范文一:E.二氢叶酸合成酶
E(二氢叶酸合成酶
答案:C
第三十四章 抗真菌药和抗病毒药 【考纲要求】
1(氟康唑的药理作用及临床应用。 2(利巴韦林的药理作用及临床应用。 第三十五章 抗结核病药
【考纲要求】
1(异烟肼的临床应用和不良反应。 2(利福平的临床应用和不良反应。 3(乙胺丁醇的药理作用和临床应用。 【考点纵览】
1(异烟肼穿透力强,单用易产生耐药性。 2(如何预防异烟肼引起的周围神经炎。 3(利福平脂溶性大,穿透力强,单用易产生耐药性;易产生肝损害。
4(乙胺丁醇不易产生耐药性,为一线抗结核药。
第三十六章 抗疟药
【考纲要求】
1(氯喹、青篙素的药理作用及临床应用。 2(伯氨喹的药理作用、临床应用及不良反应。 3(乙胺嘧啶的药理作用及临床应用。 【考点纵览】
1(氯喹、青篙素对红细胞内期裂殖体有杀灭作用,是用于控制症状的抗疟药。
2(伯氨喹只能杀灭细细胞外期裂殖子和疟原虫的配子体,是控制复发和传播的抗疟药。
3(乙胺嘧啶是病因性预防的抗疟药。 第三十七章 抗恶性肿瘤药
【考纲要求】
1(抗肿瘤药的分类:?干扰核酸合成;?破坏 DNA结构与功能;?嵌入DNA干扰转录RNA;
?干扰蛋白质合成;?影响激素平衡。 2(环磷酰胺、氟尿嘧啶的临床应用。 【考点纵览】抗肿瘤药的分类。 第五篇 医学微生物学
第一章 微生物基本概念
【考纲要求】
1(微生物的定义。
2(三大类微生物及其特点。
【考点纵览】
1(微生物定义。
2(微生物按其结构组成等,可分3大类:非细胞型微生物、原核细胞型微生物、真核细胞型
微生物。
【历年考题点津】
1(不属于原核细胞型的微生物是
A(螺旋体
B(放线菌
C(衣原体
D(真菌
E(立克次体
答案:D
第二章 细菌的形态与结构 【考纲要求】
1(细菌的三种形态及测量单位。 2(细菌基本结构的构成。
范文二:二氢叶酸还原酶和谷氨酰胺合成酶双基因筛选扩增系统对外源基因表达的影响
基金项目 :“ 八六三” 高科技发展计划资助项目 (863202207202201, 8632102207201202) ; 国家杰出青年基金资助课题 (39525001)
作者单位 :710061 西安 , 西安交通大学 (王志云、 楚雍烈 ) ; 中国 预防医学科学院病毒学研究所 (魏博、 田淑芳、 阮力 ) ; 石家庄华北制 药厂 (张玉倩 ) ? 论著 ?
二氢叶酸还原酶和谷氨酰胺合成酶双基因 筛选扩增系统对外源基因表达的影响 王志云 魏博 田淑芳 张玉倩 王秀平 楚雍烈 阮力
【摘要】 目的 研究二氢叶酸还原酶 (DHFR ,D ) 与谷氨酰胺合成酶 (G S , G ) 单基因和二氢叶酸还 原酶与谷氨酰胺合成酶 (DHFR +G S ,DG ) 双基因筛选扩增系统对外源基因表达的影响 。 方法 选择 N 端部分 TPO 基因 (T
184
) 作为靶基因 , 以 DHFR 和 G S 基因作为筛选及扩增基因构建重组质粒 pDCT 184与 p G CT 184, 将两种质粒分别转染 CH O dh fr -细胞形成单基因筛选扩增系统 , 两种质粒共转染 CH O dh fr -细胞形成双基因筛选扩增系统 。 在双基因筛选扩增系统中设计三种药物加压方式 。第一种为 DG 方 式 :先用 DHFR 系统压力 (MTX ) 筛选 , 再用 G S 系统压力 (MSX ) 筛选 ; 第二种为 G D 方式 :先用 G S 系统 压力筛选 (MSX ) , 再用 DHFR 系统压力筛选 (MTX ) ; 第三种为共加压方式 :同时利用 DHFR 与 G S 系统
压力筛选 (MTX +MSX ) 。 通过比较 T
184
基因拷贝数及表达水平来研究 DHFR 和 G S 双基因筛选扩增系
统对外源基因表达的影响 。 结果 T
184
基因拷贝数及表达水平在 DG 双基因筛选扩增系统不同药物 加压方式中 , 均比 DHFR 或 G S 单基因筛选扩增系统高 , 但不同药物选择方式没有明显差异 。 结论 采用 DHFR +G S 双基因筛选扩增系统共加压方式是提高 CH O dh fr -细胞表达外源基因的有效途径 。 【主题词】 四氢叶酸脱氢酶 ; 谷氨酰胺合成酶 ; 基因扩增 ; 甲氨喋呤
Du al gene amplification and selection system with dihydrofolate reductase and glutamine synthetase genes effectively increase the foreign gene expression WANG Zhiyun 3, WEI Bo , TIAN Shufang , ZH ANG Yuqian , WANG Xiuping , CH U Yonglie , RUAN Li . 3Xi ’ an Jiaotong Univer sity , Xi ’ an 710061,China
【 Abstract 】 Objective T o study the effect of gene amplification and selection system with DHFR plus G S and DHFR or G S gene on the foreign gene expression. Methods Using the N 2terminal truncated hTPO (T 184) gene as target gene ,tw o plasmidsre were constructed :pDC2T 184and p G C 2T 184where DHFR and G S gene were used respectively as the selective amplification marker. They were cotrans fected into CH O dh fr ’ cells to establish dual gene amplification and selection system of DHFR plus G S gene and respectively trans fected to establish single gene amplfication and selection system of DHFR or G S gene. Three selective methods in dual selective system to compare expression efficiency of hTPO were designed :thefirst method (DG ) was to use drug pressure of MTX ,then use MSX; the second method (G D ) was reversed ; the third method was simultanetously to use MTX and MSX as drug pessure. R esults DHFR +G S dual system had not only higher gene amplification efficiency but als o higher level expression. There was no distinct affect in different method of drug pressure. Conclusion MTX plus MSX dual drug pressure in dual selection system was an efficient and simple method to increase the expression of foreign gene in mammalian cells.
【 K ey w ords 】 T etrahydrofolate dehydrogenase ; G lutamine synthetase ; G ene amplification ; Methotrex 2 ate dehydrogenase
基因扩增是提高外源基因在哺乳动物细胞表达 的重要途径 , 目前最常用的基因筛选扩增系统是二 氢叶酸还原酶 (dihydrofolate teductase ,DHFR ) 系统 〔 1〕 。 二氢叶酸还原酶能够被叶酸类似物氨甲喋呤 (meth 2 otrexate ,MTX ) 所抑制 , 用含有目的基因及与之相连 的 DHFR 基因的重组质粒转化 CH O dh fr -细胞 , 利用 浓度不断提高的 MTX 选择抗 2MTX 的细胞系 , 其中 DHFR 基因及与之相连的目的基因一起扩增 , 从而 使目的基因 高 水 平 表 达 。谷 氨 酰 胺 合 成 酶 (glu 2 tamine synthetase ,G S ) 系统是近年来新发展的一种基 ? 9
5
?
因筛选扩增系统 〔 2〕 。谷氨酰胺合成酶在 ATP 水解 提供能量时 , 利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰 胺 , 在缺乏细胞外谷氨酰胺的培养条件下 , 加入谷氨 酰胺 合 成 酶 的 抑 制 物 (methionine sulphoximine , MSX ) , 可使 G S 基因及与之相连的目的基因扩增 , 达 到提高目的基因表达水平的目的 。 在病毒所遗传室 的研究工作中发现 〔 3,4〕 ,G S 系统表达水平高 , 但细胞 长期连续培养时 , 生长状况不佳 , 而 DHFR 系统表达 水平较 G S 系统低 , 但细胞生长状况良好 〔 4〕 。所以 , 建立一个既能高效表达目的基因 , 又能保持良好细 胞形态的筛选扩增系统 , 对于获得具有生产价值的 基因工程细胞系很有意义 。我们使用 DHFR 和 G S 双基因筛选扩增系统 , 研究了不同药物选择方式对 外源基因表达和细胞生长状态的影响 。
1 材料和方法
111 质粒 pDCT 184与 p G CT 184两种质粒均由中国预 防医学科学院病毒学研究所遗传免疫室构建 〔 4〕 , 前 者含 DHFR 基因 , 后者含 G S 基因 , 均以 T
184
基因 (hT 2 PO N 端 184个氨基酸基因片段 ) 为靶基因 , 除筛选 基因不同外两质粒结构完全相同 。
112 细胞株与培养基 CH O dh fr -细胞 , 由中国预 防 医 学 科 学 院 病 毒 学 研 究 所 遗 传 免 疫 室 保 存 。 DME M 培养基为 G ibco BR L 产品 。
113 DHFR 和 G S 双基因及单基因筛选扩增系统的
转染与筛选 用磷酸钙沉淀法同时将 pDCT 184和
p G CT 184重组质粒转染 CH O dh fr -细胞 〔 9〕 , 用无谷氨 酰胺 , 也无次黄嘌呤和胸腺嘧啶 , 但含有 25μm ol ΠL MSX 的 DME M 培养液稀释培养 , 混合细胞集落 , 用
于不同药物加压的研究 。同样方法将 pDCT 184和
p G CT 184重组质粒单独转染 CH O dh fr 2细胞 , 使用无次 黄嘌呤和胸腺嘧啶的 DME M 或含次黄嘌呤 、 胸腺嘧 啶和 25μm ol ΠL MSX , 但无谷氨酰胺的 DME M 分别筛 选 DHFR 和 G S 系统转化细胞 。
114 DHFR 和 G S 双基因及单基因筛选扩增系统不 同的药物加压方式 将双基因系统的混合细胞集落 分成三组 , 按以下三种方法加压 :① DG 方式 :在细胞 传代过程中 , 先分别以 MTX 1×10-7,5×10-7和 1×10-6m ol ΠL 浓度逐步培养 , 然后以 MSX 50,100和 200μm ol ΠL 浓度逐步培养 ; ② G D 方式 :先加 MSX , 然后 加 MTX , 其相应药物浓度与 DG 方式相同 ; ③ 共加压 方式 :同时增加 MTX 与 MSX 浓度 , 相应药物浓度与 DG 方式相同 。单基因系统分别使用 MTX 或 MSX , 相应药物浓度递增同上 。
115 染色体中 T 184基因的检测
11511 表达 T 184基因 CH O 细胞染色体 DNA 的提取 应 用 G ibco BR L 公 司 基 因 组 DNA 分 离 DNA Z O L T M , 进行 CH O 细胞染色体 DNA 的提取 。
11512 表达 T 184基因的 CH O 细胞染色体 DNA 的打 点杂交 CH O 细胞染色体以 5,215,1125和 01625μg 点样于 NC 膜上 , 含有 T
184基因的质粒以 50,10,2和 014ng 作对照点于膜上 , 根据一定量细胞染色体与 T 184基因探针杂交颜色深浅度和一定量质粒与 T 184基 因探针杂交颜色深浅度的比较 , 通过质粒数量确定 外源基因拷贝数 。 CH O 细胞基因组 DNA 量为 3pg Π
细胞 ,pUC182T
184质粒相对分子质量为 118×10 6。 11513 促 TPO 依赖细胞生长活性的测定 Baf 3Π
m pl 细胞系是以基因工程技术将 TPO 受体基因 m pl 导入而构建的 TPO 依赖细胞株 , 其增殖依赖于 TPO 活性蛋白 。 在 96孔板中将 TPO 标准品与待测样品 均做 5倍稀释 (5-1~5-10) , 同时设阴性对照及空白
对照 。进行 MTS 显色 , 测吸光度 A
490nm 值 , 以刺激 TPO 依赖细胞最大增殖的半数效应量 EC 50标定 TPO 活性蛋白 。
2 结果
211 转化效率 经多次重复实验 , 发现 DHFR 与 G S 双基因和单基因筛选扩增系统细胞转化效率有 差别 ,DHFR 单基因系统转化效率平均为 50克隆 Π105,G S 单基因系统转化效率平均 15克隆 Π105,DH 2 FR 和 G S 双基因系统转化效率平均 15克隆 Π105。 212 DHFR 和 G S 双基因和单基因筛选扩增系统的 细胞生长特性 在不同系统中 , 细胞形态有明显差 异 , 特别是长期培养中 DG 双系统各种药物选择方 式细胞均形态好 , 生长致密旺盛 , 不易脱落 ; G 系统 细胞易老化 , 皱缩成圆形较多 , 不宜长期培养 ;D 系 统细胞呈梭形 , 生长致密 。
213 不同药物加压方式对 DHFR 和 G S 双基因和单
基因筛选扩增系统中 T
184
基因拷贝数的影响 为了
比较 T
184
的基因拷贝数 , 提取各系统在最大压力时
转化细胞染色体 DNA , 分别与地高辛标记的 T 184探
针打点杂交 , 检测细胞内 T
184基因拷贝数 , 详见图 1。
? 0 6?
1:双系统 DG 方式 ;2:双系统 G D 方式 ;3:双系统共加压方式 ;4:G
系统 ;5:D系统 ; P :PUC 2T 184质粒阳性对照 ; C :CH O DHFR 细胞基 因组
图 1 T 184基因与各系统细胞染色体打点杂交图
1:DGmethods of dual system. 2:G D methods of dual system. 3:Coselec 2tion methods of dual system. 4:G system. 5:D system. P :PUC 2T 184. C :CH O DHFR -cells
Fig 11 D ot hybridization of genomic DNA of engineered
cell lines with T 184probe
图 2显示 DG 双系统不同药物选择方式在最大 药物浓度时细胞内 T 184拷贝数均接近 G 系统 , 为 1000拷贝左右 ,DHFR 系统 T 184约为 100拷贝
。
1:D系统 ;2:G 系统 ;3:双系统 G D 方式 ; 4:双系统 DG 方式 ;5:双系统共加压方式
图 2 各基因扩增系统 T 184的活性测定
1:Dsystem. 2:G system. 3:G D methods of dual system. 4:DGmethods of dual system. 5:coselectionmethods of dual system
Fig 12 Bioassays of T 184expressed by different gene
am plification system
214 不同药物加压方式对 DHFR 和 G S 双基因和单
基因筛选扩增系统中 T 184生物活性的影响 DG 双 系统不同药物加压方式 (G D 、 DG 和共加压方式 ) 与
D 、 G 系统的细胞在最大药物浓度时进行促 TPO 依 赖细胞增殖的检测 , 结果见图 2。结果表明 , 在促 TPO 依赖细胞的增殖活性的检测实验中 , G 系统细
胞培养液中 TPO 活性蛋白的 EC 50达 5-3~5-4
稀释 度水平 ,D 系统细胞培养液中 TPO 活性蛋白的 EC 50达 5-2
~5-3
稀释度水平 , 双系统不同药物选择方式
细胞表达水平之间没有明显区别 , 培养液中 T 184活 性蛋白的 EC 50均达 5-3
~5-4
稀释度水平 。 3 讨论
细胞遗传学表明 , 在选择压力下 , 扩增基因的大
小和结构处在不断变化之中 。 在细胞分裂的不同时 间 , 不同的宿主细胞和选择药物使基因的扩增范围
处于不断变化之中 , 从 100~1000K b 〔 4〕
。即使是同 一种细胞 , 选择过程不同 , 基因扩增的范围也不同 。 因此 , 在 DG 双基因筛选及扩增系统中 , 要考虑不同 的药物选择方式对外源基因表达水平的影响 。
DG 双基因筛选扩增系统以三种不同药物选择
方式进行基因扩增 。由于 DHFR 基因扩增范围为
100~1000K b 〔 5〕 ,G S 基因扩增范围 >50K b 〔 4〕
, 而质 粒约 7K b 。 在用一种药物选择方式单独扩增 DHFR 或 G S 基因时 , 不仅会带动与之相连的 T 184基因扩 增 , 而且使整合于细胞染色体的同一区域的 DHFR 基因与 G S 基因相互扩增 , 带动另一质粒 DNA 上的 T 184基因扩增 。因此 , 用共加压方式同时扩增 DH 2FR ,G S 基因与 G D 或 DG 方式先后单独扩增 DHFR
基因或 G S 基因 , 从而带动 T 184基因扩增 , 在 T 184基因 的表达水平上没有明显差异 。
因此 , 用 DG 双基因筛选扩增系统共加压选择 方式表达 T 184基因 , 既弥补了 D 系统细胞表达水平 偏低和 G 系统细胞对培养条件要求严格的不足 , 同 时又能够以简便的药物选择方式高效表达目的基 因 , 从而具有一定的经济价值和应用价值 。
参
考
文
献
1Loony J E ,Nunberg J H ,W instersberger E ,et al. Is olation of the am plified dihydrofolate reductase domain from methotrexate resistant chinese ham 2ster ovary cells. M ol cell Biol ,1987,9:4903.
2Bebbington G R ,Hayward BZ ,Sanders PG,et al. H igh level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an am plifiable selectable marker. Experimental Hematology , 1995,23:1040.
3刘文军 , 杨芙蓉 , 阮力等 . 谷氨酰胺合成酶 (G S ) 基因扩增选择系
统的建立 . 高技术通讯 ,1997,7:44.
4魏博 , 张玉倩 , 阮力 , 等 . 血小板生成素 (hTPO ) 在哺乳动物细胞中
高效表达的研究 . 中华微生物与免疫学杂志 , 印刷中 .
5K au fman R J ,Ruiz JZ ,Crouse G F ,et al. Ev olution of chrom os omal regions 2
containing trans fected and am plified dihydrofolate reductase sequences. M ol Cell Biol ,1983,3:699.
(收稿日期 :2000211226)
?
16?
范文三:ATP合成酶
ATP或称F0F1复合物(F0F1complexes),?该酶在分离状态下具有ATP水解酶的活性,在结合状态下具有ATP合酶的活性,?属F型ATPase。除了线粒体中有ATP合酶外,植物叶绿体的类囊体和好氧细菌都有ATP合酶的同源物,ATP合酶的分子组成和主要特点是:????头部:头部即F1,?细菌和线粒体ATP合酶的F1都是水溶性的蛋白,结构相似,由5种多肽(α、β、γ、δ和ε)组成的九聚体(α3β3γδε),α亚基和β亚基构成一种球形的排列,头部含有三个催化ATP合成的位点,每个β亚基含有一个。
柄部∶由F1的γ亚基和ε亚基构成柄部,将头部与基部连接起来。γ亚基穿过头部作为头部旋转的轴。构成基部的亚基b向外延伸成为柄部的构成部分。
基部∶基部称为F0,是由镶嵌在线粒体内膜的疏水性蛋白质所组成,由3种不同的亚基组成的十五聚体(1a:2b:12c)。其中c亚基在膜中形成物质运动的环,b亚基穿过柄部将F1固定;?a亚基是质子运输通道,允许质子跨膜运输。
范文四:蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)
1.2.1 蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性
参照於新建[]的方法并稍加改进。
酶液提取:取0.5g 左右预冷的水稻叶片(剪碎的去主叶脉的叶片) ,加4 mL缓冲液A(50mmol/L Tris—HC1,pH 7.0、10 mmol/L MgC12、2 mmol/L EDTA-Na2、20 mmol/L 巯基乙醇、2% 乙二醇) 于预冷的研钵中冰浴快速研磨成糊状,倒入离心管中,在低温冷冻离心机上4℃ 10000 r/rmin 离心30 min,所得上清液用于酶活性测定。
SS 活性的测定:在总体积0.15 mL的反应介质(含50 mmol/L Tris—HCL ,pH7.0、10 mmol/L MgC12, 10 mmol/L 果糖、3 mmol/L UDPG)中,加入100uL 酶液,30℃ 水浴中反应10 min ,加入2 mol/L NaOH 0.05mL,沸水煮10 min,流水冷却。再加入1.5 mL浓盐酸和0.5 mL 0.1% 的间苯二酚,摇匀后置于80℃ 水浴保温10 min,冷却后于480nm 处比色测定蔗糖的生成。活性单位以[蔗糖nmol /(g·min) ,Fw]表示。
SPS 活性的测定:在蔗糖合成酶反应体系中用10 mmol/L 果糖-6-磷酸取代10 mmol/L 果糖,其余均按蔗糖合成酶的方法。活性单位以[蔗糖umol /(g·h) ,Fw]表示。
药品配制(按100份)
酶液提取
1 配制缓冲液A---1000ml
200mmol /L Tris—HC1----500ml
200m mol/L Tris 12.1g----500ml 蒸馏水,
200m mol/L HC1/L 8.36ml 盐酸(37%)加水491.63ml 水
将 250 ml Tris+233.5 ml HC1,在此液中加入MgC12(分子量95.21,0.9521g ),EDTA-Na2(含两个结晶水分子量372,g ),巯基乙醇(分子量78,ml ),乙二醇(分子量,ml ),最后加蒸馏水定容到1000ml
2 配制缓冲液B---1000ml 5 ml
12.5ml Tris+11.65ml HCl,加入MgC12 0.0238g,果糖(259.19分子量,0.1296g ),加入UDPG (Uridine 5′-diphosphoglucose disodium salt from Saccharomyces cerevisiae分子量610.27,19.1ug ), 定容到25ml 容量瓶
12.5ml Tris+11.65ml HCl,加入MgC12 0.0238g,加入果糖-6-磷酸(304.1分子量,0.03041g ),UDPG (Uridine 5′-diphosphoglucose disodium salt from Saccharomyces cerevisiae分子量610.27, 19.1ug ), 定容到25ml 容量瓶
3 . 2 mol/L NaOH 50ml 0.4g 定容至50 ml
4. 0.1% 的间苯二酚 1g 999ml 蒸馏水
5.做蔗糖标准曲线
植物组织ATP 酶活性测定
一、原理
ATP 酶(adenosinetriphosphatase )可催化ATP 水解生成ADP 及无机磷的反应,这一反应放出大量能量,以供生物体进行各需能生命过程。它存在于生物细胞的多个部位,比如细胞质膜上,叶绿体类囊体膜上,对整个生命的维持有着重要的作用。在生物学研究中,常通过测定酶促反应释放的无机磷量或ATP 的减少量以及pH 变化等来测定ATP 酶的活力。本实验通过测酶促反应过程中无机磷的释放量来测定叶绿体偶联因子ATPase 的活力。偶联因子是分布在叶绿体类囊体膜表面的一种复合蛋白,它在光合作用能量转换反应中起重要作用。在正常情况下,膜上的偶联因子催化光合磷酸化反应(ATP 合成)的速率很高,而水解ATP 的活力是十分低的,但用二硫苏糖醇(DTT )、胰蛋白酶或较高温度等激活后,它水解ATP 的活力可大大增加。因此,偶联因子的测定常用激活后的ATPase 水解ATP 的活力来表示。
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料:新鲜菠菜10g ,洗净,去叶柄和中脉备用。
(二)仪器设备:1.分光光度计;2.水浴锅;3.照光设备(光源50,000Lx );4.台式离心机。
(三)试剂:1. Tris-HCl 缓冲液1mol/L(pH8.0):称60.57g Tris 溶于400ml 蒸馏水中,用浓盐酸调至pH8.0,再加蒸馏水至500ml 。2. 5mol/L 硫酸溶液:取27.8ml (比重1.
84)浓硫酸,慢慢加入到70ml 蒸馏水中,冷却后定容至100ml 。3. 10%硫酸钼酸铵溶液:称10g 钼酸铵溶于100ml5mol/L 硫酸中。4. 硫酸亚铁-钼酸铵试剂:称5g 硫酸亚铁,加入10ml 硫酸钼酸铵,再加蒸馏水稀释到70ml ,直至溶解为止(用前临时配制)。5. STN 缓冲液,将0.05mol/L Tris-HClpH7.8缓冲液(内含0.4mol/L 蔗糖、0.01mol/L NaCl) 放入冰箱中预冷。
三、实验步骤
(一)叶绿体制备及叶绿素含量测定:
取准备好的菠菜叶5g ,置于研钵或组织捣碎机杯中,加入20ml0℃下预冷的STN 缓冲液,很快研磨或捣碎(0.5min 完成),作成匀浆,以四层纱布过滤去粗渣,滤液于0~2℃下,200×g 离心约1min ,去细胞碎片,将上清液再于1500×g 离心5~7min ,取沉淀悬浮于少量STN (pH7.8)中,使叶绿素含量在0.5mg/ml 左右。小麦、水稻均可以此介质制叶绿体。如以甜菜叶子作材料,则匀浆介质中还应加入0.02mol/L 抗坏血酸钠。一般取0.1ml 叶绿体,加0.9ml 水和4ml 丙酮(分析纯),离心,取上清液于652nm 测吸光度,按Arnon 公式计算:叶绿素含量=A652×1000×5/(34.5×1000×0.1) =A652×1.45mg/ml
(二)ATP 酶的激活:
1. Mg2+-ATP酶激活液及反应液配制
2. 激活过程:取已制备好的叶绿体悬浮液1ml (叶绿素含量约为0.1mg/ml),加入1ml 激活液,于室温在白炽光50000Lx 下进行光激活6min 。
3. 反应过程:取三只试管,分别加入上述激活后的叶绿体悬浮液各0.5ml (剩下的叶绿体悬浮液供测定叶绿素含量用),再加入0.5ml 的反应液,取两管置37℃水浴中(另一管置冰浴中作空白用)保温10min ,各加入0.1ml20%的三氯乙酸停止反应。用台式离心机离心后各取上请液0.3~0.5ml (取样量按活力小大而改变)供测定ATP 水解的无机磷用。
范文五:脂肪酸合成酶
脂肪酸合成酶
脂肪酸合成酶 fatty acid synthetase 乙酰CoA+7丙=酸CoA+14NADPH+14H+→棕榈酸+7CO2+
8CoA+14NADP++6H2O。催化上述反应的酶称为脂肪酸合成酶,不过酵母酶的最终产物是棕榈酸CoA。如图所示,在丙二酸基和乙酰基缩合时,在每次延长C2单位的同时发生还原反应,在这个复杂的反应中,各有相应的酶参与作用。而酰基以CoA转移到酰基载体蛋白(ACP)上,以与此蛋白质结合的形态进行反应。通过如图所示的反应反复进行可生成棕榈酸。在大肠杆菌中,各部分反应的酶以及ACP是不结合在一起的,但在动物和酵母中,各种酶是结合型,形成所谓多酶复合体。
脂肪酸合成酶是一个具有多种功能的酶系统,在低等生物中,脂肪酸合成酶系是一种由1分子脂酰基载体蛋白(ACP)和7种酶单体所构成的多酶复合体;但在高等动物中,则是由一条多肽链构成的多功能酶,通常以二聚体形式存在,每个亚基都含有一ACP结构域。在脂肪酸合成酶中,底物和中间产物分子在各个功能结构域(可以位于同一酶分子,也可以位于不同酶分子)中传递直到完成脂肪酸的整个合成过程。
概述 脂肪酸合成酶是一个具有多种功能的酶系统,在哺乳动物中,其分子量高达272kDa。在脂肪酸合成酶中,底物和中间产物分子在各个功能结构域(可以位于同一酶分子,也可以位于不同酶分子)中传递直到完成脂肪酸的整个合成过程。
在低等生物中,脂肪酸合成酶系是一种由1分子脂酰基载体蛋白(ACP)和7种酶单体所构成的多酶复合体;但在高等动物中,则是由一条多肽链构成的多功能酶,通常以二聚体形式存在,每个亚基都含有一ACP结构域。
结构
脂肪酸合成酶组构的传统模型(“头对尾”模型)大部分是基于双功能试剂1,3-dibromopropanone(DBP)能够将一个脂肪酸合成酶单体上的酮脂酰合成酶结构域活性位点上的半胱氨酸(Cys161)的巯基和另一个单体上的载体蛋白结构域中的磷酸泛酰巯基乙胺辅基联接在一起的现象。
但对脂肪酸合成酶二聚体所进行的突变研究发现酮脂酰合成酶和单酰/乙酰转移酶结构域可以与二聚体中任何一个单体上的载体蛋白共同作用;而对于DBP联接实验结果的再分析显示酮脂酰合成酶的活性位点Cys161的巯基可以被联接到任一单体中载体蛋白4'-磷酸泛酰巯基乙胺的巯基上。而且,近来发现只含有一个完整单体的异源二聚化的脂肪酸合成酶能够进行棕榈酸酯的合成。以上的这些实验结果与之前的“头对尾”模型并不相符,于是另一个模型被提出:两个单体上的酮脂酰合成酶和单酰/乙酰转移酶结构域位于接近脂肪酸合成酶二聚体中心的位置,在这
一位置上,它们能够与任一单体中的载体蛋白接触。
在脂酸合成酶系内各种酶的催化下,依次进行酰基转移、缩合、还原、脱水、再还原等连续反应,每次循环脂酸骨架增加2个碳原子,7次循环后即可生成16碳的软脂酸,经硫酯酶水解释出。
功能
脂肪酸是脂肪族类酸,在能量运输和储存、细胞结构、提供激素合成的中间物等多个方面发挥着关键作用。脂肪酸的合成需要将乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A通过一系列的克莱森缩合反应然后脱羧(生物素作辅酶)来完成。在脂肪链的延伸过程中,通过连续的酮还原酶、脱水酶以及烯脂酰ACP还原酶的作用,加入的酮基(酰基)被还原为完全饱和的脂肪链。延伸中的脂肪链在这些酶活性位点之间循环传递时,共价连接在酰基载体蛋白的磷酸泛酰巯基乙胺(phophopantetheine)辅基上,并通过硫酯酶的作用而被释放
哺乳动物中的脂肪酸合成酶含有两个等同的多功能单链(形成同源二聚体),每一条氨基酸链的N端区域含有三个催化结构域(酮脂酰合成酶、脱水酶和单酰/乙酰转移酶]]),而C端区域则含有四个结构域(醇还原酶、酮脂酰还原酶、酰基载体蛋白和硫酯酶),这两个区域被中间600个氨基酸残基组成的核心区域所分隔。
提取方法
在低等生物中,脂肪酸合成酶系是一种由1分子脂酰基载体蛋白(ACP)和7种酶单体所构成的多酶复合体;但在高等动物中,则是由一条多肽链构成的多功能酶,通常以二聚体形式存在,每个亚基都含有一ACP结构域。
在脂酸合成酶系内各种酶的催化下,依次进行酰基转移、缩合、还原、脱水、再还原等连续反应,每次循环脂酸骨架增加2个碳原子,7次循环后即可生成16碳的软脂酸,经硫酯酶水解释出。
(1)第一轮:
①乙酰基转移:由乙酰转移酶催化生成乙酰-半胱-E1
②丙二酰基转移:生成丙二酰-泛-E2
③缩合反应:β-酮丁酰-泛-E2的生成,同时有CO2脱落
④第一次还原反应(加氢): β-羟丁酰-泛-E2的生成
⑤脱水反应: α ,β-烯丁酰-泛-E2的生成
⑥第二次还原反应(加氢): 丁酰-泛-E2的生成
丁酰-泛-E2是第一轮产物,经酰基转移、缩合、还原、脱水、再还原,碳原子由2增加至4个。
(2)第二轮
①丁酰基转移:由丁酰-泛-E2转移生成丁酰-半胱-E1
②丙二酰基转移:生成丙二酰-泛-E2
③缩合反应:β-酮己酰-泛-E2的生成
④第一次还原反应(加氢): β-羟己酰-泛-E2的生成
⑤脱水反应:α, β-烯己酰-泛-E2的生成
⑥第二次还原反应(加氢):己酰-泛-E2的生成
(3)第n轮
①丁酰基转移:由丁酰-泛-E2转移生
成脂酰-半胱-E1
②丙二酰基转移:生成丙二酰-泛-E2
③缩合反应:β-酮己脂酰-泛-E2的生成
④第一次还原反应(加氢): β-羟脂酰-泛-E2的生成
⑤脱水反应:α, β-烯脂酰-泛-E2的生成
⑥第二次还原反应(加氢):脂酰-泛-E2的生成
每循环一次,增加两个碳原子,经7 次循环,生成16C的软脂酰-泛-E2,经硫酯酶的水解作用,生成软脂酸。(图6-7)
软脂酸总反应:
乙酰CoA+ 7丙二酰CoA + 14 NADPH+14H+→软脂酸+7 CO2+6H2O+8CoASH+14NADP+