解
,, ,件下分解 底 物每 分 钟 可 以 产 生 还 原 糖 的 量表酶促进作 用 不 明 显且 在 大 部 分 时 间 点 对 其 分 泌
。U / mg。3 。有抑制作 用实 验 结 果 还 表 明 大 分 子 物 质 木 质 素 示为 每个酶切反应重复 次
1. 2. 5 FPA 4 。滤纸酶活测定对 种内 源 性 水 解 酶 平 均 促 进 作 用 最 大它 不 仅
, 为FPA ( 6 da,y 149% , 0. 750 U / mg ) , BG采用还原 糖 法 测 定用 打 孔 器 将 滤 纸 制 作 成
5 mm 1 ,( 6day, 178% , 5. 170 U / mg )CBH ( 6 day,直径为 的滤纸片每个离心管中放入 份滤 及
,120 SAB 5. 6)265% ,1. 201 U / mg)L ( pH , EG纸片再加入 μ缓冲液将其的 最 佳 诱 导 物其 次 对
mn,i。12 L,37? 60 6day,122%, 1. 486 U / mg)6day,232%, ( EX ( 浸润加 入 酶 液 μ准 确 反 应 和
120 LDNS53. 505 U / mg),。然后加 入 μ溶 液 终 止 反 应沸 水 浴 都具有相对好的诱导效果五种酶活测
,CBH EX min,,540 nm OD。,定指标比较和 的分泌对各种糖基化合物作冰浴冷却后比色测定 葡萄 540
,8 。糖标准曲 线 求 得 葡 萄 糖 含 量酶 活 力 单 位 计 算 同 个取样点内各种酶活力在用最为敏感且增幅最大 1. 2.4 。3 。4 6 1 a: e) 。( 每个酶切反应重复 次 小时和第 天有高峰促进作用图
1 图 台湾乳白蚁肠道不同部位糖基水解酶活性化学诱导曲线
Fig. 1 Graphs focrh emical induced activity variations of glysosyl hydrolase in different parts ofC , formosanus
intestine
2 d,1. 541 U / mg) , CB H ( 6 d,1. 476 U / mg) 。( 2. 2 、糖基化合物对台湾乳白蚁纤维素酶半纤维
1% 1% CMC 1%,素酶之间活性大小比例的影响分泌量 有 所 提 高 的 木 质 素和
4 h ( ) 、3 d ( 4 酶 活 高 点酶 活 山梨 糖 样 品 其 整 头 白 蚁 种 酶 活 力 的 低 点 和 高 点选取 诱 导 后 ) 、6 d ( ) 、9 d ( ) , EX:低 点酶 活 高 点酶 活 低 点的 的酶活大 小 比 例 均 与 对 照 白 蚁 基 本 一 致即
,4 BG + EG + CBH), ( 2? 整 头 乳白蚁为 样 品测 定 种 水 解 酶 活 性 大 小约为
1。 。以 未 接触诱导 物 的 同 批 台 湾 乳 白 蚁 作 对 照对 整
( 2) ,EX 头 白 蚁的酶活测定表明 图 的活力明显高3 结论与讨论
3 ,。于其 它 种是总酶活大小变化的主要影响因素
4 T. reesei ,T. reesei 种 6 d,在 的纤维素调控机制中EX ( 酶活 力 诱 导 最 大 值 的 大 小 顺 序 为
的 9. 356U / mg) , B G ( 2 d,3. 313 U / mg ), EG
生长营养条 件 能 够 显 著 影 响 其 纤 维 素 和 半 纤 维 素
2 图 台湾乳白蚁糖基水解酶肠道活性比例分布变化化学诱导曲线
Fig. 2 Graphs fcohre mical induced proportion variations of intestinal glysosyl hydrolase activities of
C, formosanus
ing et al. ,2009) ,( L因此同,导糖基水解酶的分泌 酶的产量碳 水 化 合 物 及 他 们 的 衍 生 物 可 以 作 为
理山梨糖的 差 像 异 构 体 果 糖 也 很 可 能 可 以 产 生 ing et诱导物 质 促 进 其 大 部 分 纤 维 素 酶 的 分 泌( L
诱 al. ,2009) 。根据碳水化合物在细胞代谢中的一些 。导作用山 梨 糖 和 果 糖 对 乳 白 蚁 糖 基 水 解 酶 的 分 ,共同中间 产 物本 研 究 选 取 用 于 对 台 湾 乳 白 蚁 进
,泌表现出 的 诱 导 作 用可 以 则 猜 测 为 其 可 能 拥 有 : ( 行活体诱 导 的 化 合 物 包 括代 谢 起 始 物 质 大 分
T. reesei 类似于 中控制纤维素酶和半纤维素酶的启 ) ; 子聚合物木 质 素 和 羧 甲 基 纤 维 素 钠代 谢 下 游
,动子这些 启 动 子 的 上 下 游 序 列 中 存 在 山 梨 糖 等 ( ) 、 、 。产物 单 糖 山 梨 糖果 糖葡 萄 糖 和 半 乳 糖 。4 物质的激 活 位 点但 是 山 梨 糖 和 果 糖 对 于 后 肠 实验结果表 明 这 些 糖 基 化 合 物 对 乳 白 蚁 不 用 来 源种糖基水解 酶 的 强 烈 抑 制 作 用 机 理 还 需 要 进 一 步 。 的纤维素酶的分泌起着大相径庭的作用。的研究 6 4 ,在 种化合物的影响下乳白蚁后肠 种酶的
5 木质素对乳 白 蚁 内 源 性 糖 基 水 解 酶 种 酶 活 8 , 分泌在 个 取 样 点 大 部 分 为 抑 制 状 态山 梨 糖 和
。力指标的 平 均 促 进 作 用 最 大木 质 素 是 一 种 高 度 ,FPA 果糖的抑制作 用 最 为 明 显只 有 半 乳 糖 对 活
, 。分支的由 多 种 芳 香 族 羧 酸 组 成 的 高 分 子 物 质性力有微弱的促进作用而对于乳白蚁内源性糖基水
( Xie et al. ,2000 ) 。,、解酶木质 素山 梨 糖 和 果 糖 对 酶 的 分 泌 起 到 了 质稳定降解缓慢 木质素通常
在细菌或真 菌 的 氧 化 酶 作 用 下 转 变 为 芳 环 自 由 。 正向的诱导作用
基 4 种单糖中山梨糖和果糖互为差向异构体均为 Sewalt et ( 以为 木 质 素 的 降 解 提 供 还 原 力 , 和醌类才 能 进 一 步 分 解而 纤 维 素 的 降 解 产 物 可,、己酮糖它 们 与 己 醛 糖 葡 萄 糖半 乳 糖 对 后 肠 的 al. , 1996) 。、虽然木质素代谢与乳白蚁纤维素半纤维 / + 。作用与其对前肠 唾液腺 中肠的作用相反丝状 ,Tartar 素酶分泌之间的关系目前未见报道但是 等
,真菌中葡 萄 糖 作 为 降 解 物可 以 对 纤 维 素 酶 分 泌 ( 2009)Retcutermes favpesilili 研究 表 明 黄 胸 散 白 蚁
, 的造成反 馈 抑 制但 是 当 葡 萄 糖 耗 尽 之 后 纤 维 素, 的酚氧化 酶 几 乎 全 部 来 源 于 前 肠 和 唾 液 腺而 且 ( Ilmen et al. ,1997 ) 。则可以正常 的 表 达 在 本 实 。喂食木质 素 可 以 提 高 酚 氧 化 酶 的 活 性结 合 本 研
,验中葡萄糖对乳白蚁木质纤维素分泌的抑制作用 ,, 究结果木 质 素 的 作 用 机 制 可 能 为由 木 质 素 作
, 很可能也 是 由 于 代 谢 物 的 反 馈 抑 制 作 用半 乳 糖 , 为一种间 接 促 进 酚 氧 化 酶 分 泌 的 化 学 信 号刺 激
。 作 为 葡 萄 糖 的 差 向 异 构 体 而 产 生 了 类 似 的 作 用,糖基水解 酶 分 泌 用 来 降 解 纤 维 素从 而 产 生 各 种 T. reesei 山梨糖在 中已经被证明可以通过启动子诱 代谢物质来 直 接 诱 导 分 解 木 质 素 的 酚 氧 化 酶 的 生
103 , 106,版) ,27 ( 1) : ,。产即相当于提高了糖基水解酶的分泌量 Li XH,Yang HJ,Ro B,Park EY,Jiang LJ,Wang D,Miao YG,2010. CBH EX 实验结果显 示 乳 白 蚁 和 的 分 泌 对 各 Enhanced cellulase production of theT richoderma viride mutatedb y , BG, EG 种糖基化 合 物 作 用 最 为 敏 感其 次 为 以 microwave and ultraviolet. Microbiol. Res. ,165: 190 , 198. ,EG 。最不敏感且后肠 抑制最为强烈所测定的乳 Ling M,Qin YLN,Liang Z,2009. Binding of two rtanscriptional fac- 4 ,EX 白蚁 种糖基水解酶中的活力明显高于其它 tors,Xyr1 and ACEI,in the promoter reg ion of cellulase
cbh1 4 EX, BG , EG ,,三种种 酶 的 大 小 顺 序 为 gene. B iotechnol. Let.t ,227 , 231. CBH。,CBH 到目前为止乳 白 蚁 的 基 因 只 在 后 肠 Miller GL,1959. Use of idnitrosalicylic acid reagent for ,的共生鞭 毛 虫 中 发 现而 本 实 验 中 乳 白 蚁 内 源 性 determination of CBH ,活性在接 触 诱 导 物 后 出 现 了 大 量 的 提 高因 reducing sugar. A nal Chem. ,3: 426 , 428.
Morikawa Y,Ohashi T,Mantani O,1995. Cellulase induction by lacto-此推测 乳 白 蚁 是 有 可 能 存 在 自 身 基 因 组 编 码
sein Trichoderma reesei PC , 37. Appl. Microbiol. Biotechnol. ,的
106 CBH 。基因木质 素 和 半 纤 维 素 可 以 形 成 致 密 的 网 , 111. ,, 络结构包 围 和 加 固 纤 维 素 与 半 纤 维 素 骨 架将 Nakashima K,Watanabe H,Saitoh H,Tokuda G,Azuma JI,2002. ( Yu,2008 ) , 纤维 素 成 份 紧 密 的 包 埋 起 来 所 以 Dual cellulose , d igesting system of the woo,d f eeding EX 。EX 的大量 分 泌 是 木 制 纤 维 素 代 谢 的 基 础当 termite, ,分泌大量 增 加 时从 木 质 纤 维 素 中 释 放 出 大 量 纤 Coptotermes formosanus Shiraki. nsect Biochem. Mol. Biol. ,I
,CBH 32:维素纤维素的结晶部份需要经过 的作用才
777 , 784. EG BG ,能继续被 和 分解这是其中一种可能的解
Ohkuma M,2003. Termite symbiotic system:s efficient bio ,r ecycling of 。EX CBH 释因此 的 分 泌 量 的 增 大 伴 随 着 分 泌 量 lignocellulose. Appl. Microbiol. Biotechnol, ,61: 1 , 9. ,BG EG 的相应提高而 和 则 由于处于代谢产物反 Saloheimo A,Aro N,Ilmen M,Penttila M,2000. Isolation of the cae1 馈调节中更 加 下 游 的 位 置 使 得 其 诱 导 不 明 显 或 出 gene necoding a Cys ( 2) ,H is ( 2 ) transcription factor 。T. reesei cbh1 现抑制作用同 时 在 对 启 动 子 的 研 involved cbh1 ,究中发现启 动 子 上 游 区 域 存 在 葡 萄 糖 抑 制 in regulation of activity of thec ellulase promoter cbh1 of ,位点可以 在 槐 糖 山 梨 糖 醇 的 培 养 基 中 强 烈 诱 导 Trichoder- cbh1 Takashima et al. ,1996; Ilmen et al. ,( 基 因 ma reesei. J. Biol. Chem. ,275: 5817 , 5825.
Sewalt VJH,Glasser WG,Fontenot JP,Allen VG,1996. Lignin impact1996) 。CBH 在本 实 验 中 葡 萄 糖 和 山 梨 糖 对 也 出 on fibre degradation. 1. Quinone methide intermediates formedf rom ,现了相应 的 抑 制 和 诱 导 作 用那 么 乳 白 蚁 中 是 否 lignin during in vitro fermentation of corn stoverJ. ou rnal of the cbh1 存在类似与 基因的调节机制还需要大量的基 Sci- 。础研究工作 ence oFf ood andA griculture,71: 195 , 203. 8 ,此外个取样时间点内各种酶活力均没有呈 Stricker AR,Mach RL,de Graaff LH,2008. Regulation of transcription ,4 h 6 d 现规律性的变化只在 和 两个取样点有高 of cellulases and hemicellulases ,e ncoding genesin Aspergillus
。,niger峰促进作 用有 研 究 表 明真 菌 纤 维 素 酶 的 诱 导
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范文五:【doc】蛋白质和磷酸水解酶在废水处理系统中的活性和作用
蛋白质和磷酸水解酶在废水处理系统中的
活性和作用
应用与环境生物2008,14):514-517
ChinJApplEnvironBiol=ISSN1006—687X
2008—08—25
DOI:10.3724/SP.J.1145.2008.00514 蛋白质和磷酸水解酶在废水处理系统中的活性和作用术
李茵罗翠沈国
陈华大学环境科学与工程学院上海201620)
摘要通过分析亮氨酸氨基肽酶和碱性磷酸酶,研究了厌氧一缺氧一好氧废水处理系统中蛋白质和磷酸水解酶的
活性及其作用.结果表明,亮氨酸氨基肽酶在缺氧和好氧池中的活性分别达19.2molL.h-和21.6molL.h-;而碱
性磷酸酶在厌氧池中占主导地位,平均活性达32.5molLh-,好氧池中的活性只有厌氧池的一半,缺氧池中的酶活
性最小.动力学研究得到,厌氧条件碱性磷酸酶的最大反应速度v…),'7778.42toolLh,,是亮氨酸氨基肽酶.值的
一
百倍以上;亮氨酸氨基肽酶V,值在厌氧,缺氧,好氧池中依次增大.此外,外加的N0,一,离子对亮氨酸氨基肽
酶和P0一离子对碱性磷酸酶的活m性均有不同程度的促进作用,只有浓度为对 N
碱
O3
性
-
50mg/Ll~jPO43-磷酸酶有显着的抑
制.图4表2参17;
关键词亮氨酸氨基肽酶;碱性磷酸酶;酶活性;厌氧一缺氧一好氧;废水处理
TX703
ActivitiesandActionsofProteinandPolyphosphateHydrolyticEnzymes inWastewaterTreatment
LIYin.LUOCui&SHENGuo
fCollegeofEnvironmentalScience&Engineering,DonghuaUniversity,Shanghai201620,China)
AbstractActivitiesandactionsofproteinandpolyphosphatehydrolyticenzymesinananaerobic——anoxic—-aerobicwastewater
treatmentsystemwereinvestigatedbyanalysesofleucine—aminopeptidase(L—
AMP)andalkalinephosphatase(APA).The
resultsshowedthattheL—
AMPactivitiesintheanoxicandaerobicreactorsreached19.2LLtoolL一h,
and21.6LLmolL一h-
respectively.TheAPAdisplayedpredominantactivity(32.5molL.h)intheanaerobicreactor.Theactivityintheaerobic
reactoronlyaccountedforhalfofthatintheanaerobicreactorandthatinanoxicreactorwasthelowest.Kineticstudyshowed
thatthemaximumreactionvelocityfv)ofAPAintheanaerobicreactorwas778.42LLmolLh,,whichwasoverone
hundredtimeshigherthanthatofL—AMPTheVofL—
AMPincreasedinorderoftheanaerobic.anoxicandaerobicreactors.
InadditiontheaddedNO一,NO一andPO.3-ionscouldstimulatetheactivitiesofL—
AMPandAPAtodifferentextent,except
thatonly50mg/LPO一hadobviousinhibitioneffectonAPAactivity.Fig4,b2,Ref17 Keywordsleucine--aminopeptidase;alkalinephosphatase;enzymaticactivity;anaerobic—-anoxic—-aerobicprocess;wastewater
treatment
CICX703
脱氮除磷是目前城市污水处理中一个非常关键的工艺 环节,也是控制水体富营养化的有效手段和途径[1-3].废水中 的大分子蛋白质,含氮有机物及有机磷等只有被微生物酶水 解成小分子后才能被细胞吸收[4_,而最初的水解反应是整 个有机物降解过程的限速步骤[6_.因此,研究蛋白质和磷酸 水解酶的活性及其作用,对深入探讨含氮含磷有机物的降解 机理,提高脱氮除磷效率有着重要的理论意义.
本文选取亮氨酸氨基肽酶和碱性磷酸酶作为专性蛋白 质和磷酸水解酶进行了分析.亮氨酸氨基肽酶主要涉及大量 缩氨酸和氨基酸等氨基化合物的水解;碱性磷酸酶参与了一 系列磷酸酯的水解和多聚磷酸盐的降解10].在厌氧,缺氧一 收稿日期:2007—06—12接受日期:2007—10—10 上海市自然科学基金(06ZR14002)和上海市重点学科建设项目 (B604)SupportedbytheNaturalScienceFoundationofShanghai,China
(06ZR14002)andtheShanghaiLeadingAcademicDisciplineProject(B604)
通讯作者Correspondingauthor(E—mail:yinli@dhu.educn)
好氧废水处理系统中对上述待测酶的活性大小,反应动力学 以及亚硝态氮,硝态氮和磷酸盐浓度对待测酶活性的影响等 进行了研究.
1试验部分
1.1试验装置及试验废水
试验装置由厌氧池,缺氧池和好氧池组成,体积分别为 27L,27L和17L.好氧池后接一个5L的沉淀池.试验工艺流 程见图1所示.
试验废水采用模拟城市污水,进水COD控制在700mg/ L左右,C:N:P=100:7:2.废水中总碳由葡聚糖(聚合度<4 X10)和葡萄糖提供,质量浓度分别为300mg/L和325mg/L. 总氮由蛋白胨和尿素提供,质量浓度分别为175mg/L和75 mg/L.总磷由磷酸二氢钾提供,质量浓度为75mg/L.
接种污泥取自上海松东水环境净化有限公司的二沉
4期李茵等:蛋白质和磷酸水解酶在废水处理系统中的活性和作用515 混合液
Mixed1iauids
硝化液
Ni仃ified1iquids
图1试验工艺流程
Fig.1Flowsheetofexperimentalprocess
池剩余污泥.厌氧池,缺氧池和好氧池采取分别驯化,污泥 接种量分别为12L,12L和6L.-9I化期间,厌氧池和缺氧池 COD从300mg/L]~渐提高~1]700mg/L,好氧池COD从100mg/ L提高到3o0mg/L.当各反应池生物相丰富,COD去除率稳定 达80%以后再连续贯通.此时,厌氧池,缺氧池和好氧池的容 积负荷分别达到0.89g/m./d,0.20g/m./d,0.16g/m./d;各池中 的水力停留时间分别为16h,16h和10h.好氧池中的溶解氧控 制在3,4mg/L.在整个反应系统运行稳定后,取各反应池的 活性污泥进行酶活性的测定.
1.2酶活性的测定
亮氨酸氨基肽酶是以一亮氨酰对硝基苯胺为酶作用物, 配制成初始浓度为50IXmol/L的工作液,取其0.5mL与2.5mL 试验样品充分混合后,在25?避光条件下培养一定时间(厌 氧池,缺氧池和好氧池样品的培养时间分别为8h,2h和3h1. 用3mL0.1mol/L的NaOH中止反应,4000r/minT离心30min 后取上清液,其反应产物对硝基苯胺可进行分光光度的比色 定量.
碱性磷酸酶的作用物为对硝基苯磷酸酯,厌氧池,缺氧 池和好氧池样品的培养时间分别为1h,6h和2h.酶活性的 测定方法和反应产物同亮氨酸氨基肽酶
对照样品的培养时间为零,先加人中止液,4000r/minT 离I)30min取上清液,再加酶作用物后立即测试_空白样品采 用无菌去离子水每个样品做3个平行取平均值. 酶活性(EA)大小用待测样品的活性减去对照样品的活 性后除以培养时间计算求得(EA/IXmolLh1. 2结果与讨论
2.1待测酶活性
系统正常运行时,厌氧,缺氧,好氧各阶段的处理水质 稳定,COD的去除率分别为76.8%,19.8%和63.2%,总COD去 除率达952%.总氮,总磷的去除率分别达81.5%和65.8%. 亮氨酸氨基肽酶在厌氧,缺氧和好氧池中的活性大小 变化较大(图2一A).缺氧池和好氧池中酶的活性大小分别为 2.5-47.5molL和4.9~79.9molLh.两池中平均蛋白
质水解酶大小较为接近,分别为19.2p~toolLl1_和21.6mol L.h-.厌氧池中的酶活性较小,平均只有3.7molL.h一.同时 测得厌氧池中总氮的去除率仅为23.2%,为各池中最低.亮氨 酸氨基肽酶在不同反应池中的活性大小分布反映了各池在降 解含氮有机物中的作用.在传统A<O~2艺中,硝化作用主要在 剩余污泥
Wastesludge
好氧池内进行,而反硝化过程则主要发生在厌氧池和缺氧池 中[11]_由于本试验的硝化液是回流至缺氧池而非厌氧池,因 此,反硝化作用主要由缺氧池担当.试验得到亮氨酸氨基肽 酶在缺氧和好氧池达到较高活性,与该蛋白质水解酶在系统 含氮有机物降解中所起的作用大小相一致.试验得到两池中 总氮的去除率分别为47.4%和33.5%,均高于厌氧池中的总氮 去除率,这一试验结果验证了各池中待测蛋白质水解酶的活 性大小确实与含氮有机物的去除密切相关.
碱性磷酸酶在废水处理系统中的活性分布见图2-B.
厌氧池中碱性磷酸酶的活性占主导地位,平均活性达32.5 molLh一.好氧池中的活性只有厌氧池的一半.缺氧池中的 酶活性最小,其平均活性仅为3.7molLh一.国内外研究发 现,厌氧和好氧条件有利于提高聚磷菌的活性从而增加除 磷效果[12].在厌氧条件下,聚磷菌可从降解多聚磷酸盐中获 取能量用于吸收可溶性有机物.吸收的物质随即以多羟基链 60.O
50.0
1O.O
O.O
寸.rJ卜O0
t/d
S
t/d
图2各反应池中的酶活性
Fig.2Enzymaticactivitiesineachreactor
OOOOOOOOO跚?如?如加m0
『-
,I_【0g/(《/)._【0g\(v,)
516应用与环境生物ChinJApplEnvironBiol14卷 烷酸盐的形式储存在细胞内,在好氧条件下被细胞吸收和利 用.在这一系列过程中,厌氧条件水解磷酸酯,降解多聚磷 酸盐是极为关键的一步.本试验中,碱性磷酸酶在厌氧池中 的平均活性比好氧池中的活性高一倍,比缺氧池中的平均活 性近乎高l0倍,这一试验结果充分证实了专性胞外磷酸酶在 整个系统含磷物质的去除及含磷物质循环中的作用和贡献. 厌氧池和好氧池中总磷的去除率分别为49.6%和29.2%,远大 于缺氧池中2.1%的总磷去除率,正好对应于各池中碱性磷酸
酶的活性大小分布.据此可推测,待测酶是优势胞外酶,在降 解相应有机物中起到了关键性作用.
2.2待测酶反应动力学
待测酶水解基质的反应动力学满足米氏方程尽管在 废水处理系统中,活性污泥絮团含有混杂的微生物基团,但 是各种微生物分泌的胞外酶具有严格的专,性.各专性胞外 酶是以单键的形式与各自的专性基质结合,其它酶的水解产 物或中间产物并不能作为其底物_l4J_
本试验中各待测酶的底物浓度[s]设为10-250mol/ L_测得不同底物浓度下的酶活性,采用非线性回归分析计算 得到待测酶在各反应池中的动力学参数及相关系数),见 表1,得到的动力学双曲线如图3.
14
12
—
10
8
6
4
2
0
050100150200250
[S]/lO.molL.
图3缺氧池中碱性磷酸酶作用的动力学关系曲线 Fig.3KineticrelationcurveofAPAactionintheanoxicreactor
从表l中可以发现,两待测酶的v…
和,
值均较大.厌氧
条件下碱性磷酸酶的v…值最大,是亮氨酸氨基肽酶v…值的
一
百倍以上,表明厌氧池中单位时间内微生物降解多聚磷酸 盐的量远远超过蛋白质分子.对于亮氨酸氨基肽酶,v…值从 厌氧,缺氧,好氧池是依次上升,表明随着废水处理流程, 各反应池中总蛋白质水解酶的活性是逐渐增大的. 值的大小体现了酶与基质的亲和力.值越大,说明 待测酶与合成酶基质的结合力越小,或/和活性污泥样品中 存在较高的底物浓度.相对于v,待测酶较大的值表明加 入的合成酶基质与活性污泥中现成的基质两者对酶的活性 中心存在着竞争抑制.
表2NO2-~DNO3-离子对亮氨酸氨基肽酶活性的影响 Table2EffectsofNOrandNO3.ionsOilL—AMPactivities 2.3亚硝态氮,硝态氮和磷酸盐浓度对待测酶活性 的影响
就生物脱氮而言,好氧硝化过程中氨氮被氧化成亚硝 态氮和硝态氮,缺氧反硝化过程则由亚硝态氮和硝态氮还原 成氨氮.因此,亚硝态氮和硝态氮是两个过程中共有的,其 浓度大小必然对其作用过程产生影响.本试验两者浓度设在 0-200mg/L之间,酶作用物浓度为50mol/L,结果见表2. 从试验结果可以看到,无论在缺氧池还是好氧池,亮氨 酸氨基肽酶的活性随NO[和N0一浓度的增加而有不同程度 的增加.分析原因可能是因为N0,一和N0.一离子使活性污泥得 到部分增溶,释放出更多的胞外水解酶ll5,;另一方面,外加 的N0,一和N0一离子可以改变活性污泥絮体表面的离子分布, 破坏污泥絮体结构的完整性,暴露出更多的基质,从而提高 了微生物酶的活性.国外学者在研究硫酸盐,亚硫酸盐及硫 化物对含硫矿洗废水生物反应器中脂肪酶活性影响时也有 类似的发现_l7J_
P0离子对碱性磷酸酶的活性影响较为复杂.试验P0一
浓度取在0-200mg/L之间,酶作用物浓度为50mol/L,结果 见图4.
PO43-浓度为50mg/L时,厌氧池和好氧池中碱性磷酸酶 活性均遭显着抑制,抑制率分别达92%~1160%.较低的活性可 能是由于反应器中本身的PO43-浓度已经较高,两池中总磷浓 度分别达11.5mg/L和7.9mg/L;并且由P0_力日入而增溶的多 聚磷酸颗粒极有可能被包固在活性污泥絮体中.当P0浓度
4期李茵等:蛋白质和磷酸水解酶在废水处理系统中的活性和作用517 140
120
100
80
60
40
20
O
050l00200
ConcentrationofPO4ionfp/mgL-, 图4P043.离子对碱性磷酸酶的活性影响
Fig.4EffectofP043iononAPAactivity
达100mg/L时,两反应器中碱性磷酸酶活性却比对照样分别 提高了15%和40%,其作用原理预测NNO2-;NNO(离子对亮氨 酸氨基肽酶活性的影响相似.
3结论
3.1亮氨酸氨基肽酶在缺氧池和好氧池中的平均活性为19.2 molLh和21.6txmolLh,,厌氧池中的活性最小,只有3.7 molLh,.亮氨酸氨基肽酶在不同反应池中的活性大小分 布反映了各池在降解含氮有机物中的作用.
3.2厌氧池中碱性磷酸酶占主导地位,平均活性达32.5tool
Lh...好氧池中的活性只有厌氧池的一半.缺氧池中的酶活
性最小,其平均活性仅为3.7ixtoolL.h,.
3_3动力学研究得到厌氧条件下碱性磷酸酶的v…
值是亮氨
酸氨基肽酶v…值的一百倍以上;对于亮氨酸氨基肽酶,v
值从厌氧,缺氧,好氧池依次上升,表明总蛋白质水解酶在
各反应池中的活性是逐渐增大的.同时还发现,加入的合成
酶基质与活性污泥中现成的基质两者对酶的活性中心存在
着竞争抑制.
3.4外加的N0,一,NO3-离子对亮氨酸氨基肽酶~/1PO一离子对
碱性磷酸酶的活性均有不同程度的促进作用,只有50mg/L
P0浓度对碱性磷酸酶有显着的抑制.
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