范文一:动物用乳酸菌
乳酸菌在动物体内能发挥许多的生理功能。大量研究资料表明,乳酸菌能促进动物生长,调节胃肠道正常菌群、维持微生态平衡,从而改善胃肠道功能;提高食物消化率和生物效价;降低血清胆固醇,控制内毒素;抑制肠道内腐败菌生长:提高机体免疫力等。
1.提供营养物质,促进机体生长乳酸菌如果能在体内正常发挥代谢活性,就能直接为宿主提供可利用的必需氨基酸和各种维生素(维生素B族和K等),还可提高矿物元素的生物活性,进而达到为宿主提供必需营养物质、增强动物的营养代谢、直接促其生长的作用。Dalmin等(2001)研究报道乳酸菌可以改良水质,提高斑节对虾的存活率、生长速率和健康状况。Hamad(1979)试验证明,小麦、稻米等谷物用乳酸菌发酵后,营养价值大大提高。此外,乳酸菌产生的酸性代谢产物使肠道环境偏酸性,而一般消化酶的最适PH值为偏酸性(淀粉酶
6.5、糖化酶4.4),这样就有利于营养素的消化吸收。何机峻的产生还可加强肠道的蠕动和分泌,也可促进消化吸收养分(张力等,2000)。
2.改善胃肠道功能,维持肠道菌群平衡动物的整个消化道在正常情况下都寄生有大量微生物。就其作用而言,可分乃三类:
①共生性类型,主要是兼性厌氧菌,在生态平衡时,它们的维生素和蛋白质合成、消化吸收、生物拮抗和免疫等功能对宿主有利。
②致病性类型,正常情况下数量少,寄生于正常部位,不至于使宿主发病。若失控,则会导致宿主的不良反应。
③中间性类型,即同时具有生理和致病两种作用。微生物群的平衡,对机体的健康十分重要,而乳酸菌就能够调节这种微生态平衡,保障宿主正常生理状态。乳酸菌是肠道常在菌(常生菌),畜禽服用乳酸菌后,可以改变肠道内环境,抑制有害菌繁殖,调整胃肠道菌群平衡。乳酸菌通过粘附素与肠粘膜细胞紧密结合,在肠粘膜表面定植占位,成为生理屏障的主要组成部分,从而达到恢复宿主抵抗力,修复肠道菌群屏障、治愈肠道疾病的作用。如果这个屏障遭到抗生素或其他因素的破坏,宿土丧失了对外来菌抵抗力,会使具有耐药性的肠内菌异常增殖而取代优势菌的位置,造成肠道内微生态平衡的失调。(占位及屏障作用)
3.改善免疫能力。乳酸杆菌和双歧杆菌一方面能明显激活巨噬细胞的吞噬作用,另一方面由于它能在肠道定植,相当于天然自动免疫。它们还能刺激腹膜巨噬细胞、诱导产生干扰素、促进细胞分裂、产生抗体及促进细胞免疫等,所以能增强机体的非特异性和特异性免疫反应,提高机体的抗病能力。Pergidon等(1988)报道,口服乳酸菌后,对巨璇细胞的半乳糖甙酶活性、巨噬细胞的吞噬活性等具有显著的激活和促进作用。当异物侵入机体时,免疫细胞被乳酸菌激活,增强了机体对异物产生抗体的作用。Chndra(1984)认为,乳酸菌之所以具有有激机体产生抗体的作用,是由于菌体通过淋巴结、粘膜刺激淋巴细胞接受刺激的淋巴细胞再通过肠系膜淋巴结(MIN)循环到血流中,并分布全身,从而调节机体的免疫应笞。
[功能作用]
1、促进消化,提高饲料利用率,降低料肉比,降低饲料成本,提高经济效益;
2、调节肠道菌系平衡:有益菌进入肠道内大量繁殖,抵制有害菌,最终定植在肠壁上形成菌系平衡,抑制有害菌侵入,同时产生大量有助于消化、吸收促进生长的物质;
3、有效预防黄、白痢、大肠杆菌等疾病的发生。
4、保肝护肾,调节机体内分泌,提高免疫力
5、加快生长,提高日增重,可使提前出栏;
6、明显降低畜牧业类粪便恶臭、减少蚊蝇、净化饲养环境、减少呼吸道疾病
[适用范围]
适用于家畜、家禽及虫类养殖领域包括猪、牛、羊、马、兔、狗、狐、貂、鸡、鸭、鹅、鹌
鹑、鸽子等养殖领域。
【饲料发酵方法】
1公斤益富源菌液可发酵200-300公斤粗饲料,湿度50%左右。压实密闭发酵,等到发酵料有甜酸发酵气味时即可拌料饲喂。发酵时间夏3-5天,冬5-7天
【饮水饲喂方法】
饮水:菌液比水1:300-500倍稀释后饮用。病弱动物可按每公斤体重1-2ml灌服原液。 动物食用菌液注意事项
1、以抗应激、治疗为主可加倍使用
2、与饲料混合后不能高温烫食,瞬间高制粒对本品影响不大;
3、可与任何饲料配合使用;
河南益富源生物科技有限公司是一家现代化生物企业。主要从事微生物菌的研发,并且是集现代研发、生产、销售、服务为一体的专业化公司。益富源生物公司倍受市场赞誉的产品:发酵床菌种、养殖、水产菌种、种植菌种、粗饲料发酵菌种、秸杆发酵菌种、EM菌种、泔水潲水发酵剂、动物益生菌、粪便发酵菌种等多种高效微生物益生菌产品。电话:①③⑥⑦③⑥①⑨③⑤⑥
范文二:乳酸菌养殖水产论文
乳酸菌养殖水产论文
乳酸菌养殖水产论文预读: 摘要:一、乳酸菌
乳酸菌是水产养殖中广泛使用的菌.乳酸菌可以分解糖类产生乳酸,为革兰氏阳性,厌氧或兼性厌氧生长,耐酸,在pH3.0,4.5时仍可生长,适应于胃肠的酸性环境.常用的是嗜乳酸杆菌,菌株为杆状,两端圆形.
乳酸菌是鱼肠道中的正常菌群,能在鱼肠道中定植,定植后能合成动物所需要的多种维生素,如维生素B1、叶酸等;在动物体内通过拮抗降低pH,阻止致病菌的侵入和定植,维持肠道内的生态平衡;能阻止和抑制有害物质,抵抗革兰氏阴性致病菌,增强抗感染能力;降解动物体内氨、粪臭素等有害物质;活菌体和代谢产物中的活性物质能增强机体肠黏膜的免疫调节活性,增强体液免疫和细胞免疫,增强机体调节活性,促进生长.
二、乳酸菌产品在水产上的应用
1.泼洒降pH值
乳酸菌制剂泼洒进入水体后,在适合的条件下繁殖,分泌乳酸等代谢产物降水体的pH值,具有持效的特点.乳酸菌因厌氧或兼性厌氧,在池底会长得好.使用:将乳酸菌产品用50倍以上池水稀释后全池均匀泼洒,每亩水面(水深1米)使用乳酸菌制剂100克以上(1克活菌量?50亿个).使用注意事项:?晴天上午使用,使用时及时有效增氧2小时以上,当晚注意有效增氧;?使用时配合红糖溶解泼洒效果更佳;?避免与氧化剂、抗生素或消毒剂同时使用.
2.乳酸菌内服
乳酸菌是目前广泛应用的一类益生菌,是温血动物胃肠道中的优势菌群.乳酸菌在饲料添加剂中具有重要地位,在美国FDA公布的42种微生物中有近30%是乳酸菌类.乳酸菌虽不是鱼类肠道内的优势菌群,但普遍认为乳酸菌是鱼类肠道的正常菌群成员.在鱼类养殖中,通过添加含乳酸菌的饲料可抵御致病菌侵袭、提高苗种成活率,有促进生长的作用.乳酸菌产生的代谢产物能降低日粮pH值,使胃内pH值下降,酶的活性提高;胃肠道微生物区系改善.有些有机酸是能量转换过程中重要中间产物,可直接参与体内代谢,提高营养物质消化率.乳酸菌作为鱼类益生菌,在肠道内具有较好的定植能力,而且在水产动物中,这种定植无明显的宿主特异性.乳酸菌内服的缺陷性:该菌在生长过程中不形成芽孢,抗逆性差,易失活而难以保藏,在饲料中添加使用受到一定限制.
3.乳酸菌发酵饲料
近年来,使用乳酸菌产品发酵水产饲料后再投喂,诱食、增食效果好,提高成活率明显.尤其在南美白对虾的养殖上,使用发酵饲料可以增加投喂量,缩短摄食时间、降低发病率,接受度颇高.
常见的虾饲料发酵有两种方式:?充分发酵,乳酸菌、饲料、水充分混合,密闭容器,放置于常温下发酵培养5天以上,闻之
有酸香味,pH在4.0左右表示培养成功;?快速发酵,发酵20小时左右.先把200克菌粉(1克活菌量?50亿)放入14千克水中溶解,加入20千克干饵料混匀,密闭容器(如果是湿饵料,加水到物料用手捏住有水快速滴下即可).根据气温变化大概24,48小时发酵好,有一股酸香味,可投喂.发酵饲料的注意事项:?饵料中不要添加抗生素或消毒剂;?饵料发酵成熟再使用;?发酵时每40千克饲料添加500克红糖效果更佳.
三、乳酸宝菌
乳酸宝菌是优良的乳酸菌粉剂产品,主要成分为乳酸菌,复合了芽孢杆菌、酵母菌等多种活菌.性状为白色至淡黄色粉末或小颗粒,略带发酵酸味.适用范围:适用于虾、蟹、鱼、鳖、珍珠蚌、海参等海、淡水养殖水体,同样适用于鱼蚌混养的养殖池塘,养殖全程可用,特别适用于pH高的水体和发酵饵料.作用:?发酵饵料或物料:使用本品可发酵饵料或鸡粪等物料,促进饵料分解、利用;?泼洒降pH值:本品使用后,降低水体pH值,降低高碱度的毒性,持效长久;?爽水,增加透明度,改变水色:在“浓绿水、黑恶水、浓茶水”池塘,晴天使用后水体增加
透明度,水色变为绿豆青色;?保持水质良好的藻相、菌相:大量分解池塘中的残饵和动物
排泄物等大分子有机物,为水体中益生菌、藻类提供营养,恢复池水自净及光合作用产氧能力.
作者:庄耿 张华 王兴仿 王玉群 单位:广州精博生物技术有限公司
范文三:乳酸菌在水产行业应用
乳酸菌在水产行业应用
近年来, 随着人们对动物性食品安全的广泛关注,绿色、安全且能有效替代抗生素和抗菌药物的饲料添加剂的研发成为人们的研究热点。益生菌制剂因应而生。对于益生菌制剂,2002年欧洲权威机构欧洲食品与饲料菌种协会(EFFCA)给出最新定义:益生菌是活的微生物,通过摄入充足的数量,对宿主生产一种或多种特殊且经过论证的功能性健康益处的菌种。微生态制剂是指用动物体内正常的有益微生物经特殊工艺制成的活菌制剂。其中,乳酸菌类微生态制剂的研究也已成为近年来研究的焦点之一, 目前,在众多微生物添加剂中, 乳酸菌制剂是饲用微生物添加剂中应用最为广泛,效果较好的一类,它是多种水产动物消化道主要的共生菌, 能形成正常菌群,也是中国最早公布的两种可直接使用的饲料级微生物添加剂菌种之一。乳酸菌可以在水产动物肠道内大量定植,有效调整肠道菌群平衡,可分泌乳酸,并产生多种消化酶,帮助食物消化和代谢,促进营养物质的吸收和利用; 同时它还能通过竞争营养、占位竞争、分泌细菌素等与致病菌竞争,抑制有害菌的繁殖,改善肠道内环境,调整胃肠道菌群平衡,提高动物健康水平。它为饲料和畜禽水产养殖业的健康发展提供了一条高效、无公害、无污染的新途径。
1 乳酸菌的生理特性
乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称,形态、代谢性能和生理学特征不完全相同。细胞形态多为杆状或球状,不生产孢子,不运动或少运动,不耐高温, 但耐酸,在pH3.0-4.5时仍可生长,对胃中的酸性环境有一定的耐受性,营养要求严格,除了碳水化合物,还需要多种氨基酸、维生素和肽等。在动物体内通过生物颉颃,降低pH,阻止和抑制致病菌的侵入及定植,降解亚硝氨、氨、吲哚和粪臭素等有害物质,活菌体内和代谢产物中含有较高。目前在自然界已发现的这一类菌在细菌分类学上至少包括 23 个属:乳酸杆菌属,双歧杆菌属、肉食杆菌属、链球菌属、明串珠球菌属、乳球菌属和芽孢乳杆菌属等。乳酸菌绝大多数生长繁殖于厌氧或微耗氧、矿物质和有机营养物丰富的酸性环境中,分布十分广泛,在发酵生产(青贮饲料、泡菜和酸奶)的培养物和动物消化道中含量较高。
2乳酸菌的作用机制
2.1 抑菌机制
细菌在动物肠道内定居和继续生存的因素,包括胃酸、胆盐、消化酶、免疫反应、 内源微生物及其产生的抗菌素。这些因素中任何一个因素的改变都会导致细菌活的超氧化歧化酶(SOD),能增强体液免疫和细胞免疫。乳酸菌的抑菌机制正是它的生化特性改变了致病菌的生存环境和生长机制, 从而达到抑菌的效果。
2.1.1 通过产酸改变肠道微生态环境抑制有害菌的生长
乳酸菌在体内发酵乳糖类, 生产大量的醋酸和乳酸, 使环境 pH下降,肠道处于酸性环境,而肠道内的病原细菌最适生长的 pH 为7.0-7.4,由于乳酸菌产酸及细胞崩解产酸使肠道内pH下降,不利于肠道内病原菌在肠壁定殖和生长,导
致病原细菌活力下降进而衰老和死亡,维持了肠道的生态平衡,使肠道得以发挥正常的生理功能。
2.1.2 通过产生某些抗菌物质抑制有害菌生长
乳酸菌除了产生有机酸,还可产生过氧化氢和安息香酸等抑菌物质,合成溶菌酶及其他抗菌物质,如乳酸菌素、乳酸链球菌肽和嗜酸菌素等,这些产物对肠道病原菌有抑制作用。过氧化氢和细菌素等在抑制病原菌上的机制被称为黏附抗性。黏附于肠道黏膜,是病原菌定植并产生临床症状的前提条件。体内微生物与病原微生物间存在竞争附着小肠上皮位点的作用,即竞争排斥作用,如果这些位点被较多的有益菌株占据,病原菌就会被排斥。乳酸菌可通过与病原菌间生存和繁殖的空间、时间、定居位点及营养的竞争,从而抑制病原菌黏附在肠黏膜上皮细胞上,达到抑菌作用。
2.2 营养机制
乳酸菌在动物体内正常发挥代谢活性, 就能直接为宿主提供各种可利用的必需氨基酸和各种维生素及消化酶(如淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶等)等,还可提高矿物质(如钙、磷、铁和镁) 的消化率和吸收率,从而增强动物的营养代谢,促进动物机体的生长和生产。此外,乳酸菌产生的酸性代谢产物使肠道环境偏酸性,而一般消化酶的最适pH 酸性(淀粉酶pH6.5,糖化酶pH4.4),有利于营养素的消化吸收,有机酸的产生还可加强肠道的蠕动和分泌,也可促进养分的消化吸收。
2.3 免疫机制
乳酸菌能增强动物机体免疫力,表现在2个方面: 1)影响非特异性免疫应答, 增强单核和巨噬细胞活力, 刺激活性氧、溶酶体酶和单核因子的分泌。2)刺激特异性免疫应答, 如加强黏膜表面和血清中IgA、IgM和IgG水平,以加强体液免疫。促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖, 加强细胞免疫。Schiffrin 等
( 1994) 发现, 约氏乳杆菌(L.johnsonnii ) Lj1和乳酸双歧杆菌(B.lact is ) Bb12 能在体外增强吞噬细胞对大肠菌的吞噬作用; 嗜热链球菌与沙门菌一起使用可起到免疫佐剂的作用,显著提高血清中IgA 含量。乳酸菌对免疫系统的刺激机制还在进一步研究中。Ouwehand等( 1999) 提出了摄入益生素(含乳酸菌) 对免疫刺激作用的可能途径,抗原性物质通过淋巴结中的滤泡上皮, 通过途径有 2 种:1)微生物代谢产物或碎片作为小分子抗原直接通过普通上皮细胞或透过上皮细胞间的紧密连接缝隙。2)微生物细胞本身由微皱细胞通过胞饮作用传送给位于微皱细胞包囊中的巨噬细胞等, 抗原进入淋巴组织后, 或由抗原提呈细胞处理或直接交给淋巴细胞, 产生相应的免疫应答。
2.4 中和中毒, 防止腐败产物的产生
某些细菌能中和或减少内毒素等有害物质的毒害作用。目前发现, 双歧杆菌可防止肠内容物产生氨, 蜡样芽孢杆菌可降低肠内容物和肝脏门静脉中血氨的浓度, 使酚类和吲哚等有害物质减少。
3 乳酸菌对动物的保健和治疗功效
国内外已有大量的饲养和临床试验证明, 其报道结果不一致,有正效应, 有负效应,但据统计, 正效应仍多于负效应。造成结果不一致的原因很多,如试验动物的品种、 年龄、 饲养环境、 菌株质量及有无应激等, 但乳酸菌对动物机体的有益作用还是公认的。
3.1 改善胃肠道功能, 降低动物胃肠道疾病的发生率
乳酸菌是肠道的优势菌, 畜禽服用后,通过发酵产酸可改变胃肠道内环境, 抑制有害菌的繁殖, 调整胃肠道菌群的平衡。也可通过其产生的黏附素与肠黏膜细胞紧密结合, 在肠黏膜表面定植占位,成为生理屏障的主要部分,从而达到恢复宿主抵抗力、 修复肠道细菌屏障和治疗肠道疾病的作用。
3.2 提高动物免疫力, 增进动物健康
乳酸菌在动物体内通过刺激动物机体的非特异性免疫应答和特异性免疫应答, 诱导产生干扰素、 促进细胞分裂、 产生抗体及促进细胞免疫, 提高机体的抗病能力。
3.3 促进动物生产, 提高饲料利
用率,降低饲养成本,提高经济效应乳酸菌在动物体内自身代谢产生各种营养物质提供给宿主, 如各种维生素、 必需氨基酸及各种消化酶,从而增强动物的营养代谢,促进动物机体的生长和生产, 同时乳酸菌可降低肠道 pH, 其偏酸性利于各种酶活性的发挥,利于营养素的消化吸收及降低饲养成本。
4 应用现状
综上所述, 乳酸菌具有预防、治疗疾病、 营养和保健等功效。近年来, 越来越多的人对抗生素饲料添加剂的弊端有了深刻认识, 许多学者纷纷投入到了克服这些弊端的微生态的研究中,推动了微生态制剂的发展。目前, 乳酸菌制剂已广泛应用于猪、 鸡、 牛、 羊和水产养殖等各个领域。
5存在的问题及展望
5.1 菌株的筛选
目前市场上销售的水产益生菌制剂主要有光合细菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、EM菌、芽孢杆菌和培养物等几大类。而作为益生菌制剂中重要的一员——乳酸菌菌株的筛选和活性的测定是关键问题,决定着其使用效果。合格的乳酸菌菌株必须满足以下几个方面要求。
5.1.1 正确的来源
寄主的遗传特性和环境因素,在决定肠道菌菌群结构和组成方面各起 50 %的作用, 寄主和肠道菌间存在着相互选择和相互依赖的关系。因此,许多学者认为理想的益生素菌株最好来自动物自身胃肠道。鱼体内的乳酸菌菌株毫无疑问更易在幼苗体内定植,所以菌株的来源应当和使用对象一致, 只有这样才能增强益生菌功效的特异性和针对性。所以,有针对性的乳酸菌制剂的研发具有较大发展前景。
5.1.2 定植和黏附力
益生菌乳酸菌通过对肠道黏液的黏附与定植进而起到维持机体健康的作用,虽然有调节肠道菌平衡和改善内环境的作用,但其是通过对肠道黏液的黏附与定植进而起到维持机体健康的作用,所以乳酸菌在肠壁上的黏附和定植是其发挥作用的一个重要步骤, 是大量繁殖变成优势种群的前提, 所以黏附力的强弱,对肠黏液黏附时间的长短是筛选益生菌菌株的重要标准。
5.1.3 在酸性和高胆盐环境中的生存能力
口服是益生菌进入肠道的主要途径,所以益生菌在进入大肠之前必须经受胃中盐酸和小肠中高浓度胆盐的考验。只有在盐酸和胆盐中成活率高的菌株才有可能发挥作用。
5.1.4 特异的生理功能
每一种乳酸菌具有其特定的生理功能。如嗜酸乳杆菌 GG 对寄主的免疫系统有较强的调解作用,而鼠乳酸杆菌对大肠杆菌有较强的抑制作用。目前,中国在乳酸菌制剂的研究和应用方面虽然取得了一定的成绩,但还是比较薄弱,尤其是作用机理了解得不十分清楚, 大多数研究还停留在使用效果水平上,对其生理功能,作用机制等基础理论方面的研究还远远不够,因此导致其作用效果不是很稳定。只有对各个菌株的疗效和生物特性有深入细致的研究和了解,才能根据不同情况设计出有促生长作用的微生态制剂。
5.1.5 产品中稳定的活菌数
微生态产品中活菌的数量是其发挥作用的根本保证,所以要求菌株在生产和保存过程及加工后活菌存活率高, 混入饲料后高温下稳定性好。
5.1.6 不会使人和动物致病, 不与病原微生物产生杂交种
必须用本动物或试验动物做急性毒性试验、 亚急性毒性试验和致畸致残试验, 只有安全性好的菌株才能作为生产菌种。
5.2 使用时间
微生态制剂在动物的整个生长过程都可使用,但不同的生长时期其作用效果不尽相同。一般幼龄动物,体内微生态平衡尚未完全建立,抵抗疾病的能力较弱,此时引入益生菌,可较快地进入体内,占据附着点,效果最佳。另外,在断奶、运输、饲料转变、天气突变和饲养环境恶劣等应激条件下, 动物体内微生态平衡遭到破坏,使用微生态制剂对形成优势种群极为有利,因此,把握应用时机,使其益生作用得到充分体现。
5.3 使用剂量
微生态制剂的作用是通过有益微生物在动物体内一系列生理活动、来实现的, 其最终效果同所使用的菌株的数量密切相关,数量不够, 在体内不能形成菌群优势, 难起到益生作用。根据试验,如果一种细菌在盲肠内容物的浓度低于107个/ g, 该菌产生的酶及代谢产物不足以影响宿主; 数量过多, 超出占据肠
内附着点和形成优势菌群所需的菌量, 非但功效不会增加,反而造成不必要的浪费。微生态制剂用于特定养殖动物所需的菌群数量尚无统一的规定。
5.4 提高产品中的乳酸菌数量及采用多菌株复方制剂
为了更好发挥乳酸菌的使用效果, 近年来在对微生物的菌株改造、 生产工艺和产品形式等方面作了许多研究工作。主要有以下几个方面: 1)多菌株配伍使用。有试验表明,乳酸杆菌和双歧杆菌配合使用能增加其效果。严格厌氧的菌株与非严格厌氧菌株进行共培养,可提高厌氧菌的产量和存活率,利于各菌株发挥效用。2) 提高成品中乳酸菌的数量。将菌体生长需要的微量元素、氨基酸和
B 族维生素等物质添加在培养基中, 促进菌株生长,可延长其在成品中的存活时间。3)利用合适的载体, 使菌株成功到达预期位置发生作用。Kailasapathy 等验证,奶是乳酸杆菌和双歧杆菌的有效载体,使其进入肠道后存活率提高。4) 与酶制剂、有机肽、多肽和中草药等物质的复合使用。
5.5 乳酸菌类微生态制剂的安全性问题
活的微生物应用于饲料和食品中, 其潜在的致病性、 抗药基因转移的可能性及繁殖和变异的不可控制性都是需要注意的。Adams( 1999) 综述了可能由乳酸菌引起的机体感染症, 包括心内膜炎、 菌血症及其他一些胸部和消化道感染。我们应当注意上述乳酸菌的潜在危险, 但更应看到乳酸菌更大的有益作用, 有证据表明, 除了肠球菌外,由乳酸菌引起的人类感染是极少的。因此, 科学家们认为,只要在有效监督控制下,对乳酸菌进行严格检验后再使用是安全的。 6 国内外允许使用的乳酸菌种
1989 年, 美国 FDA 和美国饲料控制官员协会公布了可直接饲喂和一般认为是安全的微生物菌种名单, 共42 种, 其中乳酸菌菌种有:双歧杆菌、 嗜热双歧杆菌、 嗜酸乳酸杆菌、 保加利亚乳杆菌、 乳酸乳杆菌和胚芽乳杆菌等。我国农业部第 105 号公布的允许使用的饲料添加剂品种目录中,微生物添加剂有12 种, 干酪乳杆菌、 植物乳杆菌、 乳酸片球菌、 枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、 嗜酸乳杆菌和乳链球菌等。总之, 乳酸菌类微生态制剂为饲料和畜禽养殖业提供了一条高效、 无害无污染且无残留的新途径。其产生和发展顺应了当前高新技术产业化和注重环保的主流,在应用中充分考虑动物菌群自身特点及寄主与环境间的关系。科学合理的使用, 必将成为本世纪饲料添加剂的主导产品。
范文四:保健食品用乳酸菌评价
保健食品用乳酸菌评价
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准技术指标参照ISO 27205 ︱IDF 149:2010《用于发酵乳制品的细菌发酵剂》中的技术指标。
本标准由 提出。
本标准由 归口。
本标准起草单位:山东宝来利来生物工程股份有限公司、
本标准主要起草人:
保健食品加工用乳酸菌评价
1范围
本标准规定了保健食品加工用乳酸菌的术语和定义、分类、要求、试验方法、检验规则和标志、包装、运输、贮存。
本标准适用于以适宜的发酵用营养物质接种乳酸菌种,经发酵培养,浓缩等工艺制成的,用于乳及乳制品、肉制品、饮料、泡菜发酵及发酵剂以外的保健食品加工用乳酸菌。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。
GB/T 191 包装储运图示标志
GB/T 601 化学试剂标准滴定溶液的制备
GB/T 602 化学试剂杂质测定用标准溶液的制备
GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备
GB 4789.4 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验
GB 4789.10 食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验 GB 4789.15 食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数
GB 4789.30食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏检验
GB 4789.35 食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验
GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法
GB 7718 预包装食品标签通则
SN/T 0738 出口食品中肠杆菌科检验方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 乳酸菌(LAB)Lactic acid bacterium (LAB)
能使糖发酵、并产生大量乳酸的细菌的通称,不能液化明胶、也不产生吲哚、呈格兰氏阳性、无运动、无芽孢、触酶阴性反应、硝酸还原酶阴性反应和细胞色素氧化酶阴性反应的细菌。
注:本标准中所涉及的乳酸菌是食品加工业重要的食品原料,主要包括乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)和片球菌属(Pediococcus)等。
4 分类
4.1按菌种类型和菌株数分为:
——单菌株乳酸菌:只含有一种明确菌株的乳酸菌产品;
——单菌种多菌株乳酸菌:含有一株以上属于同一种的乳酸菌产品;
——多菌种乳酸菌:含有一个种以上的乳酸菌产品。
4.2按使用温度分为:
——嗜温乳酸菌:使用温度在18℃~37℃的乳酸菌产品;
——嗜热乳酸菌:使用温度在30℃~45℃的乳酸菌产品。
4.3 按物理形态分为:
——液体:以液体形式存在的乳酸菌产品;
——冷冻:以深度冷冻形式存在的乳酸菌产品;
——干燥:经冷冻或低温喷雾等方式以干燥形式存在的乳酸菌产品。
5 要求
5.1 乳酸菌种
菌种除符合国家或行业相关规定外,还应符合表1规定。
5.2 感官
感官应符合表2规定。
理化要求应符合表3的规定。
5.4 微生物
5.4.1 乳酸菌微生物应符合表4的规定。
5.5 保健功能要求应符合表6的规定。
6 试验方法
本标准所用试剂和水,在没有注明其他要求时,均指分析纯试剂和符合GB/T 6682-2008规定的三级水。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时,均指水溶液。
6.1 菌种鉴定
6.1.1 16S rDNA序列同源性的鉴定方法
6.1.1.1 原理
核糖体RNA(rRNA)等保守性生物大分子广泛存在于生物细胞中,功能稳定,核酸序列中既有高度保守区又有可变区,因此可利用这些序列的信息对细菌进行鉴定和分类学研究。16S rDNA是16S rRNA 的基因,长约1.5kb。利用细菌域的通用引物扩增16S rRNA基因,序列测序后,输入GenBank中进行同源性分析,判定某个分类单位在系统发育树上的分类级别。
6.1.1.2 试剂和溶液
1 TE溶液:10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)。
2 STE溶液:0.1mol/LNaCl、10mmol/L Tris-HCl (pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)。 3 溶菌酶储液:用水配制成50mg/mL的溶菌酶储液,分装成小份并保存于-20度。
4 20%十二烷基硫酸钠(SDS):在800mL水中溶解200g电泳级SDS,加热至68度助溶,加入几滴浓盐酸调节溶液的pH至7.2,加水定容至1L,分装备用。 5 5moL/L高氯酸钠。
6 氯仿:异戊醇(24:1)。
7无水乙醇。
8 3mol/L的乙酸钠(pH5.2):在800mL水中溶解408.1g三水乙酸钠,用冰醋酸调pH至5.2,加水定容到1L,分装后高压灭菌。
9 1×Tris-乙酸(TAE)电泳缓冲液:40mmol/LTris-乙酸、1mmol/LEDTA,pH8.0。 10 LB 液体或固体培养基。
6.1.1.3 分析步骤
1 菌体收集培养
将待鉴定菌在1~5mL适宜的培养基和生长温度下培养至对数生长后期,12000r/min离心5min,收集菌体。
2 DNA提取 用细菌基因组DNA提取试剂盒。
3 以提取的细菌基因组DNA为模板,PCR(聚合酶链式反应)扩增16S rDNA 细菌域的16SrDNA基因扩增的通用引物27F(5′
-AGAGTTTGATCC/ATGGCTCAG-3′)和1541R(5′-AAGGAGGTGATCCAG-3′)分别位于大肠杆菌的16SrDNA的8~27位和1525~1541位核苷酸。
PCR的反应体系为25μL:模板DNA (大约80ng),100umol/L dNTP,
1.5mmol/LMgCl2,正向和反向引物各0.4umol/L和1UTaq DNA聚合酶。PCR过程为95℃预变性5min后,进行下述30个循环:94℃变性30s,55℃退火1min;72℃延伸1.5min,最后72℃保温10min。4℃保存。PCR结束后,取2μLPCR产物在1%(m/V)琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为1×TAE。电泳结束后,用0.5ug/g溴化乙啶溶液对凝胶染色10min,回收溴化乙啶溶液,用蒸馏水冲洗凝胶后,在紫外灯下观察。如果PCR扩增成功,则可见到相应大小为1.5kb的条带。 4 16S rDNA PCR扩增产物的纯化
浓缩16S rDNA的PCR产物:16S rDNA的PCR产物中加入1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇,混匀后置于-20度30min。12000r/min离心10min,弃上清液。自然晾干,加入15ul无菌双蒸水溶解DNA沉淀。利用商品化的DNA回收试剂盒对浓缩后的PCR产物进行回收。
5 16S rDNA PCR扩增产物的克隆和测序 送去上海生工测序。
6 16S rDNA 序列同源性分析及结果鉴定
将测得的16S rDNA长度约为500bp的部分序列提交到GenBank,使用Blast程序来寻找与其有最大同源性的序列如果两者之间的16S rDNA同源性大于
97.5%,则可认为它们属于同一个种。
6.1.2表型实验
(1)糖发酵的生化反应
(2)葡萄糖发酵终产物
6.1.3基因分型实验
6.1.3.1全基因组DNA脉冲场凝胶电泳(PFGE)的鉴定方法
按郭兴华主编的乳酸细菌现代研究实验技术中的操作进行。
6.1.3.1.1 原理
凝胶上至少有两个电场方向,时间与电流大小也交替改变,使得DNA分子能够不断地调整泳动方向,以适应凝胶中不规则的空隙变化,达到分离大分子线形DNA的目的。方法选用切割点较少的限制性内切核酸酶消化基因组DNA,产生的片段为10~80kb,条带数目5~20个,易于对比和分析。
6.1.3.1.2 试剂和溶液
6.1.3.1.2.1 重悬缓冲液:10mmol/L Tris碱,20mmol/L NaCl,50mmol/LEDTA(pH7.2)。
6.1.3.1.2.2 低熔点琼脂糖溶液。
6.1.3.1.2.3 裂解缓冲液:6mmol/L、1mol/L NaCl,100mmol/LEDTA、1%十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)、1mg/mL溶菌酶、20U变溶菌素(mutanolysin)。
6.1.3.1.2.4 蛋白酶K缓冲液:蛋白酶K(1mg/mL)溶解于100mmol/L EDTA,1%十二烷基肌氨酸钠。
6.1.3.1.2.5 0.04mg/mL苯甲基磺酰氟。
6.1.3.1.2.6 TE溶液:10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)。
6.1.3.1.2.7 5×Tris-硼酸(TBE)缓冲液:Tris碱54g,硼酸27.5g,20mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0),加水至1L。
6.1.3.1.2.8 0.5ug/mL溴化乙锭。
6.1.3.1.3 分析步骤
6.1.3.1.3.1 DNA琼脂糖凝胶块制备
1 待分型的乳酸细菌在适宜的培养基中生长至对数生长中期,加入青霉素使其终浓度为10~30ug/mL,继续培养2h。
2 3mL的培养物12000r/min离心10min收集细胞,用重悬缓冲液洗涤菌体2次后,悬浮在300uL的重悬缓冲液中。
3 配制1.5%低熔点琼脂糖溶液。
4 将等体积(各200uL)细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀,立即倒入凝胶块模具中,4度放置30min让琼脂糖固化。
5 将凝胶块自模具中取出并置入裂解缓冲液中,37度孵育过夜。
6 将凝胶块放置于蛋白酶K缓冲液中,于50度保持18h。
7 蛋白酶K消化后,可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4度。
8 将凝胶块放入装有TE及0.04mg/mL苯甲基磺酰氟(PMSF)溶液的Falcon试管中,灭活残留的蛋白酶K。
9 室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次,将凝胶块放入另一干净的试管,可直接用于酶切反应或用0.5mol/LEDTA(pH8.0)4度保存凝胶块。
10 若用EDTA保存凝胶块,取出后应用TE溶液室温下漂洗2次,每次30min。
6.1.3.1.3.2 琼脂糖凝胶块中DNA限制性内切核酸酶的消化
1 混合:酶反应缓冲液(高盐、中盐或低盐缓冲液),100mmol/L亚精胺(只用于高盐缓冲液状态),10~20U的内切酶。20U的内切酶就足以过夜完全消化10ugDNA。
2 设定一个除内切酶成分外含有混合物各组分的阴性对照,以检查是否有非特异性DNA 降解。
3 将琼脂糖凝胶块加入反应混合溶液中:通常用消毒过的手术刀或套环将凝胶块移入,37度孵育12h。
6.1.3.1.3.3 凝胶电泳
1 将1%的低熔点琼脂糖在0.5×TBE 中溶化后冷却至50~60度,立即注入凝胶框架中,并插入梳子。
2 凝胶固化后小心地拔出齿梳,用两把无菌手术刀将DNA 凝胶块上样。将DNA大小标准物上样至凝胶的两旁。
3 用1%液态低熔点琼脂糖凝胶(0.5×TBE配制)密封狭槽,若有气泡存在,用注射器驱赶气泡。
4 一旦密封的低熔点琼脂糖已固化(大约10min),可将凝胶搁入腔室,并用电泳缓冲液覆盖过胶面。
5 设定合适的电压及转换时间(脉冲时间为1~6s,电流6V/cm,温度为14度)并开始电泳,两个不同方向电泳的电流该相等。电泳总时间约22h。
电泳结束后,凝胶用EB(0.5ug/mL)染色,254nm紫外灯下观察。
注1:实验过程中应使用消毒溶液及带无菌手套以免DNA降解。
注2: 限制性内切核酸酶消化前注意用1×TE溶液仔细漂洗凝胶块,以去除EDTA,以免影响后续的酶消化反应。
6.1.4 安全性实验
6.1.4.1 抗生素耐药性谱测定
6.1.4.1.1K-B纸片琼脂扩散法
原理 通过测量含药纸片周围抑菌圈直径大小来判定细菌对药物的敏感水平。 材料 菌种、抗生素药物纸片、MRS琼脂培养基、麦氏比浊管、游标卡尺、厌氧培养箱
分析步骤
将菌种接种于MRS琼脂平板,37度厌氧培养24h,然后挑取单菌落,悬于3mL生理盐水中,混匀后通过比浊法测定其菌体密度,并调整菌体浊度为0.5麦氏单位(0.048mol/LBaCl2 0.5mL,0.36N H2SO4 99.5mL)
用无菌棉拭子蘸取菌液,在管壁上挤压去掉多余菌液。用棉拭子涂布整个MRS培养基表面,反复几次,每次将平板旋转60度,最后沿周边绕2圈,保证涂布均匀。
待平板上的水分被琼脂完全吸收后,用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面。每个平板贴5张纸片,每张纸片间距不少于24mm,纸片中心距平皿边缘不少于15mm。待菌接种后15min贴完纸片。
将平板厌氧培养18~24h后取出,用游标卡尺测量抑菌圈直径,从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录。抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长,进入抑菌环,磺胺药在抑菌环内出现轻微生长,这些都不作为抑菌环的边缘。结果判断依据鉴定所药敏纸片判定标准。
每次药敏实验同时用E.coli ATCC 25922做对照。只有当E.coli的抑菌圈直径在允许的范围内时测试菌株的结果才可以报告。E.coli ATCC25922的结果必须与
测试菌株同时记录和报告。
判定标准 参照乳酸细菌现代研究实验技术中列出标准
表 乳杆菌K—B纸片琼脂扩散法判定标准
抗生素 抑菌圈直径/mm
耐药 中介 敏感
20~27 青霉素G ≤19 ≥28
13~15 氨苄西林 ≤12 ≥16
15~16 万古霉素 ≤14 ≥17
14~15 复方新诺明 ≤10 ≥16
15~17 利福平 ≤14 ≥18
15~17 甲硝唑 ≤14 ≥18
庆大霉素 ≤12 — ≥13
12~14 链霉素 ≤11 ≥15
15~18 四环素 ≤14 ≥19
14~17 氯霉素 ≤13 ≥18
14~17 红霉素 ≤13 ≥18
菌株抑菌圈直径跟标准菌株对比。
注:制备MRS琼脂平板应用直径90mm的平皿,在水平实验台上倾注。
6.1.4.1.2 E-test法
原理:E-test试条是商品化的细长形塑料试条,内含浓度呈指数梯度的某种抗菌药物。可用于常见细菌、苛氧菌、分枝杆菌、厌氧菌和真菌的药敏实验。将试条贴于接种好待测菌株的平板上,经过合适的条件孵育后,围绕着试条的周围可形成一个卵圆形的抑菌圈,而该抑菌圈与试条的横向相交处的读数,即为该药物对待测菌株的MIC。
材料:MRS培养基、麦氏比浊管、E-test试条。
分析步骤
1菌液制备、平板制备,参见K-B纸片琼脂扩散法(厌氧菌、隐球菌和其他真菌菌悬液浓度为1个麦氏单位,其他细菌为0.5个麦氏单位)。
2加贴试条:待已涂布的琼脂平板表面完全干燥后,用E-test加样器或镊子将试条的含药面贴于平板表面,浓度最大处靠近平板边缘。试条全长应与琼脂紧密接触,一旦放平就不能再移动。肠杆菌科细菌(35±2)度培养(18±2)h;葡萄球菌属细菌33~35度培养(18±2)h(其中苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林和万古霉素敏感性测定需培养24h)。培养过程中平板应单独摆放,不超过2个叠在一起。
3结果观察及判读:按照产品说明书,在椭圆形抑菌环与E-test试条的交界点读取MIC值。若无抑菌环出现,则报告MIC大于刻度的最高值,若抑菌环与试条无交点,则报告MIC小于刻度的最低值。应读取所有的生长,包括薄雾状和散在微小菌落被抑制处的数值。将各抗生素药物的MIC(ug/mL)比对MIC解释标准,报告被测细菌对该抗生素敏感(S)、中敏(I)、耐药(R)。
4质量控制同纸片法。
结果判定:菌株抑菌圈直径跟标准菌株对比。
6.1.4.2 硝基还原酶活性检测
原理:检测细菌硝基还原酶活性主要是利用硝基还原酶催化底物硝基芳烃化合物,生成产物芳香胺;再通过后续的颜色反应检测产物芳香胺,确定细菌是否具有硝
基还原酶活性。
材料:BHI培养基、1-硝基芘、三氯乙酸、亚硝酸钠、0.5%氨基磺酸铵、0.1% 盐酸萘乙二胺、二甲基亚砜、对硝基苯甲酸、甲醇、Whitley DG250厌氧工作站、T6紫外可见分光光度计。
分析步骤
1接种细菌于含有1-硝基芘(16~32ug/mL,二甲基亚砜溶解)的BHI培养基平板;接种后置37度黑暗中厌氧孵育48h。
2向平板上加入13mL 0.21%三氯乙酸和0.007%亚硝酸钠混合液,室温孵育20min。 3再加入1mL0.5%氨基磺酸铵,孵育3min;加入5mL0.1%NEDD(水溶),室温孵育;观察是否有菌落变成紫红色,是说明菌株具有硝基还原酶活性,否说明菌株不具有硝基还原酶活性。
4、向细菌培养物中加入对硝基苯甲酸甲醇溶液,使其终浓度为10mg/mL,37度黑暗中厌氧孵育4h。
5、加入终浓度为0.21%三氯乙酸,酸化生成产物对氨基苯甲酸。
6、加入终浓度为0.007%的亚硝酸钠,室温孵育20min。
7、加入终浓度为0.04%氨基磺酸铵;室温孵育3min后,加入终浓度为0.35%的NEDD,540nm波长处测定吸光度。
8、根据对氨基苯甲酸540nm处标准曲线,计算每1010个细菌的硝基还原酶活性。 注:厌氧孵育注意避光。
6.1.4.3 D-乳酸含量检测
原理
D-乳酸在人血液中聚集过多会发生D-乳酸中毒。世界卫生组织建议限制D-乳酸的摄入量,规定成人每天摄入的D-乳酸不超过100mg/kg。分光光度法通过D-乳酸脱氢酶将D-乳酸转化为丙酮酸,同时,把等量的NAD转化为NADH;通过前后吸光度的变化测定样本中D-乳酸的含量。
材料
氧化型辅酶Ⅰ(NAD)、甘氨酸缓冲液(pH9.2;0.6mol/L甘氨酸和0.5mol/L、D-乳酸脱氢酶(D-lactate dehydrogenase)、硫酸铵(ammonium sulfate)、谷丙转氨酶(glutamate-pyruvate transaminase)、T6紫外可见分光光度计、FRESCO 17离心机。
分析步骤
将待测细菌接种到新鲜培养基,适宜条件培养若干时间,离心收取上清液。 向0.2mL待测上清液中加入0.8mL甘氨酸缓冲液、NAD(终浓度1.3mg/mL)以及0.01mLD-乳酸脱氢酶硫酸铵混悬液(每5mgD-乳酸脱氢酶与1.5mL硫酸铵混合)和谷丙转氨酶(谷丙转氨酶/D-乳酸脱氢酶活性之比为11/38);将上述混合物置于35度水浴45min。
将相同处理但不加D-乳酸脱氢酶的上清液样本作为空白对照。
测量已知D-乳酸标准品样品处理后340nm处OD值,绘制标准曲线。
340nm波长处测量反应后混合物的OD值;根据标准曲线确定所测样本D-乳酸含量。
注:样品数量较多时,注意控制加样时间。每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔;如果标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请最后乘以稀释倍数。
6.2 感官
取适量样品,在自然光线下,用肉眼观察样品的颜色和形态,检查有无杂志。
6.3 产酸能力
6.3.1 仪器和设备
pH计:精度0.01。
6.3.2 试剂和溶液
6.3.2.1 乳酸菌培养液的制备(10%)
将100g脱脂奶粉充分溶解于900mL 50度的水中,缓慢搅拌后稳定20min,密封置于适当的容器中,与高温灭菌釜中110度加热20min,待用。
6.3.2.2 NaOH标准溶液(0.1mmol/L)
6.3.2.3 发酵剂样品溶液的制备
6.3.2.3.1 称取对应每100L奶接种量的菌粉,溶解于100mL相应发酵温度的乳酸菌培养液(6.3.2.1)中,摇动10min直到完全溶解。
6.3.2.3.2 从上述菌液中用无菌移液管或移液枪均匀抽取10mL菌液,转移到90mL乳酸菌培养液(6.3.2.1)中,摇动1min直到分散均匀。
6.3.3 分析步骤
6.3.3.1 用0.1mol/LNaOH标准溶液调整待测乳酸菌培养液(6.3.2.1)的pH到6.6。
6.3.3.2 从无菌脱脂复原乳(6.3.3.3.2)中取出10mL,转移到相应发酵温度的990mL的pH调整到6.6的无菌脱脂复原乳中(6.3.3.1),摇动1min后放置到相应发酵温度的恒温水浴锅或恒温箱中培养,开始计时。
6.3.3.3 记录脱脂奶(6.3.3.2)达到标称pH的时间。
6.3.3.4 记录脱脂奶(6.3.3.2)标称时间内达到的pH。
6.3.4 结果判定
产酸活力按下述方法进行判定:
——达到标称pH的时间;
——标称时间内pH的变化值。
注1:冷冻和干燥产品需在室温下放置0.5~1h后方可使用。
注2:根据产品标志,选择记录时间(6.3.3.3)或pH(6.3.3.4)。
6.4 发酵酸度
6.4.1 原理
根据酸碱中和的原理,用碱液滴定试液中的酸,以酚酞为指示剂确定指示终点,按碱液消耗的量计算样品中总酸含量。
6.4.2 仪器和设备
除实验室常用仪器外,还需碱式滴定管:25mL。
6.4.3 试剂和溶液
6.4.3.1 1%酚酞指示剂:按GB/T 603配制。
6.4.3.2 NaOH标准滴定溶液(0.01mol/L):吸取10mL、0.1mol/L氢氧化钠溶液(按GB/T 601配制),稀释到100mL,用时当天稀释。
6.4.4 发酵用乳酸菌剂溶液的制备
称取或量取一定量的乳酸菌样品,溶解于80mL一定温度的水中,定容至100mL,使最终溶液的浓度控制在活菌数108CFU/mL。
注:对于由多菌种发酵剂物理混合而成的产品,将单位包装产品充分溶解后,按规定量取样测定。
6.4.5 发酵剂样品溶液的制备
同6.3.2.3。
6.4.6 分析步骤
取(6.4.5)中对应溶液50mL(g)到250mL三角瓶中,加入40mL~60mL去二氧化碳的蒸馏水,加1%酚酞指示剂2滴,用0.01mol/L NaOH标准滴定溶液定至微红色,保持30s 不退色,即为终点。
用无二氧化碳的水代替试样溶液进行空白实验。
注:冷冻和干燥产品需在室温下放置0.5h~1h后使用。
6.4.7 计算
发酵酸度(以乳酸计)按公式(1)计算:
X1=c×(V1?V2)×0.090×250/50m×100%··························(1)
式中:
X1——发酵酸度,以质量百分数(%)表示;
c ——NaOH标准滴定溶液的摩尔浓度,单位为摩尔每升(mol/L); V1——样品滴定时消耗NaOH标准滴定溶液的体积,单位为毫升(mL); V2——空白滴定时消耗NaOH标准滴定溶液的体积,单位为毫升(mL); 0.090——与1.00mL氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH)=0.01mol/L]相当的乳酸的质量,单位为克(g)。
m——称取样品的质量,单位为克(g)。
结果保留两位小数。
6.4.8 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的5%。
6.5产过氧化氢能力
分光光度法-辣根过氧化物酶法
6.5.1 原理
6.5.2 材料
试剂
30%过氧化氢
辣根过氧化物酶水溶液:辣根过氧化物酶以1mg/mL的浓度溶解于蒸馏水中制备过氧化物酶储液,该储液经滤膜过滤后,储存于5度直至使用。分析时该储液经1:100稀释后进行使用。
2 仪器
生化培养箱、恒温磁力搅拌器、生物洁净工作台、显微镜、高压灭菌器、各种规格手动移液器、高速冷冻离心机、分光光度计。
6.5.3方法
1、标准曲线的制备
1)采用磷酸钠缓冲液(2mol/L,pH6.5)分别制备每毫升含1ug、2ug、4ug、5ug的过氧化氢溶液,分别取10mL上述溶液,再用10mL的磷酸钠缓冲液进行稀释,制备标准溶液。
2)分别取5mL上述标准溶液,分别加入含有1mL浓度为0.01mg/mL的过氧化物酶溶液和0.1mL浓度为1%的邻联茴香胺溶液的试管中。
3)空白对照管为5mL的磷酸钠缓冲液,1mL浓度为0.01mg/mL的过氧化物酶溶液和0.1mL浓度为1%的邻联茴香胺溶液的试管中.
4)每个试管混合均匀后,在37度保温10min。
5)每个试管中加入0.2mL的4mol/L的盐酸终止反应并稳定颜色。
6)加入盐酸5min后,在400nm波长下测定密度值。
7)以过氧化氢的浓度为横坐标,以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
2、乳酸细菌培养液中过氧化氢含量的测定
1)待测乳酸细菌在MRS液体培养基中于适温下培养适宜时间;
2)取出后于12000g离心10min,收集上清液,用于分析过氧化氢的含量;
3)取5mL上清液加入一干净试管中,然后加入0.1mL浓度为1%的邻联茴香胺溶液,混合,再加入1mL浓度为0.001mg/mL的过氧化物酶溶液;
4)空白对照组采用5mL磷酸钠缓冲液代替样品溶液,其余同上。
5)每个试管混合均匀后,在37度保温10min。
6)每个试管中加入0.2mL的4mol/L的盐酸终止反应并稳定颜色。
7)加入盐酸5min后,在400nm波长下测定密度值。
8)与标准曲线对比后,确定待测样品中过氧化氢的含量。
6.6 菌株产细菌素能力检测
6.6.1原理:某些细菌产生的细菌素可作为生物防腐剂。细菌素高产菌株的筛选首先要选出具有抑菌活性的乳酸细菌,之后对乳酸发酵上清液进行处理,逐一排除非细菌素抑菌因素,再进行复筛,初步认为复筛后具有抑菌活性的乳酸菌为目的菌株。
6.6.2 材料
指示菌:金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌和沙门氏菌等作为初筛指示菌。
6.6.3分析步骤
6.6.3.1 冻干菌种的活化
1) 低温保存的菌种在室温放置几个小时,用70%乙醇棉擦拭冻干瓶的铝盖上部,用70%乙醇消毒后的剪子剥去铝盖;2)对胶塞及冻干瓶口周围进行消毒;3)用无菌镊子打开瓶塞,用接种环挑取少许菌粉接入适宜的液体培养基试管中;4)把接好菌的试管放入培养箱中37度培养36~72h;5)连续传代活化3次。
6.6.3.2有抑菌活性菌株的初筛
1) 制备含1.2%琼脂的MRS琼脂培养基,培养基冷至50度左右,倾倒平板,放置干燥;2) 实验菌在适宜液体培养基中于37度培养过夜;3)平板上点种10uL实验菌液;4)干燥后放入适宜条件下培养24h左右,长出菌落取出;5)指示菌培养过夜;6)制备含0.7%琼脂的适宜软琼脂培养基(指示菌培养基),冷至50度左右;7)每7mL软琼脂培养基接种300uL指示菌培养液;8)在长出菌落的实验菌平板上倾倒7mL 上述加入指示菌的软琼脂,放冷,干燥;9)指示菌适宜条件下培养过夜,产生的抑菌圈半径大于5mm认为有抑菌活性。
6.6.3.3 具有抑菌活性菌株的复筛
6.6.3.3.1无细胞发酵液的制备:1)纯化活化好的乳杆菌以1%的接种量接种于100mL液体培养基中,适宜温度下静止培养;2)培养到稳定期后(OD>1.9),12000*g,4度离心15min,收集上清液;3)用6mol/L氢氧化钠调pH值到6.5,以中和有机酸的干扰;4)过氧化氢酶溶解在0.02mol/L乙酸盐缓冲液(pH6.5)中配成母液。5)加入无细胞发酵上清液使过氧化氢的终浓度为5.0mg/mL,37度水浴;6)水浴2h取出,7)上清液用0.22um滤膜过滤,除去菌体及其他杂质;
8)无细胞上清液通过冷冻干燥的方法浓缩;9)冻干后加入原体积1/10超纯水(Milliq),溶解后放入-20冰箱中备用。
6.6.3.3.2 具有抑菌活性菌株的复筛。
采用采用牛津杯双层平板法,步骤如下:1)2%的素琼脂灭菌冷到50度倒平皿晾干;2)无菌镊子取6个灭过菌牛津杯放入倒过琼脂的平皿;3)指示菌培养过夜;4)制备含0.7%琼脂的指示菌培养基,冷到50度;5)每100mL软琼脂培养基接种1mL的指示菌;6)在事先放好牛津杯的平板上倾倒10mL含有指示菌的软琼脂培养基,晾干;7)在牛津杯的空中加入100uL无细胞发酵上清液,在洁净工作台中鼓风扩散3h;8)置于指示菌适宜的培养条件下,培养一定时间后用游标卡尺测定抑菌圈的直径。
6.6.3结果判定
测试菌株与标准菌株抑菌圈直径大小判定。
6.7 抗氧化能力
原理:
材料:乳酸细菌、MRS培养基、PBS缓冲液(pH=7.4);Tris-HCl(pH8.2)、
过氧化氢酶、二苯代苦味肼基自由基(DPPH)、丁基化羟基甲苯(BHT)、二乙三胺五乙酸、铁氰化钾、硫代巴比妥酸(TBA)、SOD和GSH-Px检测试剂盒、亚油酸、L-半胱氨酸盐酸盐、过氧化氢、FeSO4、邻苯三酚、O-菲罗啉、三氯乙酸(TCA)、氢氧化钠、三氯化铁、抗坏血酸、亚油酸乳化液、三氯甲烷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、Tris、邻菲罗啉、、甲醇、维生素C,均为分析纯。恒温培养箱、灭菌锅、超声破碎仪、分光光度计、分析天平、离心机 方法步骤:
乳酸细菌的培养及无细胞提取物的制备:供试菌于MRS培养基37度培养24h后,离心收集菌体,用PBS洗涤3次,重悬于PBS,调整菌数到1010/mL,冰浴超生破碎细胞,4度,12000g,离心30min,收集上清液,即为无细胞提取物。
6.7.1 对过氧化氢的耐受能力
将乳酸细菌接种于MRS液体培养基,37度静置培养24h;离心收集菌体,用PBS洗涤并制备108CFU/mL的菌液,取0.5mL菌液,分别加入5mL含有0、0.2%、0.3%、0.5%、1%H2O2的PBS中;37度处理1min,再加入0.2mg/mL过氧化氢酶,将处理后的PBS梯度稀释,涂布于MRS固体培养基上,37度培养48h,计数并计算其存活率。以标准菌株作为对照。
6.7.2 清除超氧自由基(O2·-)能力的测定
吸取0.5mL无细胞提取液,分别Tris-HCl(pH8.2)、二乙三胺五乙酸和邻苯三酚,使其终浓度为150mmol/L 、3mmol/L和1.2mmol/L,总反应体积为3.5mL。25度恒温水浴反应10min后于325nm处测吸光度。
利用以下公式计算超氧自由基的清除率:
O2·-清除率(%)=[1-(A11-A10)/(A01- A00)] ×100%
式中,A00为不含样本和邻苯三酚;A01 为不含样品,含邻苯三酚;A10为含样本,不含邻苯三酚;A11为含样品和邻苯三酚。
6.7.3 清除羟自由基(HO·)的能力
吸取0.5mL无细胞提取物和1mLO-菲罗啉,加入1mLPBS,1mL2.5mmol/L FeSO4,1mL20mmol/LH2O2;37度恒温水浴反应1.5h后,在536nm处测定吸光度。利用以下公式计算超氧自由基的清除率:
清除率(%)=[(A2-A1)/(A0-A1)]×100%
式中,A0为不含样品和H2O2;A1为不含样品,含H2O2;A2为含样品和H2O2。
6.7.4螯合Fe2+能力的测定
加入0.1mL质量分数为1%的抗坏血酸,0.1mL质量分数为0.4%的FeSO4,1mL0.2mol/L,以及0.5mL实验菌无细胞提取物;混合液37度水浴20min,TCA沉淀蛋白,于4度,4500g离心10min;取0.2mL上清液,加入2mL质量分数为0.1%的O-菲罗啉,反应10min后,510nm测定吸光值。实验以PBS作为空白对照。
6.7.5 还原活性
吸取0.5mL无细胞提取物,加入0.5mL1%铁氰化钾,0.5mLPBS,50度水浴20min; 冷却后加入TAC沉淀蛋白,4度,4500g,离心10min;取1mL上清液与1mL0.1%FeCl3反应后,于700nm处测吸光度。以L-半胱氨酸盐酸盐作为标准对照。
6.7.6 抗脂质过氧化
0.5mLPBS溶液中加入1mL亚油酸乳化液,加入0.2mL质量分数为0.01%的FeSO4和0.2mL 0.56mmol/LH2O2催化氧化,再加入0.5mL乳酸细菌菌体或乳酸细菌无细胞提取物,37度水浴反应12h;混合液中加入0.2mLTCA,2mLTBA,0.2mLBHT,100度反应30min;冷却后加入2.5mL三氯甲烷抽提,离心收集上清液,在532nm下测定吸光度。实验以PBS作为空白对照。利用以下公式计算抗脂质过氧化率:
抗脂质过氧化率=[1-A532(样品)/A532(空白)]×100%
6.7.7 清除DPPH自由基的能力
向1mLDPPH甲醇溶液(0.2mmol/L)中加入1mL乳酸细菌菌体或乳酸细胞提取液,室温下置黑暗环境中反应30min,用三氯甲烷抽提后,于517nm测吸光度。以去离子水为空白。利用以下公式计算DPPH自由基清除率:
DPPH自由基清除率(%)=[1-A517(样品)/A517(空白)]×100%
注:接种量和培养条件要保持一致。制备无细胞抽提液时,菌体用量必须准确。 菌细胞在低温下破碎。
6.8 对胃酸和胆盐的耐受性
6.8.1 原理
乳酸细菌能安全通过消化道,保持较高的数量和活性是其充分发挥功效的重要一环。乳酸细菌要进入肠道发挥作用,首先要经过胃液的酸性环境。活菌能否顺利通过胃液,HCl的耐受能力强弱将是一个关键的因素。而胃液pH因饮食结构的不同而波动很大,通常pH为3左右,食物通过时间为1~2h。因此,国内外学者一般把pH3.0和120min作为体外初步筛选的一个基本标准。
肠道胆盐对菌体也有毒性作用。胆盐可改变菌体外膜的通透性,对乳酸细菌起到抑制、杀灭作用,进而影响其存活。人体小肠中胆汁盐含量为0.3~3g/kg,尽管人体肠道胆盐浓度不断变化,但通常认为平均胆盐浓度为0.3%,因此0.3%的胆盐浓度可作为初筛的标准浓度。
6.8.2 仪器和设备
722 S分光光度计、pHS-25酸度计、超净工作台、高压灭菌锅和电热恒温培养箱等。
6.8.3 培养基和试剂
6.8.3.1 培养基 MRS液固培养基、改良MRS培养基(在固体改良MRS里加0.5% CaCO2。
6.8.3.2 试剂 盐酸、牛胆酸钠和CaCO2等。
6.8.4 分析步骤
6.8.4.1 乳酸细菌培养液的制备
乳酸细菌采用MRS培养基,37度静止培养24h,所有菌株经过2次传代。
6.8.4.2 初步筛选
把MRS培养基的pH调到3.0,121度,15min灭菌后按2%的接种量接入已经活化2代的液体培养物,37度培养24h,测定其在24h过程中吸光度的变化△OD600,同时在MRS培养基中添加0.3%牛胆盐,121度,15min灭菌后按2%的接种量接入已经活化2代的液体培养物,37度培养24h,测定其在24h过程中吸光度的变化△OD600,最后选取2个△OD600相对大的10个左右的菌株进行下一步的实验。
6.8.4.3 耐酸性实验
以pH7.0的PBS缓冲液为基础,再用37%的盐酸将其分别调至3.0,121度,15min灭菌后按10%的接种量接入已活化2代的液体培养物,37度条件下分别于0min、30min、60min、90min、120min取样测定活菌数。
6.8.4.4 胆盐耐受性实验
菌株活化2代后的液体培养物按2%接种量接入含不同胆盐浓度的改良液体MRS培养基中(培养基中分别含0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、2%胆盐),同时以不含胆盐的改良MRS培养基作为对照。在37度恒温培养箱中培养24h后取样测定活菌数。
6.8.5 结果判定
耐酸、耐胆盐按下述方法进行判定:
─ pH3.0和120min活菌数/不加盐酸对照活菌数
─胆盐浓度为0.3%时的活菌数/不加胆盐对照活菌数
注1:实验过程中注意无菌操作。
注2:酸度计必须用已知pH的缓冲液溶液进行定位校正。
注3:分光光度计使用前要预热、调零和确定波长。
6.9 黏附性测定
6.9.1 乳酸菌黏附性测定
6.9.1.1 原理
在消化道内黏附和定植是乳酸细菌发挥益生作用的关键,由于体内测定黏附特性的困难,体外细胞培养方法是研究益生菌黏附最常用的方法。人结肠腺癌细胞Caco-2由于在体外生长所表现出的形态和功能特征能够模拟成熟肠道上皮细胞,经常作为体外模型用于评价益生菌的黏附和定植能力。
6.9.1.2 材料
Caco-2细胞、改良型RPMI-1640细胞培养液、胎牛血清、Hank′s液、胰蛋白酶(0.25%)、水浴锅、离心机、吸管、血细胞计数板、倒置显微镜、MRS培养基、PBS缓冲液(pH7.4)、甲醇、Triton X-100。
6.9.1.3 分析步骤
6.9.1.3.1 将Caco-2细胞接种到含盖玻片的24孔培养板中,接种量为每孔2.0×105个细胞,37度培养至完全分化。
6.9.1.3.2 乳酸菌培养至稳定期,6000r/min离心5min收集菌体,用PBS缓冲液洗涤2次后,悬浮在不含胎牛血清的细胞培养液中,调整菌体浓度为1×109个/mL。
6.9.1.3.3 Caco-2单细胞层用PBS缓冲液洗涤2次,每孔添加1mL细菌悬浮液,37度培养1h。
6.9.1.3.4 弃细菌悬浮液,单细胞层用无菌的PBS缓冲液洗涤5次,用甲醇固定10min,然后革兰氏染色。
6.9.1.3.5 显微镜观察计数,10个随机视野中,每个细胞周围黏附的细菌个数的平均值记为菌株对Caco-2细胞的黏附值。
注1:黏附实验中用不含胎牛血清的细胞液,血清中成分复杂可在一定程度上抑制细胞的黏附。
注2:Caco-2单细胞层要清洗干净,以避免残留物质对黏附的干扰。
注3:黏附完毕后要清洗干净,以便准确计数。
注4:Triton X-100裂解细胞时作用时间不宜过长,以免影响细菌的存活率。
6.9.2 黏附性双歧杆菌菌株的筛选
6.9.2.1 原理
黏附是细菌与宿主细胞相互作用的第一步,外源的双歧杆菌能否在肠道黏附和定植是评定双歧杆菌的保健效果的主要指标之一。双歧杆菌表面的疏水性在肠道上皮细胞的初始黏附中起重要作用,疏水性强的菌株对肠上皮细胞具有较高的黏附能力,并呈现一定的依赖性,即双歧杆菌的疏水性与其对肠上皮细胞的黏附力成正比。
6.9.2.2 材料
双歧杆菌菌株、改良MRS培养基、MEM培养液(含20%胎牛血清)、50mmol/L K2HPO4(pH6.5)缓冲液,二甲苯(分析纯)、SCL-1300型垂直流洁净工作台、722S分光光度计、倒置显微镜、二氧化碳细胞培养箱、亨盖特厌氧装置、厌氧箱。
6.9.2.3 分析步骤
6.9.2.3.1 菌株活化
取活菌冻干粉少量于改良MRS液体培养基中活化,在37度下厌氧培养24h,传代2~3次后,镜检菌体生长良好再进行实验。
6.9.2.3.2 菌液浓度调整
将细菌培养物以12000r/min离心5min收集菌体,用缓冲液洗涤菌体2次,每次5 mL,离心6000r/min 2min。以缓冲液为空白对照,用缓冲液调整菌株菌体浓度,使其在600nm波长下A值为1.000(A600=1.000)。
6.9.2.3.3 疏水性测定
取2mL调整浓度后的菌液加入400uL 二甲苯,对照组不加二甲苯,振荡30S,停顿10S后再振荡30s,静置5min分层。取水相,以缓冲液为空白对照,在600nm下测定A值并记录,每株细菌平行做3管重复。
细菌细胞表面疏水性计算:
疏水率H%=[(A0-A)/A0]×100
式中,A0和A分别是与二甲苯混匀前、混匀后菌液在600nm下测得的A值。
6.9.2.3.4 黏附力测定─采用体外细胞培养法
1 细菌培养
双歧杆菌菌株接种于改良MRS培养基中厌氧培养24h,调节细菌浓度为108cfu/mL。
2 细胞培养
Caco细胞株购自协和医科大学基础所。使用MEM细胞培养液(含20%的胎牛血清),37度下在5%CO2-95%空气的二氧化碳细胞培养箱中恒温孵育,待细胞生长良好时(70%融合时)用消化液消化传代。细胞贴壁生长,通常是1~2d更换营养液,4d传代1次。
3 黏附实验
将培养好的人肠道上皮细胞Caco株进行消化,制成细胞悬液(105个/mL),接种于含20%胎牛血清不含双抗的MEM培养液后,放置入含洁净细胞飞片的24孔板(Costa公司)中,每孔中加入1mL细胞悬液,于5%CO237度细胞培养箱中孵育至单细胞贴壁。无菌PBS液洗涤3次,每孔加入1mL菌液(含菌体108cfu/ml)与1mLMEM细胞培养液的混合液,37度,5%CO2-95%空气中孵育2h。无菌PBS洗涤细胞飞片以除去未结合的细菌。然后火焰固定,革兰氏染色,显微镜下随机挑选20个视野,计数50个细胞上黏附的细菌数,每个处理平行三孔,再计算平均每个细胞所黏附的细菌数。
6.9.2.4 结果判定
数据以X±S来表示参考值范围,以q检验方法进行不同菌株与标准菌株间的比较,所有的统计分析采用SAS8.0完成。
疏水率或黏附细菌数与标准菌株相比,差异不显著或高于标准菌株,说明受试菌株黏附力强。
6.10 降低致病菌表面粘附能力
6.10.1 原理
乳酸细菌作为肠道中的优势菌群,在肠上皮细胞表面的黏附和定植可以竞争性的排除病原菌,以维护或调整胃肠道正常菌群的生态平衡。由于体内研究乳酸细菌对肠道病原菌竞争性黏附作用比较困难,通常采用体外模型研究乳酸细菌对病原菌的竞争性黏附作用。
6.10.2 材料
Caco-2细胞、改良型RPMI-1640细胞培养液、胎牛血清、Hank′s液、胰蛋白酶(0.25%)、水浴锅、离心机、吸管、血细胞计数板、倒置显微镜、受试乳酸菌、福氏志贺氏菌、MRS培养基、XLD 培养基、PBS缓冲液(pH7.4)、甲醇、Triton X-100。
6.10.3 分析步骤
6.10.3.1 将Caco-2细胞接种到24孔培养板中,接种量为每孔2.0×105个细胞,37度培养至完全分化。
6.10.3.2 离心分别收集5mL稳定期乳酸菌和福氏志贺氏菌的菌体细胞,用PBS缓冲液洗涤2次后,悬浮在不含胎牛血清的细胞培养液中,并调整菌体浓度为2×107个/mL,然后2株菌以相同的比例混合。
6.10.3.3 Caco-2单细胞层用PBS缓冲液洗涤2次,每孔添加1mL细菌悬浮液,以相同浓度福氏志贺氏菌悬浮液作为对照,37度培养1h。
6.10.3.4 弃除细菌混悬液,单细胞层用无菌的PBS缓冲液洗涤5次,添加1mL0.05%的Triton X-100,反复吹打使细胞完全裂解。
6.10.3.5 上述溶液系列稀释后,涂布XLD培养基,显微镜观察计数,10个随机视野中,每个细胞周围黏附的细菌个数的平均值记为菌株对Caco-2细胞的黏附值。
注1:细胞培养时注意防止污染。
注2:乳酸菌和福氏志贺氏菌都要保持高活性,且细胞数量相等。
6.12 微生物
6.12.1 乳酸菌活菌数
按GB4789.35进行测定。
6.12.2 酵母和霉菌
按GB 4789.15进行检验。
6.12.3 肠杆菌科
按SN/T0738进行检验。
6.12.4 金黄色葡萄球菌
按GB 4789.10进行检验。
6.12.5 沙门氏菌
按GB 4789.4进行检验。
6.12.6 单核细胞增生李斯特氏菌
按GB 4789.30进行检验。
7 检验规则
7.1 一般要求
每批产品应经生产厂检验部门检验合格后方可出厂,并附有产品质量合格证明。
7.2 组批
以同一原料,同一工艺生产的同一类型和统一规格的产品为一批。
7.3 抽样方法
7.3.1 产品按批抽样。批量少于600件时,从不少于3件包装中抽取样品;批量大于 600时件,从不少于0.5%比例的包装中抽取样品。每份样本总量不少于3倍试验检测量。
7.3.2 桶装产品应从表面 10cm以下处抽取样品,取样器应符合食品卫生标准。
7.3.3 抽取样品两份,签封,粘贴标签。在标签上应注明产品名称、生产厂名及地址、批号、取样日期及地点、取样人姓名、一份送检,一份封存,保留15天备查。做微生物检验时,取样器和玻璃瓶应事先灭菌(样品不应接触瓶口)。
7.4 出厂检验
出厂检验项目为感官、乳酸菌活菌数、产酸活力或发酵酸度。
注:作为不同产品应用的添加菌种,乳酸菌活菌数及产酸活力或乳酸菌活菌数及发酵酸度,可根据选择进行检验。
7.5 型式检验
7.5.1 型式检验项目为本标准规定的全部要求。
7.5.2 一般情况下,型式检验每6个月进行1次。有下列情况之一时,亦需进行: a)更改主要原辅材料;
b)更改关键工艺和设备;
c)新试制的产品或正常生产的产品停产3个月以上重新恢复生产时; d)国家质量监督机构进行抽检时。
7.6 判定规则
检验结果如有不合格时,可以从该批产品中加倍抽取样品,对不合格项目进行复检,复检结果只要有一项不合格,判该产品为不合格。
8 标志、包装、运输、贮存
8.1 预包装产品标签应符合GB7718的要求。一个销售单元(外包装或大包装)内含有相同品种、独立包装但不单独销售的产品,可只在外包装(或大包装)标示强制内容。直接提供给消费者的预包装产品根据产品特性,还应标注类型或乳酸菌菌种名称、产品用途、使用方法等。
8.2 包装储运图示标志宜符合GB/T 191的规定,包装应注有产品名称、制造厂名、厂址及联系方式、净含量、生产日期、保质期。
8.3 包装物和容器应整洁、卫生、无破损,并符合《中国人民共和国食品安全法》的规定。
8.4 运输过程中,应防尘、防蝇、防晒、防雨,严禁与有毒、有害物质混装混运,应提供运输、贮存说明。
8.5 根据产品类型,符合产品标称的贮存条件,严禁与有毒、有害物质混放。 附录A
(资料性附录)
检验方法
A.1 一般规定
A.1.1 本附录所用试剂和水,在没有注明其他要求时,均指分析纯试剂和符合GB/T6682-2008规定的三级水.试验中所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品,在没有注明其他要求时,均按GB/T601、GB/T602 、GB/T603的规定制备。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时,均指水溶液。
A.1.2 本附录中的设备和材料、培养基和试剂、计数方法、结果的表达及结果与报告参照GB4789.35。
A.2 嗜热链球菌计数
采用MC或M17培养基,需氧培养,(37±1)度,48h~72h。
A.3 德氏乳杆菌保加利亚亚种计数
采用MRS培养基,厌氧培养,(37±1)度,48h~72h。
A.4 双歧杆菌计数
对于单纯的双歧杆菌的选择性检测,采用MRS或OS培T养基。在200mL培养基中加入2mL浓度为5%的盐酸半胱氨酸溶液(每次使用前配制)。(37±1)度,48h~72h。
对于双歧杆菌与其他乳酸菌的混合产品的选择性检测,采用MRS或在200mL培养基中加入10mL浓度为0.1%的莫匹罗星锂盐溶液(每次使用前配制)。厌氧培养,(37±1)度,48h~72h。
A.5 嗜酸乳杆菌计数
对于单纯的嗜酸乳杆菌的选择性检测,采用MRS培养基。在200mL培养基中加入2mL浓度为5%的盐酸半胱氨酸溶液(每次使用前配制)。厌氧培养,(37±1)度,48h~72h。
对于嗜酸乳杆菌与其他乳酸菌的混合产品的选择性检侧,采用MRS培养基,调整其pH为7.0。在200mL培养基中加入0.4mL浓度为0.005%的盐酸克林霉素(使用前于4度放置14d)和1mL浓度为0.2%的盐酸环丙沙星(使用前于-20度放置56d)。厌氧培养,(37±1)度,48h~72h。
A.6 干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌计数
对于单纯的干酪乳杆菌(或鼠李糖乳杆菌)的选择性检测,采用MRS培养基。厌氧培养,(37±1)度,48h~72h。
对于干酪乳杆菌(或鼠李糖乳杆菌)与其他乳酸菌的混合产品的选择性检侧,采用MRS培养基,调整其pH为7.0。在200mL培养基中加入1mL浓度为1%的万古霉素(使用前于4度放置14d)。厌氧培养,(37±1)度,48h~72h。
注:当产品中同时含有干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌时,无法对二者分别进行选择性计数。
A.7 明串珠菌计数
采用MRS培养基,在200mL培养基中加入1mL浓度为5%的万古霉素溶液;
需氧培养,(24±1)度,72h。
A.8 乳酸乳球菌计数
采用M17培养基,调整其pH为7.0。需氧培养,(24±1)度,48h~72h。
A.9 片球菌计数
采用MRS培养基,调整其pH为6.0~6.4。厌氧培养,(37±1)度,48h~72h。
MRS 琼脂培养基:蛋白胨10g,酵母提取物5g,牛肉浸膏10g,K2HPO42g,柠檬酸铵2g,乙酸钠5g,葡萄糖20g,土温80 1mL,MgSO4·7H2O 0.58g, MnSO4·4H2O 0.25g,琼脂15g,水1L,调pH6.2~6.4,121度灭菌15min。
M17培养基:大豆蛋白胨5g,酵母提取物5g,蛋白胨5g,抗坏血酸0.5g,牛肉浸膏2.5g,1.0mol/L MgSO4·7H2O1mL,β-甘油磷酸二钠 19g,蒸馏水1L,pH7.1,121度灭菌15min,固体培养基含琼脂15g。
MC培养基:
FAO/WHO《食品益生菌评价指南》
一、细菌属、种、株的鉴定用表型实验和基因分型实验方法
DNA序列编码16S 核糖体RNA 的方法
表型实验
糖发酵的生化反应
葡萄糖发酵终产物
基因分型实验
脉冲场凝胶电泳(PFGE)实验是标准方法
菌株应按国际培养物保藏方法保存。
二、推荐的筛选益生菌的体外实验
对胃酸耐受性
胆酸耐受性
粘膜粘附性和/或人上皮细胞粘附性
对条件致病菌的抗菌活性
降低致病菌表面粘附能力
胆盐水解酶活性
对杀精子剂的耐药性 (适用于阴道用益生菌)
三、益生菌安全性测定实验
抗生素耐药性谱测定
评价代谢活性物(D-乳酸盐的产生等)
评价人体试验副作用
进行售后流行病学调查和监测
产毒菌种,必须测定其产毒能力
菌株属于已知具有溶血性,必须测定其溶血活性
四、动物实验和人体实验
随机双盲对照实验设计,与安慰剂对比研究其功效。此外,该阶段还要测定是否有副作用。安慰剂为缺乏益生菌的食物载体。样本量根据特定终点计算得出。统计学意义的解释必须与生物学接轨相结合。
声称该益生菌可以改善疾病状况,则必须有相应的人体试验结果予以支持,且人体试验至少重复一次以证实结果。
标签内容:
(1)属、种、株名称,菌株名不能诱导消费者对其功能产生误解;
(2)每个菌株在保质期内的最小活菌数;
(3)每单位推荐摄入量内达到益生菌声称的保健作用的有效剂量;
(4)保健功能;
(5)储存条件;
(6)消费者与公司的详细联系方式。
范文五:乳酸菌在水产行业应用.doc
乳酸菌在水产行产产用
近年来, 随广着人产产产物性食品安全的泛产注,产色、安全且能有效替代抗生素和抗菌产物的产料添加产的产成产人产的究产点。益生菌制产因产而生。产于益生菌研研
制产~2002年洲产威机洲食品产料菌产产欧构欧与会(EFFCA)产出最新定产:益生菌是活的微生物,通产产入充足的量数,产宿主生产一产或多产特殊且产产产产的功能性健康益产的菌产。微生产制产是指用产物正常的有益微生物产特殊工产制成的活菌制产。其体内
中,乳酸菌产微生产制产的究也已成产近年究的焦点之一研来研, 目前~在多微生众物添加产中, 乳酸菌制产是产用微生物添加产中产用最产泛广,效果产好的一产~是多产它水产产物消化道主要的共生菌, 能形成正常菌群,也是中最早公布的产可直接使国两
用的产料产微生物添加产菌产之一。乳酸菌可以在水产产物产道大量定植内,有效产整产道菌群平衡~可分泌乳酸~产生多产消化产~助食物消化和代产并帮,促产产产物产的吸收和利用; 同产产能通产产产产、占位产、分泌产菌素等致病菌产它争争与争,抑制有害菌的繁殖,改善产道产境内,产整胃产道菌群平衡,提高产物健康水平。产产料和畜禽水产产它
殖产的健康产展提供了一高效、无公害、无产染的新途。条径
1 乳酸菌的生理特性
乳酸菌指产酵糖产主要产物产乳酸的一产无芽产、革产氏染色性阳产菌的产~形产称、代产性能和生理特征不完全相同。学产胞形产多产杆或球状状,不生产产子,不产或少运运产,不耐高温, 但耐酸,在pH3.0-4.5产仍可生产,产胃中的酸性产境有一定的耐受性,产产要求产格,除了水化合物碳,产需要多产基酸、产生素和产等。在产物通产生物产产氨体内,降低pH,阻止和抑制致病菌的侵入及定植,降解产硝、、产产和产臭素等有害物产氨氨,活菌和代产产物中含有产高。目前在自然界已产产的产一产菌在产菌分产上至少包体内学
括 23 个属:乳酸杆菌~杆菌、肉食杆菌、产球菌、明串珠球菌、属双歧属属属属
乳球菌和芽产乳杆菌等。乳酸菌产大多生产繁殖于产或微耗、产物产和有属属数氧氧
机产产物富的酸性产境中~分布十分泛~在产酵生产丰广(青奶产产料、泡菜和酸)的培产物和产物消化道中含量产高。
2乳酸菌的作用机制
2.1 抑菌机制
产菌在产物产道定居和产产生存的因素内,包括胃酸、产、消化产、免疫反产、胆 内个会源微生物及其产生的抗菌素。产些因素中任何一因素的改产都产致产菌活的超氧歧化化产(SOD),能增强液免疫和产胞免疫。乳酸菌的抑菌机制正是的生化体它
特性改产了致病菌的生存产境和生产机制, 从达而到抑菌的效果。
2.1.1 通产产酸改产产道微生产产境抑制有害菌的生产
乳酸菌在产酵乳糖产体内, 生产大量的醋酸和乳酸, 使产境 pH下降,产道产于酸性产境,而产道的病原产菌最适生产的 内pH 产7.0-7.4,由于乳酸菌产酸及产胞崩解产酸使产道内pH下降,不利于产道病原菌在产壁定殖和生产内,产致病原产菌活力下降产而衰老和死亡,产持了产道的生产平衡,使产道得以产产正常的生理功能。
2.1.2 通产产生某些抗菌物产抑制有害菌生产
乳酸菌除了产生有机酸,产可产生产化产和安息香酸等抑菌物产氧,合成溶菌产及其他抗菌物产,如乳酸菌素、乳酸产球菌产和嗜酸菌素等,产些产物产产道病原菌有抑制作用。产化产和产菌素等在抑制病原菌上的机制被产附抗性。附于产道产膜氧称黏黏黏,是病原菌定植产生产床症的前提件。微生物病原微生物产存在产附并状条体内与争
着小产上皮位点的作用,即争产产排斥作用,如果产些位点被产多的有益菌株占据,病原菌就被排斥。乳酸菌可通产病原菌产生存和繁殖的空产、产产、定居位点及产产的会与
产争,从黏黏而抑制病原菌附在产膜上皮产胞上,达到抑菌作用。
2.2 产产机制
乳酸菌在产物正常产产代产活性体内, 就能直接产宿主提供各产可利用的必需基氨酸和各产产生素及消化产(如淀粉产、蛋白产和产产素产等)等,产可提高产物产(如产、、产和磷产) 的消化率和吸收率,从而增强产物的产产代产,促产产物机的生产和生产。此外体,乳酸菌产生的酸性代产产物使产道产境偏酸性,而一般消化产的最适pH 酸性(淀粉产pH6.5,糖化产pH4.4),有利于产产素的消化吸收,有机酸的产生产可加强产道的产和分泌蠕,也可促产产分的消化吸收。
2.3 免疫机制
乳酸菌能增强产物机免疫力体,表产在2个方面: 1)影响异非特性免疫产答, 增强产核和巨噬产胞活力, 刺激活性、溶产产和产氧体核因子的分泌。2)刺激特性免疫产异答, 如加强膜表面和黏清血中IgA、IgM和IgG水平,以加强液免疫。促产体T淋巴产胞和B淋巴产胞的增殖, 加强产胞免疫。Schiffrin 等( 1994) 产产, 产氏乳杆菌(L.johnsonnii ) Lj1和乳酸杆菌双歧(B.lact is ) Bb12 能在外增强产产胞产大产菌体噬
的产作用噬; 嗜产产球菌与沙产菌一起使用可起到免疫佐产的作用,产著提高血清中IgA 含量。乳酸菌产免疫系产的刺激机制产在产一步研究中。Ouwehand等( 1999) 提出了产入益生素(含乳酸菌) 产免疫刺激作用的可能途径,抗原性物产通产淋巴产中的产泡上皮, 通产途有 径2 产:1)微生物代产产物或碎片作产小分子抗原直接通产普通上皮产胞或透产上皮产胞产的产密产接产隙。2)微生物产胞本身由微产产胞通产胞产作用产送产位于微产产胞包囊中的巨噬产胞等, 抗原产入淋巴产产后, 或由抗原提呈产胞产理或直接交产淋巴产胞, 产生相产的免疫产答。
2.4 中和中毒, 防止腐产产物的产生
某些产菌能中和或少减内毒素等有害物产的毒害作用。目前产产, 双歧杆菌可防止产内氨容物产生, 蜡内静脉氨产芽产杆菌可降低产容物和肝产产中血的产度, 使产和产产酚等有害物产少。减
3 乳酸菌产产物的保健和治产功效
国内外已有大量的产产和产床产产产明, 其产道产果不一致,有正效产, 有产效产,但据产产, 正效产仍多于产效产。造成产果不一致的原因多很,如产产产物的品产、 年产、 产产产境、 菌株产量及有无产激等, 但乳酸菌产产物机的有益作用产是公产的。体
3.1 改善胃产道功能, 降低产物胃产道疾病的产生率
乳酸菌是产道的产产菌, 畜禽服用后,通产产酵产酸可改产胃产道产境内, 抑制有害菌的繁殖, 产整胃产道菌群的平衡。也可通产其产生的附素产产膜产胞产黏与黏密产合, 在产
黏膜表面定植占位,成产生理屏障的主要部分,从达而到恢产宿主抵抗力、 修产产道产菌屏障和治产产道疾病的作用。
3.2 提高产物免疫力, 增产产物健康
乳酸菌在产物通产体内体异异刺激产物机的非特性免疫产答和特性免疫产答, 产产产生干产素、 促产产胞分裂、 产生抗及促产产胞免疫体, 提高机的抗病能力。体
3.3 促产产物生产, 提高产料利
用率,降低产产成本,提高产产效产乳酸菌在产物自体内身代产产生各产产产物产提供产宿主, 如各产产生素、 必需基酸及各产消化产氨,从而增强产物的产产代产,促产产物机的生体产和生产, 同产乳酸菌可降低产道 pH, 其偏酸性利于各产产活性的产产,利于产产素的消化吸收及降低产产成本。
4 产用产状
产上所述, 乳酸菌具有产防、治产疾病、 产产和保健等功效。近年来, 越越来多的人产抗生素产料添加产的弊端有了深刻产产, 产多学者产产投入到了克服产些弊端的微生产的究中研,推产了微生产制产的产展。目前, 乳酸菌制产已泛产用于广猪、 产、 牛、 羊和水产产殖等各产个域。
5存在的产产及展望
5.1 菌株的产产
目前市产上产的水产益生菌制产主要有售双歧光合产菌、乳酸杆菌、杆菌、EM菌、芽产杆菌和培产物等大产。而作产益生菌制产中几——重要的一产乳酸菌菌株的产产和活性的产定是产产产产,决几个定着其使用效果。合格的乳酸菌菌株必产产足以下方面要求。
5.1.1 正的源确来
寄主的产产特性和产境因素,在定产道菌菌群产和产成方面各决构起 50 %的作用, 寄主和产道菌产存在着相互产产和相互依产的产系。因此~产多学者产产理想的益生素菌株最好自产物自来体内体内身胃产道。产的乳酸菌菌株毫无疑产更易在幼苗定植,所以菌株的源产和使用产来当象一致, 只有产产才能增强益生菌功效的特性和产产性。异所以~有产产性的乳酸菌制产的产研具有产大产展前景。
5.1.2 定植和附力黏
益生菌乳酸菌通产产产道液的附定植产而黏黏与体起到产持机健康的作用~产然有产产产道菌平衡和改善产境的作用内,但其是通产产产道液的附定植产而黏黏与起到产持机健康的作用~体黏个所以乳酸菌在产壁上的附和定植是其产产作用的一重要步产, 是大量繁殖产成产产产群的前提, 所以附力的强黏黏黏弱~产产液附产产的产短是产产益生菌菌株的重要产准。
5.1.3 在酸性和高产产境中的生存能力胆
口服是益生菌产入产道的主要途径,所以益生菌在产入大产之前必产产受胃中产酸和小产中高产度胆胆产的考产。只有在产酸和产中成活率高的菌株才有可能产产作用。5.1.4 特的生理功能异
每一产乳酸菌具有其特定的生理功能。如嗜酸乳杆菌 GG 产寄主的免疫系产有产强的产解作用,而鼠乳酸杆菌产大产杆菌有产强的抑制作用。目前,中在乳酸菌国制产的究和产用方面产然研取得了一定的成产,但产是比产薄弱,尤其是作用机理了解得不十分清楚, 大多究产数研停留在使用效果水平上,产其生理功能~作用机制等基产理产方面的究产产产不产研,因此产致其作用效果不是产定。很个只有产各菌株的产效和生物特性有深入产致的究和了解研,才能根据不同情况产产出有促生产作用的微生产制产。
5.1.5 产品中产定的活菌数
微生产产品中活菌的量是其产产作用的数根本保产,所以要求菌株在生产和保存产程及加工后活菌存活率高, 混入产料后高下产定性好。温
5.1.6 不使人和产物致病会, 不病原微生物产生产与交产
必产用本产物或产产产物做急性毒性产产、 产急性毒性产产和致畸致产产残, 只有安全性好的菌株才能作产生产菌产。
5.2 使用产产
微生产制产在产物的整生产产个程都可使用,但不同的生产产期其作用效果不相尽同。一般幼产产物,体内尚微生产平衡未完全建立,抵抗疾病的能力产弱,此产引入益生菌,可产快地产入体内,占据附着点,效果最佳。外另,在、产、产料产产、断奶运气天突产和产产产境产劣等产激条件下, 产物微生产平衡体内坏遭到破,使用微生产制产产形成产产产群极产有利,因此,把握产用产机,使其益生作用得到充分产。体
5.3 使用产量
微生产制产的作用是通产有益微生物在产物一体内来系列生理活产、产产的, 其最产效果同所使用的菌株的量数密切相产,数量不产, 在不能形成菌群产产体内, 产起到益生作用。根据产产,如果一产产菌在盲产内容物的产度低于107个/ g, 产菌产生的产及代产产物不足以影宿主响; 数量产多, 超出占据产附着点和形成产产菌群内所需的菌量, 非但功效不增加会,反而造成不必要的浪产。微生产制产用于特定产殖产物所需的菌群数量无产一的产定。尚
5.4 提高产品中的乳酸菌量及数采用多菌株产方制产
产了更好产产乳酸菌的使用效果, 近年在产微生物的菌株改来造、 生产工产和产品形式等方面作了产多究工作。主要有以下方面研几个: 1)多菌株配伍使用。有产产表明,乳酸杆菌和杆菌双歧氧与氧配合使用能增加其效果。产格产的菌株非产格产菌株产行共培产,可提高产菌的产量和存活率氧,利于各菌株产产效用。2) 提高成品中乳酸菌的量。菌生产需要的微量数将体氨元素、基酸和 B 族产生素等物产添加在培产基中, 促产菌株生产,可延产其在成品中的存活产产。3)利用合适的产体, 使菌株成功到产达
期位置产生作用。Kailasapathy 等产产,奶双歧体是乳酸杆菌和杆菌的有效产,使其产入产道后存活率提高。4) 与产制产、有机产、多产和中草产等物产的产合使用。5.5 乳酸菌产微生产制产的安全性产产
活的微生物产用于产料和食品中, 其在的致病性、 抗产基因产潜移的可能性及繁殖和产的不可异控制性都是需要注意的。Adams( 1999) 产述了可能由乳酸菌引起的机体感染症, 包括心内膜炎、 菌血症及其他一些胸部和消化道感染。我产产当潜注意上述乳酸菌的在危产, 但更产看到乳酸菌更大的有益作用, 有产据表明, 除了产球菌外,由乳酸菌引起的人产感染是少的。因此极, 科家学产产产~只要在有效产督控制下,产乳酸菌产行产格产产后再使用是安全的。
6 国内外允产使用的乳酸菌产
1989 年, 美国 FDA 和美国会喂产料控制官产产公布了可直接产和一般产产是安全的微生物菌产名产, 共42 产, 其中乳酸菌菌产有:双歧双歧杆菌、 嗜产杆菌、 嗜酸乳酸杆菌、 保加利产乳杆菌、 乳酸乳杆菌和胚芽乳杆菌等。我国产产部第 105 号公布的允产使用的产料添加产品产目产中,微生物添加产有12 产, 干酪乳杆菌、 植物乳杆菌、 乳酸片球菌、 枯草芽产杆菌、产豆芽产杆菌、 嗜酸乳杆菌和乳产球菌等。产之, 乳酸菌产微生产制产产产料和畜禽产殖产提供了一高效、 无害无产染且无条残留的新途。其产生和产展产产了前高新径当技产产产化和注重产保的主流,在产用中充分考产产物菌群自身特点及寄主产境产的产与学系。科合理的使用, 必成产将本世产产料添加产的主产产品。