范文一:标准的PCR反应体系
标准的PCR反应体系:
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10~100pmol
模板DNA 0.1~2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
2+Mg 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
PCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和
2+Mg
引物: 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则:
?引物长度:15~30bp,常用为20bp左右。
?引物扩增跨度: 以200~500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ?引物碱基:G+C含量以40~60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成
串排列。
?避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
?引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因
末端碱基不配对而导致PCR失败。
?引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
?引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量: 每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果
为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体
的机会。
酶及其浓度
目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,
另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物
量减少。
dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存
不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装, -20?冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于
其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸
模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是: 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋
白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀; 蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与
DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用
乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白
质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋
白酶K法,要防止RNase降解RNA。
2+Mg浓度
2+Mg对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种
2+2+dNTP浓度为200umol/L时,Mg浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。Mg浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置:基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95?变性,再迅速冷却至40 ~60?,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75?,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94?变性,65?左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 ?变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下,93?~94? lmin足以使模板DNA变性,若低于93?则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模
板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。
?退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后
温度快速冷却至40?~60?,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退
火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55?为选择最适退火温度的起点较
为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度 Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)
复性温度=Tm值-(5~10?)
在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特
异性结合,提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30~60 sec,足以使引物与模板之间完全结合。
?延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性:
70~80? 150核苷酸/S/酶分子
70? 60核苷酸/S/酶分子
55? 24核苷酸/S/酶分子
高于90?时,DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70~75?之间,常用温度为72?,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长
度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够 的。3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩
增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。 循环次数
循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30~40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之
增多。
PCR产物是否为特异性扩增 ,其结果是否准确可靠,必须对其进行严格的分析
与鉴定,才能得出正确的结论。PCR产物的分析,可依据研究对象和目的不同
而采用不同的分析方法。
凝胶电泳分析:PCR产物电泳,EB溴乙锭染色紫外仪下观察,初步判断产物的
特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致,特别是多重PCR,应用多对引物,其产物片断都应符合预讦的大小,这是起码条件。
琼脂糖凝胶电泳: 通常应用1~2%的琼脂糖凝胶,供检测用。 聚丙烯酰胺凝胶电泳:6~10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好,条带
比较集中,可用于科研及检测分析。
酶切分析:根据PCR产物中限制性内切酶的位点,用相应的酶切、电泳分离后,
获得符合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行
变异性研究。
分子杂交:分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据,也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。
Southern印迹杂交: 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针,与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定,又可以提高检测PCR产物的灵敏度,还可知其分子量及条带形状,主要用于科研。 斑点杂交: 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上,再用内部寡核苷酸探
针杂交,观察有无着色斑点,主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。 核酸序列分析:是检测PCR产物特异性的最可靠方法。
PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性,不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有?模板核酸的制备,?引物的质量与特异性,?酶的
质量及活性 ?PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板:?模板中含有杂蛋白质?模板中含有Taq酶抑制剂,?模板中蛋白质没有
消化除净,特别是染色体中的组蛋白,?在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。
?模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本
的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,
其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不
够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物
一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:?选定一个好的
引物合成单位。?引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶
电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有
条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。?引物应高浓度
小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。
?引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。
2+2+Mg浓度:Mg离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul或100ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小
体积如20ul后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。 物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有
可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火
温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的
温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序
列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。
假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。 引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易
出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段
的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:?操作时应小心轻柔,
防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。?除酶及不能耐高温的物质外,所
有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。?必要
时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中
的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,
与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法
来减轻或消除。
出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性
扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:一是引物与靶序列不
完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,
及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特
异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策
有:?必要时重新设计引物。?减低酶量或调换另一来源的酶。?降低引物量,
适当增加模板量,减少循环次数。?适当提高退火温度或采用二温度点法(93?
变性,65?左右退火与延伸)。
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶
的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。
其对策有:?减少酶量,或调换另一来源的酶。?减少dNTP的浓度。?适当降低Mg2+浓度。?增加模板量,减少循环次数。
PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛的问
题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生。 污染原因
(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,
由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。 (二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、
双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.
(三)PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题,因为PCR产
物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml),远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物污染,就可造成假阳就可形成假阳性。 还有一种容易忽视,最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时
及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.
(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对
照的检验室,这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高,另
外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的
生长繁殖的简便性及具有很强的生命力,其污染可能性也很大。 污染的监测
一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,
以便采取措施,防止和消除污染。
对照试验
1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照,它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的
参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,
如以重组质粒为阳性对照,其含量宜低不宜高(100个拷贝以下),但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而
当某一PCR试剂经自己使用稳定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免
设阳性对照。
2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括?标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作
对照。?试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增,以监测试剂是否污染。
3.重复性试验
4.选择不同区域的引物进行PCR扩增
防止污染的方法
(一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行,特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分?标本处理区;?PCR反应液制备区;?PCR循环扩增区;?PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用,实验前应将实验室用紫
外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。
(二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核
酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源,因而加样或吸取模板核酸时要十分
小心,吸样要慢,吸样时尽量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或产生气
溶胶污染。
(三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装,如有可能,PCR反应液应预先配制好,然后小量分装,-20?保存。以减少重复加样次数,避免污染
机会。另外,PCR试剂,PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存,不应放于同一冰盒或同一冰箱。
(四)防止操作人员污染,使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。 (五)设立适当的阳性对照和阴性对照,阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标
准病原体核酸为宜,并注意交叉污染的可能性,每次反应都应有一管不加模板的
试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。 (六)减少PCR循环次数,只要PCR产物达到检测水平就适可而止。 (七)选择质量好的Eppendorf管,以避免样本外溢及外来核酸的进入,打开离心
管前应先离心,将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻,以防管内液
体溅出。 (http://www.bioon.com)
PCR和RT-PCR常见问题及解答
RT-PCR灵敏RNA被降解 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA
度:在琼脂糖凝使用良好的无污染技术分离RNA
胶分析中看到在将组织从动物体取出后立刻处理
少量或没有在100%甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45?或pHRT-PCR产物 超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且,在?0.8mM DTT时加入RNase
抑制剂,一定要存在DTT。
RNA中包含逆转通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以
录抑制剂 加入糖元(0.25μg到0.4μg/μl)以帮助小量样品RNA的恢复。
逆转录抑制剂包括:SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,亚精胺,甲酰胺和胍盐。
将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
多糖同RNA共沉使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
淀
用于合成cDNA确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25?
第一链合成的引保温10分钟。
物没有很好退火 对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT)或随机六聚
体确定GSP是反义序列。
起始RNA量不够 增加RNA量。
对于60?时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP。
对于>1kb的RT-PCR产物,保持反应温度?65?。
注意:不要在高于37?时使用M-MLV。
如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。
引物或模板对残在PCR前用RNaseH处理。
余的RNA模板敏
感
靶序列在分析的尝试其他靶序列或组织
组织中不表达
PCR没有起作用 对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物 PCR灵敏度:在PCR引物设计较避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似琼脂糖凝胶分差 的引物。
析中看到少量DNA含有抑制剂 诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了或没有RT-PCR抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA
产物 富含GC的模板 对于GC含量>50%的模板,使用PCRx Enhancer Solution。
模板浓度太低 使用10^4拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。
镁离子浓度太低 从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最
佳镁离子浓度。注意:对实时定量PCR,使用3mM到5mM的镁离子浓度。
退火温度太高 使用4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5?。因为这些公式只是估算
Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。
PCR灵敏度:在引物浓度太低 最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度,在260nm测量琼脂糖凝胶分光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。(见12) 析中看到少量
或没有RT-PCR
产物
RT-PCR特异引物和模板非特在第一链合成中使用GSP,而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合性:在琼脂糖凝异性退火 成的GSP。
胶分析中观察GSP设计较差 遵循用于扩增引物设计的同样原则
到非预期条带 RNA中沾染了基使用扩增级DNase?处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
因组DNA
形成引物二聚体 设计在3'端没有互补序列的引物。
引物和模板非特以2?到5?间隔增加退火温度,减少退火时间。
异性退火 在开始几个循环使用较高的退火温度,然后使用较低的退火温度。
使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。
避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。
镁离子浓度太高 对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
因为扩增复杂模使用巢式PCR或递减PCR。
板导致引物错误
起始
沾染外源DNA 使用抗气雾剂的吸头和UDG(见)。
因为二级结构导对于GC含量>50%的模板,使用(1×-3×)PCRx Enhancer Solution。
致引物结合位点
无法接近
PCR忠实性:聚合酶忠实性低 使用带有校正活性的热稳定聚合酶,如Platinum Pfx DNA聚合酶。 PCR在产物序循环数太多 降低循环数。
列中引入了错四种dNTP的浓制备新的dNTP混合物,保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。 误 度不同
定量RT-PCR 无cDNA合成
无扩增产量 cDNA合成温度降低保温温度
相对荧光信号太高
小于等于背景反转录cDNA产提高保温温度。重新设计引物
或没有模板对物被二级结构封
照 闭
RNA被损害或降必要的话更换RNA
解
RNAse污染 维持无菌条件;加入RNase抑制剂
荧光探针无功能 确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。
用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。
必要的话设计和合成探针。
灵敏度低 初始模板RNA不增加模板RNA的浓度;使用10ng-1μg的总RNA 须在比预期更充分
高的循环中检RNA被损害和降必要的话更换RNA
出产物 解
RNAse污染 维持无菌条件;加入RNase抑制剂
无效的cDNA 通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
无效的PCR扩增 注意:反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺
调整cDNA合成温度或引物设计
信号高于预期 反应中加的样品降低模板的浓度
在低于预期的太多
循环中即可检模板或PCR残余隔离污染来源,更换试剂
出产物 污染 使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应,使用抗气溶胶的吸头。
电泳后出现意RNA被基因组用DNase I预处理RNA
外的条带 DNA污染
用于第一链合成使用基因特异性引物
的寡聚dT或随机
引物
PCR的低特异性 优化PCR条件
范文二:标准的PCR反应体系
标准的 PCR 反应体系
PCR 反应体系与反应条件
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标准的 PCR 反应体系:
10×扩增缓冲液 10ul
4种 dNTP 混合物 各 200umolL
引物 各 10~100mol
模板 DNA 01~2ug
TqDNA 聚合酶 25u
g2+ 15mmolL
加双或三蒸水至 100ul
PCR 反应五要素:参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、 dNTP 、模板和 g2+
引物:引物是 PCR 特异性反应的关键, PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互 补的程度。 理论上, 只要知道任何一段模板 DNA 序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引 物,利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则:
①引物长度:15-30b ,常用为 20b 左右。
②引物扩增跨度:以 200-500b 为宜,特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。
③引物碱基:G+C含量以 40-60%为宜, G+C太少扩增效果不佳, G+C过多易出现非特异 条带。 ATGC 最好随机分布,避免 5个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是 3' 端的互补,否则会形 成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物 3' 端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端 碱基不配对而导致 PCR 失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点, 这对酶 切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量:每条引 物的浓度 01~1umol 或 10~100mol ,以最低引物 量产生所需要的结果为好,引物浓度偏 高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度 目前有两种 TqDNA 聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然 酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2。 5U(指总反应 体积为 100ul 时 ) ,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
dNTP 的质量与浓度 dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系, dNTP 粉呈颗 粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。 dNTP 溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以 1NH 或 1Tris 。 HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 70~75,小量分装, -20℃冰冻保存。多次冻融 会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中, dNTP 应为 50~200umolL ,尤其是注意 4种 dNTP 的浓度要 相等 (等摩尔配制 ) ,如其中任何一种浓度不同于其它几种时 (偏高或偏低 ) ,就会引起错配。 浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。 dNTP 能与 g2+结合,使游离的 g2+浓度降低。
模板 (靶基因 ) 核酸 模板核酸的量与纯化程度,是 PCR 成败与否的关键环节之一, 传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。 SDS 的主要功能是:溶解细 胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白, SDS 还能 与蛋白质
结合而沉淀; 蛋白酶 K 能水解消化蛋白质, 特别是与 DNA 结合的组蛋白, 再用有机溶剂 酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份, 用乙醇或异丙醇沉淀核酸。 提取的核酸即可作为模 板用于 PCR 反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化 除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于 PCR 扩增。 RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍 或蛋白酶 K 法,
要防止 RNse 降解 RNA 。
g2+浓度 g2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响, 在一般的 PCR 反应中, 各 种 dNTP 浓度为 200umolL 时, g2+浓度为 15~20mmolL 为宜。 g2+浓度过高, 反应特异性降低, 出现非特异扩增,浓度过低会降低 TqDNA 聚合酶的活性,使反应产物减少。
PCR 反应条件的选择
PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置:基于 PCR 原理三步骤而设置变性 -退火 -延伸三个温度点。 在标 准反应中采用三温度点法,双链 DNA 在 90~95℃变性,再迅速冷却至 40~60℃,引物退火 并结合到靶序列上,然后快速升温至 70~75℃,在 TqDNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模 板延
伸。 对于较短靶基因 (长度为 100~300b 时 ) 可采用二温度点法, 除变性温度外、 退火与 延伸温度可合二为一,一般采用 94℃变性,65℃左右退火与延伸 (此温度 TqDNA 酶仍有较高 的催化活性 ) 。
①变性温度与时间:变性温度低, 解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。 一般 情况下,93℃~94℃lmin 足以使模板 DNA 变性,若低于 93℃则需延长时间,但温度不能过 高, 因为高温环境对酶的活性有影响。 此步若不能使靶基因模板或 PCR 产物完全变性, 就会 导致 PCR 失
败。
②退火 (复性 ) 温度与时间:退火温度是影响 PCR 特异性的较重要因素。 变性后温度 快速冷却至 40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA 比引物复杂得多,引物 和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。 退火温度与时间, 取决于引物 的长度
、 碱基组成及其浓度, 还有靶基序列的长度。 对于 20个核苷酸, G+C含量约 50%的引物, 55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。 引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的 温度:
Tm 值 (解链温度 )=4(G+C)+2(A+T)
复性温度 =Tm值 -(5~10℃)
在 Tm 值允许围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高 PCR 反应的特异性。复性时间一般为 30~60se ,足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间:TqDNA 聚合酶的生物学活性:
70~80℃150核苷酸 S 酶分子
70℃60核苷酸 S 酶分子
55℃24核苷酸 S 酶分子
高于 90℃时, DNA 合成几乎不能进行。
PCR 反应的延伸温度一般选择在 70~75℃之间,常用温度为 72℃,过高的延伸温 度不利于引物和模板的结合。 PCR 延伸反应的时间, 可根据待扩增片段的长度而定, 一般 1Kb 以内的 DNA 片段, 延伸时间 1min 是足够的。 3~4kb 的靶序列需 3~4min ; 扩增 10Kb 需延伸 至 15min 。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要 稍长些。
循环次数 循环次数决定 PCR 扩增程度。 PCR 循环次数主要取决于模板 DNA 的浓 度。一般的循环次数选在 30~40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。
PCR 技术概论
聚合酶链反应 (PolymerseCinReion,PCR)是 80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管
内将所要研究的目的基因或某一 DNA 片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍 , 使肉眼能直接 观察和判断; 可从一根毛发、 一滴血、 甚至一个细胞中扩增出足量的 DNA 供分析研究和检测 鉴定。过去几天几星期才能做到的事情,用 PCR 几小时便可完成。 PCR 技术是生物医学领域 中的一项革命性创举和里程碑。
PCR 技术简史
PCR 的最早设想核酸研究已有 100多年的历史,本世纪 60年代末、 70年代初人们致力 于研究基因的体外分离技术, Korn 于 1971年最早提出核酸体外扩增的设想:“经过 DNA 变 性,与合适的引物杂交,用 DNA 聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆 RNA 基因”。
PCR 的实现 1985年美国 PE-Ceus 公司人类遗传研究室的 ullis 等发明了具有划时代意 义的聚合酶链反应。 其原理类似于 DNA 的体内复制, 只是在试管中给 DNA 的体外合成提供以 致一种合适的条件 ---摸板 DNA ,寡核苷酸引物, DNA 聚合酶,合适的缓冲体系, DNA 变性、 复性及延伸的温度与时间。
PCR 的改进与完善 ullis 最初使用的 DNA 聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶的 Kleno 片段, 其缺点是:①Kleno 酶不耐高温,90℃会变性失活,每次循环都要重新加。②引物链延伸反 应在 37℃下进行,容易发生模板和引物之间的碱基错配,其 PCR 产物特异性较差,合成的 DNA 片段不均一。 此种以 Kleno 酶催化的 PCR 技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点, 但由于 Kleno 酶不耐热, 在 DNA 模板进行热变性时, 会导致此酶钝化, 每加入一次酶只能完 成一个扩增反应周期, 给 PCR 技术操作程序添了不少困难。 这使得 PCR 技术在一段时间内没 能引起生物医学界的足够重视。 1988年初, Keonog 改用 T4DNA 聚合酶进行 PCR ,其扩增的 DNA 片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种 DNA 片段。但每循环一次,仍需加入新 酶。 1988年 Siki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (ermusquius)中提取到一种耐热 DNA 聚合酶。此酶具有以下特点:①耐高温, 在 70℃下反应 2后其残留活性大于原来的 90%,在 93℃下反应 2后其残留活性是原来的 60%,在 95℃下反应 2后其残留活性是原来的 40%。② 在热变性时不会被钝化, 不必在每次扩增反应后再加新酶。 ③大大提高了扩增片段特异性和 扩增效率, 增加了扩增长度 (20Kb)。 由于提高了扩增的特异性和效率, 因而其灵敏性也大大 提高。 为与大肠杆菌多聚酶 Kleno 片段区别, 将此酶命名为 TqDNA 多聚酶 (TqDNAPolymerse)。 此酶的发现使 PCR 广泛的被应用。
PCR 技术基本原理
PCR 技术的基本原理 类似于 DNA 的天然复制过程, 其特异性依赖于与靶序列两端互补 的寡核苷酸引物。 PCR 由变性 --退火 --延伸三个基本反应步骤构成:①模板 DNA 的变性:模 板 DNA 经加热至 93℃左右一定时间后, 使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离, 使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板 DNA 与引物的退火 (复性 ) :模板 DNA 经加热变性成单链后,温度降至 55℃左右,引物与模板 DNA 单链的互补序列配对 结合;③引物的延伸:DNA 模板 --引物结合物在 TqDNA 聚合酶的作用下,以 dNTP 为反应原 料, 靶序列为模板, 按碱基配对与半保留复制原理, 合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保 留复制链重复循环变性 --退火 --延伸三过程, 就可获得更多的“半保留复制链”, 而且这种 新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2~4分钟, 2~3小时就能将待扩目的基 因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Pleu)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR 的反应动力学 PCR 的三个反应步骤反复进行,使 DNA 扩增量呈指数上升。反应最 终的 DNA 扩增量可用 Y =(1+X)n 计算。 Y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数, X 表示平 (Y)均每 次的扩增效率, n 代表循环次数。 平均扩增效率的理论值为 100%, 但在实际反应中平均效率 达不到理论值。反应初期,靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式,随着 PCR 产物的逐渐积累, 被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加, 而进入线性增长期或静止期, 即出现“停滞效应”, 这 种效应称平台期数、 PCR 扩增效率及 DNA 聚合酶 PCR 的种类和活性及非特异性产物的竟争等 因素。大多数情况下,平台期的到来是不可避免的。
PCR 扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。 短产物片段的长度严格地限定 在两个引物链 5’端之间,是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所 结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补的 DNA 为模板,引物是从 3’端开始延伸,其 5’端是固定的,3’端则没有固定的止点,长短 不一, 这就是“长产物片段”。 进入第二周期后, 引物除与原始模板结合外,还要同新合成 的链 (即“长产物片段”)结合。 引物在与新链结合时, 由于新链模板的 5’端序列是固定的, 这就等于这次延伸的片段 3’端被固定了止点, 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩 增序列以内、 形成长短一致的 “短产物片段” 。 不难看出 “短产物片段” 是按指数倍数增加, 而“长产物片段”则以算术倍数增加,几乎可以忽略不计,这使得 PCR 的反应产物不需要再 纯化,就能保证足够纯 DNA 片段供分析与检测用。
PCR 反应体系与反应条件
标准的 PCR 反应体系:
10×扩增缓冲液 10ul
4种 dNTP 混合物 各 200umolL
引物 各 10~100mol
模板 DNA 01~2ug
TqDNA 聚合酶 25u
g2+ 15mmolL
加双或三蒸水至 100ul
PCR 反应五要素:参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、 dNTP 、模板和 g2+
引物:引物是 PCR 特异性反应的关键, PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互 补的程度。 理论上, 只要知道任何一段模板 DNA 序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引 物,利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则:
①引物长度:15-30b ,常用为 20b 左右。
②引物扩增跨度:以 200-500b 为宜,特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。
③引物碱基:G+C含量以 40-60%为宜, G+C太少扩增效果不佳, G+C过多易出现非 特异条带。 ATGC 最好随机分布,避免 5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是 3’端的互补,否则 会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物 3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因 末端碱基不配对而导致 PCR 失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点, 这 对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量:每条引物的浓度 01~1umol 或 10~100mol ,以最低引物量产生所需要的 结果为好, 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增, 且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度 目前有两种 TqDNA 聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然 酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 25U(指总反应体 积为 100ul 时 ) ,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
dNTP 的质量与浓度 dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系, dNTP 粉呈颗 粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。 dNTP 溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以 1NH 或 1Tris 。 HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 70~75,小量分装, -20℃冰冻保存。多次冻融 会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中, dNTP 应为 50~200umolL ,尤其是注意 4种 dNTP 的浓度要 相等 (等摩尔配制 ) ,如其中任何一种浓度不同于其它几种时 (偏高或偏低 ) ,就会引起错配。 浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。 dNTP 能与 g2+结合,使游离的 g2+浓度降低。
模板 (靶基因 ) 核酸 模板核酸的量与纯化程度,是 PCR 成败与否的关键环节之一, 传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。 SDS 的主要功能是:溶解细 胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白, SDS 还能 与蛋白质结合而沉淀; 蛋白酶 K 能水解消化蛋白质, 特别是与 DNA 结合的组蛋白, 再用有机 溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份, 用乙醇或异丙醇沉淀核酸。 提取的核酸即可作 为模板用于 PCR 反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体, 消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于 PCR 扩增。 RNA 模板提取一般采用异硫氰 酸胍或蛋白酶 K 法,要防止 RNse 降解 RNA 。
g2+浓度 g2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响, 在一般的 PCR 反应中, 各 种 dNTP 浓度为 200umolL 时, g2+浓度为 15~20mmolL 为宜。 g2+浓度过高, 反应特异性降低, 出现非特异扩增,浓度过低会降低 TqDNA 聚合酶的活性,使反应产物减少。
PCR 反应条件的选择
PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置:基于 PCR 原理三步骤而设置变性 -退火 -延伸三个温度点。 在标 准反应中采用三温度点法,双链 DNA 在 90~95℃变性,再迅速冷却至 40~60℃,引物退火 并结合到靶序列上,然后快速升温至 70~75℃,在 TqDNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模 板延伸。 对于较短靶基因 (长度为 100~300b 时 ) 可采用二温度点法, 除变性温度外、 退火与 延伸温度可合二为一,一般采用 94℃变性,65℃左右退火与延伸 (此温度 TqDNA 酶仍有较高 的催化活性 ) 。
①变性温度与时间:变性温度低, 解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。 一般 情况下,93℃~94℃lmin 足以使模板 DNA 变性,若低于 93℃则需延长时间,但温度不能过 高, 因为高温环境对酶的活性有影响。 此步若不能使靶基因模板或 PCR 产物完全变性, 就会 导致 PCR 失败。
②退火 (复性 ) 温度与时间:退火温度是影响 PCR 特异性的较重要因素。 变性后温度 快速冷却至 40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA 比引物复杂得多,引物 和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。 退火温度与时间, 取决于引物 的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于 20个核苷酸, G+C含量约 50%的引 物, 55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。 引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合 适的温度:
Tm 值 (解链温度 )=4(G+C)+2(A+T)
复性温度 =Tm值 -(5~10℃)
在 Tm 值允许围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高 PCR 反应的特异性。复性时间一般为 30~60se ,足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间:TqDNA 聚合酶的生物学活性:
70~80℃150核苷酸 S 酶分子
70℃60核苷酸 S 酶分子
55℃24核苷酸 S 酶分子
高于 90℃时, DNA 合成几乎不能进行。
PCR 反应的延伸温度一般选择在 70~75℃之间,常用温度为 72℃,过高的延伸温 度不利于引物和模板的结合。 PCR 延伸反应的时间, 可根据待扩增片段的长度而定, 一般 1Kb 以内的 DNA 片段, 延伸时间 1min 是足够的。 3~4kb 的靶序列需 3~4min ; 扩增 10Kb 需延伸 至 15min 。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要 稍长些。
循环次数 循环次数决定 PCR 扩增程度。 PCR 循环次数主要取决于模板 DNA 的浓 度。一般的循环次数选在 30~40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。
PCR 反应特点
特异性强 PCR 反应的特异性决定因素为:
①引物与模板 DNA 特异正确的结合;
②碱基配对原则;
③ TqDNA 聚合酶合成反应的忠实性;
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。 引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基 配对原则的。 聚合酶合成反应的忠实性及 TqDNA 聚合酶耐高温性, 使反应中模板与引物的结 合 (复性 ) 可以在较高的温度下进行, 结合的特异性大大增加, 被扩增的靶基因片段也就能保 持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。
灵敏度高 PCR 产物的生成量是以指数方式增加的, 能将皮克 (g=10-12g)量级的起始待测 模板扩增到微克 (ug=10-6g)水平。能从 100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中, PCR 的灵敏度可达 3个 RFU(空斑形成单位 ) ;在细菌学中最小检出率为 3个细菌。
简便、快速 PCR 反应用耐高温的 TqDNA 聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在 DNA 扩增液和水浴锅上进行变性 -退火 -延伸反应,一般在 2~4小时完成扩增反应。扩增产物一 般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞, DNA 粗制品及总 RNA 均可作为 扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的 DNA 扩增检测。
PCR 扩增产物分析
PCR 产物是否为特异性扩增,其结果是否准确可靠,必须对其进行严格的分析与鉴定, 才能得出正确的结论。 PCR 产物的分析, 可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
凝胶电泳分析:PCR 产物电泳, EB 溴乙锭染色紫外仪下观察,初步判断产物的特异性。 PCR 产物片段的大小应与预计的一致,特别是多重 PCR ,应用多对引物,其产物片断都应符 合预讦的大小,这是起码条件。
琼脂糖凝胶电泳:通常应用 1~2%的琼脂糖凝胶,供检测用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳:6~10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好, 条带比较 集中,可用于科研及检测分析。
酶切分析:根据 PCR 产物中限制性内切酶的位点, 用相应的酶切、 电泳分离后,获得符 合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究。
分子杂交:分子杂交是检测 PCR 产物特异性的有力证据, 也是检测 PCR 产物碱基突变的 有效方法。
Souern 印迹杂交:在两引物之间另合成一条寡核苷酸链 (内部寡核苷酸 ) 标记后做探针, 与 PCR 产物杂交。 此法既可作特异性鉴定, 又可以提高检测 PCR 产物的灵敏度, 还可知其分 子量及条带形状,主要用于科研。
斑点杂交:将 PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上,再用内部寡核苷酸探针杂交, 观察有无着色斑点,主要用于 PCR 产物特异性鉴定及变异分析。
核酸序列分析:是检测 PCR 产物特异性的最可靠方法。
PCR 常见题总结
PCR 产物的电泳检测时间一般为 48以内,有些最好于当日电泳检测,大于 48后带型不 规则甚致消失。
假阴性,不出现扩增条带
PCR 反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及 活性④PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有 Tq 酶抑制剂,③模板中蛋白质没有 消化除净, 特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多, 或吸入酚。 ⑤模板核 酸变性不彻底。 在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核 酸提取过程出了毛病, 因而要配制有效而稳定的消化处理液, 其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活:需更换新酶, 或新旧两种酶同时使用, 以分析是否因酶的活性丧失或不够 而导致假阴性。需注意的是有时忘加 Tq 酶或溴乙锭。
引物:引物质量、引物的浓度、 两条引物的浓度是否对称,是 PCR 失败或扩增条带 不理想、容易弥散的常见原因。 有些批号的引物合成质量有题,两条引物一条浓度高, 一条 浓度低,造成低效率的不对称扩增, 对策为:①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度 不仅要看 D 值, 更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳, 一定要有引物条带出现, 而且两引物 带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带, 此时做 PCR 有可能失败, 应和 引物合成单位协商解决。 如一条引物亮度高, 一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③ 引物应高浓度小量分装保存, 防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分, 导致引物变质降解失效。 ④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。
g2+浓度:g2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大, 浓度过高可降低 PCR 扩增的特异 性,浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变:通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul 、 30ul 、 50ul 。或 100ul , 应用多大体积进行 PCR 扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如 20ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。
物理原因:变性对 PCR 扩增来说相当重要,如变性温度低, 变性时间短, 极有可能 出现假阴性 ; 退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引 物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。 有时还有必要用标准的温度计, 检测一下扩增仪或水
溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是 PCR 失败的原因之一。
靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失, 影响引物与模板特异性结合, 或因靶序列 某段缺失使引物与模板失去互补序列,其 PCR 扩增是不会成功的。
假阳性
出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。
引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行 PCR 扩增时,扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。 需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的 交叉污染, 导致假阳性。 这种假阳性可用以下方法解决:①操作时应小心轻柔,防止将靶序 列吸入加样枪内或溅出离心管外。 ②除酶及不能耐高温的物质外, 所有试剂或器材均应高压 消毒。 所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。 ③必要时, 在加标本前, 反应管和试剂用 紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短, 但有一定的同源性。 可互相拼接, 与引物互补后, 可扩增出 PCR 产物, 而导致假阳性的产生, 可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带
PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增 带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现, 其原因:一是引物与靶序列不完全互补、 或引 物聚合形成二聚体。二是 g2+离子浓度过高、退火温度过低,及 PCR 循环次数过多有关。其 次是酶的质和量, 往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现, 酶量过多 有时也会出现非特异性扩增。 其对策有:①必要时重新设计引物。 ②减低酶量或调换另一来 源的酶。③降低引物量, 适当增加模板量,减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温 度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸 ) 。
出现片状拖带或涂抹带
PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。 其原因往往由于酶量过多或酶的质 量差, dNTP 浓度过高, g2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:①减 少酶量, 或调换另一来源的酶。 ②减少 dNTP 的浓度。 ③适当降低 g2+浓度。 ④增加模板量, 减少循环次数。
PCR 污染与对策
PCR 反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛的题是易污染, 极其微量的污染即可造成假阳性的产生。
污染原因
(一 ) 标本间交叉污染标本污染主要有收集标本的容器被污染, 或标本放置时, 由于密
封不严溢于容器外, 或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染 ; 标本核酸模板在提取过程中, 由于吸样枪污染导致标本间污染 ; 有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩 散,导致彼此间的污染。
(二 )PCR 试剂的污染主要是由于在 PCR 试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水 及其它溶液被 PCR 核酸模板污染
(三 )PCR 扩增产物污染这是 PCR 反应中最主要最常见的污染题, 因为 PCR 产物拷贝量 大 (一般为 1013拷贝 ml) , 远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限, 所以极微量的 PCR 产物污染, 就可造成假阳就可形成假阳性。
还有一种容易忽视,最可能造成 PCR 产物污染的形式是气溶胶污染 ; 在空气与液体面 摩擦时就可形成气溶胶, 在操作时比较剧烈地摇动反应管, 开盖时、 吸样时及污染进样枪的 反复吸样都可形成气溶胶而污染据计算一个气溶胶颗粒可含 48000拷贝, 因而由其造成的污 染是一个值得特别重视的题
(四 ) 实验室中克隆质粒的污染在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的 检验室, 这个题也比较常见。 因为克隆质粒在单位容积内含量相当高, 另外在纯化过程中需 用较多的用具及试剂, 而且在活细胞内的质粒, 由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强 的生命力,其污染可能性也很大。
污染的监测
一个好的实验室, 要时刻注意污染的监测, 考虑有无污染是什么原因造成的污染, 以 便采取措施,防止和消除污染。
对照试验
1阳性对照在建立 PCR 反应实验室及一般的检验单位都应设有 PCR 阳性对照, 它是 PCR 反应是否成功、 产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。 阳性对照要 选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照, 其含 量宜低不宜高 (100个拷贝以下 ) ,但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本,其对检测 或扩增样品污染的可能性很大。 因而当某一 PCR 试剂经自己使用稳定, 检验人员心中有数时, 在以后的实验中可免设阳性对照。
2阴性对照每次 PCR 实验务必做阴性对照。 它包括①标本对照被检的标本是血清就用 鉴定后的正常血清作对照 ; 被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂对照 在 PCR 试剂中不加模板 DNA 或 RNA ,进行 PCR 扩增,以监测试剂是否污染。
3重复性试验
4选择不同区域的引物进行 PCR 扩增
防止污染的方法
(一 ) 合理分隔实验室将样品的处理、配制 PCR 反应液、 PCR 循环扩增及 PCR 产物的鉴定
等步骤分区或分室进行, 特别注意样本处理及 PCR 产物的鉴定应与其它步骤严格分开。 最好 能划分①标本处理区;②PCR 反应液制备区;③PCR 循环扩增区;④PCR 产物鉴定区。 其实验用 品及吸样枪应专用,实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的 DNA 或 RNA 。
(二 ) 吸样枪吸样枪污染是一个值得注意的题。 由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪 内或粘上枪头是一个严重的污染源, 因而加样或吸取模板核酸时要十分小心, 吸样要慢, 吸 样时尽量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶污染。
(三 ) 预混和分装 PCR 试剂所有的 PCR 试剂都应小量分装,如有可能, PCR 反应液应预先 配制好,然后小量分装, -20℃保存。以减少重复加样次数,避免污染机会。另外, PCR 试 剂, PCR 反应液应与样品及 PCR 产物分开保存,不应放于同一冰盒或同一冰箱。
(四 ) 防止操作人员污染,使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。
(五 ) 设立适当的阳性对照和阴性对照, 阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原 体核酸为宜, 并注意交叉污染的可能性, 每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不 含有被扩增核酸的样品作阴性对照。
(六 ) 减少 PCR 循环次数,只要 PCR 产物达到检测水平就适可而止。
(七 ) 选择质量好的 Eendor 管,以避免样本外溢及外来核酸的进入,打开离心管前应先 离心,将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻,以防管内液体溅出。
范文三:标准测力杠杆
标准测力杠杆
一、产品说明:
标准测力杠杆是根据JJG157-93《小负荷材料试验机检定规程》中有关示值检定用标准测力
杠杆加荷法的要求而设计制造的,具有精度高、稳定可靠、使用简便等特点,是一种较为理
想力值计量标准器具。主要用于纺织强力试验机的示值检定,也可用于橡胶、塑料、线材等
其它材料试验机的示值检定。
二、主要技术参数:
杠杆基数负荷:200N
杠杆额定负荷:5000N
测量范围:200-5000N
力值误差:??0.1%
杠杆臂比:14:1
重量(毛重):41kg
???????????????????
公司名称:苏州拓博机械设备有限公司
公司地址:苏州市吴中区木渎镇刘庄路8#
联 系 人:钟思桥
联系电话:0512-67075930
联系传真:0512-67075929
电子邮件:MOZI8018@163.com
手 机:13584812189 13915502189 Q Q:156968352
网 址:http://www.tophung.com
http://www.thtechnic.com 邮 编:215101
范文四:杠杆式力标准机的自动化改造
杠杆式力标准机的自动化改造
f7一
第17卷第2期西安工业学院VcI17N02
1997年6月JOURNALOFXI'ANINsTITuTEOFTECHNOLOGYJ1ln_1997 杠杆式力标准机的自动化改造
劳奇成田军伟
(西安工业学院测量与控制技术所.西安.710032,劳奇成,男,34岁.讲师)
一rfI
【摘要l阐述了杠杆式力标准机自动化改造方法,提出了硬件改造方案和在
Windows3.X下的
一W—indows
TH164姗【关键词l力标准机自动化改造十【士'军,十【中图号l.'.,'
TheautomaticimprovementofLever-typeforcenormalmachinery LaoOichengTianJunwei
(Mesurement&eontroltinginsftute.Xi'aninstituteofte~hnology.710032)
AbstractThispaperirtstrnducesamethodoftheautomaticimprovementoffnormalmachiner
y.
Thescheme0f
thehardwareimprovingandthesoftwareprogrammingwayunderwindowshavebeenshown
KeyWordsforcenormalmachineryautomaticimpmmentWindows 引言
tO0型1000kN杠杆式力标准机是7O年代设计的一种大型精密力学计量设EEl—
备,其控
制系统由近百个机械式继电器和数十个限位开关组成,由于机械触点多.故障率高.
可靠性差,
维修困难.有许多设备由于控制系统的故障,已处于瘫痪状态.而机械系统由于其
耐用性,一般
比较完好目前一台EEl?100型杠杆式力标准机售价为数十万元,其中机械系统占有很大的
比重.所以,对该机的控制系统进行改造,实现操作,数据处理等方面的自动化,使半报废的设
备重新投人使用,具有很高的经济效益
EEl—i00型1000kN杠杆式力标准机属于二等力标准机.主要用于测力计(测力仪)等的
检定和定度.原控制系统为继电接触式控制,全部手动操作.通过转换开关控制大小砝码的加
载和卸载,拉压空问的调整(即杠杆平衡的调整).人工进行读数,记录和数据处理经过改造
后,采用非接触式传感器,提高了系统的抗干扰能力.采用计算机控制.实现了手动测量,自动
测量和手动控制等功能在自动测量下,系统可自动完成加载,读数,数据处理和结果输出等项
工作.在手动控制下.以鼠标器或键盘代替原控制系统的转换开关.对机械系统进行控制,可实
?1996?06—10收稿
158西安工业学院第17卷
现原控制系统的功能.采用Windows31中文版操作系统.用户界面友好,操作方便.可实时显
示系统状态,载荷值和读数值.
1硬件改造方案
杠杆式力标准机自动化改造,主要是对其控制系统进行改造,使用计算机系统取代原有继
电器逻辑控制线路.其系统框图如附图所示.
附图系统框图
1.1平衡检测和砝码定位
平衡检测和砝码定位均使用光电开关.对杠杆位置和砝码托盘位置进行编码.将位置转化
为二进制代码.通过DI卡送人计算机.由于系统采用了非接触式传感器,杜绝了限位开关所
固有的接触不良现象,减少了元件和信号线数量,提高了系统的可靠性. 12锁紧机构的改造
根据标准测力仪检定规程,在进程检定过程中需减少小砝码,或在回程检定过程中需增加
小砝码时,必须先将杠杆锁紧,然后再增减砝码原锁紧机构是由手轮通过一对伞齿轮带动锁
紧丝杠,对杠杆进行锁紧或放松.为对锁紧和放松过程进行自动控制,采用电动机通过减速器
直接带动锁紧丝杠,同时在锁紧块上安装了两个霍尔器件来检测锁紧状态.锁紧状态信号通过
DI卡进人计算机,当锁紧或放松到位后,由计算机关闭电动机. 1.3自动读数装置
不同的标准测力仪有不同的读数装置.有些需人工读人(如百分表等);有些则可通过位移
传感器(如应变片,电感测位仪,容栅百分表等)将位移量变成电信号,再经接1:3电路(如串行
口,并行口,A/D卡等)由计算机自动读人.采用自动读数的方法,可以减少测力仪在使用和检
定过程中的人为读数误差,提高使用过程中的自动化水平.在本系统中,通过串行1:3连接,一
个容栅百分表,作为自动读数装置
1.4电动机控制
平衡电动机,大小砝码电动机和锁紧电动机由计算机直接控制.计算机根据检定过程的需
要,通过DO卡输出控制信号,驱动电控柜执行元件,控制电动机运转.
2系统软件设计
本系统的软件用C语言编写,采用模块化设计,运行于Windows3l中文版.该软件利用
了Windows的一致性界面和多任务特性,因而人机界面友好,简单易学,操作方便系统软件
第2期劳奇成田军伟:杠杆式力标准机的自动化改造
由人机界面,系统控制和数据处理等部分组成.
2.1人机界面
人机界面包括显示面板和操作面板两部分.显示面板用来实时显示平衡状态,负荷大小,
读数值(自动读数时)以及电动机状态,它由系统时钟驱动.当显示面板窗口收到wM—TIMER
消息后,读DI卡和自动读数装置,将状态显示出来.同时,在检定过程中记录到的数据可随时
在检定记录窗口上显示和保存,以供以后的数据处理使用.操作面板按不同的操作方式,设计
有手动控制,手动测量和自动测量三种操作面板三者可以相互切换. 手动控制面板相当于控制柜外部开关,直接控制各个电动机运转设置有点动按键,长动
按键,停止按键和一组用来选择控制电动机无线电按键点动按键设计为自绘按键,它具有
BS—OWNERDRAW属性,在Windows3.X中,这种按键当鼠标左键按下和抬起时都会向其父
窗口发送wM—DRAWITEM消息,其32位参数为一指向REDAWITEMSTRUCT结构的指
针,该结构中的CtlID成员是按键的ID值,itemState成员是按键的状态,鼠标按下是itemState
的ODS-sELEcTED位置位,松开是ODS-FOCUS位置位,父窗口收到消息后,重新
绘制新的
按键外观,此时系统分别可以控制电动机的启动和停止,完成点动控制.长动按键为一般按键,
即不设定Bs—OwNERDRAw属性,这时鼠标点按键时,Windows向其父窗口发送的是wM—
COMMAND消息,其16位参数为该按键的ID值,窗口收到消息后启动电动机.同样按下停止
按键时,窗口也会收到wM.COMMAND消息,此时程序关闭电动机.Windows对无线电按键
也有同样的管理机制.
手动测量,设有加载,记录,停止等按键按下加载按键,输入载荷值后.系统给系统控制模
块发送加载指令,完成加载过程.按下记录按键.系统在检定记录窗口增加一条记录,记录内容
为负荷和读数值.检定记录窗口为一个列表框,添加记录时先将负荷值和读数值转化为字符
串,以字符串的指针作为消息的32位参数,向窗口发送LB-ADDSTRING消息,就可以将该字
符串添加在检定窗口中,列表框中有一定的缓存,可以对数据进行保存, 自动测量,设有执行,复位,暂停等按键,可按照JJB144—92所规定的检定规程自动完成检
定的全过程.在进人自动测量或按下复位按键后,系统控制所有电机归位,给检定记录窗口发
送LB—REsETcONTENT消息,清除列表框中的所有记录,准备检定. 按下执行按键后,系统开始自动检定.先根据测量参数计算出检定力值点,然后控制电动
机对各力值点按规程规定的方法进行加载,记录完成整个检定过程.力值点由起始力值点,终
止力值点和力值点数计算而来,根据情况用户还可增加一些额外力值点.通过排序
处理,得到
一
组检定力值点.
在按下暂停键后,系统先记录电动机运转状态,然后关闭电动机,进入PeekMessage循环,
等待执行或复位按键的按下.当按下复位键时,退出循环,执行复位过程;当有执行按键按下
时,退出循环,按原电动机运转状态启动电动机.继续检定
系统控制
系统控制主要控制各个电动机运转和读数装置读数系统控制模块接到加载指令后,根据
当前力值和目标力值确定是进程还是回程,并由小砝码的增减判断杠杆是否需要锁紧,若需要
则先锁紧,然后增减大小砝码,到位后,再将杠杆松开.然后调整杠杆平衡状态在乎衡调整过
西安工业学院第17卷
程中,先要读人平衡状态,平衡状态是表示偏离平衡位置的一个二进制数,当距平衡位置较远
时,启动快速平衡电动机,当距平衡位置较近时,改用慢速平衡电动机,直至到达平衡位置,关
闭电动机.
测力仪若没有自动读数接口,系统在读数时,会显示一个输入对话框,可用键盘输入.若有
自动读数接口,则需装载接口驱动程序.接口驱动程序设计为一个动态链接库(DLL),在其中
输出一个函数OetReadString,其功能是读人读数并将其转化为一个字符串.由于动态链接库
是在程序运行时由系统程序调入的,因而当自动读数装置改变时,只需在测量参数
对话框中选
取相应的驱动程序,而不需重新修改系统程序驱动程序由LoadLibaray函数装载,然后获取
GetReadString函数的地址.读数时用地址调用该函数,就可得到读数 数据处理
本系统数据处理只需根据检定规程所提供的公式进行计算即可由于检定原始记录或从
磁盘中读人的以前的检定原始记录都装入检定记录窗口,所以计算时需要从该列表框中提取
数据.提取数据时,先向列表框发送LB—GETTEXT消息,得到一条记录的字符串,将字符串转
化为浮点数,就得到负荷值和读数值.存盘,显示,打印时所需要的数据也取自该列表框.由于
Windows3.x提供了强大的GDI(图形设备界面),当设备模式由SetMapMode设置为MM—
LOMETRIC模式时,输出设备的单位为0.1mm,而与设备无关,因此在打印检定证书时,不论
哪种打印机都可以精确地在印制好的证书上填写数据,而不需要作任何改动. 3结束语
本系统采用了微型计算机作为控制器代替硬件逻辑线路,大大地简化了硬件电路,提高了
系统的可靠睦,增强了系统的功能.在软件设计上,充分利用了Windows提供的API,使复杂
的界面设计大大简化,而且人机界面友好.
参考文献
lcha尊PetzoldWindows31程序设计.文都等译.北京:海洋出版社,1993 2周兆丰.挺I力硬度计量简明手册北京1国防工业出版社,1987 3中国计量科学研究院.JJG144—92中华人民共和国计量检定规程:标准测力仪北京中国计量出版杜,
1992
4耆颤成,郝颤道.1000kN力标准机微机控科系统研制成功.航空计掇I技
术,1994(2):29,32
{编辑,校对郭位仓
范文五:杠杆基金的杠杆分布
行情大的话杠杆基金应该表现不错。
理论净值杠杆公式。实战中更有意义的是考虑到仓位与溢价率影响后的市值杠杆。
操作还是要看走势来定夺,杠杆虽然存在,也要看市场的心情。
假设瑞福分级能很好的跟随指数,如果瑞福进取某个阶段的杠杆为2,当指数涨幅为10个点,理论上瑞福进取参考净值的涨幅会到20个点,当市场预期很好的时候,自然瑞福进取会受到资金的追捧,杠杆为炒作提供了想象空间。
之所以称参考净值,第一是因为瑞福进取并没有独立运作,不存在真正独立的净值,而是根据瑞福分级的净值根据上面的公式计算而来;第二,封闭式基金在封闭期没有结束也没有场内外套利机制的时候净值只能参考,就如同权证的价值,只有到行权那天才是确定的,在这之前溢价的变化取决于市场的心情。
比如今日从国投瑞银网站查到瑞福分级的净值为0.843,比昨日增长百分之0.24;
对应表1,瑞福进取的参考净值计算为2*0.843-0.9455=0.7405,比昨日增长百分之0.47,杠杆就体现在这里。
实际上,据表1,假如瑞福分级的净值从今日的0.843增长到0.9455,其增长幅度为百分之12;
对应的瑞福进取的参考净值将会从今日的0.7405增长到0.9455,增长幅度达到百分之27;
当然这只是理论计算,实际走势还是资金说了算的,我们只需要知道有这个好的预期就行了。
瑞福进取净值在0.9455以上时,杠杆作用完全消失,只有在0.721-0.9455之间时才有较好的杠杆作用。
同庆B在净值为0.406-1.6之间时才有杠杆作用,且在1.6之上才有1倍以上的作用。
是以瑞福分级和长盛同庆的净值来分区间的。
瑞福进取有3个区间有杠杆,同庆b有2个区间有杠杆。
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