范文一:pres基因打靶载体同源臂的PCR引物设计
pres基因打靶载体同源臂的PCR引物设计
海军医学杂志2008年12月第29卷第4期
JournalofNavyMedidne2008Dec.Vo1.29,No.4
pres基因打靶载体同源臂的PCR引物设计
徐灵活,章建程,丁猛,王晓花
(海军医学研究所,上海200433)
?
289?
[摘要]目的:设计pres基因打靶载体同源臂的PCR引物.方法:在对pres基因结构
和功能进行分析之后,选取目标
扩增区域进行针对性的酶切位点分析.基于引物设计原则,在符合酶切位点要求
的区域内设计同源臂PCR引物.结果:用于
构建打靶载体同源长短臂的引物设计符合研究要求.结论:在考虑引物设计原则
和酶切位点分析的基础上,可成功设计打靶
载体同源臂PCR引物.
[关键词]pres基因;PCR引物;引物设计
[中图分类号]R393—33[文献标识码】A[文章编号】
1009—0754{2008)04—0289—03
DesignofPCRprimerfortargetingvectorhomologyarmofpresgene
XLing—huo,ZHGJian—cheng,DINGMeng,WANGXiao—hua
(NavalMedialResearchInstitute,Shanghai200433,China)
Abstract:Objective:TodesignPCRprimerfortargetingvectorhomologya/Tnofpresgene.
Methods:Afterananalysison
structureandfunctionofpresgene,artobjectiveamplification7x)newasselectedtomakeal
1.analysisonenzymecuttingsites.Then,
onaccountoftheprincipleofprimerdesign,thehomologyamPCRprimerwasdesignedont
hezoneeonsistentedwiththerequire—
mentsofenzymecuttingsites.Results:Theprimerdesignedfortargetingvectorhomology
armcouldmeetthisresearchrequirement.
Conclusions:Basedontheprincipleofprimerdesignandtheanalysisofenzymecuttingsite
s,PCRprimerfortargetingvectorhomd?
ogyam1canbedesignedsuccessfully.
Keywords:presgene;PCRPrimer;primerdesign
近年来,对pres基因功能的研究颇受关注,探
讨pres基因缺失对听力的影响是其中的热点.本
文通过探讨pres基因打靶载体的同源臂PCR引物
的设计,以用于构建pres基因缺失小鼠模型.
1pres基因的初步结构功能分析
2O0o年,Zheng等[1]通过从1个OHC—IHC削
[基金项目】海军医学研究所科研基金(06HY31)
减的沙鼠外毛细胞cDNA文库中,克隆出编码外毛
细胞电一机械运动马达蛋白的基因pres,该基因属
编码离子转运蛋白基因家族(SCL26),其所编码的
马达蛋白被命名为prestin.
小鼠pres基因位于5号染色体上,全长54950
bp,含有20个已知的外显子(Exon),在整个pres基
因上的位置见表1.
?
290?海军医学杂志2008年12月第29卷第4期
JoumalofNavyMedicme2008Dec.Vo1.29,No.4
表1外显子在pres基因上的位置一览表
Exon编号基因上位置Exon编号基因上位置
l1,751143497——43610
23599--37071244499,44576
318226——184271345197——45292
419243——193821445817,45923
524929——250391548597——48666
49937 627558——277241649845——
728219——283831750601——50708
831236,31388l851551,51751
934076,52280 ——341581952226
1042008——421552054264--54950
pres基因编码的prestin蛋白是1个由744个
氨基酸组成的糖蛋白,相对分子质量约为80000[2J.
prestin电一机械运动的电压感受器被认为是胞内的
Cl一,a一与prestin上的位点结合后,通过prestin对
cl一的半转运使其分子构像发生改变,带动了外毛
细胞轴向高频运动,从而使哺乳动物耳蜗具有对外
界声音起放大作用,prestin结构和功能的改变对哺
乳动物耳蜗的听力敏感性有显着影nl~t3].
Exon3编码的氨基酸序列是prestin发挥功能
的重要活性部分,Tang等]发现,由于Exon3无法
正常剪接连接,致使prestin蛋白结构异常,其功能
活性显着下降,被试动物出现明显的听力损失.本
研究设计构建TK—Neo—PPNT打靶载体,通过同
源臂与ES细胞目标区域的同源重组,将Neo基因
替换pres基因的Exon3及其上下游的部分内含子.
从而实现构建pres基因敲除小鼠的目的.
2pres基因打靶载体的同源臂PCR引物设计
选取pres基因全长序列中1,30000bp作为
引物设计模板,利用Primer5.0软件进行引物设计,
引物设计基于以下原则[5]:(1)引物的长度一般为
15--30bp,最好为18-24bp,因为太短易形成错配
和降低特异性,太长会降低特异性且降低产量;(2)
引物在模板内最好具有单一性,也就是说在模板内
部没有错配.特别是3’端,一定要避免连续4个以
上的碱基互补错配;(3)引物序列的GC含量最好在
40%,60%,且上下游引物序列GC含量的差异不
要太大,3’端最后5个碱基最好不要富含GC’特别
是连续3个的GC;(4)DNA双链形成所需的自由能
?G最好不好高于9.0kcal/mol;(5)5’端对PCR
影响不太大,可以引进修饰位点和标记物.
根据以往基因敲除载体设计经验,同源臂总长
度可为5,8kb【6J6.因此,我们设计同源短臂位于
Exon3上游,长度2,3kb,同源长臂位于Exon3下
游,长度3,4kb,整个同源臂长度为5,7kb.
由于设计的同源长短臂将与PPNT—TK—Neo
载体连接,因此需考虑同源臂酶切位点的单一性.
TK—Neo—PPNT全长6736bp,在Neo两端共有6
个单一酶切位点,分别是NotI,XhoI,Sall,XbaI,
BamHI,KpnI,该载体为氨苄青霉素抗性,携带有
,如图1. TK基因
图1载体IK—Neo-PPNT示意图
本研究设计在PPNT—TK—Neo载体Neo的
)KpnI和BarnHI位点插入同源长臂;在 下游(3’端
PPNT—TK—Neo载体Neo的上游(5’端)Sail和
NotI位点插入同源短臂.因此,在设计的同源长短
臂内部不能包含有上述4种限制性酶切位点.
基于上述考虑,我们首先选取pres基因1,
30000bp进行酶切位点分析,进而选取无上述4种
限制性酶切位点的区域进行引物设计.根据酶切位
点分析结果,确定19000--23000bp区域进行同源
短臂引物设计并添加酶切位点KpnI和BarnHI;确
定1300016480bp区域进行同源短臂引物设计
并添加酶切位点Sall和NotI.设计的同源长,短臂
引物如下:
同源长臂长度=3268(19398-22665)bp
S:5’一CGGGATCCCG1I(,(rIrTGTTATG
GTGTGTG一3’
海军医学杂志2008年12月第29卷第4期
JournalofNawMedicine20o8Dec.Vo1.29.No.4
a:5’一GGGGTACCCCGGCTATG1,GGA1?A
TGGACTT一3’
同源短臂长度=2422(1345615877)bp
S:5’一11,(X3GCCGCAAAG_1,(rAACCT
CCAG_1?耵一3’
a:5’
IIT一3’
3讨论
通过对pres基因结构和功能的初步分析,充分
考虑待连接载体的酶切位点特性,并基本遵循了引
物设计原则.成功设计了pres基因打靶载体同源臂
的PCR引物,可用于下一步研究.
[参考文献]
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(收稿日期:2008—09—28)
(本文编辑:甘辉亮)
几种海洋生物多糖对疫苗免疫效果的影响比较
张慧,朱伟,王学辉,沈俊,章建程,刘永德
(1.海军医学研究所,上海200433;2.上海交通大学农生院,上海201104)
【摘要】目的:探讨羊栖菜岩藻聚糖硫酸酯,珠母贝糖胺聚糖,乌贼墨肽聚糖等粉剂和注射液的免疫增强作用.方法:分
别用3种多糖的粉剂和注射液饲喂和注射试验鸡.经鸡新城疫(ND)油乳剂疫苗免疫后,在第7,l4,21天分别采集静脉血分
离血清,采用J8微量血凝抑制试验(HI)检测NDHI抗体效价.结果:在饲喂多糖实验中,免疫后14d,肽聚糖组,岩藻聚糖组
鸡NDHI抗体效价显着高于对照组(P<0.05);免疫后21d,岩藻聚糖组鸡NDHI抗体效价显着高于对照组(P<0.05).在
注射多糖实验中,疫苗免疫后14,21d,岩藻聚糖50rag/kg体质量组NDHI抗体效价显着高于对照组(P<0.05);免疫后7,
14,21d,岩藻聚糖100mg/kg体质量组NDHI抗体效价显着,极显着高于对照组
(P<0.05或P<0.01o结论:饲喂和注射
实验显示,在3种多糖中,岩藻聚糖具有显着的免疫增强作用,且起效较快,维持的时间较长.
[关键词】海洋生物多糖;鸡新城疫;油乳剂疫苗;增强免疫
[中图分类号]R392.1[文献标识码]A[文章编号】1009—0754(2008}04—0291—04
Effectsofseveralhalobiosamyloseextractswith
Newcastlediseasevaccineontheimmunity
ZHANGHui,ZHUWei,WANGXue—hui,SHENJun,ZHANGJian—cheng,LIUYong—de
(NavalMedicalResearchInstitute,Shanghai200433,China)
[基金项且]海军医学研究所科研基金(05HY51)
范文二:同源重组
折叠 编辑本段 简介
同源重组(Homologus Recombination) 是指发生在非姐妹染色单体(sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化,如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等;以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。
同源重组同源重组反应通常根据交叉分子或Holliday结构(Holliday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段,即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。同源重组反应严格依赖DNA分子之间的同源性,100%重组的DNA分子之间的重组常见于非姐妹染色体之间的同源重组,称为Homologous Recombination,而小于100%同源性的DNA分子之间或分子之内的重组,则被称为Hemologus Recombination。后者可被负责碱基错配对的蛋白如原核细胞内的MutS 或真核生物细胞内的MSH2-3等蛋白质"编辑"。同源重组可以双向交换DNA分子,也可以单向转移DNA分子,后者又被称为基因转换(Gene Conversion)。由于同源重组严格依赖分子之间的同源性,因此,原核生物的同源重组通常发生在DNA复制过程中,而真核生物的同源重组则常见于细胞周期的S期之后。
折叠 编辑本段 基因敲除
折叠 定义
基因敲除(geneknockout),是指对一个结构已知但功能未知的基因,从分子水平上设计实验,将该基因去除,或用其它顺序相近基因取代,然后从整体观察实验动物,推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。
基因敲除除可中止某一基因的表达外,还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因,也可以用正常基因敲除相应的突变基因。
折叠 技术路线
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。80年代初,胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年,首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年,Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年中,基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。
基因敲除的技术路线如下:
(1)构建重组基因载体﹔
(2)用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内﹔
(3)用选择培养基筛选已击中的细胞﹔
(4)将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物,对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。
基因敲除的靶细胞目前最常用的是小鼠ES细胞。基因敲除的技术路线虽不复杂,但由于高等真核细胞内外源DNA与靶细胞DNA序列自然发生同源重组的机率非常低,约为百万分之一,要把基因敲除成功的细胞筛选出来是一件非常困难的工作。因此,同源重组的筛选和检测就成了基因敲除技术所要解决的关键问题。目前已有多种筛选方法,其中1988年犹它大学的Capecchi教授的研究组发展的"正负双向选择系统"适用范围宽且效率较高。
折叠 编辑本段 转移法
同源重组(homologous recombination)是将外源基因定位导入受体细胞染色体上的方法,因为在该座位有与导入基因同源的序列,通过单一或双交换,新基因片段可替换有缺陷的基因片段,达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组,重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点;attachmentsite,att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组,因而重组具有特异性和高度保守性。
根据氨基酸序列相似性和催化机制的差异,位点特异性重组酶主要分为两大家族,即整合酶系和解离酶/转化酶系,这两个家族相隔很远。整合酶家族催化重组的机制是进行酪氨酸介导的链交换,该家族包含有Cre/loxP、FLP/FRT等已经研究得比较清楚并广泛应用的重组酶系统。解离酶/转化酶家族催化机制是由丝氨酸介导的,当酶和DNA之间形成含磷的丝氨酸连接时,连接处DNA的4条链发生协调的交错断裂,然后重新结合,完成同源重组。该家族成员包括来自于链霉菌噬菌体的φC31整合酶、lactococcal噬菌体的TP901-1整合酶、放线菌噬菌体的R4整合酶等。中C31整合酶(φC31-int)能够有效介导噬菌体基因组中attP位点与细菌宿主染色体上attB位点间的重组反应,将外源基因整合到基因组中,使转基因的持续、高效表达,为非病毒载体转移系统在遗传病基因治疗的应用开辟了新的途径。
折叠 编辑本段 DNA
日本理化研究所发表新闻公报说,该所研究人员发现酵母线粒体中的DNA(脱氧核糖核酸)在一定条件下进行同源重组时,不像以前认为的那样需要DNA形成超螺旋。这一发现将为抗衰老等方面的生物医学研究提供新线索。
新闻公报说,记录生命遗传信息的DNA呈稳定的双链螺旋结构,但在复制、转录和重组等过程中,DNA链会出现一种超螺旋现象,这类似于螺旋状的电话线在受到外力时可能出现复杂的螺旋状态。
理化研究所的凌枫和柴田武彦等研究人员在酵母线粒体DNA的同源重组实验中,使用经过高度纯化的酶"Mhr1"进行催化,发现这种条件下的DNA同源重组不需要形成超螺旋,而是通过一种名为"三链体"的中间体进行。
凌枫对记者说,曾有研究证明"Mhr1"酶在抑制线粒体异质性上发挥着关键作用,此次研究揭示了其催化的反应机制核心。由于线粒体异质性与衰老等生理过程密切相关,理化研究所的这项研究为抗衰老等方面的生物医学研究提供了新线索。
范文三:同源重组
中 国 生 物 工 程 杂 志
第23卷第12期
CHINABIOTECHNOLOGY
2003年12月
Red同源重组技术研究进展
韩 聪
1,2
张惟材
13
游 松
2
(1军事医学科学院生物工程研究所 北京 100071 2沈阳药科大学 沈阳 110016)
摘要 伴随着分子生物学的发展,一种基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统已应用于大肠
杆菌基因工程研究。Red重组系统由三种蛋白组成:Exo蛋白是一种核酸外切酶,结合在双链DNA的末端,从5′端向3′端降解DNA,产生3′突出端;Beta蛋白结合在单链DNA上,介导互补单
链DNA退火;Gam蛋白可与RecBCD酶结合,抑制其降解外源DNA的活性。Red同源重组技术具有同源序列短(40~60bp)、重组效率高的特点。这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行,大大推动功能基因组研究的发展。关键词 Red同源重组 基因打靶 基因工程 同源重组是基因工程实验中常用的技术手段,在基因打靶和基因克隆方面具有重要作用。常规的基因打靶技术是以RecA同源重组为基础,通常需要数百碱基甚至更长的同源序列,并且重组效率较低,更由于真核基因组中大量重复序列的存在,而导致意外重排现象的发生。BAC、PAC、YAC等克隆载体的构建为基因克隆提供了有力工具,但常规的克隆操作依赖于限制性酶切位点的存在,还需繁琐的连接、纯化步骤,大大限制了对大片段基因功能的研究。近几年来,一种基于λ噬菌体Red重组酶作用的同源重组技术逐渐成为基因工程研究的热点之一,并取得了一系列重要进展。
Red同源重组技术的原理是将一段携带与靶
而不需要特定的限制性酶切位点,即可在生物体内完成重组过程,省去了体外DNA酶切、连接等步骤。这样,在靶基因两翼序列已知的条件下就可以通过Red重组技术对该基因进行敲除、敲入、点突变等操作,还可在靶基因的上下游加入适当的启动子和终止子序列以调节基因的表达。将含有ori复制序列的线性载体片段导入细胞,也可将靶基因克隆于载体上。实验证明,这种基因打靶技术是基因功能研究和新菌株构建的有力工具。
1 Red同源重组机制
Red同源重组系统由λ噬菌体exo、bet、gam三
基因两翼各有40~60bp同源序列的PCR片段导
入宿主菌细胞,利用λ噬菌体Red重组酶的作用,使导入细胞的线性DNA片段与染色体(或载体)的特定靶序列进行同源重组,靶基因被标记基因置换下来(如图1所示)。PCR引物由两部分组成,靠近5′端的区域为与靶基因同源的序列(约40bp),靠近3′端的区域(约20bp)与模板DNA互补。这种重组技术是最近发展起来的一项可在染色体水平上进行遗传操作的新技术,只需较短的同源序列,
收稿日期:2003208205 修回日期:20032112033通讯作者,电子信箱zhangweicai@hotmail.com
个基因组成,它们分别编码Exo、Beta、Gam三种蛋
白质。Exo蛋白是一种核酸外切酶,单亚基的分子量为24kD,这种蛋白的活性形式是一种环状三聚物分子,中间有一中空的通道,通道的一端可容纳
[1,2]
双链DNA分子,另一端只可容纳单链DNA。Exo蛋白可结合在双链DNA的末端,从DNA双链的5′端向3′端降解DNA,产生3′突出端。Beta蛋白是一种退火蛋白,单亚基的分子量为2518kD。在溶液中,Beta蛋白自发地形成环状结构,紧紧地结合在单链DNA3′突出端,防止DNA被单链核酸酶
[3]
降解,同时介导互补单链DNA的退火,双链DNA退火完成后,Beta蛋白从DNA双链上解离下来。Beta蛋白在Red同源重组过程中起着决定性的作
图2 Red重组机制示意图
且重组效率远高于RecA重组。
2 Red同源重组技术应用策略
图1 Red同源重组技术用于基因打靶
Ha和Hb:同源重组区域;Pa和Pb:引物位点;sm:筛选标记
Red重组技术利用较短的同源序列,即可使外
用,它与沙门氏菌P22噬菌体的Erf蛋白、大肠杆菌Rac噬菌体的RecT蛋白、真核生物的Rad52蛋白同
源DNA片段与靶标分子完成重组作用,但通常在
靶标分子上留下筛选标记基因,染色体或载体上含有筛选标记,有可能影响其生物功能。Red重组技术与其它基因工程技术结合运用,有效地解决了以上问题。目前利用Red重组技术进行基因工程研
[7]
究的策略主要有以下4种(如图3所示):(1)一步筛选,中间为筛选标记基因两端为同源序列的线性DNA片段借助同源序列与靶载体发生重组作用,标记基因将靶基因置换下来。线性DNA若为含有ori复制起点序列的载体片段,可通过重组作用,将靶基因克隆于载体上。(2)筛选+反向筛选,在第一轮重组中,线性DNA片段含有筛选标记和反向筛选标记两个基因,通过筛选标记基因将重组分子筛选出来。在第二轮重组中,线性DNA片段中的目的基因将重组分子上的两个筛选标记基因置换,通过反向筛选标记基因将第二轮重组分子筛选出来,常用的反向筛选标记基因有sacB、tetR、rpsL等。(3)筛选+位点特异性重组,筛选标记基因的两侧含有被Cre或FLP位点特异性重组酶识别的特殊位点,经过第一次筛选的重组分子可通过位点特异性重组酶的作用将筛选标记基因删除,但在重组分子上留下34(或36)bp的特殊序列。(4)筛选+限制性酶切反应,在筛选标记基因的两侧存在限
属一类重组蛋白家族,都具有介导互补单链DNA退火的功能降解作用
[5]
[4]
。Gam蛋白为16kD的多肽分子,可
与RecBCD核酸外切酶结合,抑制其对外源DNA的
。当Beta蛋白与单链DNA3′突出端结
合形成丝状体后,重组机制分为两种:若参与重组的另一同源序列为没有断裂的双螺旋DNA链,单链DNA在RecA蛋白的作用下侵入双链DNA,完成
重组过程,这一机制称为链侵入(strandinvasion)模型;若另一同源序列为单链DNA,Beta蛋白介导互补单链DNA退火,完成重组过程,这一机制称为单
[6]
链退火(singlestrandannealing)模型,如图2所示。
由于Rac噬菌体的RecE、RecT蛋白分别具有Exo、Beta蛋白的活性,也可介导重组作用的完成,
因此,Red重组又称为ET重组
[7]
。Muyrers等对
[8]
ET重组机制进行研究,发现只有当RecEΠRecT、ExoΠBeta蛋白配对使用时,重组才能进行。尽管RecE、RecT蛋白分别与Exo、Beta蛋白的功能类似,
但当它们交叉配对使用时,重组功能无法实现。此外,Zhang等发现当RecT蛋白过量表达时,重组效率明显提高。与大肠杆菌RecA重组机制不同的是,Red同源重组不存在对RecA蛋白的绝对依赖性,避免了RecA蛋白引起的基因重排和随机重组,并
[9]
制性酶切位点,利用限制性内切酶切割重组分子后,再将其连接。这种技术不仅可将标记基因删除,而且在重组分子上创造出惟一的酶切位点。Red同源
图3 Red同源重组技术应用策略
sm:筛选标记;csm:反筛选标记;sg:特定基因;A和B:同源序列
重组技术同其它DNA实验技术的组合使用,大大丰
富了基因操作的技术手段。研究人员可灵活的运用这些实验技术,以达到不同的实验目的。
分别由exo、bet基因替代)、pBAD2RedGam(exo、bet基因由PBAD启动子控制,gam基因由EM27启动子控制),结合CreΠloxP、FLPΠFRT位点特异性重组技术,在质粒、BAC、PAC和大肠杆菌染色体上的多个位点完成了基因敲除、敲入、点突变等操作。在实验中,Red重组对基因打靶位点的选择无特异性要求,也没有意外重排现象的发生,这说明这种技术具有较高的适用性和准确性,可广泛应用于大肠杆
[13]
菌基因工程研究。Zhang等利用Red重组技术,使载体DNA片段(两端为同源序列,中间含有ori复制起点序列和筛选标记基因)与靶基因两侧同源区域重组,将靶基因克隆于载体上,克隆的基因无突变发生。靶基因可存在于质粒、BAC和大肠杆菌染色体上,也可是来源于酵母菌或小鼠ES细胞的基因组DNA。虽然来源于真核生物的靶基因重组效率较低,但这大大拓宽了Red重组技术的应用范围,使之成为基因克隆和亚克隆的有力工具。
[14]
Yu等将部分λ噬菌体基因整合至大肠杆菌染色体上(如图4所示),控制exo、bet、gam三个基因的PL启动子受到CI857阻遏蛋白的抑制作用。经42℃热诱导后,CI857阻遏蛋白失活,PL启动子才能启动Red基因表达。这种Red重组系统的优点在于Red基因稳定地存在于染色体上,并受到严格的表达调控,避免了意外重组现象发生。尽管染
3 Red同源重组技术的研究进展
近年来,国内外有数个研究小组开展对Red同
[10]
源重组技术的研究,取得了一定的成果。Murphy较早利用质粒pTP223(Red基因由lac启动子控制)表达Red重组酶,使线性DNA片段与染色体发生重组,而后构建的大肠杆菌基因缺陷株KM22(ΔrecBCD::Plac2betexo)重组效率大大提高,但在重组过程中需要长达数百碱基的同源序列。Zhang[9]
等筛选到大肠杆菌sbcA突变株JC9604,sbcA突变株可启动Rac原噬菌体recEΠrecT操纵子表达,而具有RecET重组的功能。他们将一段两端与靶基因两翼同源的序列(各有42bp)、中间为药物抗性基因的线性DNA片段和含有靶基因的载体同时电转入JC9604菌株细胞,抗性基因成功地将靶基因置换下来。为在各种大肠杆菌中都能运用Red
[9,11,12]
同源重组技术并且提高重组效率,Muyrers等
γ(recE基因置于由阿拉伯糖构建了质粒pBAD2ET
诱导的PBAD启动子控制下,recT基因由组成型强启动子EM27控制,gam基因由组成型Tn5启动子控
αβγ(质粒pBAD2ETγ的recE、制)、pBAD2recT基因
色体上的基因是单拷贝的,但由于Red基因在PL启动子控制下表达水平较高,仍能满足重组过程的
需要。利用这种Red重组系统,Yu等将大肠杆菌染色体和质粒上多个靶基因敲除。Lee等结合FLPΠFRT位点特异性重组技术,将Cre基因敲入BAC284H12上的Eno2基因,并利用pBR322载体从BAC上克隆长达80kb的DNA片段。更重要的
[16]
是,Ellis等在研究中发现,单链DNA可与染色体上的同源序列(40~70bases)发生重组。与双链DNA重组机制不同,这种单链DNA的重组只需要Beta蛋白的作用,无需Exo和Gam蛋白参与。研究
[15]
中随从链序列一致的单链DNA重组效率明显高于与前导链序列一致的单链DNA,其具体机制还需进
[16,17]
一步研究。利用单链DNA重组技术,可在染色体和BAC上进行基因敲入、置换、点突变的操
[16]
作。Ellis等在将单链DNA(70bases)与染色体DNA重组的实验中,修复galKtyr145am琥珀突变和删除313kb长的基因片段获得了同样高的重组效率。
[18]
Swaminathan等应用单链DNA重组技术修饰BAC也获得了成功。由于体外合成寡核苷酸的技术已经相当成熟,单链DNA重组技术使得染色体上的基因操作更简便易行,为进行基因工程研究提供了有利条件
。
表明,单链DNA的重组效率与重组区域DNA的复制方向有关,在发生重组的区域,与DNA复制过程
图4 大肠杆菌染色体上的缺陷型λ原噬菌体
Datsenko等将gam、bet、exo基因置于受阿
拉伯糖诱导的ParaB启动子的控制下,构建了具有高效重组功能的低拷贝质粒pKD46,加入一定浓度的阿拉伯糖,诱导质粒pKD46表达出Exo、Beta、Gam三种蛋白质,将含有抗性基因的PCR片段电转入含有质粒pKD46的大肠杆菌,在Red重组酶的作用下,PCR片段借助两端与靶基因两翼同源的序列与染色体上对应区域发生重组,染色体上的靶基因被抗性基因所替代。这种重组系统的优点在于质粒pKD46具有温敏型复制子,在高温条件下无法复制,重组完成后可升高宿主菌培养温度将pKD46从菌株中消除,以便于进一步研究靶基因的突变效
[20]
应。王恒 等将质粒pKD46转入痢疾杆菌福氏2a2457T中,敲除染色体上的asd基因,说明质粒pKD46的Red重组功能在其他类型宿主菌中也可发挥作用。
目前Red同源重组技术的研究主要在大肠杆菌进行,类似的基因打靶技术也可应用于酿酒酵[21][22]
母和Ashbyagossypii的基因敲除研究,在这些微生物中可能存在着类似Red重组酶的蛋白。
[17]
β(bet)基因的载体pcDNA2Zhang等构建含有red
3
βredΠPGK2neo,将其转入小鼠ES细胞,电转入两侧各含28个碱基同源序列的单链DNA,成功地将neo基因突变修复,这说明单链DNA重组技术在真核生物细胞中也可以实现。随着研究的深入,Red同源重组技术也将应用于高等生物基因组研究,从而
[19]
在后基因组时代,大大推动功能基因组学研究的发[23]
展。
4 结 语
30年前,限制性内切酶的发现给分子生物学带
来革命性的变化并导致现代基因工程的诞生。随着基因工程研究的不断深入,酶切位点的依赖、繁琐的实验操作、较低的重组效率极大限制了功能基因组研究的发展。Red同源重组技术是一种新型的基因打靶技术,具有同源序列短、重组效率高、适用范围广和操作策略灵活的特点,它的诞生是遗传工程领域的一场革命,为研究基因结构与功能、表达与调控、转基因及基因治疗等提供有力的工具。
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AdvancesintheRed2mediatedRecombination
HanCong
1,2
ZhangWeicai YouSong
12
(1InstituteofBiotechnology Beijing 100071 2ShenyangPharmaceuticalUniversity Shenyang 110016)
Abstract Withthedevelopmentofmolecularbiology,anefficientbacteriophageλ2basedEscherichiacoli
homologousrecombinationsystemhasbeendevelopedforgeneticengineering.ThesystemtermedRedconsistsofthreeproteins:Exoprotein,whichbindstoadsDNAendandprocessivelydegradeslineardsDNAina5′to3′direction;Betaprotein,whichbindstossDNAandpromotesstrandannealing;andGamprotein,whichbindstothebacterialRecBCDenzymeandinhibitsitsactivities.TheseRedproteinsenabletherecombinationeventsbetweenDNAspecieswithaslittleas40~60bpofsharedsequencestooccurathighefficiency.TheRed2mediatedrecombinationcanbeusedtoinsert,deleteorsubstituteDNAsequencesatanydesiredpositiononatargetmoleculewithouttheneedforrestrictionenzymesorDNAligases.Furthermore,thenewformofrecombinogenicengineeringisapplicabletodirectsubcloningandcloningofDNAsequencesfromcomplexmixtures,includingbacterialartificialchromosomesandgenomicDNApreparations.TheRedrecombineeringfacilitatesmanykindsofgenomicexperimentsthathavebeendifficulttocarryoutandwillimprovefunctionalgenomicstudiesbyprovidingnewavenuesforDNAmanipulationingeneral.
Keywords Redhomologousrecombination Genetargeting Geneticengineering
范文四:red同源重组技术
R ed 同源重组技术研究进展
韩 聪
1,2
张惟材
13
游 松
2
(1军事医学科学院生物工程研究所 北京 100071 2沈阳药科大学 沈阳 110016)
摘要 伴随着分子生物学的发展 , 一种基于 λ噬菌体 Red 重组酶的同源重组系统已应用于大肠
杆菌基因工程研究 。 Red 重组系统由三种蛋白组成 :Ex o 蛋白是一种核酸外切酶 , 结合在双链 DNA 的末端 , 从 5′ 端向 3′ 端降解 DNA , 产生 3′ 突出端 ;Beta 蛋白结合在单链 DNA 上 , 介导互补单
链 DNA 退火 ; G am 蛋白可与 RecBC D 酶结合 , 抑制其降解外源 DNA 的活性 。 Red 同源重组技术具 有同源序列短 (40~60bp ) 、 重组效率高的特点 。 这种技术可在 DNA 靶标分子的任意位点进行基 因敲除 、 敲入 、 点突变等操作 , 无需使用限制性内切酶和连接酶 。 此外 , 这种新型重组技术可直接 将目的基因克隆于载体上 , 目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组 DNA 。 Red 同源 重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行 , 大大推动功能基因组研究的发展 。 关键词 Red 同源重组 基因打靶 基因工程 收稿日期 :2003208205 修回日期 :20032112033通讯作者 , 电子信箱 zhangweicai @hotmail.com
同源重组是基因工程实验中常用的技术手段 , 在基因打靶和基因克隆方面具有重要作用 。常规 的基因打靶技术是以 RecA 同源重组为基础 , 通常 需要数百碱基甚至更长的同源序列 , 并且重组效率 较低 , 更由于真核基因组中大量重复序列的存在 , 而导致意外重排现象的发生 。 BAC 、 PAC 、 Y AC 等克 隆载体的构建为基因克隆提供了有力工具 , 但常规 的克隆操作依赖于限制性酶切位点的存在 , 还需繁 琐的连接 、 纯化步骤 , 大大限制了对大片段基因功 能的研究 。 近几年来 , 一种基于 λ噬菌体 Red 重组 酶作用的同源重组技术逐渐成为基因工程研究的 热点之一 , 并取得了一系列重要进展 。
Red 同源重组技术的原理是将一段携带与靶
基因两翼各有 40~60bp 同源序列的 PCR 片段导
入宿主菌细胞 , 利用 λ噬菌体 Red 重组酶的作用 , 使导入细胞的线性 DNA 片段与染色体 (或载体 ) 的 特定靶序列进行同源重组 , 靶基因被标记基因置换 下来 (如图 1所示 ) 。 PCR 引物由两部分组成 , 靠近 5′ 端的区域为与靶基因同源的序列 (约 40bp ) , 靠 近 3′ 端的区域 (约 20bp ) 与模板 DNA 互补 。这种 重组技术是最近发展起来的一项可在染色体水平 上进行遗传操作的新技术 , 只需较短的同源序列 ,
而不需要特定的限制性酶切位点 , 即可在生物体内 完成重组过程 , 省去了体外 DNA 酶切 、 连接等步 骤 。 这样 , 在靶基因两翼序列已知的条件下就可以 通过 Red 重组技术对该基因进行敲除 、 敲入 、 点突 变等操作 , 还可在靶基因的上下游加入适当的启动 子和终止子序列以调节基因的表达 。将含有 ori 复制序列的线性载体片段导入细胞 , 也可将靶基因 克隆于载体上 。 实验证明 , 这种基因打靶技术是基 因功能研究和新菌株构建的有力工具 。
1 R ed 同源重组机制
Red 同源重组系统由 λ噬菌体 exo 、 bet 、 gam 三
个基因组成 , 它们分别编码 Ex o 、 Beta 、 G am 三种蛋
白质 。 Ex o 蛋白是一种核酸外切酶 , 单亚基的分子 量为 24kD , 这种蛋白的活性形式是一种环状三聚 物分子 , 中间有一中空的通道 , 通道的一端可容纳
双链 DNA 分子 , 另一端只可容纳单链 DNA [1,2]
。 Ex o 蛋白可结合在双链 DNA 的末端 , 从 DNA 双链 的 5′ 端向 3′ 端降解 DNA , 产生 3′ 突出端 。 Beta 蛋白 是一种退火蛋白 , 单亚基的分子量为 2518kD 。在 溶液中 ,Beta 蛋白自发地形成环状结构 , 紧紧地结 合在单链 DNA3′ 突出端 , 防止 DNA 被单链核酸酶
降解 , 同时介导互补单链 DNA 的退火 [3]
, 双链 DNA 退火完成后 ,Beta 蛋白从 DNA 双链上解离下来 。 Beta 蛋白在 Red 同源重组过程中起着决定性的作
第 23卷第 12期
中 国 生 物 工 程 杂 志
CHI NA BI OTECH NO LOGY
2003年 12月
图 1 R ed 同源重组技术用于基因打靶
Ha 和 Hb :同源重组区域 ;Pa 和 Pb :引物位点 ;sm :筛选标记
用 , 它与沙门氏菌 P22噬菌体的 Erf 蛋白 、 大肠杆菌 Rac 噬菌体的 RecT 蛋白 、 真核生物的 Rad52蛋白同 属一类重组蛋白家族 , 都具有介导互补单链 DNA 退火的功能 [4]。 G am 蛋白为 16kD 的多肽分子 , 可 与 RecBC D 核酸外切酶结合 , 抑制其对外源 DNA 的 降解作用 [5]。当 Beta 蛋白与单链 DNA3′ 突出端结 合形成丝状体后 , 重组机制分为两种 :若参与重组 的另一同源序列为没有断裂的双螺旋 DNA 链 , 单 链 DNA 在 RecA 蛋白的作用下侵入双链 DNA , 完成 重组过程 , 这一机制称为链侵入 (strand invasion ) 模 型 ; 若另一同源序列为单链 DNA , Beta 蛋白介导互 补单链 DNA 退火 , 完成重组过程 , 这一机制称为单 链退火 (single strand annealing ) 模型 [6], 如图 2所示 。 由于 Rac 噬菌体的 RecE 、 RecT 蛋白分别具有 Ex o 、 Beta 蛋白的活性 , 也可介导重组作用的完成 , 因此 ,Red 重组又称为 ET 重组 [7]。 Muyrers 等 [8]对 ET 重组机 制 进 行 研 究 , 发 现 只 有 当 RecE ΠRecT 、 Ex o ΠBeta 蛋白配对使用时 , 重组才能进行 。尽管 RecE 、 RecT 蛋白分别与 Ex o 、 Beta 蛋白的功能类似 , 但当它们交叉配对使用时 , 重组功能无法实现 。此 外 ,Zhang 等 [9]发现当 RecT 蛋白过量表达时 , 重组 效率明显提高 。 与大肠杆菌 RecA 重组机制不同的 是 ,Red 同源重组不存在对 RecA 蛋白的绝对依赖性 , 避免了 RecA 蛋白引起的基因重排和随机重组 , 并
图 2 R ed 重组机制示意图
且重组效率远高于 R ecA 重组 。
2 R ed 同源重组技术应用策略
Red 重组技术利用较短的同源序列 , 即可使外 源 DNA 片段与靶标分子完成重组作用 , 但通常在 靶标分子上留下筛选标记基因 , 染色体或载体上含 有筛选标记 , 有可能影响其生物功能 。 Red 重组技 术与其它基因工程技术结合运用 , 有效地解决了以 上问题 。 目前利用 Red 重组技术进行基因工程研 究的策略主要有以下 4种 [7](如图 3所示 ) :(1) 一 步筛选 , 中间为筛选标记基因两端为同源序列的线 性 DNA 片段借助同源序列与靶载体发生重组作 用 , 标记基因将靶基因置换下来 。线性 DNA 若为 含有 ori 复制起点序列的载体片段 , 可通过重组作 用 , 将靶基因克隆于载体上 。 (2) 筛选 +反向筛选 , 在第一轮重组中 , 线性 DNA 片段含有筛选标记和 反向筛选标记两个基因 , 通过筛选标记基因将重组 分子筛选出来 。在第二轮重组中 , 线性 DNA 片段 中的目的基因将重组分子上的两个筛选标记基因 置换 , 通过反向筛选标记基因将第二轮重组分子筛 选出来 , 常用的反向筛选标记基因有 sac B 、 tet R 、 rps L 等 。 (3) 筛选 +位点特异性重组 , 筛选标记基 因的两侧含有被 Cre 或 F LP 位点特异性重组酶识别 的特殊位点 , 经过第一次筛选的重组分子可通过位 点特异性重组酶的作用将筛选标记基因删除 , 但在 重组分子上留下 34(或 36) bp 的特殊序列。 (4) 筛选 +限制性酶切反应 , 在筛选标记基因的两侧存在限 制性酶切位点 , 利用限制性内切酶切割重组分子后 , 再将其连接。 这种技术不仅可将标记基因删除 , 而 且在重组分子上创造出惟一的酶切位点。 Red 同源
图 3 R ed 同源重组技术应用策略
sm :筛选标记 ;csm :反筛选标记 ;sg :特定基因 ;A 和 B :同源序列
重组技术同其它 DNA 实验技术的组合使用 , 大大丰 富了基因操作的技术手段。 研究人员可灵活的运用 这些实验技术 , 以达到不同的实验目的。
3 R ed 同源重组技术的研究进展
近年来 , 国内外有数个研究小组开展对 Red 同 源重组技术的研究 , 取得了一定的成果 。 Murphy [10]较早利用质粒 pTP223(Red 基因由 lac 启动子控制 ) 表达 Red 重组酶 , 使线性 DNA 片段与染色体发生 重组 , 而 后 构 建 的 大 肠 杆 菌 基 因 缺 陷 株 K M22 (Δrec BC D ::Plac 2bet exo ) 重组效率大大提高 , 但在重 组过程中需要长达数百碱基的同源序列 。 Zhang 等 [9]筛选到大肠杆菌 sbc A 突变株 JC9604, sbc A 突 变株可启动 Rac 原噬菌体 rec E Πrec T 操纵子表达 , 而具有 RecET 重组的功能 。他们将一段两端与靶 基因两翼同源的序列 (各有 42bp ) 、 中间为药物抗 性基因的线性 DNA 片段和含有靶基因的载体同时 电转入 JC9604菌株细胞 , 抗性基因成功地将靶基 因置换下来 。为在各种大肠杆菌中都能运用 Red 同源重组技术并且提高重组效率 ,Muyrers 等 [9,11,12]构建了质粒 pBAD 2ET γ(rec E 基因置于由阿拉伯糖 诱导的 P
BAD 启动子控制下 , rec T 基因由组成型强启 动子 E M 27控制 , gam 基因由组成型 Tn5启动子控 制 ) 、 pBAD 2αβγ(质粒 pBAD 2ET γ的 rec E 、 rec T 基因 分别由 exo 、 bet 基因替代 ) 、 pBAD 2RedG am (exo 、 bet 基因由 P
BAD
启动子控制 , gam 基因由 E M 27启动子 控制 ) , 结合 Cre ΠloxP 、 F LP ΠFRT 位点特异性重组技 术 , 在质粒 、 BAC 、 PAC 和大肠杆菌染色体上的多个 位点完成了基因敲除 、 敲入 、 点突变等操作 。在实 验中 ,Red 重组对基因打靶位点的选择无特异性要 求 , 也没有意外重排现象的发生 , 这说明这种技术 具有较高的适用性和准确性 , 可广泛应用于大肠杆 菌基因工程研究 。 Zhang 等 [13]利用 Red 重组技术 , 使载体 DNA 片段 (两端为同源序列 , 中间含有 ori 复制起点序列和筛选标记基因 ) 与靶基因两侧同源 区域重组 , 将靶基因克隆于载体上 , 克隆的基因无 突变发生 。 靶基因可存在于质粒 、 BAC 和大肠杆菌 染色体上 , 也可是来源于酵母菌或小鼠 ES 细胞的 基因组 DNA 。 虽然来源于真核生物的靶基因重组 效率较低 , 但这大大拓宽了 Red 重组技术的应用范 围 , 使之成为基因克隆和亚克隆的有力工具 。 Y u 等 [14]将部分 λ噬菌体基因整合至大肠杆菌 染色体上 (如图 4所示 ) , 控制 exo 、 bet 、 gam 三个基
因的 P
L 启动子受到 CI857阻遏蛋白的抑制作用 。
经 42℃ 热诱导后 ,CI857阻遏蛋白失活 , P
L
启动子 才能启动 Red 基因表达 。这种 Red 重组系统的优 点在于 Red 基因稳定地存在于染色体上 , 并受到严 格的表达调控 , 避免了意外重组现象发生 。尽管染
色体上的基因是单拷贝的 , 但由于 Red 基因在 P L 启动子控制下表达水平较高 , 仍能满足重组过程的
需要 。 利用这种 Red 重组系统 , Y u 等将大肠杆菌 染色体和质粒上多个靶基因敲除 。 Lee 等 [15]
结合 F LP ΠFRT 位点特异性重组技术 , 将 Cre 基因敲入 BAC 284H12上的 Eno2基因 , 并利用 pBR322载体 从 BAC 上克隆长达 80kb 的 DNA 片段 。更重要的
是 ,Ellis 等 [16]
在研究中发现 , 单链 DNA 可与染色体 上的同源序列 (40~70bases ) 发生重组 。与双链 DNA 重组机制不同 , 这种单链 DNA 的重组只需要 Beta 蛋白的作用 , 无需 Ex o 和 G am 蛋白参与 。研究
表明 , 单链 DNA 的重组效率与重组区域 DNA 的复 制方向有关 , 在发生重组的区域 , 与 DNA 复制过程
中随从链序列一致的单链 DNA 重组效率明显高于 与前导链序列一致的单链 DNA , 其具体机制还需进
一步研究 [16,17]
。利用单链 DNA 重组技术 , 可在染 色体和 BAC 上进行基因敲入 、 置换 、 点突变的操
作 。 Ellis 等 [16]
在将单链 DNA (70bases ) 与染色体 DNA 重组的实验中 , 修复 galK tyr145am 琥珀突变和删 除 313kb 长的基因片段获得了同样高的重组效率 。
S waminathan 等 [18]
应用单链 DNA 重组技术修饰 BAC 也获得了成功 。由于体外合成寡核苷酸的技术已 经相当成熟 , 单链 DNA 重组技术使得染色体上的 基因操作更简便易行 , 为进行基因工程研究提供了 有利条件
。
图 4 大肠杆菌染色体上的缺陷型 λ原噬菌体
Datsenko 等 [19]
将 gam 、 bet 、 exo 基因置于受阿
拉伯糖诱导的 ParaB 启动子的控制下 , 构建了具有 高效重组功能的低拷贝质粒 p K D46, 加入一定浓度 的阿拉伯糖 , 诱导质粒 p K D46表达出 Ex o 、 Beta 、 G am 三种蛋白质 , 将含有抗性基因的 PCR 片段电转入 含有质粒 p K D46的大肠杆菌 , 在 Red 重组酶的作用 下 ,PCR 片段借助两端与靶基因两翼同源的序列与 染色体上对应区域发生重组 , 染色体上的靶基因被 抗性基因所替代 。这种重组系统的优点在于质粒 p K D46具有温敏型复制子 , 在高温条件下无法复 制 , 重组完成后可升高宿主菌培养温度将 p K D46从菌株中消除 , 以便于进一步研究靶基因的突变效
应 。 王恒 等 [20]
将质粒 p K D46转入痢疾杆菌福氏 2a 2457T 中 , 敲除染色体上的 asd 基因 , 说明质粒 p K D46的 Red 重组功能在其他类型宿主菌中也可 发挥作用 。
目前 Red 同源重组技术的研究主要在大肠杆 菌进行 , 类似的基因打靶技术也可应用于酿酒酵 母 [21]和 Ashbya gossypii [22]
的基因敲除研究 , 在这些 微生物中可能存在着类似 Red 重组酶的 蛋 白 。
Zhang 等 [17]
构建含有 red
β(bet ) 基因的载体 pcDNA 2red βΠPGK 2neo 3
, 将其转入小鼠 ES 细胞 , 电转入两侧 各含 28个碱基同源序列的单链 DNA , 成功地将 neo 基因突变修复 , 这说明单链 DNA 重组技术在真核 生物细胞中也可以实现 。随着研究的深入 ,Red 同 源重组技术也将应用于高等生物基因组研究 , 从而
在后基因组时代 , 大大推动功能基因组学研究的发 展 [23]
。
4 结 语
30年前 , 限制性内切酶的发现给分子生物学带
来革命性的变化并导致现代基因工程的诞生。 随着 基因工程研究的不断深入 , 酶切位点的依赖、 繁琐的 实验操作、 较低的重组效率极大限制了功能基因组 研究的发展。 Red 同源重组技术是一种新型的基因 打靶技术 , 具有同源序列短、 重组效率高、 适用范围 广和操作策略灵活的特点 , 它的诞生是遗传工程领 域的一场革命 , 为研究基因结构与功能、 表达与调 控、 转基因及基因治疗等提供有力的工具。
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Han C ong
1,2
Zhang Weicai 1 Y ou S ong
2
(1Institute of Biotechnology Beijing 100071 2Shenyang Pharmaceutical University Shenyang 110016)
Abstract With the development of m olecular biology , an efficient bacteriophage λ2based E scherichia coli
hom olog ous recombination system has been developed for genetic engineering. The system termed Red consists of three proteins :Ex o protein ,which binds to a dsDNA end and processively degrades linear dsDNA in a 5′ to 3′ direction ;Beta protein ,which binds to ssDNA and prom otes strand annealing ;and G am protein ,which binds to the bacterial RecBC D enzyme and inhibits its activities. These Red proteins enable the recombination events between DNA species with as little as 40~60bp of shared sequences to occur at high efficiency. The Red 2mediated recombination can be used to insert ,delete or substitute DNA sequences at any desired position on a target m olecule without the need for restriction enzymes or DNA ligases. Furtherm ore ,the new form of recombinogenic engineering is applicable to direct subcloning and cloning of DNA sequences from com plex mixtures , including bacterial artificial chrom os omes and genomic DNA preparations. The Red recombineering facilitates many kinds of genomic experiments that have been difficult to carry out and will im prove functional genomic studies by providing new avenues for DNA manipulation in general.
K ey w ords Red hom olog ous recombination G ene targeting G enetic engineering
1
2第 12期
韩 聪 等 :Red同源重组技术研究进展
范文五:同源重组的原理
同源重组的原理
转基因动物的构建与鉴定
2. RNAi技术
3. 生物芯片技术
基因芯片技术
蛋白芯片技术
四、实践环节
生物医学实验研究中心参观
五、课内学时分配
章内 容参考学时1基因组的基本知识52基因定位和克隆技术 53基因诊断与治疗24基因功能研究技术4
大纲制定者:黄 辰 执笔
大纲审定者:宋土生
大纲批准者:俞晓瑞
大纲校对者:宋土生
"影像断层解剖学"课程教学大纲
英文名称:Sectional Anatomy
课程编码:BASM3034
学时: 32 学分:2
适应对象:临床医学专业五、七年制,预防医学、法医学、口腔医学专业 先修课程:系统解剖学,局部解剖学
使用教材及参考书:
[1]刘树伟主编,《断层解剖学》,人民卫生出版社,1998
[2]姜树学 马述盛,《断面解剖与MRI CT ECT对照图谱》,辽宁科学技术出版社,1998
[3]刘 军主编,《影像断面解剖》,陕西人民教育出版社,1993
一、课程性质、目的和任务
断层解剖学是用断层的方法来研究人体形态结构及其相关功能的科学,是在学习系统解剖学和局部解剖学的基础上,密切结合影像诊断学和介入放射学的需要,学习人体主要结构在连续断层中的变化规律。断层解剖学的学习应采取整体与断层相结合、理论联系实际的方法,将人体断层标本与影像相结合,方可更好的理解和掌握断层解剖学。学习本课程的目的在于掌握人体主要结构在连续断面上的形态结构及其变化规律,为疾病的现代影像学诊治、介入治疗和外科手术打下坚实的基础。
二、教学基本要求
1.断层解剖学是解剖学与医学影像学等学科相互渗透、相互结合而形成的边缘学科,因此断层解剖学必须在掌握了坚实宽广的系统解剖学和局部解剖学,以及熟悉医学影像技术的基础上实施。
2.断层解剖学属于应用性形态学范畴,教学过程一定要理论联系实际,在大课讲授每章节的基本理论知识的基础上,应让学生实地观察断层标本和有关的影像图片。
3. 本大纲所列教学内容:按要求程度的不同,分为"掌握内容"和"了解内容"两级。掌握内容为重点内容,学生必须通过反复学习与思考达到牢固掌握、熟练描述、准确指认和联系
实际应用的程度。了解内容则要求学生达到一般的认识和了解。大纲中未要求的内容属参考
内容。
三、教学内容及要求
绪 论
1.掌握断层解剖学的定义、特点、研究范围、学习目的和临床意义。断层解剖学的常用
术语。
2.了解超声、CT、MRI的成像原理及诊治技术新进展。
3.了解断层解剖学的历史、现状与未来。
第一章 头颈部
1.掌握头颈部连续横断层解剖。了解头颈部矢、冠状断层解剖。
2.掌握脑血供特点及脑血管的来源分支、行径、分布和断面解剖表现。
3.掌握脑室断层解剖。
4.了解脑池断层解剖。
5.掌握蝶鞍区断层解剖。
6.了解喉区断层解剖。
第二章 胸 部
1.掌握胸部连续横断层解剖。
2.了解纵隔淋巴结断层解剖。
3.了解肺内管道的配布规律。
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