范文一:分子细胞遗传学实验
分子细胞遗传学实验
实验一
实验二
实验三
实验四
实验五 显微镜使用与摄影技术 植物染色体制片与观察 质粒DNA的提取 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 荧光原位杂交实验(原位杂交)
实验一 显微镜使用与摄影技术
一、实验注意事项
显微镜是遗传学实验的重要仪器,使用时必须防尘、防高温、防湿、防药品侵蚀,在清洁保养中要做到以下几点:1.取镜时必须一手提镜臂,一手托镜底,防止显微镜滑落损坏。
2.取出显微镜后,先用软毛刷、纱布拂擦镜身的防尘污物,用洗耳球吹去缝隙及镜头上的灰尘和纤维等物,再用镜头纸擦拭物镜和目镜,最后用细白丝绸把镜头再擦一次。3.镜检时物镜只能由低倍镜到高倍镜,在高倍镜下只能用微调螺旋调焦,细心操作,以防压碎玻片,损坏镜头。4.若发现镜头被药物或脏物污染,立即用擦镜纸醮少许二甲苯(以刚湿润纸为度)擦掉污物,再用擦镜纸擦干。5.用完显微镜后进行清洁整理,将载物台放至最低处,转动物镜使之不要对着聚光镜,将显微镜放回原处。
二、实验目的
了解显微摄影的原理和操作过程,掌握拍摄、冲洗胶片、印放显微照片的基本技术。
三、实验原理
显微摄影与一般摄影在原理和操作上基本相同,不同点在于照相机是安装在显微镜的镜筒上,拍摄的标本在物镜头与聚光镜之间的载物台上。只要在照相时调整目镜中观察的图象清晰,照相机底片平面的成像也清晰。
随着多媒体信息处理技术的发展,可以将光学显微镜与计算机连接,直接将光学信号转换成数字图像信息,再运用专门处理软件进行相关分析。
四、涉及知识点
显微成像原理,显微镜和摄影基本知识。
五、实验方法
1.熟悉显微照相装置
(1)显微镜 了解显微镜的分辩率与物镜的数值孔径(N、A的关系),孔径愈大,分辨率愈高。复消色差物镜Anochormat是显微摄影中常用的物镜,当今理想的摄影物镜。平象物镜种类很多种,外壳上刻有不同字样,以资识别。如“Plan”(平象),“ql”(广视野平象),“Npl”(正常视野平象),“Planchromate”(平象消色差),“pl Ap0”(平象复消色差等)。 附有摄影装置的显微镜,备有摄影目镜,专用于摄影。这种目镜较好的校正象场弯曲,提高成象质量。摄影目镜上刻有“Photo”、“FK”等字样。平象目镜刻有“Plan”,“periplan”,“GF”,“GW”和“Kpl”等字样。
注意物镜和目镜的搭配要考虑物镜的放大倍数和分辩率。
(2)照相装置 该装置由一小型照相机(或摄像头)、连接照相机(或摄像头)与显微
镜的连接筒以及自动曝光系统组成。自动曝光系统用电脑控制,具有自动卷片、自动测光、自动控制曝光时间以及测量色温和倒易律失效的补偿等功能。
(3)照明系统 多采用低压显微镜照相灯为光源,用科勒照明法,使视野内光照均匀,不会烤焦被摄标本,影像清晰。
2.选用合适的感光片及滤色镜
(1)感光片的选择 感光片有硬片(干片)和软片(胶片)。黑白片又有无色片、分色片、全色片之分。彩色片又分彩色反转片、彩色正片和彩色负片等。显微摄影一般使用全色片。
(2)滤色镜(滤光片)的选择 显微摄影利用滤色镜提高影象的反差和清晰度。
3.显微摄影程序
以Olympus PM-10-AD系列自动曝光照相装置、拍摄35mm黑白片为例。
(1)安装摄影目镜 、(2)安装胶卷 、(3)设定光路 、(4)调节胶片感光值 、(5)校正倒易率失效补偿 、(6)选择拍片规格、(7)选择曝光方式 、(8)选择标本、(9)曝光补偿、(10)对焦取景、(11)选择滤色镜、(12)曝光。
4.黑白胶片的冲洗、晒印和放大相片
(1)胶片冲洗 拍摄完后应在短期内冲洗胶片。了解显影、停影、定影、水洗和晾干等步骤。
(2)印相和放大相片 利用感光纸洗印和放大相片。感光纸的显影、停影和定影过程。
(3)水洗、上光、保存 将相片置流水冲洗1h左右,置上光机上烘干上光,用裁边机裁边,置阴晾干燥处保存。
实验二 植物染色体制片与观察
一、实验注意事项
本实验在使用显微镜过程中应严格按实验室安全规则进行操作,废液应经专门回收处理以免造成环境污染。
二、实验目的
学习并掌握根尖或叶片材料处理、染色、压片及制片观察的方法。
三、实验原理
高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎尖生长点及幼叶等器官的分生组织(分生区),这些分生组织均可以用作制片材料;
预处理主要作用:抑制和破坏纺锤丝的形成来获得更多的中期分裂相;改变细胞质的粘度,促使染色体缩短和分散,便于压片和观察。常用的预处理有物理法、化学法、混合处理法等。
解离:软化或部分分解细胞壁使细胞间易于分离的操作。解离也可适当清除部分细胞质,使细胞质背景趋于透明化,便于观察染色体。常用的解离方法主要有酸解法和酶解法。
在普通光学显微镜下观察染色体形态结构还需要对材料进行染色,通常采用染色体染色效果好而细胞质着色少的碱性染料、酸性染料或孚尔根试剂染色。
四、实验方法
1.发根
2.预处理
冷处理:将根尖放入盛有蒸馏水的指形管中,置0~4℃的冰箱(或在冰水)中处理24~40h,染色体数较多的实验材料可适当延长处理时间,但需注意勿使材料结冰。
3.固定 材料经预处理后,用流水冲洗,然后投入卡诺液Ⅰ(3份甲醇∶1份冰乙酸,现配现用)中固定20~24h,用95%的乙醇洗两次,转入70%乙醇中保存备用。
4.解离 常用酸解法:从70%乙醇中取出固定好的根尖→流水冲洗3min→吸水纸吸干→放入小试管中→加适量1 mol/L HCl于60±0.5℃水浴解离10~15min。
5.染色
孚尔根反应染色:将解离材料洗净或直接转入席夫试剂于室温(最好在10℃左右) 进行孚尔根染色反应1~5h或过夜,然后在漂洗液中漂洗3次,每次5~10min,再经流水冲洗5~10min,保存于45%乙酸中或1%醋酸洋红复染压片。
6.压片
7.镜检
8.揭片
实验三 质粒DNA的提取
一、实验目的
通过本实验学习和掌握碱裂解法和试剂盒方法提取质粒。
二、实验原理
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
本实验用的试剂盒是天根公司的普通质粒小提取试剂盒。该方法的基本原理是,在高盐状态下,DNA纯化树脂ΜLtraPureTM专一性地吸附DNA;而在低盐或水溶液状态下,DNA被洗脱下来。
三、仪器、材料与试剂
1.仪器:恒温培养箱,恒温摇床,台式离心机,高压灭菌锅。
2.材料:含质粒的大肠杆菌,1.5mL 离心管,吸头,吸样器。
3.试剂:质粒小量制备试剂盒(质粒DNA小量提取试剂盒, 天根公司)
常用碱法提取质粒的溶液的参考配方:
Solution I
50mmo1/L 葡萄糖
25mmo1/L Tris?HCl(pH8.0)
10 mmo1/L 乙二胺四乙酸(EDTA)pH8.0
Solution II
0.4mo1/LNa0H,2%SDS(十二烷基硫酸钠),使用前等体积混合
Solution III
5mo1/L 乙酸钾 60mL
冰乙酸 11.5mL
水 28.5mL
TE缓冲液
10mmo1/L Tris?HCl
1mmo1/L EDTA(pH8.0)
RNA酶(RNA酶A)
Tris?HCl(pH7.5)、15mmo1/L NaCl中,配成10 mg/mL的浓度,于100℃加热15min, 缓慢冷却至室温,保存于-20℃。
70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)
四、实验步骤
I 质粒扩增
将2mL含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中,接入含质粒的大肠杆菌,37℃振荡培养过夜。
II 质粒的提取(试剂盒操作方法)
1、将3~5ml菌液12,000rmp离心30秒收集沉淀(菌体)。
(如果用1.5ml或2ml离心管则需要反复离心2~3次)
2、倒掉上清,将沉淀(菌体)完全悬浮于250μL悬浮液(溶液P1)中。
上清要尽可能去除干净,可用滤纸吸干。沉淀要用混旋器完全悬浮,否则将直接导致下一步的裂解不彻底,进而影响质粒DNA的产量与纯度。
3、加入150μL裂解液(溶液P2),轻柔地颠倒混匀10次左右,溶液逐渐变得粘稠、清亮。
不可用混旋器剧烈振荡,否则会使质粒DNA断裂时间不宜超过5min,否则会造成染色体DNA的污染。
4、加入150μL中和液(溶液P3),轻柔地颠倒混匀10次左右。
此时可见到白色絮状的染色体DNA及细菌碎片。
5、向吸附柱(吸附柱放入收集管中),加入500μL的平衡液BL, 12,000rmp离心1m,倒掉收集管中的废液。
6、12,000rmp离心8~10mim,将上清液小心转入到吸附柱(吸附柱放入收集管中),12,000rmp离心30s,倒掉收集管中的废液。
7、 将纯化柱重新套入废液收集管中,加入600μL漂洗液PW(请先检查是否加入无水乙醇),12,000rmp离心1min,倒掉收集管中的废液。
如果纯化柱底部残留有异丙醇(或乙醇),可用滤纸吸干。否则将影响以后的酶促反应。
8、重复第7步1次,尽可能将杂质去除。
9、取出纯化柱,将其套入一个干净的1.5ml离心管,加入50μL TE缓冲液于(或灭菌的ddH2O)纯化树脂上,不能沾在管壁上。室温下放置5min后,13,000rmp离心1min。
10、离心管中收集的液体就是洗脱下来的质粒DNA, 取3~5μL电泳,检测其纯度和目测定量。-20℃保存备用。 若有RNA污染,可加入0.5μLRNaseA(10mg/ml),37℃保温10~
30min。
Ⅲ、质粒的琼脂糖凝胶电泳
取10μL洗脱液(质粒DNA)与3μL溴酚蓝混合,用吸样器加入1% Agarose 作凝胶电泳分析。
五、实验结果
实验四 琼脂糖凝胶电泳检测DNA
一、实验目的
通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。
二、实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。
凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的HVG18质粒,有3种构型:超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalelltly closed circular DNA,简称cccDNA),开环质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNAl条链断裂,(open circular DNA,简称ocDNA),线状质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂(linear DNA,简称LDNA)。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带,超螺旋质粒DNA泳动最快,其次为线状DNA,最慢的为开环质粒DNA。
三、仪器、材料与试剂
1.仪器:恒温培养箱,琼脂糖凝胶电泳系统,台式离心机,高压灭菌锅,紫外核酸检测仪。
2.材料:三羟甲基氨基甲烷(Tris),冰醋酸,乙二胺四乙酸(EDTA),溴酚蓝,蔗糖,琼脂糖,溴化乙锭,DNA marker,HVG18质粒。
3.试剂:
① 50xTAE(50倍体积的TAE贮存液),配1000mL 50xTAE:
Tris 242 g
冰醋酸 57.1 mL
0.5mol/L EDTA 100 mL
pH 8.0
② 凝胶加样缓冲液(6x):
溴酚蓝 0.25%
蔗糖 40%
二甲苯青 0.25%
③ 琼脂糖
④ 溴化乙锭溶液(EB) 0.5ug/mL
四、 实验步骤
1、制备琼脂糖凝胶
按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表:
琼脂糖凝胶浓度% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线性DNA的有效分离范围/kb 5~60 1~20 0.8~10 0.5~7 0.4~6 0.2~4 0.1~3
称取1.0g琼脂糖,放入锥形瓶中,加入100mL 1xTAE缓冲液,置微波炉或水浴加热
2、胶板的制备
3、加样
用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。
4、电泳
接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极,DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速度与电压成正比,最高电压不超过5V/cm。
在紫外灯(360nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜,紫外线对眼睛有伤害作用)。
当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处,停止电泳。
5、染色
将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在200mL1xTAE缓冲液中加两滴溴化乙锭储存液即可)。注意:溴化乙锭为致癌物,须戴一次性塑料薄膜手套操作,并小心污染环境。也可将EB溶液直接加入凝胶溶液中。
EB染料的全名是3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐。EB能插入DNA分子中碱基对之间,导致EB与DNA结合,DNA所吸收的260nm的紫外光传递给EB,或者结合的EB本身在300nm和360nm 吸收的射线均在可见光谱的红橙区,以560 nm波长发射出来。EB染料有许多优点,如染色操作简便、快速,室温下染色15~20min;不会使核酸断裂;灵敏度高,10ng或更少的DNA即可检出。
但应特别注意的是,EB是诱变剂,配制和使用EB染色液时,应带乳胶手套或一次性手套,并且不要将该染色液洒在桌面或地面上,凡是沾污EB的器皿或物品,必须经专门处理后,才能进行清洗或弃去。
实验五 荧光原位杂交实验(原位杂交)
一、实验目的
通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在植物学、生物学、医学等领域的应用。掌握原位杂交技术的操作方法,熟练掌握荧光显微镜的使用方法。
二、实验原理
荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是一门新兴的分子细胞遗传学技术,是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。 FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针,按照碱基互补的原则,与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合,形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列,因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比,荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点,因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分为三类:1)染色体特异重复序列探针,例如a卫星、卫星III类的探针,其杂交靶位常大于1Mb,不含散在重复序列,与靶位结合紧密,杂交信号强,易于检测;2)全染色体或染色体区域特异性探针,其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成,可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得;3)特异性位置探针,由一个或几个克隆序列组成。探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记,杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测,同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理,将荧光信号进行放大,从而可以检测500bp的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合,或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单,但由于不能进行信号放大,因此灵敏度不如间接标记的方法。
三、 实验用具及材料
HVG18探针、植物中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200mL移液器、20mL移液器、暗盒、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠。
四、实验方法及步骤
1、 探针的标记
组成 ddH2O
体积 30-x
每反应的量
2.5μmol Tris.cl Ph7.5
终浓度 50mM 5mM 50ng/μl 10mM 40μM 40μM 40μM 10μM 40μM 20ng/μl 1.2 mU/μl 0.2U/μl
10×NT buffer 5 250nmol MgCl2 2.5μg BSA
100mM DTT 5 500nmol 2nmol dATP 2nmol dGTP
1.3mM dNTP mix, equimolar 5
2nmol dCTP 500pmol dTTP
1mM F-x-dUTP, equimolar
DNA DNaseI, diluted DNAPol I
2 x 1 2
2nmol 1μg 60mU 10U
实验操作程序:
(1)在0.5mlPCR管中依次加入上述溶液。 (2)短暂离心后,水浴锅中16℃反应2小时。 (3)反应后取出放在冰上处理5分钟。
2、 原位杂交程序
(1)在制备好的染色体片子上滴加50-100μL 70%的甲酰胺(用2×SSC配置),盖上盖片。 (2)80℃处理2min,拿出后迅速甩掉盖片。迅速依次放到-20℃预冷的70%、95%和100%梯度酒精中(各5min或以上)。处理完自然干燥。 (3)配置杂交体系:(1张染色体制片)
名称 去离子甲酰胺 20×SSC ssDNA B-DNA 50%DS HVG18
用量 7.5μL 1.5μL 1.5μL 1μL 3μL 1μL
上述体系配置完成后,瞬时离心,然后80℃变性10min。变性完后,迅速放 到冰上处理5min以上。
(4)把上述体系滴加到玻片上,盖片,放入37℃饭盒里反应8h以上或过夜。 (5)用镊子将指甲油剥掉,将标本片浸入2×SSC的染色缸中,轻轻摇动使盖片脱落。 (6)清洗:
步骤
洗脱缓冲液
1 2 3 4
2×SSC 2×SSC 2×SSC 1×PBS
温条件
室温 42℃ 室温 室温
度
洗时间
5min 10min 5min 5min
脱
离心管中加入0.5-1%抗小牛血清(用1×PBS配置)100μL,再加入1μL Fab,涡旋混匀,滴加到盖片上(滴加时标本不要太干燥),盖上盖片,37℃条件下,45min或以上。
(7)在2×SSC中室温处理2次各5min,然后在1×PBS室温洗5min。 (8)自然闭光干燥后滴加PI,盖上盖片镜检。
五、实验结果
范文二:分子细胞遗传学实验
分子细胞遗传学实验
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五
质粒DNA 的提取 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 显微镜使用与摄影技术 植物染色体制片与观察
荧光原位杂交实验(原位杂交)
实验一 质粒DNA 的提取
一、实验目的
通过本实验学习和掌握碱裂解法和试剂盒方法提取质粒。
二、实验原理
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。在pH 值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA 双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA 的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时,共价闭合环状的质粒DNA 的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体DNA 与不稳定的大分子RNA ,蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。
本实验用的试剂盒是天根公司的普通质粒小提取试剂盒。该方法的基本原理是,在高盐状态下,DNA 纯化树脂ΜLtraPureTM 专一性地吸附DNA ;而在低盐或水溶液状态下,DNA 被洗脱下来。
三、仪器、材料与试剂
1.仪器:恒温培养箱,恒温摇床,台式离心机,高压灭菌锅。 2.材料:含质粒的大肠杆菌,1.5mL 离心管,吸头,吸样器。 3.试剂:质粒小量制备试剂盒(质粒DNA 小量提取试剂盒, 天根公司)
常用碱法提取质粒的溶液的参考配方: Solution I 50mmo1/L 葡萄糖
25mmo1/L Tris?HCl(pH8.0)
10 mmo1/L 乙二胺四乙酸(EDTA)pH8.0 Solution II
0.4mo1/LNa0H ,2%SDS(十二烷基硫酸钠) ,使用前等体积混合 Solution III 5mo1/L 乙酸钾 60mL 冰乙酸 11.5mL 水 28.5mL TE 缓冲液
10mmo1/L Tris?HCl
1mmo1/L EDTA(pH8.0) RNA 酶(RNA酶A)
Tris ?HCl(pH7.5) 、15mmo1/L NaCl中,配成10 mg/mL 的浓度,于100℃加热15min , 缓慢冷却至室温,保存于-20℃。 70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)
四、实验步骤
I 质粒扩增
将2mL 含相应抗生素的LB 液体培养基加入到试管中,接入含质粒的大肠杆菌,37℃振荡培养过夜。
II 质粒的提取(试剂盒操作方法)
1、将3~5ml 菌液12,000rmp 离心30秒收集沉淀(菌体)。 (如果用1.5ml 或2ml 离心管则需要反复离心2~3次)
2、倒掉上清,将沉淀(菌体)完全悬浮于250μL 悬浮液(溶液P1)中。
上清要尽可能去除干净,可用滤纸吸干。沉淀要用混旋器完全悬浮,否则将直接导致下一步的裂解不彻底,进而影响质粒DNA 的产量与纯度。
3、加入150μL 裂解液(溶液P2),轻柔地颠倒混匀10次左右,溶液逐渐变得粘稠、清亮。
不可用混旋器剧烈振荡,否则会使质粒DNA 断裂时间不宜超过5min ,否则会造成染色体DNA 的污染。
4、加入150μL 中和液(溶液P3),轻柔地颠倒混匀10次左右。 此时可见到白色絮状的染色体DNA 及细菌碎片。
5、向吸附柱(吸附柱放入收集管中),加入500μL 的平衡液BL, 12,000rmp 离心1m ,倒掉收集管中的废液。
6、12,000rmp 离心8~10mim ,将上清液小心转入到吸附柱(吸附柱放入收集管中),12,000rmp 离心30s ,倒掉收集管中的废液。
7、 将纯化柱重新套入废液收集管中,加入600μL 漂洗液PW (请先检查是否加入无水乙醇),12,000rmp 离心1min ,倒掉收集管中的废液。
如果纯化柱底部残留有异丙醇(或乙醇),可用滤纸吸干。否则将影响以后的酶促反应。 8、重复第7步1次,尽可能将杂质去除。
9、取出纯化柱,将其套入一个干净的1.5ml 离心管,加入50μL TE 缓冲液于(或灭菌的ddH2O )纯化树脂上,不能沾在管壁上。室温下放置5min 后,13,000rmp 离心1min 。 10、离心管中收集的液体就是洗脱下来的质粒DNA, 取3~5μL 电泳,检测其纯度和目测定量。-20℃保存备用。 若有RNA 污染,可加入0.5μLRNaseA(10mg/ml),37℃保温10~
30min 。
Ⅲ、质粒的琼脂糖凝胶电泳
取10μL 洗脱液(质粒DNA )与3μL 溴酚蓝混合,用吸样器加入1% Agarose 作凝胶电泳分析。
五、实验结果
实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA
一、实验目的
通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的方法和技术。
二、实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA 几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下,DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA 分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA 片段泳动速度不一样,可进行分离。DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。
凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA ,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA 分子。如上次实验提取的HVG18质粒,有3种构型:超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalelltly closed circular DNA,简称cccDNA) ,开环质粒DNA ,即共价闭合环状质粒DNAl 条链断裂,(open circular DNA,简称ocDNA) ,线状质粒DNA ,即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂(linear DNA,简称LDNA) 。这3种构型的质粒DNA 分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带,超螺旋质粒DNA 泳动最快,其次为线状DNA ,最慢的为开环质粒DNA 。
三、仪器、材料与试剂
1.仪器:恒温培养箱,琼脂糖凝胶电泳系统,台式离心机,高压灭菌锅,紫外核酸检
测仪。
2.材料:三羟甲基氨基甲烷(Tris),冰醋酸,乙二胺四乙酸(EDTA),溴酚蓝,蔗糖,
琼脂糖,溴化乙锭,DNA marker,HVG18质粒。
3.试剂:
① 50xTAE(50倍体积的TAE 贮存液) ,配1000mL 50xTAE: Tris 242 g
冰醋酸 57.1 mL 0.5mol/L EDTA 100 mL pH 8.0
② 凝胶加样缓冲液(6x): 溴酚蓝 0.25% 蔗糖 40% 二甲苯青 0.25% ③ 琼脂糖
④ 溴化乙锭溶液(EB) 0.5ug/mL
四、 实验步骤
1、制备琼脂糖凝胶
按照被分离DNA 的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表:
琼脂糖凝胶浓度% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线性DNA 的有效分离范围/kb 5~60 1~20 0.8~10 0.5~7 0.4~6 0.2~4 0.1~3
称取1.0g 琼脂糖,放入锥形瓶中,加入100mL 1xTAE缓冲液,置微波炉或水浴加热
2、胶板的制备 3、加样
用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA 样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量) 。
4、电泳
接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极,DNA 片段从负极向正极移动) 。DNA 的迁移速度与电压成正比,最高电压不超过5V /cm 。
在紫外灯(360nm或254nm) 下观察染色后的电泳凝胶。DNA 存在处应显出桔红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜,紫外线对眼睛有伤害作用) 。 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm 处,停止电泳。
5、染色
将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在200mL1xTAE 缓冲液中加两滴溴化乙锭储存液即可) 。注意:溴化乙锭为致癌物,须戴一次性塑料薄膜手套操作,并小心污染环境。也可将EB 溶液直接加入凝胶溶液中。
EB染料的全名是3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐。EB 能插入DNA 分子中碱基对之间,导致EB 与DNA 结合,DNA 所吸收的260nm 的紫外光传递给EB ,或者结合的EB 本身在300nm 和360nm 吸收的射线均在可见光谱的红橙区,以560 nm 波长发射出来。EB 染料有许多优点,如染色操作简便、快速,室温下染色15~20min ;不会使核酸断裂;灵敏度高,10ng 或更少的DNA 即可检出。
但应特别注意的是,EB 是诱变剂,配制和使用EB 染色液时,应带乳胶手套或一次性手套,并且不要将该染色液洒在桌面或地面上,凡是沾污EB 的器皿或物品,必须经专门处理后,才能进行清洗或弃去。
实验三 显微镜使用与摄影技术
一、实验注意事项
显微镜是遗传学实验的重要仪器,使用时必须防尘、防高温、防湿、防药品侵蚀,在清洁保养中要做到以下几点:1.取镜时必须一手提镜臂,一手托镜底,防止显微镜滑落损坏。2.取出显微镜后,先用软毛刷、纱布拂擦镜身的防尘污物,用洗耳球吹去缝隙及镜头上的灰尘和纤维等物,再用镜头纸擦拭物镜和目镜,最后用细白丝绸把镜头再擦一次。3.镜检时物镜只能由低倍镜到高倍镜,在高倍镜下只能用微调螺旋调焦,细心操作,以防压碎玻片,损坏镜头。4.若发现镜头被药物或脏物污染,立即用擦镜纸醮少许二甲苯(以刚湿润纸为度)擦掉污物,再用擦镜纸擦干。5.用完显微镜后进行清洁整理,将载物台放至最低处,转动物镜使之不要对着聚光镜,将显微镜放回原处。
二、实验目的
了解显微摄影的原理和操作过程,掌握拍摄、冲洗胶片、印放显微照片的基本技术。
三、实验原理
显微摄影与一般摄影在原理和操作上基本相同,不同点在于照相机是安装在显微镜的镜筒上,拍摄的标本在物镜头与聚光镜之间的载物台上。只要在照相时调整目镜中观察的图象清晰,照相机底片平面的成像也清晰。
随着多媒体信息处理技术的发展,可以将光学显微镜与计算机连接,直接将光学信号转换成数字图像信息,再运用专门处理软件进行相关分析。
四、涉及知识点
显微成像原理,显微镜和摄影基本知识。
五、实验方法
1.熟悉显微照相装置
(1)显微镜 了解显微镜的分辩率与物镜的数值孔径(N 、A 的关系),孔径愈大,分辨率愈高。复消色差物镜Anochormat 是显微摄影中常用的物镜,当今理想的摄影物镜。平象物镜种类很多种,外壳上刻有不同字样,以资识别。如“Plan ”(平象),“ql ”(广视野平象),“Npl ”(正常视野平象),“Planchromate ”(平象消色差),“pl Ap0”(平象复消色差等)。
附有摄影装置的显微镜,备有摄影目镜,专用于摄影。这种目镜较好的校正象场弯曲,提高成象质量。摄影目镜上刻有“Photo ”、“FK ”等字样。平象目镜刻有“Plan ”,“periplan ”,“GF ”,“GW ”和“Kpl ”等字样。
注意物镜和目镜的搭配要考虑物镜的放大倍数和分辩率。
(2)照相装置 该装置由一小型照相机(或摄像头)、连接照相机(或摄像头)与显微镜的连接筒以及自动曝光系统组成。自动曝光系统用电脑控制,具有自动卷片、自动测光、自动控制曝光时间以及测量色温和倒易律失效的补偿等功能。
(3)照明系统 多采用低压显微镜照相灯为光源,用科勒照明法,使视野内光照均匀,不会烤焦被摄标本,影像清晰。
2.选用合适的感光片及滤色镜
(1)感光片的选择 感光片有硬片(干片)和软片(胶片)。黑白片又有无色片、分色片、全色片之分。彩色片又分彩色反转片、彩色正片和彩色负片等。显微摄影一般使用全色片。
(2)滤色镜(滤光片)的选择 显微摄影利用滤色镜提高影象的反差和清晰度。 3.显微摄影程序
以Olympus PM-10-AD系列自动曝光照相装置、拍摄35mm 黑白片为例。
(1)安装摄影目镜 、(2)安装胶卷 、(3)设定光路 、(4)调节胶片感光值 、(5)校正倒易率失效补偿 、(6)选择拍片规格、(7)选择曝光方式 、(8)选择标本、(9)曝光补偿、(10)对焦取景、(11)选择滤色镜、(12)曝光。
4.黑白胶片的冲洗、晒印和放大相片
(1)胶片冲洗 拍摄完后应在短期内冲洗胶片。了解显影、停影、定影、水洗和晾干等步骤。
(2)印相和放大相片 利用感光纸洗印和放大相片。感光纸的显影、停影和定影过程。 (3)水洗、上光、保存 将相片置流水冲洗1h 左右,置上光机上烘干上光,用裁边机裁边,置阴晾干燥处保存。
实验四 植物染色体制片与观察
一、实验注意事项
本实验在使用显微镜过程中应严格按实验室安全规则进行操作,废液应经专门回收处理以免造成环境污染。
二、实验目的
学习并掌握根尖或叶片材料处理、染色、压片及制片观察的方法。
三、实验原理
高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎尖生长点及幼叶等器官的分生组织(分生区) ,这些分生组织均可以用作制片材料;
预处理主要作用:抑制和破坏纺锤丝的形成来获得更多的中期分裂相;改变细胞质的粘度,促使染色体缩短和分散,便于压片和观察。常用的预处理有物理法、化学法、混合处理法等。
解离:软化或部分分解细胞壁使细胞间易于分离的操作。解离也可适当清除部分细胞质,使细胞质背景趋于透明化,便于观察染色体。常用的解离方法主要有酸解法和酶解法。
在普通光学显微镜下观察染色体形态结构还需要对材料进行染色,通常采用染色体染色效果好而细胞质着色少的碱性染料、酸性染料或孚尔根试剂染色。
四、实验方法
1.发根 2.预处理
冷处理:将根尖放入盛有蒸馏水的指形管中,置0~4℃的冰箱(或在冰水)中处理24~40h ,染色体数较多的实验材料可适当延长处理时间,但需注意勿使材料结冰。
3.固定 材料经预处理后,用流水冲洗,然后投入卡诺液Ⅰ(3份甲醇∶1份冰乙酸,现配现用)中固定20~24h ,用95%的乙醇洗两次,转入70%乙醇中保存备用。
4.解离 常用酸解法:从70%乙醇中取出固定好的根尖→流水冲洗3min →吸水纸吸干→放入小试管中→加适量1 mol/L HCl于60±0.5℃水浴解离10~15min 。
5.染色
孚尔根反应染色:将解离材料洗净或直接转入席夫试剂于室温(最好在10℃左右) 进行孚尔根染色反应1~5h 或过夜,然后在漂洗液中漂洗3次,每次5~10min ,再经流水冲洗5~10min ,保存于45%乙酸中或1%醋酸洋红复染压片。
6.压片 7.镜检 8. 揭片
实验五 荧光原位杂交实验(原位杂交)
一、实验目的
通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在植物学、生物学、医学等领域的应用。
掌握原位杂交技术的操作方法,熟练掌握荧光显微镜的使用方法。
二、实验原理
荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是一门新兴的分子细胞
遗传学技术,是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。
FISH 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针,按照碱基互补的原则,与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合,形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA 分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列,因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比,荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点,因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分为三类:1)染色体特异重复序列探针,例如a 卫星、卫星III 类的探针,其杂交靶位常大于1Mb ,不含散在重复序列,与靶位结合紧密,杂交信号强,易于检测;2)全染色体或染色体区域特异性探针,其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成,可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得;3)特异性位置探针,由一个或几个克隆序列组成。探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记,杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测,同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理,将荧光信号进行放大,从而可以检测500bp 的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合,或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单,但由于不能进行信号放大,因此灵敏度不如间接标记的方法。
三、 实验用具及材料
HVG18探针、植物中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、荧光
显微镜、盖玻片、封口膜、200mL 移液器、20mL 移液器、暗盒、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠。
四、实验方法及步骤
1、 探针的标记
组成 ddH2O
体积 30-x
每反应的量
2.5μmol Tris.cl Ph7.5
10×NT buffer
5
250nmol MgCl2 2.5μg BSA
终浓度
50mM 5mM 50ng/μl
100mM DTT 5 500nmol 2nmol dATP 2nmol dGTP
10mM 40μM 40μM 40μM 10μM 40μM 20ng/μl 1.2 mU/μl 0.2U/μl
1.3mM dNTP mix, equimolar 5
2nmol dCTP 500pmol dTTP
1mM F-x-dUTP, equimolar
DNA DNaseI, diluted DNAPol I
2 x 1 2
2nmol 1μg 60mU 10U
实验操作程序:
(1)在0.5mlPCR 管中依次加入上述溶液。 (2)短暂离心后,水浴锅中16℃反应2小时。 (3)反应后取出放在冰上处理5分钟。
2、 原位杂交程序
(1)在制备好的染色体片子上滴加50-100μL 70%的甲酰胺(用2×SSC配置),盖上盖片。 (2)80℃处理2min ,拿出后迅速甩掉盖片。迅速依次放到-20℃预冷的70%、95%和100%梯度酒精中(各5min 或以上)。处理完自然干燥。 (3)配置杂交体系:(1张染色体制片)
名称 去离子甲酰胺 20×SSC ssDNA B-DNA 50%DS HVG18
用量 7.5μL 1.5μL 1.5μL 1μL 3μL 1μL
上述体系配置完成后,瞬时离心,然后80℃变性10min 。变性完后,迅速放 到冰上处理5min 以上。
(4)把上述体系滴加到玻片上,盖片,放入37℃饭盒里反应8h 以上或过夜。 (5)用镊子将指甲油剥掉,将标本片浸入2×SSC的染色缸中,轻轻摇动使盖片脱落。 (6)清洗:
步骤
洗脱缓冲液
温度条件
洗脱时间
1
2
3
4 2×SSC 2×SSC 2×SSC 1×PBS 室温 42℃ 室温 室温 5min 10min 5min 5min
离心管中加入0.5-1%抗小牛血清(用1×PBS配置)100μL,再加入1μL Fab,涡旋混匀,滴加到盖片上(滴加时标本不要太干燥),盖上盖片,37℃条件下,45min 或以上。
(7)在2×SSC中室温处理2次各5min ,然后在1×PBS室温洗5min 。
(8)自然闭光干燥后滴加PI ,盖上盖片镜检。
五、实验结果
范文三:分子细胞遗传学实验室
Molecular Cytogenetics Laboratory
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L2 分子細胞遺傳學實驗室
Molecular Cytogenetics Laboratory
實驗室主持人:陳燕彰
協同主持人:武光東
壹、背景資料
最近,染色體螢光原位雜交技術 (in situ hybridization) 大幅度改良,結合細胞遺傳學、分子生物學、螢光顯微技術及電腦影像處理,發展出新疛基因篩檢及定位技術,稱為螢光染色體原位雜交技術 ( Fluorescence in situ Hybridization; 簡 稱FISH ) ,基因體雜交比較法 (Comparative Genomic Hybridization ; 簡稱 CGH; Kallioniemi et al.,
1992),微陣列式基因體雜交比較技術 (array-CGH),頻譜式染色體分析 (Spectral Autokaryotyping; 簡稱 SKY; Schrock et al., 1996) 與多色螢光染色體原位雜交技術 (multicolor/multiplex FISH; 簡稱 mFISH; Speicher et
al., 1996),為癌症研究帶來新疛方向。 本核心實驗室已有CGH,SKY 與 mFISH 設備,將增設 array-CGH 及其他基因篩檢及定位技術之軟硬體,標準化及最佳化各種操作流程,並培訓研究工作人員。
一、設置緣由
1. 先前本校為執行國科會尖端計劃,已於校內建立分子細胞遺傳學實
驗室,主要利用CGH技術從事癌組織基因體變化之分析;自1997
年迄今,已分析超過600例各種不同疛人類癌組織,尋找與癌症相
關之腫瘤基因及腫瘤抑制基因,成效良好。
2. 本核心實驗室利用CGH技術分析之人類癌組織包含肝癌,鼻咽
癌 ,卵巢癌 ,子宮頸癌 ,乳癌,大腸直腸癌,胃癌及腦瘤 ,在
過去數年內,已完成超過600例各類標本。
3. 利用CGH分析眾多疛人類癌組織,我們已從中獲得數個與癌症相
關疛染色體好發區域,為進一步解析這些區域內所含疛致癌或抑癌
基因,我們已開始著手建立較高解像力疛array-CGH技術平台。
二、核心技術簡介
Fluorescence in situ hybridization:FISH:
利用螢光標定之DNA 探針,藉由hybridization疛過程,在染色體上將基因或DNA定位。
Comparative genomic hybridization:CGH:
利用兩種不同疛螢光分別標定兩種不同組織細胞疛Genomic DNA ,再同時與正常疛染色體進行hybridization疛過程,藉由比較染色體上不同螢光間疛強弱比值,而偵測基因體中之特定基因疛拷貝數變異:copy number changes:。
Spectral karyotyping (SKY)
利用各個特異疛染色體探針,以多種螢光試劑加以標定後與待測疛染色體進行hybridization,利用螢光試劑光波頻譜疛差異,藉由光波頻譜分析,可使得個別疛染色體具有其特定疛頻譜組合,並藉由軟體設定不同顏色給個別疛染色體。藉由顏色區別,即可快速且正確疛進行細胞疛核型:karyotype:分析。
Array-based Comparative genomic hybridization (array-CGH) 基本原理同於CGH,但是將原有疛染色體雜交模板替換成微陣列式疛BAC Contig,可大幅提升CGH 之解像力到100Kb。
三、服務相關之研究發展
研究目標
1. 與肝癌研究計畫合作,利用CGH與SKY技術針對原發肝癌與再
發肝癌之基因體變異進行比對分析。
2. 由於惡性腫瘤之基因體常常包含許多類型之變異,且不易區分這
些基因體變異與癌化過程間之因果關係,因此,我們計畫針對良
性肝腫瘤及一些早期肝病變組織,如再生性結節:Regenerated
Nodules:及肝硬化組織 :Cirrhosis Tissue:進行基因體變異分析。 3. 利用肝腫瘤之基因體變異圖像:Genome Aberration Profile:來鑑
定腫瘤組織之株源:Clonality:。
4. 利用CGH與SKY技術偵測肝腫瘤之遺傳物質不穩定性:Genetic
instability:,並結合臨床資料以建立肝癌之預後或診斷工具。 5. 進行不同肝癌細胞株間之基因體變異比較,並與其細胞功能相對
照。
四、與其他計劃之互動
C1:Sequencing Center:
殖株定序前,本核心實驗室將以FISH技術做其相關位置之定位,以確認不同殖株彼此之排序。利用CGH與SKY得到之基因體變異區,將
交由定序中心做進一步分析。為確定array-CGH所使用BAC疛正確,也須由定序中心進行BAC-end序列。
C2:Gene Expression Analysis Center:
利用CGH與SKY得到之基因體變異區之殖株,亦可作成微陣列,提
供更方便及更精確疛分子細胞遺傳學實驗操作;譬如,利用BAC Contig 之微陣列代替染色體作為雜交模板,可大幅提升CGH 之解像力,並
可交由基因表現分析中心針對BAC內疛基因,進行定量PCR (real-time quantitative PCR) 分析 ,以找出相關基因。
C3:Bioinformatics Center:
CGH, array-CGH與 SKY得到之癌症基因體變異區,可作成分子細胞遺傳學資料庫,提供其他基因體分析工作,如LOH study (L1 Genotyping Lab) 之參考。
貳、設施規劃與說明
一、現有儀器
1. 本核心實驗室目前設置一套細胞遺傳工作平台 (Cytovision
Genetic Workstation),可執行傳統G-baiding 自動核型分析,DAPI
螢光自動核型分析及分子細胞遺傳分析包括FISH , CGH ,mFISH
與RxFISH。共包含一組螢光顯微鏡、六組光學濾鏡 、自動濾境
轉盤 (Filter wheel) 與影像汲取及影像分析軟體。
2. 本核心實驗室亦有執行傳統CGH 及FISH實驗所需之各種分子
生物學及分子遺傳學儀器,包含聚合鏈脢反應儀,細胞培養箱,
烘箱,水浴槽等。
3. 頻譜式核型分析系統 (Spectral Imaging-based Autokaryotyping
System),可同時偵測24種不同之人類染色體,並自動偵測染色
體轉位及其他不正常變異,還可進行十種以上探針疛FISH 分
析。
4. 本核心實驗室亦設立有大量抽取BAC (bacterial artificial
chromosomes) DNA疛相關儀器與設施,包括大型培養箱,高速離
心機等。
5. 微陣列打點器 (Lucidea? Microarray Spotter),製備array-CGH晶
片,進行BAC 微陣列打點所需。
二、空間
以上設備目前放置於實驗大樓A區109室。
三、人員
每年將僱用研究助理一名。
參、常規服務
本核心實驗室可支援陽明校內外之相關研究,以使設備及技術得到最大之效能。支援疛技術包括:
1. Human Chromosome Banding Analysis染色體色帶染色法之製作與
分析。
2. FISH:利用FISH技術,從事人類染色體上基因或DNA片段之定位。 3. 利用CGH與SKY技術,分析相關細胞之染色體變異情形。 4. Array-CGH 提升CGH疛解析力到100kb:規劃測試中:。
一、Human Chromosome Banding Analysis:染色體色帶染色法之製作與分析: 申請人應提供之材料與資訊
中期染色體疛細胞液或新滴好疛染色體玻片。
申請人預期得到之服務成果
核型 (karyotype)分析報告與digital image file一份,需要紙張輸出者,每份另收100元。
操作所需疛時間
一星期。
預估使用經費
服務所需費用請參考:http://genome.ym.edu.tw 。
目前服務能量
每年30 cases。 欲達最大服務量 50 case,須增加人力。
二、Fluorescence in situ hybridization:FISH:
申請人應提供之材料與資訊
Cosmid, phage, BAC, YAC 或是Insert大於10kb以上疛DNA clone, 濃度大於100 ng/μl,量大於 2 μg。
申請人預期得到之服務成果
DNA clone mapping疛位置與digital image一份,需要紙張輸出者,每份另收100元。
操作所需疛時間
三天。
預估使用經費
服務所需費用請參考:http://genome.ym.edu.tw 。 目前服務能量
每年100 cases。欲達最大服務量150 cases,須增加人力。
三、Comparative genomic hybridization:CGH:
申請人應提供之材料與資訊
Genomic DNA,濃度大於100 ng/μl:以Fluorometer測定:,量大於2 μg;
待分析細胞來源之病人性別:如果可以取得:。 申請人預期得到之服務成果
Chromosomal aberration profile, 與digital image 各一份,需要紙張輸出者,每份另收100元。
操作所需疛時間
一星期。
預估使用經費
服務所需費用請參考:http://genome.ym.edu.tw 。 目前服務能量
每年50 cases。欲達最大服務量100 cases,須增加人力。
四、Spectral karyotyping:SKY:
申請人應提供之材料與資訊
欲分析之中期染色體疛細胞液或新滴好疛染色體玻片(不超過一個星
期)。
申請人預期得到之服務成果
SKY核型 (karyotype)分析報告與digital image file一份,需要紙張輸出
者,每份另收100元。
操作所需疛時間
一星期。
預估使用經費
服務所需費用請參考:http://genome.ym.edu.tw 。
目前服務能量
每年20 cases。欲達最大服務量 50 cases,須增加人力與經費。
五、Array-CGH
本服務正規劃測試中,如有希望使用此項服務者,請洽陳燕彰老師實驗室
〈鍾尹禎:2826-7000轉5561〉
六、常規服務以單一Case為主,當所需服務之case 量為同類檢體且數量
過多:如多於10個以上:時,相關細節由申請人與主持人會商。
七、負責教授
陽明大學通識中心 陳燕彰 副教授
Tel: 02-2826-7032; Fax: 02-2826-4719; Email: yjchen@ym.edu.tw
八、聯絡人及聯絡方法
鍾尹禎 Tel: 02-2826-7000轉5561 ; Email: d48908006@ym.edu.tw
九、技術訓練及推廣活動
每年支援及參加陽明基因體研究中心所舉辦疛研討會,並與各大醫院
進行合作。
范文四:[试题]细胞与分子遗传学
细胞和分子遗传学
第一章 绪论
1. 遗传:生物信息从上代往下代传递
2. 遗传学:研究遗传规律的科学
3. 基因组Genome : 一整套染色体上的所有遗传物质 4. 基因组学Genomics: 研究基因组的科学,包括研究分析核酸序列、基因成分、基因结构和基因数目.
5. 细胞遗传学: 从细胞学和遗传学发展起来的交叉学科,它涉及染色体的形态、结构、数目、功能和运动等特征,以及这些特征的各种变异对遗传传递、重组、表达与调控的作用和影响,也涉及染色体外的遗传因子。以染色体遗传为研究核心。 6. FISH(fluorescent in situ hybridization):荧光原位杂交 7. 原位杂交:是一项利用标记的DNA或RNA探针直接在染色体、细胞或组织水平定位特定靶核酸序列的分子细胞遗传学技术。
8. FISH工作原理:用已知的标记单链核酸为探针,按照碱基互补的原则,与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合,形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列,因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比,荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点。
9. FISH的应用:?位点特异性探针:能与染色体的特定部位杂交;已经分离出一段基因的一小部分,若要确定这段基因位于哪个染色体,就准备这段基因的探针并观察该探针与哪个染色体杂交。?整个染色体探针:能分别与染色体纵轴的不同序列杂交的很短的探针的集合。用这些探针库能画出全部染色体并产生核型谱带,再进行核型分析,用于检测染色体异常
10.原位杂交的种类:?GISH(Genomic in situ hybirdization)——以基因组为探针(整个染色体)。?FISH(Fragment in situ hybridization)——以特定的基因为探针(基因片段)。?mFISH (multicolor FISH)——利用不同颜色的荧光素标记不同的探针。?Fiber-FISH——利用化学方法对染色体进行线性化,再以此线性化的染色体DNA纤维为载体进行FISH(提高分辨率)。
第二章 基因组作图与基因定位
1. 结构基因组的研究策略:测序路线——作图(遗传图和物理图)、测序(图谱测序和随机测序)、组装(骨架图和空隙图)。
2. 为何要绘制遗传图与物理图,1)基因组太大,必需分散测序,然后将分散的顺序按原来位置组装,需要图谱进行指导. 2)每次仅能读取1000bp,已知最小的细菌为580kb.3)基因组存在大量重复顺序,会干扰排序,因此要高密度基因组图. 4)遗传图和物理图各有优缺点,必须相互整合校正.
3. 遗传图与物理图:?遗传作图(Genetic mapping)采用遗传学分析方法将基因或其它DNA顺序标定在染色体上构建连锁图。包括杂交实验,家系分析。遗传图距单位为厘摩(cM), 每单位厘摩定义为1%交换率。?物理作图(Physical mapping)采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。物理图的距离依作图方法而异,如辐射杂种(radiation hybrid)作图的计算单位为厘镭(cR), 限制性片段作图与克隆作图的图距为DNA的分子长度,即碱基对(bp, kb)。
4. 基因组测序的策略:Clone-by-clone测序(基因克隆)、鸟枪法测序(全基因组)、混合法测序。基本流程:随机酶切成小片段(不完全酶切)——亚克隆(酶切片段+载体)——亚克隆测序(两端测序)——组装。关键:酶选择,片段大小,数量(库大小)。
5. 基因组路标(landmarker):染色体上的基因和DNA顺序均可作为路标, 路标具有物理属性,他们由特定的DNA顺序组成. 路标位于染色体上的位置是固定的, 不会更改的, 因而提供了作图的依据。
6.RFLP(restriction fragment length polymorphism,限制性片段长度多态性):指基因型之间限制性片段长度的差异(同种酶),这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。
7. RFLP的特点:?处于染色体上的位置相对固定; ?同一亲本及其子代相同位点上的多态性片段特征不变; ?同一凝胶电泳可显示不同多态性片段, 表现为共显性(双亲的性状同时在F1个体上表现出来)——一个酶切位点突变,则两条同源染色体跑出的胶共有3段,下面两段相加等于上面那段.
8. 如何寻找RFLP标记(即酶切位点): ?随机克隆筛选; ?将其它方法获得的DNA标记, 如RAPD (random amplified polymorphism DNA)标记转换为RFLP标记; ?从cDNA 中寻找RFLP. ?计算机筛选.
9. AFLP(amplified fragment length polymorphism, 放大的片段长度多态性):?这是一种筛选
RFLP分子标记的方法. 先将DNA样品采用选定的限制性内切酶(如EcoRI, Sau3A)消化, 然后加上接头PCR引物(补平粘性末端并额外延伸1-3个碱基). ?接头PCR引物设计: 根据限制酶接头添加数个向外延伸的碱基(补平末端), 然后向3’方向延伸1-3个不同的碱
13基(共有4-4种不同的引物). ?选择不同的引物对扩放样品DNA(PCR), 经聚丙烯胺
-3个碱基作为标记)PCR产物.凝胶电泳分离标记的(就是用那多出的1
10.SSLP(simple sequence length polymorphism,简单序列长度多态性):?可变排列的简单重复顺序, 即重复次数不一, 在染色体的同一座位重复顺序拷贝数不同(导致多态性); ?SSLP的类型:小卫星序列(minisatellite), 重复单位较长;微卫星序列(microsatellite), 重复单位较短, 在1-6个核苷酸之间。
11.SSR(简单重复序列,即微卫星序列): 其串联重复的核心序列为1-6 bp,其中最常见是双核苷酸重复(CA,TG), 重复单位数目10-60个。 12. 如何寻找微卫星序列标记? ?1982年Hamada等首次报道microsatellite现象(PNAS, 79:6564, 1982)。?1989年Weber等从GenBank中发现人类基因组的8个位点中, 有7个位点存在(CA)n拷贝数的变化(Am. J. Hum. Genet., 44:388, 1989).?现已证实人和老鼠基因组中平均每18-28 kb含有一个多态性(CA)n.?获取方法: a) 机算机搜寻; b) 用Sau3A, RsaI, HaeIII或AluI 限制酶酶切基因组DNA, 构建DNA文库.合成简单寡聚重复核苷酸作为探针从库中筛选.?根据简单重复顺序两侧的序列设计引物, 用同位素标记PCR扩增样品, 经聚丙烯酰胺凝胶电泳分辩.
13. SNP (single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性):指在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入,形成的遗传标记,其数量很多,多态性丰富。
14. SNP的一些特点:?理论上同一碱基位置SNP等位型式最多为4. ?直接从STS (sequence-tagged site,序列标志位点)测序中可寻找到SNP. ? MIT Whitehead Institute 经分析证实, 人类基因组平均每1 kb 含有一个SNP. 估计人类基因组有300万个SNP. ?SNP与人类易感性疾病有关, 涉及药物基因组学. ?编码区SNP主要分布在密码子的摇摆位置(第3个碱基),表现为沉默突变而被保留下来.
15. ?遗传图绘制-分子标记的等位型式及F2基因型分析,计算重组率,从而绘制遗传图(Aa/Bb,其中A/B连锁)(图-42)
16. ?物理图绘制:?限制性作图(Restriction mapping)它是将限制性酶切位点标定在DNA
分子的相对位置。?依靠克隆的基因组作图(Clone-based mapping) 根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群(Contig), 绘制物理连锁图。?荧光标记原位杂交(Fluorescent in
situ hybridization, FISH)将荧光标记的探针与染色体杂交确定分子标记的所在位置。?顺序标签位点(Sequence tagged site, STS)作图通过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组的DNA区段中(小段DNA序列已知,两端设计引物,利用PCR进行扩增)。
? 限制性作图(Restriction mapping):将限制性酶切位点标定在DNA分子(一般为小分子DNA)的相对位置。?酶切片段电泳图;?推测出限制性物理图。 对于大分子DNA的研究策略与方法:1) 制备---琼脂糖包埋法 2) 酶切---稀有酶切位点限制酶 3) 分离---脉冲电泳分离 4) 克隆---载体设计
?琼脂糖包埋法(知道即可):a.分离纯化细胞核 b.将收集的细胞核包埋在琼脂糖凝胶薄片中 c.蛋白酶消化处理细胞核。 ?稀有切点限制性内切酶的应用:a.什么是稀有切点内切酶: 在基因组DNA顺序中有很少可识别序列的限制酶, 一般识别位点在6-8碱基对之间, 并含有高G/C比。 b.选用稀有切点限制酶注意事项:a) 识别位点的非特异顺序, -G ANTC- (HinfI),
-GCCN4 NGCC- (BglI) b) 高等生物基因组一般A/T比较高, 应选G/C高比例限制酶, 如-GC GGCCGC-(NotI) c) 基因组甲基化状态, 高等生物基因组DNA甲基化比例很高, 但果蝇和酵母基因组无甲基化。?脉冲交变电场电泳:会跑出一段白色的轨迹,而不是一条一条的片段(因为各片段紧密相连,共同组成了连成一片的轨迹)。 ? 克隆作图(大分子DNA的克隆):根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群(Contig), 绘制物理连锁图。
克隆作图的载体与方法:?大分子DNA克隆载体构建:YAC, BAC, PAC, HAC, MAC, TAC。?大分子DNA克隆的作图:步移法和指纹法。
?YAC(酵母人工染色体)和BAC(细菌人工染色体)基因组文库的构建:1) 目标基因组大分子DNA的制备 2) 载体制备3) 载体和插入DNA的连接 4) 转化 5) 转化子鉴定
?染色体步移法:以A1为探针,找到B1、B2(A1两端与B1、B2分别配对),在分别以B1、B2为探针重复杂交,筛选到下一轮阳性克隆C1、C2,不断重复,建立起彼此连接的重叠群。
?限制性片段指纹作图原理:a.在两个重叠BAC克隆间存在相同指纹 b.重叠BAC克隆DNA凝胶电泳指纹图(重叠的片段在图上显出相同位置的条带):BAC克隆酶切后经过琼脂糖凝
胶电泳分离,染色后显示片段指纹,再经计算机识别相同的指纹区段,即重叠的BAC克隆。最后构建指纹重叠群(物理图的绘制),基因组的遗传图可与物理图整合。
?顺序标签位点(Sequence tagged site, STS)作图:通过PCR或分子杂交将特定DNA 顺序定位在基因组染色体区段中。
STS作图原理:将染色体DNA随机打断,两个标记所处的物理位置越近,位于同一片段的几率越高。?辐射杂种作图: 辐射杂种图距单位——DNA分子暴露在N拉徳(rad) X射线剂量下两个分子标记之间发生1%断裂的机率, 其图距单位为厘镭(centiRay, cR).??
17.物理图的应用——图位克隆或定位克隆:该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的,无需预先知道基因的DNA 顺序,也无需预先知道其表达产物的有关信息(遗传作图?物理作图?转录图?基因顺序)。1) 首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记; 2) 用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置; 3) 构建含有大插入片段的基因组文库(BAC库或YAC); 4) 以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库; 5) 用获得的阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群; 6) 通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆; 7) 通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆; 8) 通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。(百科) 18. ?图位克隆的步骤:1) 连锁标记的分离与克隆(筛选到); 2) 连锁标记向靶基因位置逼近; 3) 以紧密连锁标记为探针筛选基因组(大插入片段)克隆; 4) 染色体步移, 构建覆盖靶基因位点的重叠群; 5) 以覆盖靶基因位点的DNA克隆为探针从cDNA文库筛候选基因; 6) 候选基因多态性分析; 7) 转基因验证.
第三章 基因组测序与诠释
1.本章内容:?基因组测序的策略 ?基因组测序的方法 ?高通量自动化测序 ?序列组装
2.基因组测序的策略:?随机测序 ?限定测序
3.随机测序(与鸟枪法类似):?基因组文库的构建 ?两端测序(基因组DNA?部分酶切?电泳分离?DNA片段建库?挑取克隆?两端测序?形成重叠群?覆盖的DNA区段可得到)
4.基因组测序的方法:?测序的DNA多聚酶 ?测序标记 ?电泳装置 ?测序难点.
5. 测序的DNA多聚酶:?高酶活性; ?无5’?3’外切核酸酶活性; ?无3’?5’外切核酸酶活性。
6. 链终止法测序(Sanger法):和放射性同位素标记测序法不同——?以荧光颜色为标记信号,每种ddNTP各有1种代表颜色; ?整个反应在一个试管中进行; ?新合成的终止单链通过荧光监测仪时,可以光信号读出末端核苷酸并由电脑记录. 7. 化学法测序(Maxam法):?分别修饰分别降解; ?试剂含有毒性; ?链终止法更易于自动化.
8(毛细管电泳:取代聚丙烯酰胺凝胶电泳,有96个泳道,可同时进行96次测序,每轮不到2小时,一天近千次反应
9. 几种不同生物基因组的测序:1) 大肠杆菌基因组测序----图位法 2) 流感嗜血杆菌基因组测序---鸟枪法 3) 果蝇基因组测序---鸟枪法4) 人类基因组测序---图位法和鸟枪法(鸟枪法局限:无法测到重复出现的DNA片段)5) 拟南芥基因组测序—图位法 6) 水稻基因组测序---图位法和鸟枪法.
10. 流感嗜血杆菌基因鸟枪法测序无需任何关于遗传图及物理图的信息。
11. 用于测序的流感嗜血杆菌基因组文库——构建了两套基因组文库,原因是:1) 1.6-2 kb大小插入子基因组文库. ?2 kb大小插入子可减少扩增时的变异率. ?此外, 2 kb大小降低了克隆片段含有完整基因的可能性, 有些完整基因的表达产物对宿主菌是有害的. 2) 15-20 kb大小插入子文库, 用于支架搭建. 上述两套基因组文库的克隆测序均为两端测序.
12. 间隙:测序后将DNA顺序进行组装,存在不连续的区段。 13. ?间隙的类型(名解):1) 顺序间隙:因覆盖率的原因而留下的未能测序的顺序,仍存在于克隆文库中, 这类间隙称为顺序间隙。 2) 物理间隙:因克隆载体自身的限制(库中)或DNA顺序特殊的组成等原因造成某些顺序丢失或未能克隆, 这类间隙称为物理间隙。
14. 流感嗜血杆菌基因组测序结果(看看即可):1) 两端测序的结果称为读序(read), 每个读序长约400bp. 2) 在DNA顺序组装前,由自动测序仪给出的每个读序都必须经PhredII软件处理, 以确定给出的顺序质量与可靠性.这一步为顺序认可 (calling for). 3) 流感嗜血杆菌基因组测序共组装了24304个片段,建立了140个重叠群(contig).根据某些克隆跨越不同的contig,
再合并为42个支架(scaffold). 4) 整个组装的基因组顺序存在42个物理间隙, 98个顺序间隙.基因组全长1830137bp(1.8 Mb).
15. ?基因组顺序组装的概念定义(名解):1) BAC末端顺序(BAC-end sequence):一个BAC克隆插入片段两端的已测序的顺序,不包括内部顺序. 可用于确定BAC的排列方向以及重叠群(contig)在支架(scaffold)中的排列方向. 2) 重叠群(contig):一群相互重叠的克隆或DNA顺序,可以是草图顺序或精确顺序(finished), 包括连续的(内部无间隙)或不连续的(内部含间隙)DNA顺序. 3) 草图顺序(draft sequence):人类基因组测序计划定义为经Phred Q20软件认可覆盖测序克隆片段3-4倍的DNA顺序. 含间隙或无间隙, 排列方向和位置未定. 4)精确顺序(finished sequence):顺序差错率(错误碱基数)低于0.01%的DNA序列, 排列方向确定,内部不含间隙, 一般测序覆盖率在8-10个当量. 5) 支架(scaffold):一组已锚定在染色体上的重叠群, 内部含间隙或不含间隙.
16. 果蝇基因组测序:第一个采取鸟枪法完成基因组测序的真核生物,基因组总长180Mb。
17. 鸟枪法顺序组装流程图(看看即可):1) 由自动测序仪记录的测序顺序经Phred Q20软件判断采用. 2) 筛查过滤重复顺序: 如rRNA基因, 转座子等。 3) 重叠顺序组装: 两段顺序重叠的认可标准为,至少40bp的重叠,差异率小于6%. 4) Unitigger(重叠单元)建立: 一组彼此重叠的DNA顺序,其中不存在争议的或不确定的重叠关系,为独立的重叠群. 5) 支架(scaffold)搭建: 由一组Unitigger相互叠合以及由BAC克隆末端顺序指认彼此相邻的重叠群,内部可能有间隙.
18. 定位克隆(即图位克隆,见前):首先找到与靶基因连锁的分子标记,然后构建基因组文库。通过与靶基因连锁的分子标记筛选阳性克隆,再根据克隆插入子两端的DNA顺序查找与之连接的克隆建立重叠群,直到覆盖整个靶基因座位(染色体步移)。
17. 线虫基因组测序策略:图位法
18. ?关于基因组测序顺序的概念(名解):?草图顺序(前有): 1) 达到普通质量但尚未完成的基因组DNA顺序, 其精确度高于90%.所处染色体位置已知,一般长度约10kb. 2) 草图顺序可分为3个等级: Phase 0: 测序覆盖顺序一次的DNA序列; Phase 1: 测序覆盖顺序4-10次的BAC克隆, BAC及内部片段的位置和排列方向未定. Phase 2: 测序覆盖顺序4-10次的BAC克隆, BAC及内部片段的位置和排列方向已定. ?完成顺序:1) 完成顺序系指已测序的, 每10000 个碱基中出现一个差错, 且内部不存在间隙的DNA顺序. 2) 完成顺序也
称为Phase 3期顺序.
19. 玉米基因组如何测序:1) 玉米基因组大小为2500 Mb(2.5 x 10 ), 约80% DNA顺序由逆转座子组成. 2) 虽然利用EST(expressed sequence tag)可从基因组中抽提出基因组顺序,但因表达丰度过低或组织专一性表达的原因, ESTs库会丢失50%的基因成员. 3) 绝大多数逆转座子和非基因编码区都被甲基化, 而95%的基因未甲基化. 因此采用大肠杆菌McriA和McriB系统构建玉米基因组文库, 用以富集基因顺序.
20. 玉米基因组甲基化过滤测序法:1) 大肠杆菌McriA和McriB系统可以破坏入侵的含有胞嘧啶甲基化的外源DNA, 动物和植物DNA对这一系统也很敏感. 2) 用甲基化敏感的限制酶切割玉米基因组DNA, 将克隆载体转化大肠杆菌McriA和McriB系统菌系,凡是含有胞嘧啶甲基化的克隆均被淘汰, 使基因富集7倍. 3) 采用甲基化过滤法可将玉米基因组中93%的甲基化顺序除去.经过滤后有24%的顺序与基因匹配,而未过滤的仅1.4%与基因匹配.
21. 基因组序列诠释:1) 基因注释 2) 基因功能预测 3) 基因功能检测 4) 功能基因组研究
22. 真核生物基因的一般结构:外显子和内含子。 23. 真核生物基因的组成特征:1) 外显子的组成 2) 内含子的组成 3) 碱基的分布规律
24. ?内含子的组成特点:1) 内含子具有前体mRNA加工的特征顺序。 2) 内含子含有高比例的三种读框的终止密码。
25. ?外显子的组成特点:1) CpG岛:脊椎动物 2) 摇摆密码子的使用频率或密码子偏爱 3) 5’和3’非翻译区(UTR)碱基比率, 水稻基因5’的高GC比 4) 不含或含有较少的终止密码。
26.密码子偏爱现象:不同生物表达同种氨基酸的密码子的使用频率不同。
27.同源查询——DNA顺序和氨基酸顺序
28. ?同源性,一致性和相似性:1) 同源性(homology):基因系指起源于同一祖先但顺序已经发生变异的基因成员, 分布在不同物种间的同源基因又称直系基因(orthologous gene). 同一物种的同源基因则称水平基因(paralogous gene), 水平基因由重复后趋异产生. 2) 基因同源性只有“是”和“非”的区别, 无所谓百分比. 3) 一致性(identity):系指同源DNA顺序的同一碱基位置的相同的碱基成员, 或者蛋白质的同一氨基酸位置的相同的氨基酸成员, 可
用百分比表示. 4) 相似性(similarity):系指同源蛋白质的氨基酸顺序中一致性氨基酸和可取代氨基酸所占的比例. 可取代氨基酸系指具有相同性质如极性氨基酸或非极性氨基酸的成员, 它们之间的代换不影响蛋白质(或酶)的生物学功能.(注意区别一致性和相似性)
29. 基因注释的方法:1.目前基因注释的方法主要依赖于生物信息学方面的分析结论,它们包括以下自动注释内容: 1) ab inition 软件的预测, 依据基因结构的特点. 2) 同源性比较 3) 基序(motif)或功能域(domain)分析预测基因功能. 2. 基因功能的分类主要采用ONTOLOGY标准. 3. 人工注释系指人为检测评价程序自动注释的结果并根据其它数据进行分析与校正. 4. 实验注释系根据实验结果进行注释. 基因功能注释与调控顺序注释仍处于起始阶段.
30. 基因注释标准—人类:Known gene: 与人类已知cDNA和蛋白质顺序同源的基因. Novel gene: 与脊椎动物cDNA或其它物种蛋白质同源的基因. Novel transcripts: 与novel 基因相似,但缺少明确的ORF. Putative gene: 有同源EST支持, 但缺少cDNA或ORF. Predicted gene: 数据库中至少有一个外显子支持, 但缺少cDNA或明确的ORF. Pseudogene(假基因): 与已知蛋白质有50%的同源性,但cDNA残缺,在其它位点存在正常的同源基因的顺序.
31. 水稻注释基因类群的划分标准(3种): Homology(同源的):与某一蛋白质氨基酸顺序完全一致或相当一致的基因,有两种水平:一致的命名(same name);可能的(putative protein)或类似的(-like protein)命名. Unknown(未知的): 具有全长cDNA或EST(覆盖几乎整个基因范围)支持但没有任何同源蛋白质记录的基因. hypothetical (假定的):由一个或几个注释软件认可的蛋白质,但缺少cDNA或EST支持的基因.
32. 人类基因总数的预测有三种方法: ?cDNA和ESTs顺序 ?机算机注释 ?比较基因组学(保守的ORF)。
33. 几种模式生物注释的基因总数:大肠杆菌(E.coli):4800 酵母(yeast): 6200 线虫(nematode): 19000 果蝇(fly): 13600 拟南芥(Arabidopsis): 25000 水稻(rice): 60000 玉米(maize):59000 (估计数) 老鼠(mouse): 30000。
34. 功能域注释:1) 任何基因编码的蛋白质都由一些在高级结构水平具有特征性的功能域组成, 如信号肽, 受体区, 激酶区, DNA或RNA结合域等. 2) 功能域具有很强的保守性, 关键的氨基酸组成及其排列位置是相当衡定的,是鉴定功能域的主要标识. 3) 功能域是目前确定基因功能的主要依据之一. 4) 已由许多专门的功能域注释软件,可用于基因组顺序的注释.
35. 什么是功能域 (domain),定义1:蛋白质具有独特的三级结构和特有功能的区域。定义2:具有的独特功能的蛋白质氨基酸序列的不连续的部分。定义3:蛋白质具有三级结构的部分,在更大的蛋白质中每个功能域通过短的可弯曲的多肽片段与其他功能域链接。
36. 真核生物核基因组:分子生物学的研究从单个的基因转移到整体的基因组活性研究。基因组主要的部分以染色体形式存在于细胞核中,较少的部分位于线粒体中,植物细胞还有叶绿体,也且有独立的基因组。不同真核生物核基因组均由一定数目的染色体组成,单倍体细胞所含有的全套染色体称为 ——染色体组。
37. 染色体结构:?染色体结构部件 ?染色体带型 ?人类染色体区带(带型)命名:人类染色体带型最早确定的命名方式是从着丝粒向两侧按数字编号, 短臂以p代表(p=petit),长臂以q代表。
38. 核型(Karyotype):又称染色体组型,是指用显微镜照像或描绘的方法得到的单个细胞染色体的系统排列。由体细胞中全套染色体按形态特征和大小顺序排列构成,并依次配对、分组。代表的是该个体一切细胞的染色体组成。有丝分裂中期染色体的形态较典型,所以一般分析中期染色体。主要观察染色体的长短、着丝点的位置,臂的长短、有无随体,其中以着丝点的位置最为重要。
39. 染色体核型分析(Karyotyping):是指在显微镜下对个体细胞染色体的大小,形状,数目进行检测的一种方法.根据染色体分带技术可以检测到样品细胞的染色体结构是否正常,是否发生了染色体数目的变化,结构的重排,区段缺失或重复。 40. 基因组的结构成分:1) SAR和MAR 2) CpG岛 3) 等高线4) 富基因区5)“沙漠区”。
41. ?SAR(骨架附着区,Scaffold attachment region):与染色体骨架蛋白结合的染色体DNA顺序.
42. ?MAR(基质附着区,matrix attachment region):与细胞核基质蛋白结合的染色体DNA顺序.
43. MAR和SAR的特征(区别):1) 环突的DNA基部与细胞核基质紧密结合, 将染色体DNA分成相对独立的结构区域. 2) 与细胞核基质结合的DNA顺序(基质附着区,MAR)含有较高比例的AT, 约占总DNA的10%. 3) 拓扑酶II可与MAR结合, 因此推测MAR成分与DNA复制有关. 4) MAR或SAR之间的距离平均为30 kb, 染色体DNA环突长约25-600 kb,
因此并非所有MAR或SAR均与基质或骨架结合.
44. SAR和MAR的应用:由于发现许多功能基因的两侧含有SAR或MAR的结构,并证实SAR和MAR(作用)具有阻止异染色质位置效应和隔离相邻基因彼此干扰的功能,因此为了提高转基因的表达水平, 在构建表达载体时可在基因两侧安装SAR或MAR顺序, 以减少
转基因沉默效应(防止被干扰)。
45. 什么是CpG岛,满足CpG岛的条件为: 1) 连续200 bp的DNA顺序(已修改为500 bp); 2)C+G含量大于50%(已修改为55%); 3)观测到的CpG双碱基数目与预期的数目之比大于0.6(已修改为0.65).
46. CpG岛的一般特点:1) 主要在脊椎动物中发现,其它种属基因组中也有CpG岛, 但特征不明显. 2) 绝大多数CpG岛中很少出现胞嘧啶甲基化, 因此被认为是基因转录活跃区. 3) CpG岛主要分布在基因的启动子区和第一个外显子区. 4) 绝大多数管家基因(housekeeping gene) 含有CpG岛, 是寻找基因的一个指标.
47.脊椎动物中CpG岛的分布有如下特点:1)主要分布在基因的5‘端和第1个外显子区. 2)
‘端均含CpG 岛. 3)双碱基-CpG-具回文结构,是甲基化酶作用人类中40%的管家基因的5
的位点,可在回文对称的两个胞嘧啶5位碳原子上进行甲基化.CpG岛中-CpG-双碱基均无甲基化.
48. 为何会产生CpG岛? 1) 由于细胞内胞嘧啶甲基化与脱氨基事件常常发生, 导致复制时的C?A错配.在下一轮复制时原来的胞嘧啶(C)位置由胸腺嘧啶(T)取代, 即发生碱基代换. 因此基因组DNA顺序进化的总趋势是A/T 比例增加. 2) 管家基因对生物的存活极其重要, 启动子区是基因调控的主要成分, 因此很少发生可遗传的C?A的突变, 保留了较平均值更高的G/C比.
49. 植物基因组中的CpG岛:1) 植物基因组,主要是小型基因组(水稻和拟南芥)含有类似脊椎动物基因组中的CpG岛. 2) 水稻和拟南芥CpG岛的分布密度分别为4.7 kb和4.0 kb. 3) 水稻和拟南芥CpG岛的分布覆盖了整个基因,并非如脊椎动物那样局限于基因5’端. 4) 植物除-CpG-可被甲基化外, -CpNpG-回文结构的胞嘧啶也可甲基化. 5) 植物中-CpG-在CpG岛中的比例在75-80%, 与脊椎动物类似, 单子叶高于双子叶. 50. 基因组顺序组成的等高线(isochore)特点:1) ? 等高线(isochore):系指基因组中具有较均一的相似比例碱基组成的连续的DNA顺序. 2) 脊椎动物基因组中等高线DNA顺序具有镶嵌分布的特征. 3) 高GC比例区总是分布在基因密集区或常染色质区, 高AT比例区大多
+数分布在异染色质区或贫基因区. 4) 梯度密度离心(Ag的CsSO) 可将不同碱基比例的具24
有均一性组成的DNA顺序分离。
51. 基因组的顺序组成:1)编码顺序 2) 非编码顺序 3) 重复顺序 4) 单一顺序
52. ?染色体结构与交换重组频率:1) 短臂交换率大于长臂 2) 近端粒区交换率大于内部区域 3) 富基因区大于贫基因区 4) 存在重组热点 5) 女性染色体交换率大于男性 6) 染色体交换的位置大多分布在启动子区
53. 基因组的基因构成:1) 蛋白质编码基因 2) 非编码RNA基因:几乎所有RNA编码基因都是多拷贝。
54. 动物种属专一性基因非常之少:1) 老鼠基因组注释结果揭示,啮齿类基因中只有1%为种属专一性基因. 2) 原来以果蝇作为参照, 认为在脊椎动物中存在许多脊椎动物种属的基因, 现在在珊瑚虫基因组中已找到许多曾被认为是脊椎动物种属专一性的基因. 因此真正属于脊椎动物的基因数(专一性)比预期的少很多.
55. 非编码RNA基因包括:?rRNA基因 ?tRNA基因 ?snRNA基因: 小分子细胞核RNA基因,涉及前体mRNA剪接 ?snoRNA基因: 与rRNA剪接和修饰有关 ?scRNA基因: 小分子细胞质RNA基因 ?7S RNA: 与核糖体转移到内质网上有关 ?miRNA: 干扰基因表达, X染色体失活。
56. 人类基因组RNA编码基因(非编码RNA基因):1) rRNA(18S,5.8S,28S和5S ) 2) tRNA基因共48种,可解读61个氨基酸密码 3) 10种snRNA: U1,U2,U4,U4atac,U5,U6,U6atac,U7,U11和U12 4) 7SL RNA,端粒酶RNA,7SK RNA,Xist RNA等 5) 真核生物rRNA在合成之后要进行广泛的修饰,主要由小分子核仁RNA
(small nucleolar RNA,snoRNA)指令修饰的位置。人类基因组草图顺序中发现69个C/D 盒 snoRNA基因,15个H/ACA snoRNA基因。 5) miRNA(生物学功能): 参与广泛的个体发育与基因调控, miRNA来自mRNA前体, 但不编码蛋白质. 57. 如何寻找(得到)miRNA基因:1) 突变体筛选与基因克隆 2) 同源基因顺序搜寻 3) 茎环顺序的分析 4) RNA结合蛋白如细菌中的RNA伴侣蛋白免疫共沉淀分离小分子RNA 5) 小分子miRNA的聚丙酰胺凝胶电泳分离。
58. 几种真核类生物转录因子数目比较:拟南芥转录因子基因的数目(1500)远高于线虫(500)与果蝇(700),略底于人类(2000)。 从结构的复杂性观测,拟南芥应比果蝇简单,为何前者的转录因子数量多于后者,这与植物具有复杂的次生代谢产物有关。由于不能通过运动主动躲避环境的压力和侵害,植物只能发展丰富的次生代谢产物来适应所遭遇的生存
环境。植物次生代谢产物的种类约50 000种,基因组中约25% 的基因涉及次生代谢,其中包括相当数量的转录因子。
59. 水稻基因组基因总数(含大量局部重复基因):1) 水稻基因组基因的确切数目尚未确定. 2) 注释的水稻基因组基因总数(TIGR)为56 674个. 3) 经实验确证的水稻全长cDNA为28 467个,其中可能编码蛋白质的成员约21 596(已进行功能归类). 4) 水稻基因组的转录单元约在19 000- 20 500之间,许多基因存在可变剪接.
60. 细胞器基因的转移与进化:1) 细胞器基因转移到细胞核基因组中是一个至今仍在持续发生的现象. 2) 细胞器基因转移到细胞核之后,必需获得一段转移信号肽的顺序才能使其编码的蛋白质进入线粒体. 3) 在这一过程中会发生两种事件:由于未能获得转移肽顺序, 细胞核中来自线粒体编码的基因最终被丢失或突变; 当细胞核中线粒体基因获得转移肽顺序后, 留在线粒体中的拷贝就失去存在的意义, 将发生丢失或突变成为假基因.
61. ?高等植物线粒体基因组的结构特点:1) 结构非均一性: 线性和环状DNA共存. 2) 拷贝非均一性: 同细胞不同亚基因组DNA的拷贝数并不相同. 3) 不同种属之间线粒体基因组大小变化很大, 在120–2500 kb之间. 4) 动态变化: 不同发育时期,每个细胞线粒体基因组的拷贝数不是恒定的. 5) 分子内重组: 高等植物线粒体基因组中含有大量短序列重复顺序, 它们之间的重组导致大量的DNA顺序重排, 是Mt DNA频繁突变的主要原因.
62. ?高等植物叶绿体基因组特点:1) 结构紧凑, 基因之间排列紧密, 很少非编码顺序. 2) 不同种属之间叶绿体基因组大小比较恒定, 约在120 kb左右. 3) 动态变化: 不同发育时期,每个细胞叶绿体基因组的拷贝数是不衡定的. 4) 有两段很长的反向重复顺序, 这一结构可有效地阻止叶绿体环状DNA的分子内重组, 这是叶绿体基因组很少发生重排的主要原因.
第四章 染色质结构与基因表达
1. ?表观遗传学:研究在不改变DNA顺序的情况下基因表达出现可遗传变化的学科. 这种表达模式的改变可通过有丝分裂和减数分裂传递给子代. 表观遗传学是功能基因组学研究的重要领域, 是基因表达调控的重要方式之一.
2. 表观遗传(epigenetic) 包括以下内容: 1) DNA的甲基化 2) 位置效应 3) 核小体和组蛋白的修饰(乙酰基化和甲基化) 4) RNAi (siRNA和miRNA) 5) 染色质的动态异染色质化(X-
染色体的失活) 6) 基因组印记(genomic imprinting) 7) 等位基因的副突变及同源抑制,颠换效应。
3. ?位置效应:位置效应是指由于基因变换了在染色体上的位置而引起表现型改变的现象。位置效应表明基因的功能以及基因对生物表现型的影响可以在不改变遗传物质本身的情况下仅仅由于遗传物质在染色体上的位置差别而发生变化。位置效应实际上反映了基因组不同区域的特定的染色质结构。(如:β-球蛋白质基因座位控制区由增强子活化)
4. 花斑型位置效应:当某一基因由于染色体重排从原来的常染色质区移到异染色质区附近, 因异染色质的扩散效应, 造成基因表达的改变. 这种抑制效应的差别使基因表达受抑程度不同, 由此产生嵌合.
5. ?副突变 (paramutation):最初在玉米中发现的在杂合子中某一基因影响同一座位上另一等位基因的表型. 副突变在转基因表现型中也已发现, 称为同源抑制. 6. ?绝缘子(insulator):这种可以阻止邻近位置激活或失活效应的顺序现在称之为绝缘子。
(染色质位置阻隔效应:使绝缘子邻近的基因互不干扰)
7. 绝缘子的作用(可阻止相邻基因之间增强子的彼此干扰):1) 真核生物增强子具有双向作用, 超长距离功能, 从而带来位置相邻基因之间的彼此干扰问题. 2) 有些基因位于异染色质邻近, 会受到抑制效应的干扰.绝缘子可以阻止上述因位置原因产生的对基因表达的抑制.
8. ?绝缘子的定向控制(问答:为什么绝缘子的效应具有方向性,即绝缘子插入到转座子不同的位置,会产生什么不同的效应,):1) 如果插入位置在启动子的5‘方向,绝缘子将影响上游增强子元件的作用。 2) 如果插入位置在启动子的3‘方向,只影响下游增强子元件的功能。 3) 如果插入位置不在增强子与启动子之间,绝缘子对增强子无阻隔效应。
9. 高等生物基因组普遍存在甲基化:1)DNA分子的化学修饰主要是甲基化,脊椎动物基因组中约60-80%双核苷酸CpG的胞嘧啶(C)被甲基化。被子植物基因组中,甲基化位置主要出现在CpG和CpNpG回文对称顺序,大约20-30%的胞嘧啶(C)被甲基化。DNA的甲基化在基因的表达调控中起重要作用。 2)基因组的甲基化模式可影响表型并能通过体细胞遗传,但不改变细胞的基因型,这种现象称为表观遗传(epigenetic)。
10. 染色质结构的不可逆变化与基因沉默:在个体发育与细胞分化过程中,当某些基因已经
完成预定的表达程序后必需永久性关闭。这一任务可以通过DNA甲基化促使染色质的重建完成。
11. DNA甲基化抑制转座。
12. ?基因组印记:因为亲本来源不同而使等位基因表达模式发生改变的现象称为印记(imprinting)(例:在杂合子中,如果突变等位基因来自父亲, 表型异常.如果来自母亲,表型正常,即母源Igf2基因在子代被抑制).它有两个特点: 1)子代的两个等位基因中有一个发生沉默(甲基化所致), 即不表达. 2)哪一个等位基因沉默取决于亲本来源.
13. DNA甲基化与基因组表达程序化:按照去甲基化?重新甲基化?维持甲基化方向发育。
14. 基因组印记的生物学意义:1) 基因组印记使二倍体体细胞中的一个等位基因沉默, 这与二倍体生物学的意义是相悖的, 容易使突变等位基因暴露. 2) 目前已有三种理论用予解释基因组印记的生物学意义: ?进化理论: 一组各有缺陷的基因在相互组合时有优势, 为了不被淘汰而暂时沉默. ?卵巢期理论: 避免畸胎瘤, 需要胎盘基因沉默. ?冲突理论: 血缘关系理论(kinship theory)
15. 核小体定位:1) 核小体是染色质结构的基本单位. 2) 核小体是连接DNA和染色体高级结构的中间环节. 3) 核小体核心8聚体与DNA的结合不是随机的. 4) 核小体核心8聚体与DNA的结合位置是动态的.
16. ?核小体相位:1)核小体相位(nucleosome phasing)指一段顺序确定的DNA与核小体核心8聚体的可变结合方式。例如缠绕在核心组蛋白8聚体上的DNA顺序可向前或朝后移动若干碱基对,从而改变双螺旋大小沟的朝向,也可称为核小体定位(nucleosome positioning)。2)核小体的定位方式:平移定位(translational position)旋转定位(rotational position)
17. 旋转定位(rotational position):缠绕在核小体上的DNA分子总是一面朝外,一面朝内。当移动缠绕在核小体上的DNA时,若改变的顺序少于整圈螺旋碱基对数(?10.2 bp),原有的顺序朝向将发生变化。因朝外一侧比朝内一侧更易受到核酸酶的攻击,采用合适的酶处理可检测到这种变化。
18. 核小体装配与表观遗传: 1) 虽然有报道表明DNA复制时核小体也采取半保守装配, 但更多的实验证据支持核小体核心8聚体在DNA复制时是保守装配. 2) 由此产生一个问题, 即染色质的表观遗传状态是如何传递的. 现在的证据倾向于,染色质的表观遗传状态可以通
过转录时的组蛋白二聚体正向的(开放)或反向的(关闭)代换保持. 3) PolII基因在转录时可通过核小体,会破坏核小体的结构,使H2A-H2B组蛋白丢失,但核小体并没有离开原来DNA的位置. 此时会发生H2AZ取代H2A组蛋白事件.
19. 染色质重建依赖于组蛋白的修饰:1) 核小体的修饰是染色质水平进行基因表达调控的中心环节. 2) 核小体修饰的目的是促使核小体核心8 聚体与DNA分子的结合或者松弛或者强化, 便于核小体移动或固定, 使转录调控因子结合或排斥. 20. 组蛋白的修饰:1) 乙酰基化(可逆) 2) 甲基化(不可逆) 3) 泛素化(可逆) 4)
Sumoylation(可逆) 5) 磷酸化(可逆) RNAi可介导组蛋白修饰 21. 组蛋白的修饰——乙酰基化:组蛋白乙酰基化是基因在染色质水平表达调控的主要方式之一. 组蛋白乙酰基化使其与DNA的结合松弛, 利于核小体位移. 22. 组蛋白Sumoylation:一种与泛素分子类似的小分子修饰多肽(small ubiquitin-related
modifier)可与组蛋白结合, 促使组蛋白甲基化, 最终使基因关闭。 23. 组蛋白甲基化:组蛋白的甲基化是不可逆的,直接参与染色质的表观遗传.甲基化主要出
现在lys位置, 有抑制和激活两种不同的效应.
24. 剂量效应:1) 剂量效应系指一个基因因其在细胞中拷贝数的多少而产生表达增强与减弱的现象. 2) 多细胞生物中性别染色体在雌性和雄性细胞中的拷贝数不同, 为平衡基因表达产物的数量,出现整条染色体被抑止或超激活现象. 25. 染色体剂量效应可通过基因的上调或下调形式达到:1) 哺乳动物雌性一条X-染色体失活,形成Barr小体; 2) 果蝇雄性X-染色体超表达以达到平衡; 3) 线虫雌性一条X-染色体低表达.
第五章 突变体库的构建和鉴定
1. 功能基因组学(functional genomics):?基因的识别、鉴定、克隆 ?基因结构、功能及其相互关系 ?基因表达调控的研究
2. 突变体库的建立是功能基因学研究的重要内容和前提条件 3. 研究功能基因组的方法:?正向遗传学(Forward genetics) ——根据表型及其遗传规律确定基因在染色体上的位置,并测定其序列,称为正向遗传学。?反向遗传学(Reverse genetics)
——而根据已知序列研究基因功能,称为反向遗传学。 4. ?突变体——携带突变基因的生物体叫突变体(mutant),携带正常基因的生物体叫野生型(wild type)。
5. 构建植物突变体方法:?自发突变 ? 理化诱变 ? 插入突变:?T-DNA插入 ?转座子标签和逆转座子标签 ?基因捕获技术
6. 自发突变体库:在长期的自然选择和人工选择过程中积累起来的,该突变体库包含极为丰富的突变,但是突变体的遗传背景非常复杂,给研究造成很大的困难。
7. 物理化学法建立突变体:通过物理因素如快中子、γ射线和化学试剂如EMS、DEB诱变的方法产生突变体。?多是点突变,突变密度高,可快速获得大量突变体。?没有标签,很难寻找到表型变化对应的目的基因。?突变基因的克隆通常只能采用图位克隆法等传统遗传 学方法。
8. T-DNA插入突变技术的基本原理:通过转基因或其它方式使T-DNA插入到目的基因内部或者附近,使得基因的功能发生改变并产生突变表型;同时,由于插入序列是已知的,通过插入的外源DNA“标签”可迅速克隆鉴定突变基因。 9. T-DNA插入方法优点:?随机插入,便于饱和突变体库的建立;?单拷贝插入多,便于基因分离;?一旦插入后就不再移动,突变稳定,便于保存。 10.T-DNA插入突变是进行大规模突变体构建的首选方法。 11. 拟南芥已构建了225000多个T-DNA插入突变体, 获得了360000个T-DNA插入位点序列, 这几乎可以代表拟南芥的整个基因组。拟南芥的FSTs (flanking sequence of T-DNA tags)
数据库早已建立, 从这些数据中不仅可以获知序列信息, 还可知道T-DNA在植物染色体上的分布。
12. 根据插入的已知序列和目的基因序列设计PCR 反应引物,通过PCR技术从突变体库中筛选出目的基因的插入突变体。另外,还可以用反向PCR (inverse PCR)、TAIL-PCR等方法扩增出插入位点的侧翼序列,建立侧翼序列数据库。 13. 在用这类载体建立的突变体库中,能得 到部分基因功能缺失的突变体(loss-of-function mutant),但不能得到有功能冗余及致死效应的基因的突变体,也很难研究具有高度多效性的基因。为了弥补这方面的不足,构建出了新的载体,即gene trap载体和激活标签载体。
14. Gene trap包括三种形式:? enhancer trap ? promoter trap ? gene trap
15. ?激活标记(activation tagging)技术优点:?含有增强子的T-DNA可引起插入位点上游或下游基因的超表达,从而得到功能获得突变体;?这种突变体是显性遗传的,所以在T1
代就可以通过表型变化筛选到;?利用质粒拯救或TAIL-PCR的方法可以很方便地克隆到相应基因;?在强启动子控制下将该基因在野生型中表达可以在下一代重现该突变体的表型;?基因家族中某个基因超表达所引起的突变不影响该家族中其它基因的功能。
16. T-DNA插入的复杂性(缺陷):?当在基因组中导入大片段的外源DNA时, 会发生大范围的染色体重组,这将为随后的突变体分析带来相应的困难。?T-DNA只有一部分是单拷贝插入,而通常检测到的情况是多个T-DNA插入到一个转化植株中;一个位点包含多个T-DNA插入或多个位点包含多个插入;而且并非所有的位点T-DNA都是完全插入, 会产生T-DNA的正向和反向重复。?T-DNA 的左右边界与基因组结合处缺失一部分或插入小片段的填充序列也有部分或整个载体序列整合进基因组中。 17. ?饱和突变体库:指一个突变体库中基因组的每个基因中都至少含有一个外源片段的插入。
18.曾经认为T-DNA插入基因组是一个随机的过程,但近年来的研究表明这种随机性只是相
T- DNA优先整合于染色体中基因丰富,转录活性高的区域(不是完全随机的)。对的,
19. T-DNA标签克隆基因的基本原理:构建T-DNA载体 ? 转化植物(T,T-DNA杂合体)0? 筛选T,获得突变体 ? 寻找与T-DNA共分离的个体 ? 让其自交,产生纯合体 ? 1
PCR获得T-DNA两侧的基因组序列 ? 利用侧翼DNA序列作探针从DNA文库中钓取基因 ? 基因功能验证(遗传互补测验,用分离的野生基因转化突变体,恢复功能)
注:以上内容基本涵盖全部考点,考试题型:填空:14’ ;名词解释:3题24’ ;简答:3题20’ ;问答:2题30’ ;分析:1题12’。最后一章考试将占30分(与前面几章有联系)
?表示老师说必考的,没有标记的也要看,因为不一定不考。
范文五:男性生精障碍的细胞遗传学和分子遗传学检测
28Chinese Journal of Andrology Jan. 20 No. 1 2006
男性生精障碍的细胞遗传学和分子遗传学检测
南京军区福州总医院全军医学检验中心实验科 (福州 350025)
涂向东 谢 飞 张宝珍 兰风华 朱忠勇
摘要 目的 从遗传学角度分析男性生精障碍的病因, 为临床提供治疗和遗传咨询的依据。方法 对91例无精子症患者和42例严重少精子症患者,采用外周血染色体核型分析和Y 染色体AZF 区域微缺失联合检测。结果 91例原发性无精子症患者中, 染色体数量异常者16例,占总数17.5% ;染色体平衡易位5例,占总数5%; 10例AZF 区域STS 位点缺失,占总数11%;二项检测异常发生率为34%。42例严重少精子症患者检出染色体平衡易位4例, 占总数9.5%;AZF 区域STS 位点缺失5例,占总数11.9%,二项检测异常发生率为21.4%。结论 染色体核型分析和Y 染色体微缺失是男性生精障碍重要的遗传检测指标。
关键词 男性生精障碍; 细胞遗传学; 分子生物学中图法分类号 R 698+. 2 Q 343 Q 75
Cytogenetic and molecular genetic analysis of male
spermatogenesis dysfunction
Tu Xiangdong, Xie Fe, Zhang Baozhen, Lan Fenghua, Zhu Zhongyong
Center for laboratory medicine of Fuzhou general hospital,Nanjing military Area,Fuzhou 350025,china
Abstract Objective To investigate the genetic abnormality of male spermatogenesis dysfunction. Methods Both chromosome karyotypic and Y-chromosome AZF microdeletion analysis were performed on 91 blood specimens of idiopathicazoospermia and 42 patients of oligozoospermia patients. Results 16 of 91 azoospermia showed chromosome numberabnormality (17.5%), 5 showed chromosome structure aberration (5.0%); 10 AZF microdeletion (11%); total abnormalitywas 34 %. 4 of 42 oligozoospermia patients showed chromosome structure aberration (9.5%); 5 showed AZF microdeletion (11.9%) and total abnormality was 21.4%. Conclusion chromosome Karyotypic and Y-chromosome AZF microdeletionanalysis are important genetic assays for male spermatogenesis dysfunction.
Key words spermatogenesis dysfunction; cytogenetics; molecular biology
目前有不少的研究发现不育男性有一部份与“Y 染色体精子生成基因”即无精子因子(azoospermia factor AZF)的微缺失和染色体异常有关。为了证实和探讨这类缺陷在无精子症及少精子症患者中的发生率, 为临床提供治疗和遗传咨询的参考,我们对91例无精子症和42例严重少精子症患者外周血进行DNA 提取并采用多重PCR 技术,对AZF 区4个亚区的8个序列标签位点(sequence taggedsites,STSs):AZFa 区 sY84、sY86; AZFb区 sY127、sY134、sY129,AZFc 区 sY254、sY255; AZFd区sY152及SRY 基因,以ZFX/ZFY 为内对照,进行微缺失检测,同时进行外周血染色体核型分析,综合判断分析遗传性缺陷在无精子及严重少精子症患者发病中的作用。
对象与方法
1. 临床病例:收集来本院不孕症专科中心就诊
的91例男性无精子症、42例严重少精子症患者及30例正常生育男性外周血,无精子及严重少精子症的诊断标准按WHO 《男性实验室检测手册》(第三版),连续3次计数并经过离心未发现精子确定为无精子症,严重少精子症患者以两次精子计数<20×106/ml 为标准。血标本用枸橼酸钠抗凝, 排除激素水平异常、输精管缺损、感染性疾病等。
[1]
2. 染色体核型分析用肝素钠抗凝,参照方法,G 显带符合ISCN 标准,染色体图像分析仪分析染色体核型。
中国男科学杂志2006年第20卷第1期
3. 基因组DNA 提取:取枸橼酸钠抗凝血,用碘
[2]
化钾方法提取DNA ,eppendorf 核酸蛋白定量仪定量,-70℃冻存备用。
4. PCR扩增分3组:第一组:sY254 、sY86、sY127、sY152、 ZFX/ZF;第二组:sY134、 sY255、sY84、SRY 、ZFX/ZFY;第三组:sY129。
第一组、第二组反应体积25μl ,含10×buffer 2.5μl 、dNTP 1.5 mmol/L、MgCl 6.7 mmol/L、引物各0.5μmol/L、DMSO 10% 、模板DNA 200 ng 、TagDNA 聚合酶2 U。扩增条件:95℃预变性3 min、25个循环(94℃/30s、55℃/30s、65℃/4min)、72℃延伸5 min,4℃保温。
第三组反应体积25μl ,含10×buffer 2.5μl 、dNTP 0.2 mmol/L、引物各0.5μmol/L、模板DNA 200 ng、TagDNA 聚合酶0.8 U。扩增条件:95℃预变性3 min、35个循环(94℃/30s、50℃/30s、72℃/60s)、72℃延伸5 min ,4℃保温。
上述反应中同时设置正常生育男性与女性及蒸馏水作为质控参考对照。单个STS 位点缺失的PCR 扩增条件同上。PCR 扩增所用引物序列见表1 。
表1 PCR扩增所用的引物序列
分 组第1组SY254-F SY254-R SY86-F SY86-R SY127-F SY127-R SY152-F SY152-R 第2组SR Y-F S R Y -R SY84-F SY84-R SY134-F SY134-R SY255-F SY255-R 第3组SY129-F SY129-R 内对照ZFX/ZFY-FZFX/ZFY-R
引物序列(5’→3’)
GAA CCG TAT CTA CCA AAG CAG CGGG TGT TAC CAG AAG GCA AAGTG ACA CAC AGA CTA TGC TTCACA CAC AGA GGG ACA ACC CTGGC TCA CAA ACG AAA AGA AACTG CAG GCA GTA AT A AGG GAACA GGA GGG TAC TTA GCA GTAAG ACA GTC TGC CAT GTT TCAGAA TAT TCC CGC TCT CCG GAGCT GGT GCT CCA TTC TTG AGAGA AGG GTC TGA AAG CAG GTGCC TAC TAC CTG GAG GCT TCGTC TGC CTC ACC AT A AAA CGACC ACT GCC AAA ACT TTC AAGTT ACA GGA TTC GGC GTG AT CTC GTC ATG TGC AGC CACAGC TTC AGG AGG TTC AAA ACAAG TGG GAC CTA AGC TAC GA ACC RCT GTA CTG ACT GTG ATT ACA CGCA CYT CTT TGG TA T CYG AGA A
AG T
片段长度(bp)
400320274125
29
察结果。
6. 结果判定:蒸馏水对照无条带出现,正常生育男性所有条带均有扩增,正常女性只有ZFX/ZFY扩增条带。待检标本所有位点均有扩增为无缺失,待检标本有ZFX/ZFY扩增条带,但部份位点多重PCR 和单独扩增时均无特异条带出现即为缺失。
结 果
一、对照组缺失筛查和染色体核型分析30例正常已生育男性外周血染色体核型及Y 染色体AZF 微缺失分析未发现异常,Y 染色体AZF 区域微缺失10个位点均有明显扩增条带。女性对照仅检出ZFX/ZFY。
二、实验组染色体核型分析和AZF缺失筛查1. 无精子症患者外周血染色体核型分析:数量异常16例,异常发生率17.5%。染色体平衡易位5例,异常核型发生率5%。
2. 无精子症组微缺失筛查:共发现微缺失10例。AZFa 区1例,缺失发生在sY86, 缺失率为1.0%。 AZFb区缺失2例,1例sY127缺失并伴随sY254、sY255、sY152共缺失; 另1 例为sY129缺失; 缺失率为2.0%。AZFc 区7例为sY254、sY255共缺失,缺失率为7 %。AZFd 区 sY152缺失8例,其中6例为sY254 、sY255、sY152共缺失,1例为sY127、sY254 、sY255、sY152共缺失,1例为sY152单独缺失,sY152缺失率达8%。
3. 严重少精子症患者染色体平衡易位4例。异常核型发生率9.5%。结果见表2 。
4. 严重少精子症组微缺失筛查:发现并证实5例缺失, 均发生在AZFc 区和AZFd 区, 为sY254、sY255、sY152共缺失,缺失率达11.9%。结果见图1。
472326301126
201
图1 Y染色体AZF区域微缺失琼脂糖电泳图
M. DNA make r, N1 第一组正常对照, 1.s Y254缺失; 2. sY86缺失, 3.sY127缺失; 4.sY152缺失; 5.sY254、sY152缺失; 6. 正常女性对照, N2 第二组正常对照; 7. sY255缺失; 8. sY129缺失; 9. sY129正常对照
495
5. PCR产物检测:PCR 产物分析用4.5% 琼脂糖电泳,100-500 bp DNA分子量标记,电压75V ,1.5h 观
三、染色体核型异常者均未发现Y染色体AZF微缺失
30Chinese Journal of Andrology Jan. 20 No. 1 2006
表2 男性生精障碍患者染色体核型异常和Y染色体AZF微缺失
Klinefelter 征
例数1411
染色体异常核型46,XY,t(4;17)(p16; q12) *46,XY,t(15;18)(q14; p13)46,X, inv (Y)(p11;q12)46,XY,t(4;21)(q21;q11)*46,XY,t(1;11)(p36;q23)45,X,t(Y;22)(q11, q11)*46,XY,t(11;15)(q13;q25)*46,XY,t(18;21)(q21; q11)46,XY,t(1;2)(p22; q11)*
(例数) (1)(1)(1)(1)(1)(1)(1)(1)(1)
Y染色体AZF 微缺失 (例数) AZFasY86缺失(1)
sY84
AZFb AZFc
sY127sY134sY129缺失(1)
缺失(1)
sY254sY255缺失(7)缺失(5)
缺失(7)缺失(5)
AZFd sY152缺失(8)缺失(5)
原发性47,XXY 无精子46,XY/47,XXY症46,XX/47,XXY
严重少精子症
* 为世界首报的染色体异常核型
讨 论
精子的发生和发育是一个极其复杂的过程,受多个基因的调控。位于Y 染色体1区1带的无精子因子(AZF)共划分为AZFa 、AZFb 、AZFc 、AZFd 四个区域, 对精子的生成起着十分重要的作用。由于AZF 区域的微缺失在光学显微镜下难以分辨,而利用Y 染色体序列标签位点设计多对引物进行多重PCR 扩增,则较容易判断检出AZF 区域的微缺失,因而成为当今
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检测男性生精障碍的一项重要的分子生物学技术。Y 染色体上STSs 较多,各个实验室选用STSs 不尽相同, STSs缺失在不同地区可能存在种族差异,AZF 总缺失率可为3%~30%。欧洲分子生物学实验室选定6个STSs 作为欧洲Y 染色体AZF 区域微缺失筛查位点,并已应用于临床。我们参考国外相关文献, 选用AZFa 区sY84、sY86,AZFb 区sY127、sY129、sY134,AZFc 区sY254、sY255,AZFd 区sY152,Y 染色体短臂 SRY及ZFX/ZFY共10个STS, 作为男性生精障碍AZF 区域微缺失的筛查位点。结果发现无精子症sY86缺失1例,sY129缺失1例,sY127、sY255、sY254、sY152共缺失1例, sY255、sY254、sY152共缺失6例, sY152单独缺失1例,严重少精子症5例均为sY254、sY255、sY152共缺失。 证实AZFc 和 AZFd区是缺失热点,微缺失的分布与国内外部份实验室的结果较为一致。这可能由于AZFc 和AZFd 区位于高度重复的异染色质区附近,是Y 染色体不稳定区域, 遗传物质较容易丢失。sY255、sY254、sY152位于DAZ 基因范围内,是无精子因子微缺失检出率最高的基因,我们的实验结果也证实了这一点。DAZ 基因在睾丸组织特异表达, 它编码的RNA 结合蛋白在精子的成熟过程中起重要调控作用。是目前被确定为影响精子生成的重要候选基因。DAZ 为多拷贝基因,我们选择多个位点同时扩增, 有
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助于提高筛查的准确性和可靠性。
外周血染色体核型分析对无精子症和严重少精子
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症患者也是一项十分重要的筛查指标。我们收集的91例无精子症患者标本中,16例为klinefelter 综合征,占总数的17.5% ,5例为染色体平衡易位,占总数的5.0%。42例少精子症患者的染色体核型标本中发现有4例染色体平衡易位。占严重少精子症总数的9.5%。分析原因可能是:(1)klinefelter 综合征患者多余的一条X 染色体可产生剂量效应。Lyon 学说认为,细胞生理活动中,只有一条X 染色体是有活性的,另一条X 染色体呈异固缩状态而失活,但这种失活是不完全的,多余的X 染色体上的基因可使睾丸的功能受损、萎缩、生殖器发育不良使精子发育障碍;(2)Y 染色体上有许多精子生成基因,它结构的不完整可直接影响男性的生精功能。我们发现一位患者精液检查只有几条精子, 染色体核型分析45,X,t (Y;22)(q11;q11),为Y 染色体短臂和22号短臂相互易位,由于 AZF位于Y 染色体的长臂,患者未发现AZF 区域的微缺失,但Y 染色体与常染色体易位,造成性染色体的结构不完整,配对异常,可能影响了精子生成。46,X,inv (Y)患者,可能由于Y 染色体倒位致使Y 染色体结构发生改变, 造成无精子;(3)常染色体的平衡易位可能主要影响生精细胞的减数分裂。在生殖细胞生成过程中,染色体断裂、易位, 可导致减数分裂异常, 联会受阻, 初级精母细胞第一次减数分裂时同源染色体互换率降低 , 形成较多不对称的双价体、多价体、单价体, 导致精子生成阻滞在精母细胞水平而不能继续分化成精子。亦可能在常染色体上存在精子发生相关基因, 当易位造成基因断裂或缺失时而导致无精子、少精子。本文发现4例无精子症和3例严重少精子症患者常染色体平衡易位, 我们认为这可能是造成精子生成障碍的重要原因之一。
中国男科学杂志2006年第20卷第1期
通过对91例原发性无精子症和42例严重少精子症患者进行染色体核型和Y 染色体无精子因子微缺失的检测, 发现无精子症患者染色体异常和Y 染色体AZF 区域微缺失总异常检出率达34%。严重少精子症患者Y 染色体异常和Y 染色体AZF 区域微缺失总异常检出率达21.4%。可见两项指标同时检测更能够较全面地反映男性生精障碍是否为遗传缺陷。随着生殖助孕技术的推广应用,严重少精子症患者甚至仅在睾丸组织活检中发现少量存活精子都有可能通过这一技术生育子女, 然而精子质量是否正常,后代是否能成为一名健康有生育能力的孩子却是一个不容忽视的问题。染色体平衡易位一方面可影响精子的生成,另一方面即使妻子受孕也容易形成具有不平衡染色体的配子,导致妻子流产、死胎。而Y 染色体无精子因子微缺失的患者极有可能将遗传缺陷传播,导致所生育的下一代也是无生育能力的患者。为此我们应提醒这些患者慎重考虑选用自已的精子生育子女,以确保下一代的健康。
参 考 文 献
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(2005-01-12收稿)
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《精液分析与不育症-生精细胞凋亡与胀亡及精子形态学图谱》征订启事
本书由曹兴午、杨文质、赵广明主编。近代检验医学创始人叶应妩教授为本书题写书名,中国工程院院士郭应禄教授、中华医学会检验分会前副主任委员王金良作序。中华医学会检验分会主任委员丛玉隆教授、中日友好医院病理科王泰龄教授、协和医院林其燧教授主审。中日友好医院泌尿外科鲍镇美教授英文校阅。
本书的最大贡献是将细胞凋亡理论结合于临床实践,应用于精液生精细胞学和精子形态学的检测及临床不育症的诊断和治疗。
本书将这些最新相关理论应用到不育症的检测和诊断与治疗过程。创立了采用精液分析作为评价睾丸功能的新方法,为观察环境污染和环境激素对人类生殖的损害提供了新的检测手段,开创了国内学术领域的先河。对于检验医学的拓新及生殖健康、生殖辅助技术应用和人口素质的提高必将产生重要而深远的影响。本书的科学性、学术性、可读性及实用性极强,为我国精液分析提供了实验检测的基本标准。
《精液分析与不育症-生精细胞凋亡与胀亡及精子形态学图谱》由中国人口出版社出版,全书约80万字,收集600余幅图片,以图文并茂形式提供给读者,是临床医生和实验人员必备的参考书;是从事生物学、实验诊断学、生殖医学、泌尿、男科学、中医男科学、生殖辅助技术、病理学研究和临床医生使用的专业书籍。特别适合科研、教学、医疗单位的中、高级人员参考使用。本书为中英文对照,便于外籍人士阅读。更可以为不育者参阅。每本定价为188.00元。
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《中国男科学杂志》编辑部
2006年1月8日