范文一:一种高效的小鼠肺单细胞悬液制备方法的研究(可编辑)
一种高效的小鼠肺单细胞悬液制备方法的研究
‘医学版
东南大学学; 一?,’ ’‘、.‘。., . , ,: ? . ,, ,.??. ,, ,. , , , ?. ., ,: ? . . ,
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一
种高效的小鼠肺单细胞悬液制备方法的研究
刘军,张朋书,于晴,邱海波
东南大学附属中大医院,江苏南京摘要 目的:应用胶原酶 酶消化法建立一种高效的小鼠肺单细胞悬液制备方法。方法:小鼠处死后取出
肺脏,将其剪碎,应用胶原酶消化,孵育 ,随后进行细胞计数、活细胞百分率和流式
细胞仪检测。结果:光镜下见胶原酶 消化所得小鼠肺细胞多种多样,大小不一,细胞形态完整,分散度
好; 小鼠肺组织可提取细胞数量为 ~ × 。个,肺单细胞悬液中活细胞百分率均在 %以上; 流式细胞术检测可见大量的肺细胞。结论:应用胶原酶 酶消化法制备小鼠肺单细胞悬液高效、简便,
为肺细胞生物学及肺部疾病发病机制研究提供了有效的肺单细胞制备方法。
关键词 肺单细胞悬液;酶消化法;胶原酶 ;小鼠
中图分类号 一 文献标识码 文章编号 ? ? : . /. . .. .
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收稿日期?修回日期 ?基金项目 江苏省医学领军人才基金资助项目 ;江苏省 重点人才基金资助项目 ;江苏省高校科研创新计划项目
作者简介 刘军 一 ,男,江西九江人,副主任医师,在读博士研究生。: .通信作者 邱海波 : . . 东南大学学报 医学版 年 月, , 。,.?,;; ;小鼠由于来源广泛、免疫及遗传背景清楚、基因与 应用’ 平衡液以浓度配制胶原
人类相似、价格便宜、所需试剂的量相对较小,是急性 酶 消化液,牛血清白蛋白使用时以新鲜配制的
肺损伤 、肺部感染、哮喘、肺气肿、肺纤维化等肺 液配制为 %浓度。
部疾病动物模型中常用的动物? 。制备小鼠肺单细
. 实验方法
胞悬液为近年一些实验室常用的技术,是肺细胞生物
. . 小鼠肺的采集 小鼠处死, %医用乙醇消毒
学研究的前提。实体肺组织单细胞悬液的制备较为困 局部皮肤,无菌操作打开胸腔取出肺脏并移入平皿中,
难,获得产率高、活性高、功能强的单细胞对于进一步
无菌清洗肺组织表面的血液及血凝块,去除气管
的实验研究十分必要,而细胞数量不足、细胞碎片过 和支气管。
多、细胞粘连成团等均可导致整个实验的失败 。近
. . 胶原酶 消化法制备肺单细胞悬液 取
年来,尽管小鼠作为模式动物在生物医学研究中的优 肺组织,无菌状态下应用眼科剪将肺组织轻柔剪成
势越来越明显,但目前有关肺单细胞悬液制备的报道 ~小块,然后用匀浆机匀浆。将组织加入预
较少,尤其是动物实验中小鼠肺组织量极少 成年小 热至 ?的新鲜胶原酶
消化液中,置人 ?的水浴
鼠肺组织仅约 ? ,如何应用少量小鼠肺组 箱中,每隔 ~轻轻振摇 次。 时可见肺
织制备足量的肺单细胞悬液以进一步进行实验研究值 组织几乎全部消化,冰浴终止消化,轻轻吹打分散细胞, 得关注。
收集消化液; 目不锈钢网过滤;离心 ~, 目前常见的分散组织以制备单细胞悬液的方法有 ;去上清,加入轻柔吹打;
离心去上清;加入
机械法和化学 酶消化 法 。现在分离组织单细胞 红细胞裂解液 ,冰上孵育 ;离心去上清;加 悬液常用的有以下方法:机械法,适宜于一些纤维成分 入吹打,再离心漂洗 ~ 次,去上清,加入含 % 很少的软组织,但该方法对组织损伤较大,易引起细胞 的 ? 得到小鼠肺
单细胞悬液。
损伤和丢失;酶消化法,适宜于含结缔组织成分多的标 . 细胞鉴定
本,所需的组织需要量少,但酶可消化细胞膜上的某些 . . 细胞形态学观察 光学显微镜下观察肺细胞
成分 。机械分离法简单,但由于分离组织不彻底、 形态。
含有组织块较多、分离的细胞数量偏少等原因,现已较 . . 细胞计数 吸取少量细胞悬液,加到细胞计数 少采用,宜根据组织类型、研究目的及要求选择恰当的 板上,在倒置显微镜 ×物镜 下计数 个大方格内 方法和试剂。制备小鼠肺单细胞悬液是非常重要的 的细胞总数。按公式计算,细胞数目大格细胞数 一
个实验环节,对于研究肺部疾病的细胞学机制,探 之和/ × ×细胞原液量。
讨防治策略具有重要意义。本实验应用少量的小鼠 . . 细胞活性测定 台盼蓝排斥实验 吸取 滴 肺组织,采用胶原酶 酶消化法成功制备了小鼠肺 细胞悬液,加入 滴 . %台盼蓝,混匀后在内 单细胞悬液,并应用细胞计数和流式细胞术等对其 计数活细胞和死细胞数量,计数细胞活性率。蓝染细 进行了鉴定
胞为死亡细胞,活细胞不着色。计数 个细胞,计算 出活细胞百分率。
材料和方法
. . 流式细胞术检测肺细胞悬液 取小鼠肺单细
. 材料
胞悬液样本,离心去上清,加人 . 溶液,混匀 .. 实验动物 级健康雄性 / 小鼠,
后应用流式细胞仪检测分析。
~ 周龄,体质量 ~,购自中国人民解放军军事 结 果
医学科学院实验动物中心提供合格证号:苏军 ? 。 . 细胞形态
.. 主要试剂及配制 型胶原酶和台盼蓝均购 光镜下,胶原酶 消化法所得小鼠肺细胞多种多 自 公司, ’ 平衡液、液和红细胞裂解液 样、大小不一,但细胞形态完整、边界清晰、分散度好、 由碧云天生物技术研究所提供,牛血清白蛋白购自 背景较干净、杂质及细胞碎片较少、细胞团较少 公司。 图 。
范文二:实体组织单细胞悬液制备方法
?490?
临床与实验病理学杂志.,ClinExpPathol2007Aug;23(4)
实体组织单细胞悬液制备方法
任兴昌,方黎,陈洪勋
关键词:实体组织;单细胞悬液;HE染色1.2.3机械一化学法固定组织用清水浸泡几天后用刀切中图分类号:R
446.8;R944.17
文献标识码:B
成1.00mm2的小块或用刀在组织块表面刮出薄薄的细胞团文章编号:1001-7399(2007)04-0490—02
块。切成小块的组织加适量的EDTA溶液静置过夜,期间震荡数次。280目筛网过滤,取滤液,2
000
r/min离心10
min
在实际工作中由于机器操作和手工操作均不能保证每后弃上清;薄细胞团块则280目筛网过滤后,直接加入适量
张玻片的条件一致,因此到目前为止还没有有效可靠的对照的红细胞裂解液,细胞团块则280目筛网过滤,取滤液加入方法,故其标准化问题日益受到大家的重视。我们以新鲜组适量的红细胞裂解液,震荡后静置40rain,转入50IIll离心织和固定组织为标本,探讨实体组织单细胞悬液制作的具体管中2
000
r/rain离心10min后弃上清。然后加适量的ED—
过程,为实现一一对照式原位玻片检测技术寻求一套全面、TA溶液静置过夜,每半小时震荡1次。后续操作同机械打可靠的技术方法。散法。1材料与方法
2结果
1.1标本选择杭州市中医院临床活检标本,包括新鲜组在HE染色切片中细胞核呈蓝色,血红细胞呈红色,细织和固定组织,运用机械法、机械一酶消化法、机械一化学法胞碎片呈淡蓝色,微生物呈蓝色¨’21。
来制备单细胞悬液,并将制备的单细胞悬液取少许进行HE通过比较3种制备实体组织单细胞悬液的方法(表1),染色,常规显微镜观察,以选择最优方法。
HE染色后镜检结果表明在细胞密集度方面,机械一酶消化≮
1.2方法
法效果最好,机械法其次,机械一化学法较差;细胞形态保存1.2.1机械打散法将新鲜组织块用生理盐水(加入10%
方面,3种方法的效果相似;细胞损坏度方面,机械法造成大的肝素)洗涤,然后浸泡40min;固定组织则在清水中浸泡几量的细胞损伤,其它方法的结果差不多;污染度方面,只有用
天后用匀浆机打散或手工磨碎。打散后的产物倒入50IIll
酶消化一机械法制备新鲜实体组织单细胞悬液时出现了少
离心管中,2
000
r/min离心10min弃上清,加入适量的红细
量的杆菌污染;血红细胞数量方面,每种方法均有血红细胞胞裂解液,震荡后静置40min,2000
r/min离心10rain后弃
存在,但机械法的较多;细胞团块方面,只有用机械一酶消化
上清。加入适量的生理盐水或PBS液冲洗后,离心弃上清,法制备固定实体组织单细胞悬液时存在一部分细胞团块。
重复此步骤2~3次,沉积物加入3倍的特制保存液,4℃保3讨论
存,取少许涂片进行HE染色,封片后镜检。
1.2.2机械一酶消化法将组织块用生理盐水(加入10%
我们用新鲜组织和固定组织为标本,进行实体组织单细的肝素)洗涤,然后浸泡40min左右;固定组织用清水浸泡胞悬液制作,为组织化学、免疫组织化学、原位杂交等实现一几天后用刀切成1.00mm2的小块或用刀在组织块表面刮出一对照式的原位玻片检测技术寻求一套全面、可靠的技术方
薄薄的细胞团块。加入t0%福尔马林震荡后静置40
rain,2
案奠定了实践基础。目前虽然新出现了一种Mediinachine
000
r/min离心10min,去上清液,然后加入生理盐水漂洗。
系统,该系统是将实体组织制备成单细胞或单细胞核悬液的小块组织加适量的胶原酶Ⅱ溶液在37℃的温箱中静置过自动化系统口J,但它仍不适用于临床病理工作。
夜,期间震荡数次。280目筛网过滤,取滤液,2
000
r/min离
机械分散法主要包括剪碎法、网搓法、研磨组织法使细心10rain弃上清;薄细胞团块则280目筛网过滤后,直接加胞从紧密联结的组织中释放出来一。。该方法操作简便快捷入适量的红细胞裂解液,震荡后离心弃上清,然后加适量胶无污染,但常常造成大量的细胞损伤,细胞产量较低。为使原酶Ⅱ溶液在37℃的温箱中静置过夜,期间震荡数次。2
细胞碎片不影响检测结果,还需采用适当的方法除去碎000
r/rain离心10min弃上清,加入适量的生理盐水或PBS
片"o。而且固定后直接绞磨所制的单细胞细胞膜破坏大,所液冲洗,重复2—3次,最后于沉淀中加入特制保存液,取少以机械法制得对照物的阳性部分最好的是细胞核和胞许涂片进行HE染色,封片后镜检。
质H’“。新鲜组织的细胞形态比固定过的组织易受损坏,且前期的处理方法不同,所以同种方法新鲜组织和固定过的组
收稿日期:2006—11—09修回日期:2007一01—05织的效果有差异:用机械打散法制得的完整细胞特别少,而
作者单位:杭州市中医院病理科,杭州310007
用机械打散法制备固定实体组织单细胞悬液则完整细胞较作者简介:任兴昌,男,主任医师。E-mail:xch_ren2000@yahoo.tom
多。
万
方数据
临床与实验病理学杂志JClinExpPathol
2007
Aug;23(4)
。491?
机械一酶消化法是先用机械法将组织初步分散再用酶进一步消化分离。这里采用的机械法较机械分散法温和,细胞损伤率不高。实体组织的酶主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶和胶原酶3种。酶对实体组织的分散作用主要是水解组织间的胶原纤维和黏多糖物质,分开细胞间的紧密连接,达到制备单细胞悬液的目的¨J。用酶消化时要根据组织选择相应的酶及作用条件,含有大量结缔组织的肿瘤如食管癌、乳癌、皮肤癌等应用胶原酶为主,胶原酶具有在钙离子、镁离子存在或在血清状态下不发生活性减低的特点。本实验用的材料多是上皮组织及癌组织,所以用胶原酶Ⅱ溶液在37℃温箱内消化。胶原酶Ⅱ对胶原的消化作用很强,它仅对细胞问质有消化作用丽对上皮细胞影响不大,适用于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织。机械一酶消化法在操作上比机械法繁琐费时,但细胞形态的保存较好,完整细胞的数量较多、细胞碎片较少、基本上无细胞团块。当标本为新鲜组织时出现了杆菌污染,这是由于用胶原酶Ⅱ溶液在37℃温箱下消化,而37℃是在杆菌生长温度范围内,所以易造成污染。若是固定组织则基本上不会出现细菌污染。
综合以上分析,我们认为具体制备实体组织单细胞悬液应该视不同特性的组织和实验目的而定。在以新鲜实体组织为材料时机械分散法、机械一化学法较难获得足够浓度的
单细胞悬液,机械一酶消化法是较好的制备方法。在制备固定实体组织单细胞悬液时,机械分散法的效果与机械一酶消化法差不多,但是在操作上前者要简捷方便的多且费时少。所以机械分散法是制备固定实体组织单细胞悬液中较好的方法。参考文献:
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?国外期刊文摘?
多发性胃肠道间质瘤
KangDY,ParkCK,Choistromal
例多发性GISTs中,散发性5例,家族性KIT基因突变2例,另外5例合并神经纤维瘤病1型。除1例散发性GISTs外其他4例以及家族性多发性GISTs都显示KIT基因突变,且
JS,eta1.Multiplegastrointestinal
andgeneticanalysisof12pa-
tumors:Clinicopatholo西c
tients.Am
JSurgPathol,2007,31(2):224—232.
每位患者的每个GIST肿瘤具有相同的突变。但是在1例散发性GIST中观察到不同类型的KIT基因突变。2例家族性
多发性GIST表现为cajal间质细胞弥漫增生并广泛累及胃肠道。发生在空肠合并神经纤维瘤病1型的多发性GISTs无KIT或PDGFRA基因突变。在这些病例中KIT基因突变的类型不同,由此作者提出:罕见情况下,胃肠道内GISTs复发可能是多原发灶,而非真正复发。多发性GISTs呈独特的临床、表型和遗传特点,而这些特性取决于其特殊的发病机制,不管GISTs的肿瘤数目多少或者表型如何,其总体预后良好。
(付长霞1摘译,张仁亚2审5/1潍坊医学院病理教研室,潍坊261042;2济宁医学院附属医院病理科,济宁272029)
胃肠道间质瘤(GISTs)起源于转化的肿瘤性前驱Cajal间质细胞(ICC),是最常见的胃肠道问叶性肿瘤。多发性胃肠道间质瘤(GISTs)罕见,通常合并神经纤维瘤病1型和家族性GIST。在GISTs的肿瘤形成过程中,KIT和PDGFRA的激活似乎是主要的肿瘤形成事件。CDll7免疫组化测定KIT蛋白表达,几乎是GISTs和KIT突变的诊断标准,见于60%一90%病例,但其预后意义尚未充分阐明。作者针对多发性GISTs进行了多中心研究,通过分析其临床、表型和遗传特征,阐明其潜在的发病机制和临床生物学行为。作者对12例多发性GISTs患者的47个蜡块进行了分析。分别从肿瘤、正常黏膜、KIT基因突变的4种外显子和PDGFRA基因突变的3种外显子中提取基因组DNA,并进行了检测。12
万方数据
实体组织单细胞悬液制备方法
作者:作者单位:刊名:英文刊名:年,卷(期):被引用次数:
任兴昌, 方黎, 陈洪勋
杭州市中医院病理科,杭州,310007
临床与实验病理学杂志
CHINESE JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL PATHOLOGY2007,23(4)1次
参考文献(7条)
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相似文献(3条)
1.期刊论文 李宾. 周春喜 用Medimachine系统制备实体组织的单细胞悬液 -临床与实验病理学杂志1999,15(4)
流式细胞术(flow cytometry, FCM)作为一种可在单细胞水平上对大量细胞进行快速、准确、多参数定量分析和分选的高技术,在细胞生物学、免疫学、肿瘤学等方面的应用日趋广泛和深入.进行FCM分析的前提是样品为单细胞悬液,而大多数实体组织都难以制成高质量的单细胞悬液样本,因而大大限制了FCM对实体组织特别是实体瘤的分析和研究[1].
2.期刊论文 王建中. 王淑娟 当前临床流式细胞分析的发展趋势 -中华检验医学杂志2002,25(1)
流式细胞分析,又称流式细胞术(Flow cytometry,FCM),是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒,测量其产生的散射光和发射荧光的强度,从而对细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术,它具有如下几个特点:①标本只要是单细胞即可用于分析,如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞等,实体组织只要经处理后制成单细胞悬液也能分析,因此,实际上所有组织细胞均可用于分析.②极短时间内可分析大量细胞,只要标本中的细胞数量足够,流式细胞仪(Flow cytometer)可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量,测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个.③可同时分析单个细胞的多种特征,当同时用多种分子探针,如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色,通过流式细胞分析,即可获得单细胞的多种信息,使细胞亚群的识别、计数更为准确.④定性或定量分析细胞:通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度等均可进行单细胞水平的定性与定量分析.
3.学位论文 李杰 凋亡抑制因子Clusterin在大肠癌中的表达及其与肿瘤细胞凋亡的相关性研究 2008
目的:
观察凋亡抑制因子Clusterin在大肠癌组织、癌旁组织和正常组织中的表达情况以及大肠癌组织肿瘤细胞凋亡的情况,分析Clusterin的表达与细胞凋亡以及大肠癌临床病理特征如年龄、部位、肿瘤大小、临床分期、分化程度及淋巴结转移之间的关系,探讨Clusterin在大肠癌发生发展中所起的抗细胞凋亡作用以及靶向Clusterin基因治疗在大肠癌中的应用前景,为大肠癌的治疗提供新的方法和一定的理论依据。 方法:
1.收集本院临床资料完整的大肠癌术后标本58例,其中包括直肠癌32例,结肠癌26例,根据1990年全国大肠癌诊治规范进行Dukes分期:A期9例,B期16例,C期11例,D期22例(7例伴有远处转移),其中18例有淋巴结转移。分化程度:高分化12例,中分化31例,低分化15例。肿瘤≥5cm的25例,<><>
2.免疫组织化学用标本取材后均经10%中性甲醛固定,石蜡包埋,切片,常规脱蜡,水化,应用免疫组织化学技术(Immunohistochemicaltechnique)SP法,分别检测Clusterin在大肠癌组织、癌旁组织和正常大肠组织中的表达。
3.流式细胞术(Flow Cytometry)用标本取材后用70%酒精固定,立即采用机械法和酶消化法将肿瘤实体组织制备成单细胞悬液,染色后上流式细胞仪进行检测。 结论:
1.Clusterin的抗凋亡机制在大肠癌发生发展中可能起着重要的促瘤生长作用。
2.利用Clusterin的抗凋亡机制在大肠癌中的重要作用为靶点,将可能为大肠癌的防治带来新的突破。
引证文献(1条)
1. 王燕燕. 毛朝明. 旷苗. 郭华. 赵咏桔. 李立新. 张雁云. 宁光. 王曙 浆细胞样树突状细胞、干扰素α调节性T细胞在Graves病中免疫致病机制的研究[期刊论文]-内科理论与实践 2010(2)
本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_lcysyblxzz200704031.aspx
授权使用:中科院生态环境研究中心(中科院生态环境研究中心),授权号:e8623629-4a3e-48a0-84d4-9e550113d9d2
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范文三:制备新鲜实体组织单细胞悬液
制备新鲜实体组织单细胞悬液的常用方法
流式细胞术对细胞的各种参数分析必须基于单细胞的基础上,根据不同实体组织成分的特点可选择不同的分散细胞的方 法,以期达到单细胞产量高、细胞损伤小的目的。在实体组织分散为单细胞的过程中,解离的方法有可能瞬间或持久地影响细胞的性质,比如,形态上显而易见的细 胞膜破损,细胞表面上可出现泡状特征,还有一些是难以观察到的线粒体活性的变化、选择性膜表面抗原的丢失、蛋白质的丢失等,细胞受损程度受温度、pH值、 处理时间等多种因素的影响。机械性或人工制备的单细胞,在某些性质上很可能已改变了原组织细胞特性,因此处理不同组织时,努力摸索方法,尽可能采用对细胞 损伤小,产率较高的单细胞悬液制备方法,最大限度地保持细胞原有特性。下面介绍几种常用的细胞悬液制备方法:
(一)酶消化法
酶的作用原理主要有三方面:一是破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等,二是水解组织细胞的紧密连接结构的蛋白质,三是水解组织粘多糖物质。酶消化法是实体组织 分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类有:胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶、弹性蛋白酶等。可根据分散的组织类型确定 使用的酶类。需要注意的是使用条件和影响因素(酶浓度、酶效价、作用时间、pH值)等,如胃蛋白酶在碱性环境下失去活性,胰酶在中性溶液中活性欠佳。酶消化法常规程序如下:
1、 将适合于酶消化的组织置于离心管中。
2、 将选好的酶溶液1,2ml加入盛有被消化组织的试管中。
3、 常规消化20,30min(恒温37?或室温),消化期间间断振荡或吹打。
4、 终止消化,收集细胞悬液,以300目尼龙网过滤,除去细胞,以低速离心除去细胞碎片。
5、 加入PBS 2ml充分混匀,离心弃掉上清。再加入0.5ml PBS重悬细胞。
6、 将制备好的单细胞悬液进行荧光标记后上机检测或保存备用。
(二)机械法
机械法分散实体组织包括:用剪刀剪碎组织或用锋利的解剖刀剁碎组织,用匀浆器匀浆,用线注射针头反复抽吸细胞等,最后用300目尼龙网过滤细胞得到单细胞悬液。
1、剪碎法
(1) 将组织块放入平皿中,加入少量生理盐水。
(2) 用剪刀将组织剪至匀浆状。
(3) 加入10ml生理盐水。
(4) 用吸管吸取组织匀浆,先以100目尼龙网过滤到试管内。
(5) 离心沉淀1000rpm/min,4,5min,再用生理盐水洗3次,每次以短时低速(500,800rpm/min)离
心沉淀去除细胞碎片。
(6) 以300目尼龙网过滤去除细胞。
(7) 选择适当的固定液(70,冰乙醇等)固定细胞或低温保存备用。
2、网搓法
(1) 将100目、300目尼龙网扎在小烧杯上。
(2) 把剪碎的组织放在网上,用眼科镊子轻轻搓组织块,边搓边用生理盐水冲洗,直到将组织搓完。 (3) 收集细胞悬液,离心沉淀细胞500,800rpm/min,2分钟。
(4) 固定细胞或低温保存备用。
3、研磨法
(1) 先将组织剪碎成1,2mm3小块。
(2) 放入组织研磨器中加入1,2ml生理盐水。
(3) 转动研棒,研至匀浆。
(4) 加入10ml生理盐水,冲洗研磨器。
(5) 收集细胞悬液,并经300目尼龙网过滤,离心沉淀细胞,500,800rpm/min,2分钟,再用生理盐
水洗3遍,离心沉淀。
(6) 固定或低温保存细胞,备用。
(三)化学处理法
化学处理法的主要原理是:将组织细胞间起粘连作用的钙、镁离子置换出来,从而使细胞分散下来。但化学处理法获得的细胞存活率低,细胞产量较低,细胞碎片和细胞聚集量不稳定。 1、试剂配制
(1) 0.2,EDTA配制:将0.2gEDTA溶解于100ml Hank液中,封装高压消毒,置0,4?保存。 (2) 胰酶加EDTA配制:胰酶0.25g加PBS(pH7.0)200ml,浓度为0.125,,EDTA0.2g加PBS(pH7.0)
100ml,浓度为0.2,。各取40ml混合,分装后置0,4?冰箱保存,使用前过滤即可使用。 2、实验方法
(1) 将组织切成薄片,置于试管。
(2) 首先加入EDTA液5ml,室温下0.5小时,离心弃之。
(3) 加入胰酶,EDTA液5,10ml,置37?恒温水浴30min,间断振荡3,5次。 (4) 用300目尼龙网过滤,离心沉淀1000rpm/min,5分钟。再以生理盐水洗2,3次,离心500,800rpm,
1,2分钟。
(5) 将细胞固定或低温保存备用。
范文四:实体瘤组织单细胞悬液制备
实体瘤组织单细胞悬液制备及培养方案
一、 单细胞悬液制备
(一) 仪器、材料及试剂
1. 仪器:
(1) CO2培养箱(调至37℃),离心机,水浴锅(37℃),血球计数板;
(2) 无菌器械:细胞培养瓶,50ml 离心管,平皿,吸管,移液管,纱布,200目/300目尼龙滤网,手术器械。
2. 材料:肿瘤造模成功的大鼠
3. 试剂:RPMI1640 培养基(含10%小牛血清),0.25%胰酶,Hank’s液/PBS缓冲液,碘酒
附:Hank’s液配方:
KH 2PO 4:0.06g ;NaCl :8.0g ;NaHCO 3:0.35g ;KCl :0.4g ;
Glucose :1.0g ;Na 2HPO 4·H 2O :0.06g ;
加H 2O 定容至 1000ml
注:Hank’s液可以高压灭菌,4℃下保存。
(二) 操作步骤
机械-胰酶消化法
1. 取材:制备实体瘤单细胞悬液,肿瘤取材部位非常重要,体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区,取材时尽量避免用退变组织,挑选活力较好的部位。将大鼠麻醉,置75%酒精泡3-5 min(时间不能过长,以免酒精从口和肛门浸入体内),固定后再用碘酒消毒腹部,带入超净台内解剖取肿瘤组织,置于平皿中。
2. 用Hank’s 液/PBS缓冲液洗涤三次,并剔除周围脂肪、结缔组织、血液等。
3. 用无菌眼科手术剪将肿瘤剪成小块(1-2mm ),再用Hank’s 液/PBS缓冲液洗涤三次,转移至50ml 离心管中。
4. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液,37℃中消化20-40min ,每隔5min 轻轻振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。
5. 加入2-5ml 含血清培养基,以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)。
6. 静置2-3 min,使未分散的组织块下沉,将悬液转移到新的离心管中。
7. 用200/300目尼龙网过滤悬液2次。
8. 将过滤后悬液1000rpm ,离心5-10 min,弃上清液。
9. 加入Hank’s液/PBS缓冲液5ml ,轻轻冲散细胞,再离心一次,弃上清液。
10. 视细胞量加入l-2 ml培养液,血球计数板计数。
11. 将细胞调整到5×105/ml左右,转移至25ml 细胞培养瓶中,37℃下培养。或者直接用作流式分析及其他分析。
二、 实体瘤组织中抗癌药物含量检测
1. 按上述取材步骤取出合适的肿瘤组织,分成A 、B 两份,分别置于含有1-2ml PBS
缓冲液的无菌离心管中(离心管及PBS 液已称重),准确称量肿瘤组织的重量。A 组可直接用于检测组织中抗癌药物的含量,B 组用于检测细胞内抗癌药物含量。
2. B 组组织按照上述步骤制成单细胞悬液,制备过程中,保留每一次的PBS 洗液(1-2
ml ),标记清楚,用于检查含药量。
3. 将单细胞悬液计数,统计细胞总量,检查细胞内抗癌药物含量。
三、 肿瘤细胞培养
(一) 肿瘤细胞培养
1. 肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格,一般常用的 RPMIl640、 DMEM 、
等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。
肿瘤细胞多为贴壁细胞,将刚分散的细胞转移至培养瓶后,待4-5 h后观察细胞贴壁情况,此时可更换新的培养基,除去未能贴壁的细胞碎片及死细胞。
2. 每日观察细胞生长增殖情况,待细胞贴壁密度大于90%时,可用胰酶消化,
按1:5比例进行传代到新的培养瓶或培养板上,可根据需要适当调整接种比例,或者取适量消化后进行其他细胞实验。
(二) 成纤维细胞的排除
成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长,致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快,最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。
1. 机械刮除法:是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头(用胶塞剪成三角形插以不锈钢
丝)、或裹少许脱脂棉制成,装入试管中高压灭菌后备用(也可用特制电热烧灼器刮除)。刮除程序为:
1) 标记:镜下观察,用记号笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位;
2) 刮除:弃掉培养液,把无菌胶刮伸入瓶皿中,肉眼或显微镜窥视下,刮除
无标记空间;
3) 用Hanks 液/PBS缓冲液冲洗一两次,洗除被刮掉的细胞;
4) 注入培养液继续培养,如发现仍有成纤维细胞残留,可重复刮除至完全除
掉为止
2. 反复贴壁法:根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点,并结合使用不加
血清的营养液,把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁,使两类细胞相互分离,操作方法与传代相同。
1) 待细胞生长达一定数量后,倒出旧培养液,用胰酶消化后,Hanks /PBS
缓冲液冲洗2次,加入不含血清的培养液,吹打制成细胞悬液;
2) 取编号为此A 、B 、C 三个培养瓶;首先把悬液接种入A 培养瓶中。置温
箱中静止培养5~20分钟后,轻轻倾斜培养瓶,让液体集中瓶角后慢慢吸
出全部培养液,再接种入B 培养瓶中后;向A 瓶中补充少许完全培养液
置温箱中继续培养;
3) 培养B 瓶中细胞5~20分钟后,接处理A 的方法,把培养液注入C 培养
瓶中;再向B 瓶中补加完全培养基。
4) 当三个瓶内都含有培养液后,均在温箱中继续培养。如操作成功,次日观
察可见A 瓶主要为成纤维细胞,B 瓶两类细胞相杂,C 瓶可能主要为癌
细胞。必要时可反复处理多次,直至癌细胞纯化为止。
3. 消化排除法:
1) 先是用0.5%胰蛋白酶和0.02%EDTA (1:1)混合液漂洗培养细胞一次,
然后再换成新的混合液继续消化,并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养
瓶,到半数细胞脱落下来后,便立即停止消化;
2) 把消化液吸入离心管中,离心去上清,吸入另瓶中,加培养液置温箱中培
养;向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后,成纤维细胞比
肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理,可能把成纤维细胞除净。
4. 胶原酶消化法:
本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点,通过消化进行选择。
1) 可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理,边消化边在倒置显微镜下窥视,当发
现成纤维细胞被除掉后,即终止消化;
2) 用Hanks/PBS缓冲液洗涤处理一次后,更换新培养液,继续培养,可获
纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净,可再次重复。
四、 注意事项
(一) 自取材开始,保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
(二) 在超净台中,组织细胞、培养液等不能暴露过久,以免溶液蒸发。
(三) 凡在超净台外操作的步骤,各器皿需用盖子或橡皮塞,以防止细菌落入。
四、无菌操作的几个注意事项
(一) 操作前要洗手,进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦拭。试剂等瓶口
也要擦拭。
(二) 点燃酒精灯,操作在火焰附近进行,耐热物品要经常在火焰上烧灼,金属器械烧灼
时间不能太长,以免退火,并冷却后才能夹取组织,吸取过营养液的用具不能再烧灼,以免烧焦形成碳膜。
(三) 操作动作要准确敏捷,但又不能太快,以防空气流动,增加污染机会。
(四) 不能用手接触已消毒器皿的工作部分,工作台面上用品要布局合理。
(五) 瓶子开口后要尽量保持45°斜位。
(六) 吸溶液的吸管等不能混用。
范文五:新鲜实体组织单细胞悬液制备
流式细胞术对细胞的各种参数分析必须基于单细胞的基础上,根据不同实体组织成分的特点可选择不同的分散细胞的方法,以期达到单细胞产量高、细胞损伤小的目的。在实体组织分散为单细胞的过程中,解离的方法有可能瞬间或持久地影响细胞的性质,比如,形态上显而易见的细胞膜破损,细胞表面上可出现泡状特征,还有一些是难以观察到的线粒体活性的变化、选择性膜表面抗原的丢失、蛋白质的丢失等,细胞受损程度受温度、pH 值、处理时间等多种因素的影响。机械性或人工制备的单细胞,在某些性质上很可能已改变了原组织细胞特性,因此处理不同组织时,努力摸索方法,尽可能采用对细胞损伤小,产率较高的单细胞悬液制备方法,最大限度地保持细胞原有特性。下面介绍几种细胞悬液制备方法,仅供参考。
(一)酶消化法
酶的作用原理主要有三方面:一是破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等,二是水解组织细胞的紧密连接结构的蛋白质,三是水解组织粘多糖物质。酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类有:胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶、弹性蛋白酶等。可根据分散的组织类型确定使用的酶类。需要注意的是使用条件和影响因素(酶浓度、酶效价、作用时间、pH 值)等,如胃蛋白酶在碱性环境下失去活性,胰酶在中性溶液中活性欠佳。
酶消化法常规程序如下:
1、将适合于酶消化的组织置于离心管中。
2、将选好的酶溶液1~2ml 加入盛有被消化组织的试管中。
3、常规消化20~30min (恒温37℃或室温),消化期间间断振荡或吹打。
4、终止消化,收集细胞悬液,以300目尼龙网过滤,除去细胞,以低速离心除去细胞碎片。
5、加入PBS 2ml充分混匀,离心弃掉上清。再加入0.5ml PBS重悬细胞。
6、将制备好的单细胞悬液进行荧光标记后上机检测或保存备用。
(二)机械法
机械法分散实体组织包括:用剪刀剪碎组织或用锋利的解剖刀剁碎组织,用匀浆器匀浆,用线注射针头反复抽吸细胞等,最后用300目尼龙网过滤细胞得到单细胞悬液。
1、剪碎法
(1)将组织块放入平皿中,加入少量生理盐水。
(2)用剪刀将组织剪至匀浆状。
(3)加入10ml 生理盐水。
(4)用吸管吸取组织匀浆,先以100目尼龙网过滤到试管内。
(5)离心沉淀1000rpm/min,4~5min ,再用生理盐水洗3次,每次以短时低速(500~800rpm/min)离心沉淀去除细胞碎片。
(6)以300目尼龙网过滤去除细胞。
(7)选择适当的固定液(70%冰乙醇等)固定细胞或低温保存备用。
2、网搓法
(1)将100目、300目尼龙网扎在小烧杯上。
(2)把剪碎的组织放在网上,用眼科镊子轻轻搓组织块,边搓边用生理盐水冲洗,直到将组织搓完。
(3)收集细胞悬液,离心沉淀细胞500~800rpm/min,2分钟。
(4)固定细胞或低温保存备用。
3、研磨法
(1)先将组织剪碎成1~2mm3小块。
(2)放入组织研磨器中加入1~2ml 生理盐水。
(3)转动研棒,研至匀浆。
(4)加入10ml 生理盐水,冲洗研磨器。
(5)收集细胞悬液,并经300目尼龙网过滤,离心沉淀细胞,500~800rpm/min,2分钟,再用生理盐水洗3遍,离心沉淀。
(6)固定或低温保存细胞,备用。
(三)化学处理法
化学处理法的主要原理是:将组织细胞间起粘连作用的钙、镁离子置换出来,从而使细胞分散下来。
1、试剂配制
(1)0.2%EDTA 配制:将0.2gEDTA 溶解于100ml Hank 液中,封装高压消毒,置0~4℃保存。
(2)胰酶加EDTA 配制:胰酶0.25g 加PBS (pH7.0)200ml ,浓度为0.125%,EDTA0.2g 加PBS (pH7.0)100ml ,浓度为0.2%。各取40ml 混合,分装后置0~4℃冰箱保存,使用前过滤即可使用。
2、实验方法
(1)将组织切成薄片,置于试管。
(2)首先加入EDTA 液5ml ,室温下0.5小时,离心弃之。
(3)加入胰酶-EDTA 液5~10ml ,置37℃恒温水浴30min ,间断振荡3~5次。
(4)用300目尼龙网过滤,离心沉淀1000rpm/min,5分钟。再以生理盐水洗2~3次,离心500~800rpm ,1~2分钟。
(5)将细胞固定或低温保存备用。
化学处理法获得的细胞存活率低,细胞产量较低,细胞碎片和细胞聚集量不稳定。
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