范文一:细菌内毒素检查
细菌内毒素检查
1、 实验原理
2、 实验试剂
3、 试验器具
4、 检查方法概述
5、 供试品溶液的制备
6、 内毒素限值的确定
7、 最大有效稀释倍数(MVD )的确定
8、 鲎试剂灵敏度复核
9、 干扰试验
10、供试品的细菌内毒素检查
1、实验原理:利用鲎试剂与微量内毒素产生凝聚反应的现象,以判断供试品中细菌内毒素 的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素的量用内毒素单位(EU )表示。
2、实验试剂:
①鲎试剂:从海洋无脊椎动物 “鲎” 的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物, 经低温冷冻 干燥精制的生物制剂。
鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示, 即鲎试剂的灵敏度, 单 位为 EU/ml。 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时, 应进行鲎 试剂灵敏度复核试验。
②细菌内毒素国家标准品:系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒素,用于标定细菌内 毒素工作标准品和标定,仲裁鲎试剂灵敏度。
③细菌内毒素工作标准品:系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价,用于试验 中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
④细菌内毒素检查用水:指内毒素含量少于 0.015EU/ml(用于凝胶法)或 0.005 EU/ml (用于光度测定法) ,且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。
3、实验器具:刻度吸管、凝聚管(10×75mm ) 、三角瓶、小试管(10×100mm ) 、试管架、洗 耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。
耐热器皿常用干热灭菌法(250℃, 30分钟以上)去除,塑料用具应选用无内毒素并且 对试验无干扰的器械(目前多为无热源的一次性用品) 。
4、检验方法概述
①凝胶法:限量法、半限量法
②光度测定法:浊度法(终点浊度法和动态浊度法) 、显色基质法(终点浊度法和动态 浊度法)
凝胶法:最简单、经济、应用广泛、中国药典的“仲裁”方法,对干扰相对不敏感,较 光度测定法不灵敏。
5、供试品溶液的制备
某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸取制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的 PH 值在 6. 0~8.0的范围内。
可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节 PH 值。
6、内毒素限值的确定
一般按公式:L ≡ K /M
式中:
L 为供试品的细菌内毒素限量,以 EU /ml , EU /mg 、或 EU /U (活性单位)表示。
K 为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量,注射剂 K =5 EU(kg.h ) , 放射性 药品注射剂 K =2.5EU (kg.h )靶内用注射剂 K =0.2 EU(kg.h ) 。
M 为人人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量,依据药品使用说明书,≤临床用药须 知≥规定。
7、最大有效稀释倍数(MVD )的确定
最大有效稀释倍数(MVD )指在试验中供试品溶液被稀释的最大倍数,在不超过此稀 释倍数的浓度下进行内毒素限度的测定。
MV D =Cl /λ
式中:
L 为供试品的细菌内毒素限量 , C为供试品溶液的浓度,当 L 以 EU /ml 表示时,则 C 等于 1.0ml /ml ,当 L 以 EU /mg 表示时, C 的单位为 mg /ml, λ为在凝胶法中鲎试剂的标 示灵敏度(E U /ml ) 。
8、 鲎试剂灵敏度复核
目的:考察鲎试剂的灵敏度是否符合标准, 考察检验人员操作方法是否正确及实验条件 是否符合规定。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检查结果的改变时, 应进行鲎试剂灵敏 度复核试验。
细菌内毒素标准溶液的准备:①、取细菌内毒素工作标准品(或国家标准品)一支, 轻弹瓶壁,使粉末洛入瓶底,然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕, 75℅酒精棉球擦拭后启开, 启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。 ②、 按照标准品说明书, 加入规定量的细菌内毒素检查 用水溶解其内容物,用封口膜将瓶口封严,置旋涡混合器上混合 15分钟,然后进行稀释, 制备成 4个浓度的细菌内毒素标准溶液,即 2λ、 λ、 0.5λ和 0.25λ(λ为所复核的鲎试 剂的标示灵敏度) ,四个浓度的内毒素标准溶液,每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀 30分钟。
示例 :某待复核鲎试剂的灵敏度标示值为 0.25E U /ml ,细菌内毒素工作标准品规格为 150 EU /ml ,将细菌内毒素工作标准品用 1 ml细菌内毒素检查用水,再稀释制备成浓度为 0.50E U /ml , 0.25 EU /ml , 0.125 EU /ml 和 0.06 EU /ml 的细菌内毒素标准溶液。
细菌内毒素标准溶液的制备过程图示:
待复核鲎试剂的准备
取规格 0.1m l ∕支的鲎试剂 18支, 每支加入 0.1ml 检验用水使溶解备用 (规格大于 0.1m l ∕支的鲎试剂,按其标示量加入细菌内毒素检查用水复溶后按 0.1m l ∕管分装到凝聚管中, 至少准备 18管) 。
加样
将已充分溶解的待复核鲎试剂 18支(管)放在试管架上,排成 5列,其中 4列 4支, 1列 2支。其中 4支 4列分别加入 0.1ml 的 2λ、 λ、 0.5λ和 0.25λ内毒素标准溶液,另 2支(管)加入 0.1ml 检查用水作为阴性对照。
加样结束后,将鲎试剂用封口膜封口,轻轻振动混匀,垂直放入 37±1℃恒温器中,保 温 60±2分钟。
观察结果
将试管轻轻取出,缓缓倒转 180°,若管内形成凝胶,并且凝胶不变形、不从管壁滑落 者为阳性,未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑落着为阴性。
计算
当最大浓度 2λ管均为阳性, 最低浓度 0.25λ管均为阴性, 阴性对照为阴性时实验为有 效,按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果。
λC =lg-1(∑ X /4)
式中 X 为反应终点浓度的对数值(lg ) 。
反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
例子:
结果判断
当 λC 在 0.5λ~2λ(包括 0.5λ和 2λ)时,方可用于细菌内毒素检查,并以标示灵 敏度 λ为该批鲎试剂灵敏度。
9、 干扰试验
目的:确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作 用,为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。
当进行新药的内毒素检查试验前, 或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时, 须进 行干扰试验。
当鲎试剂、 供试品的配方、 生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果 的变化时,须进行干扰试验。
进行干扰试验一般步骤
①供试品限量确定
②根据鲎试剂的灵敏度确定 MVD 范围(供试品溶液浓度范围)
③预试验(帅选试验) :确定样品最大不干扰浓度
④正式干扰试验
干扰试验预实验
目的:初步确定供试品的最大不干扰浓度(当限值以 E U /mg 或 EU /U 活性单位标示) 或最小不干扰稀释倍数(当限值以 E U /ml 标示) ,为正式干扰实验提供依据,避免干扰试 验的盲目性。
操作方法
①将无可检测到内毒素的供试品进行一系列倍数的稀释,但最大的稀释倍数不得超过 MVD=CL/λ0.03(0.03EU/ml为现今我国市售鲎试剂的最高灵敏度 )
②使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。 每一稀释倍数下做 2支供试品管和 2支供试品 阳性对照(即该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成 2λ浓度) 。另取 2支细菌内毒素 检查用水作为阴性对照, 2支加入 2λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。
例子 制备稀释倍数为 4的供试品阳性对照溶液:
0.3ml4.0入 EU ∕ ml 的内毒素标准溶液 +0.3ml稀释倍数为 2的供试品稀释液 =0.6ml含 2入 EU ∕ ml 内毒素标准溶液的稀释溶液为 4的供试品稀释数。
③保温 60±2分钟,观察并记录结果。
④当阴性对照为阴性,阳性对照为阳性时,实验有效。
当系列浓度中出现供试品溶液 2管为阴性, 供试品阳性对照 2管为阳性时, 认为供试品 在该浓度下不干扰实验, 此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。 即可选择该稀释倍数进行正 式干扰实验。
⑤当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性, 或供试品阳性对照不为阳性时, 说明 供试品对内毒素与鲎试剂的反应在干扰,则应对供试品进行更大稀释倍数(不得超过 MVD=CL ∕入 0.03)或通过其他适宜的方法(如过滤、中和、透析或加热中和等)排除干 扰。
⑥当供试品的内毒素限值单位为 E U /㎎或 EU /U 活性单位时,应将最小不干扰稀释倍 数换算成最大不干扰浓度(即稀释倍数下溶液的浓度) ,以㎎/ml 或活性单位/ml 标示。 举例
某注射液限值为 2.5E U /ml ,按 MVD=CL/入计算出灵敏度为 0.03E U /ml 下的 MVD 为 83倍,将供试品溶液进行一系列稀释,用灵敏度为 0.25EU /ml 的鲎试剂预实验,结果如下:
由以上结果可初步确定该样品的最小不干扰稀释倍数为 20倍,可在此浓度下进行正式 干扰试验。
正式干扰试验
制备内毒素标准对照溶液
取 1支细菌内毒素标准品,用细菌内毒素检查用水稀释成 4个浓度的标准溶液即 2入、 入、 0.5入、 0.25入。
制备含内毒素的供试品溶液
将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数,再用此稀释液将同支细菌内毒素标 准品稀释成 4个浓度即 2入、入、 0.5入、 0.25入的含内毒素的供试品溶液。
鲎试剂的准备
取规格为 0.1m l /入支的鲎试剂 36支,备用。
加样
准备好的 36支鲎试剂放在试管架上,按下图加样。
加样样结束后,用封口膜封口,轻轻振动混匀,避免产生气泡,放入 37℃±1℃恒温器 中,保温 60±2分钟,观察并记录结果。
实验结果计算
如两组最大浓度 2入均为阳性, 最低浓度 0.25入均为阴性, 阴性对照 4管均为阴性时, 按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值 (Es ) 和用供试 品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(Et ) 。
Es=lg1(∑ Xs /4)
Et=lg1(∑ Xt /4)
式中:Es 、 Et 分别用检查用水和试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度 的对数值 (lg ) 。
当 Es 在 0.5入~5入(包括 0.5入和 2入)及 Et 在 0.5Es ~2 Es(包括 0.5Es 和 2 Es) 时,则认为供试品在该浓度下无干扰作用,可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。 当 Et 不在 0.5Es ~2 Es(包括 0.5Es 和 2 Es)时,则认为供试品在该浓度下干扰实验。 应使用适宜的方法排除干扰,如可将供试品进行更大倍数稀释(不超过 MVD ) 。
建立新品种细菌内毒素检查方法时,每个厂家至少取三个批号的供试品。用两个以上 鲎试剂生产厂家的鲎试剂进行干扰实验。
10、供试品的细菌内毒素检查
在细菌内毒素检查中, 每批供试品必须做 2支供试品管和 2支供试品阳性独照, 同时每 次实验必须做 2支阳性对照和 2支阴性对照。
供试品溶液的准备
根据内毒素限度值,计算 MVD=CL /入,然后将供试品进行稀释,其稀释倍数不得超 过 MVD 。
一般稀释至 MVD :如样品有干扰作用,选择符合干扰试验要求的第二农地作为日常检 验浓度。
阳性对照溶液的制备
用检查用水将内毒素标准品稀释制成 2入浓度的内毒素标准溶液。
供试品阳性对照溶液的制备
用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成 2入浓度的内毒素标准溶液 阴性对照 即细菌内毒素检查用水
鲎试剂的制备
取规格为 0.1m l /支的鲎试剂 8支,每支加入 01ml 检查用水使溶解备用。
加样
8支管中 2支加入 0.1ml 供试品溶液或其稀释液作为供试品管, 2支加入 0.1ml 阳性对 照溶液作为阳性对照管, 2支加入 0.1ml 检查用水作为阴性对照管, 2支加入 0.1ml 供试品 阳性对照溶液作为供试品阳性对照管。
将试管中溶液轻轻混匀后,用封口膜封闭管口,垂直放入 37℃±1℃水浴或适宜恒温器 中,保温 60±2分钟。
结果判断
当阳性对照都为阳性,供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时,实验方有效。 若供试品 2管均为阴性, 认为该供试品符合规定; 如供试品 2管均为阳性, 应认为不符 合规定;如 2管中 1管阳性, 1管阴性,则另取 4支供试品管复试, 4管中如有 1管为阳性, 即认为不符合规定。 若第一次实验时供试品的稀释倍数小于 MVD 而结果出现 2管均为阳性或 2管中 1管为阳性时,按同样方法复试,复试时要求将稀释至 MVD 。
例 某葡萄糖注射液,其内毒素限值为 0.5EU ∕ ml ,设所用鲎试剂的灵敏度为 0.125EU ∕ ml 。 MVD=CL∕入 =0.5∕ 0.125=4
将样品进行 4倍稀释,并做 4倍稀释下的供试品阳性对照。
范文二:细菌内毒素检查SOP
细菌内毒素检查SOP
1. 适用范围
本标准适用于细菌内毒素的检查。 2. 职责
QC负责人 监督检验员按SOP检查 检验员 严格该SOP检查 3. 内容 3.1. 原理
用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定,内毒素的量用内毒素的单位(EU)来表示。 3.2. 实验材料及用具
3.2.1.电热干燥箱温度应能达到250℃。 3.2.2. 恒温水浴箱(37±1℃)。 3.2.3.温度计,精度在1℃以下。 3.2.4. 旋涡混合器。
3.2.5. 鲎试剂应具有国家主管部门批准文号。
3.2.6. 细菌内毒素工作标准品,应使用中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。 3.2.7. 细菌内毒素检查用水(含内毒素小于0.015EU的灭菌注射用水)。 3.3.准备工作
3.3.1.试验所用器皿,250℃干烘至少≥60分钟。
3.3.2.鲎试剂灵敏度复核,按《中国药典》2005版三部287页进行。 3.3.3.供试品干扰试验, 按《中国药典》2005版三部287页进行。 3.4.操作方法
3.4.1. 试验准备 将试验所用器皿用洗涤剂和自来水洗净除去水分后置洗液中浸泡4小时,取出将洗液滤干,用自来水将残余洗液洗净,在用新鲜蒸馏水冲洗干燥后,用锡箔纸密闭玻璃器皿口,放置适宜的密闭金属容器中,置烤箱中在250℃干烤至少1小时,容器在不打开包装的情况下可在一周内使用,否则须再加热除去热源。 3.4.2.内毒素标准溶液的制备
3.4.2.1. 取细菌内毒素工作标准品一支,轻弹瓶壁,使粉末落入瓶底,用75%酒精棉球擦拭后开启,防止玻屑落入瓶内。
3.4.2.2. 按使用说明书用移液管加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物,用封口膜将瓶口封严。置旋涡混合器上混合15分钟,然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准品溶液,每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。
3.4.3. 供试品溶液的制备
3.4.3.1 供试品最大有效稀释倍数的计算:
C?L
MVD=
? L为供试品的细菌内毒素限值;
? 为使用鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml);
C为供试品的浓度,当L以EU/ml表示时,C等于1.0ml/ml。
3.4.4.鲎试剂的制备 取0.1ml/支的鲎试剂8支,轻弹瓶壁,使粉末落入瓶底,用75%酒精棉球擦拭后开启,防止玻璃屑落入瓶内,加入0.1ml的细菌内毒素检查用水复溶,轻 轻转动瓶壁,使内容物充分溶解,避免产生气泡。 3.4.5.细菌内毒素稀释法 3.4.5.1.阳性对照溶液的制备
用细菌内毒素检查用水将内毒素标准品稀释成2?浓度的内毒素溶液。
如细菌内毒素规格为5EU/ml,检品细菌内毒素限量应小于0.25EU, 鲎试剂灵敏度0.25EU/1ml,规格0.1ml, 细菌内毒素应稀释成0.5EU/ml(2?浓度)。 3.4.5.2.供试品阳性对照溶液的制备
用供试品液将内毒素标准品制成2?浓度的内毒素。 3.5.凝胶法
3.5.1. 原理:通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 3.5.2.方法:取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原装安瓿8支,其中2支加入0.1ml按最大有效稀释倍数稀释的供试品溶液作为供试品管,2支加入0.1ml用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素标准品制成的2?浓度的内毒素溶液作为阳性对照管,2支加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照管,2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液(用被测供试品或供试品的最大有效稀释液制成2.0?的内毒素液)作为供试品阳性对照管。将安瓿中溶液轻轻混匀后,用封闭管口,垂直放入37±1℃水浴中,保温60分钟±2分钟。保温和拿取过程应避免受到振动,造成假阴性结果。
注:A为供试品溶液;B为供试品阳性对照;C为阳性对照;D为阴性对照 3.3. 结果判断
保温60分钟±2分钟后观察结果。从水浴中轻轻取出安瓿,缓缓倒转180°,若管内形成凝胶,并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性(+),未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性(-)。保温和拿取安瓿过程中应避免受到震动造成假阴性。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性(-),供试品阳性对照液B的平行管均为阳性(+),阳性地照溶液C的平行管均为阳性,试验有效。
若溶液A的两个平行管均为阴性。判供试品符合规定;若溶液A的两个平行管均为阳性,判供试品不符合规定;若溶液A的两个平行管中一管为阳性 ,另一管为阴性,需进行复试。复试时,溶液A需做4支平行管,若所有平行管均为阴性,判供试品符合规定,否则判供试品不符合规定。 3.6注意事项
3.6.1实验操作应在清洁环境中进行,过程中应防止微生物的污染。 3.6.2实验前,须用肥皂洗手,用75%酒精棉球消毒。 3.6.3注意鲎试剂的批号、有效期、规格、灵敏度等。
3.6.4在测定过程中,稀释操作要熟练准确,混合要充分均匀,才能转入下一步操作。 3.6.5在使用洗耳球、移液管取样时,应注意不要将洗耳球中的气体吹入溶液中,以防止气体中的内毒素进入供试液。
3.6.6 溶解鲎试剂及混匀供试品和鲎试剂时,不要剧烈振荡避免产生气泡。
3.6.7 由于凝集反应是不可逆的,所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动,以免凝胶破碎产生假阴性结果。
4附件
细菌内毒素检验记录 JK21022003-04
范文三:细菌内毒素检查注意
细菌内毒素检查法的正确理解
·如何全面理解细菌内毒素检查法中污染物对试验结果的影响? ·如何正确认识器皿洗涤的重要性?
·如何正确理解鲎试剂的抗干扰能力和鲎试剂的特异性?
许多客户对污染的认识是不全面或错误的,他们认为在细菌内毒素检查过程中,器皿被污染的结果必然导致阳性结果的出现,但试验结果正好与他们的认识有时正好相反,可能阳性对照全为阴性,对此亦有百思不得其解。要正确理解这个问题,首先要正确理解鲎试剂与内毒素的反应机理,鲎试剂与内毒素的反应为一系列酶反应,生物酶反应受许多因素的干扰。在日常工作中,我们要特别注意一些因素对试验结果的影响,如PH值、器皿的洁净度以及环境因素等。
图1 鲎试剂与内毒素的反应机理
1、PH值:鲎试剂生物活性在pH 6-8时酶活性稳定;pH ≤3 或≥10时,酶活性受到抑制。故鲎试验时,供试品 pH 最好应预调和6.8-8.0 为好,必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液调节 pH 值。
2、器皿: 内毒素稀释不宜用注射器,而应用经过校正的刻度玻璃吸管。因为注射器刻度准确度差,而且针栓壁磨沙面易吸附内毒素,试验误差大。同时要特别注意注射器针头引入的铁离子对试验结果的干扰,铁离
子对鲎试验反应有较强的抑制作用。操作中常用的聚丙烯塑料管可能干扰试验结果,故宜慎用。
3、金属阳离子: 离子对细菌内毒素测定结果影响较大,一方面阳离子如Fe3+、Al3+强度较大会引起内毒素的聚集造成内毒素局部浓度过高,同时还必须注意高价阳离子(如Fe3+)对鲎试剂酶反应具有强抑制作用;另一方面鲎试剂必须在二价阳离子Ca2+、Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。许多药物因PH值≥10时,其中的阴离子会吸收鲎试剂中的 Ca2+、Mg2+离子,使实验呈假阴性。
4、其它物质:如血液中的凝血因子、络合剂、抗凝剂等,都可能干扰鲎试剂与内毒素的反应,同时消毒剂和有机溶剂对鲎试验都有抑制作用。
一、器皿洗涤的重要性
《中国生物制品操作规程》389页——细菌内毒素检查法“玻璃器皿的洗涤”规定:“将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水分后,置洗液中浸泡4小时,取出将洗液沥干,用自来水将残余的洗液洗净,再用新鲜蒸馏水冲洗干燥(禁用超纯水或久置的蒸馏水冲洗)后置适宜的密闭金属容器中,迅速置烤箱中,除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素。”应特别注意,该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿必须“用新鲜蒸馏水冲洗,禁用纯化水和久置的蒸馏水冲洗。”有的客户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿,结果试验中所有的阳性对照都为阴性,复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大,这主要是由于纯化水和蒸馏水内在质量不同所造成的。因纯化水中存在的阴阳离子经250℃高温干烤不能完全被破坏,这时不同的离子就产生对鲎试剂酶反应抑制或增强的反应,为了保证试验结果的准确性和检验报告的权威性,我们应该严格遵守操作规程,用新鲜多效蒸馏水冲洗鲎试验用玻璃器皿。
二、抗干扰能力和鲎试剂的特异性
有客户在做白蛋白的干扰试验时使用两个厂家的鲎试剂,干扰试验结果其中一个厂家的鲎试剂需要稀释4倍而另一个厂家的鲎试剂需要稀释8倍才能排除干扰。据此向我们咨询是否稀释倍数小的鲎试剂抗干扰能力强?而稀释倍数大的鲎试剂抗干扰能力就差?我们认为对一些粘度较大
的产品白蛋白、医用透明质酸钠,建议使用8倍或16倍稀释来建立内毒素常规检查规程(SOP),因为鲎试验是一种复杂酶反应,任何一种药品、生物制品的浓度或粘度对试验结果皆有影响,是抑制还是增强反应仍需做具体的分析。单纯以干扰试验的稀释倍数来判断鲎试剂的质量是片面的。 如何判断鲎试剂抗干扰能力,必须从几个方面进行分析:
1、 鲎试剂灵敏度的差异 不同厂家的鲎试剂虽然标示值(λ)相同,但仍然存在较大的误差。比如,标示值为0.5EU/ml的鲎试剂,若有的产品真实灵敏度可能是0.75EU/ml或1.0EU/ml;而另一个厂家的鲎试剂可能是0.35EU/ml或0.25EU/ml时,按0.5-2λ误差标准都是合格产品,但对同一检品虽然在相同的稀释倍数下,这两个厂家的鲎试剂产品对内毒素的检出水平却不同。
2、 鲎试剂与内毒素脂多糖反应的差异 在正常的药品、生物制品生产时,因不同时期的原料来源和水源的因素,都可能导致半成品或成品污染的菌株不同,而导致内毒素脂多糖物质与鲎试剂反应的活性不同。有的鲎试剂对革兰氏阴性菌或各种微生物产生的内毒素脂多糖均有敏感性,有的鲎试剂可能只对革兰氏阴性菌产生的内毒素敏感而对其它微生物产生的内毒素脂多糖不敏感,故同一检品虽然在相同稀释倍数下,两个厂家的鲎试剂对内毒素的检出能力亦不同。
3、 PH值的影响 鲎试剂生产用水质量和BET水PH值的差异,可影响鲎试剂对内毒素脂多糖反应敏感性。有的鲎试剂生产公司(或厂)的原料用水不是多效蒸馏水,而是利用一般纯化水,而且PH值都在6.0以下。而鲎试剂的酶反应最佳PH值为6.8-8.0,所以一直以来美国、英国药典和日本药局方规定检品必须调节PH值6.0-8.0。
近几年来,鲎试剂特异性差所造成的后果比较隐蔽,不易被使用者所发现,但是这种危害性往往以人的生命为代价所表现出来。《法律在线》报道:2000年5月4日晚10时,8岁女童何某某因扁桃体发炎,被父亲带到河南省某中心医院就诊。医院为她所用的药物为青霉素,所用液体是该医院自己生产的250ml袋装生理盐水(批号20000427)。输液约20分钟后,何某某开始出现胸闷、全身颤抖等症状。6小时后,经抢
救无效死亡。2000年5月8日,该医院将何一一使用的该院自制氯化钠注射液样品送往省质量检验部门检验,检验结果是:细菌内毒素不符合规定。经医疗事故技术鉴定委员会鉴定,“患儿何某某因输入细菌内毒素超标的液体引起输液反应,输液反应导致主要脏器缺血缺氧,功能衰竭死亡”(豫医鉴〖2001〗10号),这是一起严重的由于内毒素漏检所造成的悲剧。用我厂生产的海浪牌鲎试剂来检验该批生理盐水,同样检测出该药品注射液内毒素不合格。同样的事故还发生在吉林省公主岭地区某制药厂和河北邯郸某制药厂,他们分别使用某企业的鲎试剂都没有检验出。产品中的内毒素而造成产品漏检,造成临床大面积严重的输液反应,这种情况都是鲎试剂特异性差的一种表现。对内毒素不合格的药品,便威胁到人民群众的生命安全。
鲎试剂的特异性系指在药品、生物制品和血液制品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力,既不能造成样品内毒素的漏检,也不能将其它物质错判为内毒素。目前我厂研究证明,已知能与鲎试剂发生反应的物质有细菌内毒素和β-葡聚糖,而内毒素反应曲线为S型特征曲线,β-葡聚糖反应曲线为经过0点的斜线。如下图:
鲎试剂的特异性(专属性)差的另一种表现,是将其它物质(如β-葡聚糖)判定为内毒素,错误将合格药品判为不合格,造成制药厂直接经济损失。
例如在山东省青州某制药厂,该药厂生产5%葡萄糖注射液(规格:100ml 产品批号:0307040101)内毒素限量是合格的,但是用某公司的鲎试剂检验却是阳性。该产品经我厂(湛江海洋生物制品厂)通过凝胶法检验是合格的。我们对这种现象进行研究分析,认为应从鲎试剂的特异性方面考察。我们通过定量检测,对这一批药品的反应数据、反应曲线和反应速率曲线进行研究分析,认为该批药品内毒素检测合格,验证了凝胶法结论的正确性,为该制药厂挽回经济损失。
通过以上几个方面的分析,干扰试验结果时稀释几倍能排除干扰并不重要,而对内毒素的检出能力(鲎试剂的特异性)才是最关键的,也是判定鲎试剂质量的唯一标准。
三、污染的全面理解
通过以上几个方面的分析,我们应认识到内毒素的污染只是其中之一,污染物的种类很多,影响情况也很复杂,比如样品中的药品及其它成分影响了样品的PH值、鲎试剂的特异性、内毒素的活性等。这些污染物可能对鲎试剂与内毒素反应产生增强和抑制作用,其中以抑制作用为主。试验环境(检验室空气洁净度、温度和湿度等)和操作程序都可能引起试验结果的差异,应引起大家的注意。
问题在于,虽然乙醇能破乳并在一定浓度一下没有干扰,但我的产品本身存在干扰。在稀释倍数已经不能再大的情况下,参照药典的说明进行了过滤后(滤头用的是milipore的无菌无热源的专用滤头),就不存在干扰了。
可是对于验证的做法存在疑问,方法一,按05版SOP的方法,制备4λ工作标准品和2倍样品等比混合,得到的“2λ/供试品”为阳性,即没有干扰,方法二,按课题组长的提议制备400λ及供试品原液(稀释200倍后成为供试品)混合,共同稀释200倍后,得到的“2λ/供试品”为阴性,即有干扰。(两种方法均过滤)
另外,我单独验证了过滤环节,不存在干扰。这样的试验重复了好几次,结果无一例外。
分析下来,很有可能内毒素被吸附了,在样品稀释倍数较大的情况下,吸附不明显。像这种情况应该选择那种方法?按照药典规范操作样品的确是合格的。
范文四:细菌内毒素检查法
附录Ⅺ E 细菌内毒素检查法
本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素,以判断
供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法,即凝胶法和光度测定法,后者包括浊度法
和显色基质法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果
有争议时,除另有规定外,以凝胶法结果为准。
细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成,用于标定、复核、仲
裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价,用于
试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于 0.015EU/ml(用于凝胶法)或
0.005EU/ml(用于光度测定法)且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。
试验所用的器皿需经处理,以去除可能存在的外源性内毒素。常用干热灭
菌法(250℃、30 分钟以上)去除,也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的
适宜方法。若使用塑料器械,如微孔板和与微量加样器配套的吸头等,应选用标
明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。
供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制
成供试品溶液。一般要求供试品溶液的 pH 值在 6.0~8.0 的范围内。对于过酸、 过碱或本身有缓冲能力的供试品,需调节被测溶液(或其稀释液)的 pH 值,可 使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节 pH 值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用 水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定 药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公
式确定:
L=K/M
式中 L 为供试品的细菌内毒素限值,以 EU/ml、EU/mg 或 EU/U(活性单位)表 示;
K 为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量。以 EU/(kg·h)表示,
注射剂 K=5EU/(kg·h),放射性药品注射剂 K=2.5EU/(kg·h),鞘内用
注射剂 K=0.2EU/(kg·h)。
M 为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量,以 ml/(kg·h)、mg/(kg·h) 或 U/(kg·h)表示,人均体重按 60kg 计算,注射时间若不足 1 小时,按
1 小时计算。若供试品按体表面积给药,M=(最大给药剂量/m2/h×1.62m2)
/60kg。
按人用剂量计算限值时,如遇特殊情况,可根据生产和临床用药实际情况做 必要调整,但需说明理由。
确定最大有效稀释倍数(MVD) 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶 液被允许稀释的最大倍数,在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检 测。用以下公式来确定 MVD:
MVD=cL/λ
式中 L 为供试品的细菌内毒素限值;
c 为供试品溶液的浓度,当 L 以 EU/ml 表示时,则 c 等于 1.0ml/ml,当 L
以 EU/mg 或 EU/U 表示时,c 的单位需为 mg/ml 或 U/ml。如供试品为注射 用无菌粉末或原料药,则 MVD 取 1,可计算供试品的最小有效稀释浓度 c= λ/L;
λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml),或是在光度测定法中所使 用的标准曲线上最低的内毒素浓度。 方法 1 凝胶法
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素 的方法。
鲎试剂灵敏度复核试验 在本检查法规定的条件下,使鲎试剂产生凝集的内 毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用 EU/ml 表示。当使用新批号的鲎试
剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时,应进行鲎试剂灵敏度复核 试验。
根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ),将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素 工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解,在旋涡混合器上混匀 15 分钟,然后制 成 2λ、λ、0.5λ和 0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液,每稀释一步均应在旋
涡混合器上混匀 30 秒钟。取分装有 0.1ml 鲎试剂溶液的 10mm×75mm 试管或复溶
后的 0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿 18 支,其中 16 管分别加入 0.1ml 不同浓度
的内毒素标准溶液,每一个内毒素浓度平行做 4 管;另外 2 管加入 0.1ml 细菌内
毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后,封闭管口,垂直放入
37℃±1℃的恒温器中,保温 60 分钟±2 分钟。
将试管从恒温器中轻轻取出,缓缓倒转 180°\u65292X若管内形成凝胶,并且凝胶
不变形、不从管壁滑脱者为阳性;未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管
壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
当最大浓度 2λ管均为阳性,最低浓度 0.25λ管均为阴性,阴性对照管为阴
性,试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值,即为鲎试剂灵敏度
的测定值(λc)。
λc=lg-1(∑X/4)
式中 X 为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素
浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc 在 0.5λ~2λ(包括 0.5λ和 2λ)时,方可用于细菌内毒素检查,
并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
干扰试验 按表 1 制备溶液 A、B、C 和 D,使用的供试品溶液应为未检验出
内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液,按鲎试剂灵敏度复核试验项
下操作。
只有当溶液 A 和阴性对照溶液 D 的所有平行管都为阴性,并且系列溶液 C 的结果
在鲎试剂灵敏度复核范围内时,试验方为有效。按下式计算系列溶液 C 和 B 的反
应终点浓度的几何平均值(Es 和 Et)。
Es=lg-1(∑Xs/4)
Et=lg-1(∑Xt/4)
式中 Xs、Xt 分别为系列溶液 C 和溶液 B 的反应终点浓度的对数值(lg)。
当 Es 在 0.5λ~2λ(包括 0.λ和 2λ)及 Et 在 0.5Es~2Es(包括 0.5Es
和 2Es)时,认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于 MVD 的稀
释倍数下对试验有干扰,应将供试品溶液进行不超过 MVD 的进一步稀释,再重复
干扰试验。
表 1 凝胶法干扰试验溶液的制备
编号
内毒素浓度/配制内毒
稀释用液
稀释倍 所含内毒素
平行管数
素的溶液 无/供试品溶液
数
的浓度
A
- 供试品溶液
-
- 2λ
2
B
2λ/供试品溶液
1
4
2
1λ 0.5λ
4
4
4
8
0.25λ
4
C
2λ/检查用水
检查用水
1
2λ
4
2 4
1λ 0.5λ 0.25λ
4 4
8
4
D 无/检查用水 -
- - 2
注:A 为供试品溶液;B 为干扰试验系列;C 为鲎试剂标示灵敏度的对照系列;D 为阴性对照。
可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法(如过滤、中
和、透析或加热处理等)排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰
且不会使内毒素失去活性,要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶
液进行干扰试验。
当进行新药的内毒素检查试验前,或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查
法时,须进行干扰试验。
当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影
响试验结果的变化时,须重新进行干扰试验。
检查法
(1)凝胶限量试验
按表 2 制备溶液 A、B、C 和 D。使用稀释倍数为 MVD 并且已经排除干扰的供
试品溶液来制备溶液 A 和 B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表 2 凝胶限量试验溶液的制备
编号
内毒素浓度/配制内毒素的溶液
平行管数
A 无/供试品溶液 2
B
2λ/供试品溶液
2
C
2λ/检查用水
2
D 无/检查用水 2
注:A 为供试品溶液;B 为供试品阳性对照;C 为阳性对照;D 为阴性对照。
结果判断 保温 60 分钟±2 分钟后观察结果。若阴性对照溶液 D 的平行管
均为阴性,供试品阳性对照溶液 B 的平行管均为阳性,阳性对照溶液 C 的平行管
均为阳性,试验有效。
若溶液 A 的两个平行管均为阴性,判供试品符合规定;若溶液 A 的两个平行
管均为阳性,判供试品不符合规定。若溶液 A 的两个平行管中的一管为阳性,另
一管为阴性,需进行复试。复试时,溶液 A 需做 4 支平行管,若所有平行管均为
阴性,判供试品符合规定;否则判供试品不符合规定。
(2)凝胶半定量试验
本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按表 3 制备
溶液 A、B、C 和 D。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
结果判断 若阴性对照溶液 D 的平行管均为阴性,供试品阳性对照溶液 B
的平行管均为阳性,系列溶液 C 的反应终点浓度的几何平均值在 0.5λ~2λ之
间,试验有效。
系列溶液 A 中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ,为每个系列的反应终
点浓度,所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度
〔按公式 c=lg-1(∑X/2)〕。如果检验时采用的是供试品的稀释液,则计算原始
E
溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。
如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性,应记为内毒素浓度小于λ(如
果检验的是稀释过的供试品,则记为小于λ乘以供试品进行半定量试验的初始稀
释倍数)。如果供试品溶液的所有平行管均为阳性,应记为内毒素的浓度大于或
等于最大的稀释倍数乘以λ。
表 3 凝胶半定量试验溶液的制备
编号
内毒素浓度/配制内
稀释用液
稀释倍
所含内毒素的
平行管数
毒素的溶液
A
无/供试品溶液
检查用水
数
浓度
1 — 2
2
—
2
4
—
2
8
— 2λ
2
B
2λ/供试品溶液
1
2
C
2λ/检查用水
检查用水
1
2λ
2
2
1λ
2
4 8
0.5λ 0.25λ
2 2
D 无/检查用水 —
— — 2
注:A 为超过 MVD 并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至
1 倍、2 倍、4 倍和 8 倍,最后的稀释倍数不得超过 MVD。
B 为含 2λ浓度标准内毒素的溶液 A(供试品阳性对照)。
C 为含 2λ、1λ、0.5λ和 0.25λ浓度标准内毒素的检查用水系列。
D 为阴性对照。
若内毒素浓度小于规定的限值,判供试品符合规定。若内毒素浓度大于或等
于规定的限值,判供试品不符合规定。
方法 2 光度测定法
光度测定法分为浊度法和显色基质法。
浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含
量的方法。根据检测原理,可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据
反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度或透光率)之间存
在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到
达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间,或是检测浊度增加速度的方法。
显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底
物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理,分为终点显色
法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时
释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法
是检测反应混合物的色度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间,或检测
色度增长速度的方法。
光度测定试验需在特定的仪器中进行,温度一般为 37℃±1℃。
供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等,参照所 用仪器和试剂的有关说明进行。
为保证浊度和显色试验的有效性,应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供
试品的干扰试验。
标准曲线的可靠性试验 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可
能会影响检验结果的改变时,需进行标准曲线的可靠性试验。
用标准内毒素配成溶液,制成至少 3 个浓度的稀释液(相邻浓度间稀释倍数
不得大于 10),最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混
匀时间同凝胶法,每一浓度至少做 3 支平行管。同时要求做 2 支阴性对照。当阴
性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间,将全部数据进行线性回归
分析。
根据线性回归分析,标准曲线的相关系数(r)的绝对值应大于或等于 0.980, 试验方为有效。否则须重新试验。
干扰试验 选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度(设为λm),作 为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度。按表 4 制备溶液 A、B、C 和 D。
表 4 光度测定法干扰试验溶液的制备
注:A 为稀释倍数不超过 MVD 的供试品溶液。
B 为加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知内毒素浓度的,且与溶液 A 有相同稀释倍数的供试品
溶液。
C 为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的,用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。
D 为阴性对照。
按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液
的内毒素含量 c和 c,再按下式计算该试验条件下的回收率(R)。
s
t
R=(c-c)/λm×100%
s
t
当内毒素的回收率在 50%~200%之间,则认为在此试验条件下供试品溶液
不存在干扰作用。
当内毒素的回收率不在指定的范围内,须按“凝胶法干扰试验”中的方法
去除干扰因素。并重复干扰试验来验证处理的有效性。
当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何
有可能影响试验结果的变化时,须重新进行干扰试验。
检查法
按“光度测定法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。
使用系列溶液 C 生成的标准曲线来计算溶液 A 的每一个平行管的内毒素浓
度。
试验必须符合以下三个条件方为有效:
(1)系列溶液 C 的结果要符合 “标准曲线的可靠性试验”中的要求;
(2)用溶液 B 中的内毒素浓度减去溶液 A 中的内毒素浓度后,计算出的内
毒素的回收率要在 50%~200%的范围内;
(3)溶液 D 的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间。
结果判断 若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后,小
于规定的内毒素限值,判供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值,判
供试品不符合规定。
注:本检查法中,“管”的意思包括其他任何反应容器,如微孔板中的孔。
范文五:细菌内毒素检查法
受控号:
细菌内毒素检查法
颁发部门: 质量保证部 生效日期: 年 月 日
分发清单: 质量控制部
1 目的
为确保药品检验的准确有效,建立细菌内毒素检查法的标准操作规程。 2 范围
适用于细菌内毒素的检查。 3 定义与缩写
3.1细菌内毒素检查法:本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法,内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。 3.2细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品:除另有规定外,应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。
3.3细菌内毒素检查用水:系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。 4 职责
4.1 质量控制部QC人员:
负责执行本规程。 4.2 QC主管:
负责监督本规程的实施。 5 内容 5.1设备用具
5.1.1实验设备:电热干燥箱(250℃以上)、内毒素凝胶法测定仪(37±1℃)、旋涡混合器。 5.1.2实验用具:刻度吸管、吸耳球、试管、试管架、封口胶、砂轮、75%酒精棉球、金属直镊、秒表、记号笔、取样瓶、可调微量移液器及配套玻璃吸头。
5.2试剂:鲎试剂(其标示值用λ表示)、内毒素工作标准品、内毒素检查用水。 5.3试验准备
5.3.1洗液的配制:称取重铬酸钾200g,用少许热水溶解后,加浓硫酸至5000ml。 5.3.2 玻璃器皿的洗涤:将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗
液中泡至少4小时取出将洗液滤干,用自来水将残余的洗液洗净,再用新鲜蒸馏水冲后置适宜的密闭金属容器,迅速置烤箱中。
5.3.3除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素:玻璃器皿置烤箱后经250℃干烤30分钟以上,除去热原。 5.4 鲎试剂灵敏度复核试验
5.4.1在本检查法规定的条件下,使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时,应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
5.4.2根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ),将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解,在旋涡混合器上混合15分钟,然后制成2.0λ,1.0λ, 0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液,每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。取分装0.1mL复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支,其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液,每一个内毒素浓度平行做n管;另外 2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后封闭管口,垂直放入37℃±1℃的恒温器中,保温60分钟±2分钟。
5.4.3将试管从恒温器中轻轻取出,缓缓倒转180°,若管内形成凝胶,并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性,未形成凝胶或者形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动,造成假阴性结果。
5.4.4当最大浓度2.0λ管均为阳性,最低浓度0.25λ管均为阴性,阴性对照管为阴性,试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值,即为鲎试剂灵敏度的测定值 (λC)。
λC =antilg (∑X/n)
式中 X为反应终点内毒素浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λC在0.5λ~2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时,方可用于细菌内毒素检查,并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。每批新的鲎试剂在用于试验前都要进行灵敏度的复核。 5.5 供试品干扰试验
5.5.1按鲎试剂灵敏度复核试验项下每浓度平行管各2管,用细菌内毒素检查用水和未检出内毒素的供试品溶液或其不超过最大有效稀释倍数(MVD)的稀释液分别将同一支细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品2.0λ,1.0λ,0.5λ和0.25λ四种浓度的内毒素溶液。用细菌内毒素检查用水和用供试品溶液或其稀释液制成的每一浓度平行做4支,另取细菌内毒素检查用水和供试品溶液或其稀释液各做2支阴性对照管。如最大浓度管2.0λ均为阳性,最低浓度0.25λ管均为阴性,阴性对照管均为阴性时,按下式计算用细菌内毒素检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(Es)和用供试品溶液或其稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(Es)。
Es=antilg (∑Xs/2) Et= antilg (∑Xt/4)
式中 Xs、Xt分别为细菌内毒素检查用水和供试品溶液或其稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对为反应终点内毒素浓度的对数值(lg)。
5.5.2d 当供试品管和阴性对照管都为阴性,并且Es在0.5λ~2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时,实验有效。Et在0.5λ~2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时,则认为供试品在该浓度下不干扰试验,否则使用更灵敏的鲎试剂,对供试品进行更大倍数稀释或采用其他适合排除干扰作用的方法。当鲎试剂、供试品的来源、供试品的配方或生产工艺有变化时,须重新进行干扰试验。 5.6检查法:
5.6.1用75%酒精棉球擦拭台面,打开内毒素凝胶法测定仪的开关,使温度恒定在(37±1)℃。 5.6.2 用75%酒精棉球擦手消毒。 5.6.3 内毒素阳性对照溶液的制备:
5.6.3.1 取内毒素工作标准1支,用砂轮在瓶颈易折点上部轻轻滑痕,用75%酒精棉球擦拭消毒后开启。
5.6.3.2用刻度吸管吸取1ml内毒素检查用水,加入到内毒素工作标准品中,用封口胶封口,置旋涡混合器至少混合15min,作为内毒素标准品溶液。用砂轮在瓶颈易折点处滑痕,用75%酒精棉球擦拭消毒后开启。再从中取出适量,逐步稀释成2.0λ浓度的内毒素溶液,作为内毒素阳性对照溶液。
5.6.4 供试品溶液的配制:
5.6.4.1 供试品的最大有效稀释倍数(MVD)的计算:
MVD=CL/λ
式中:L为供试品的细菌内毒素限值 C为供试品溶液的浓度,其中当 L以 EU/ml表示时,C为 1.0ml/ml,当 L以 EU/mg或 EU/u表示时,C的单位为 mg/ml或 u/ml。 5.6.4.2取供试品适量,加入内毒素检查用水,按最大有效稀释倍数定量稀释成供试品溶液。 5.6.5供试品阳性对照液的配制:从前面的内毒素标准品溶液中取出适量,加入适量的供试品溶液,稀释成浓度为2.0λ浓度的供试品阳性对照液。 5.6.6以内毒素检查用水作为阴性对照液。
5.6.7 取0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓶8支,用砂轮在瓶颈易折点处轻轻滑痕,用75%酒精棉球擦拭消毒后开启,每支中均加入细菌内毒素检查用水0.1ml, 8支鲎试剂安瓶均如此操作。
5.6.7.1 向其中2支中各加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照管。 5.6.7.2向其中2支中各加入0.1ml供试品溶液作为供试品管。
5.6.7.3向其中2支中各加入0.1ml供试品阳性对照液作为供试品阳性对照管。 5.6.7.4向其中2支中各加入0.1ml2.0λ浓度的内毒素阳性对照液作为阳性对照管。 5.6.7.5打开内毒素凝胶法测定仪的盖子,将安瓶中溶液轻轻混匀后,迅速将8支安瓶垂直放入(37±1)℃内毒素凝胶法测定仪中,保温(60±2)分钟。 5.6.8结果判断:
5.6.8.1将安瓶从测定仪中轻轻取出,缓缓倒转180°时,按安瓶内凝胶不变形,不从管壁滑脱者为阳性,记录为(+);凝胶不能保持完整,并从管壁滑脱者为阴性,记录为(-)。 5.6.8.2若阳性对照的2管均为(+),供试品阳性对照的2管均为(+),阴性对照的2管均为(-),试验有效;阳性对照为(-)或供试品阳性对照为(-)或阴性对照为(+)均认为试验无效。
5.6.8.3供试品2管均为(-)应认为符合规定,如2管均为(+)应认为不符合规定。 5.6.8.4如两管中1管为(+),1管为(-)按上述方法另取4支供试品管复试;4管中有1管为(+)即认为供试品不符合规定。
6 引用文件
《中国药典2015四部》通则1143 7 记录与附录 无。 8 变更记载