范文一:桂花多糖的提取及含量测定方法研究
龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn
桂花多糖的提取及含量测定方法研究
作者:冯程程 王思明
来源:《科技资讯》2013年第03期
摘 要:目的:利用溶剂法从桂花中提取出多糖,并对其含量进行测定。方法:使用乙醇对桂花进行脱脂处理,继用热水提取,醇析后得粗多糖,使用三氯乙酸除去蛋白质得精制多糖。利用多糖类化学成分在硫酸作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糠醛衍生物,后者和苯酚缩合成有色化合物的特性,以葡萄糖作为标准品,采用苯酚-硫酸法,在紫外分光光度计490 nm处其测定吸光度,绘制标准曲线。取适量精制多糖,按测定标准曲线同样方法测其吸光度值,根据公式计算出桂花的多糖含量。结果:采用苯酚-硫酸法对多糖的含量进行了测定,测得平均结果为34%。结论:水提醇沉法制得桂花粗多糖;TLA法除去蛋白质得精制多糖。苯酚-硫酸法对其多糖含量进行测定,结果令人满意。
关键词:桂花 多糖 提取分离
中图分类号:R284 文献标识码:A 文章编号:1672-3791(2013)01(c)-0087-01 1 仪器试剂
1.1 仪器
RE-52A 旋转蒸发仪器 上海亚荣生化仪器厂
SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司
UV-757CRT型紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司
KDM型调温电热套 鄄城华鲁电热仪器有限公司
1.2 试剂
分析醇95%、固体氢氧化钠,无水乙醇、丙酮、三氯乙酸、苯酚、铝片、硫酸、葡萄糖、桂花、(以上试剂为分析纯)
2 实验方法
2.1 桂花多糖的粗提取
2.1.1 溶剂提取法
范文二:百合多糖的提取及含量测定方法
第8期(总第253期)2011年8月农产品加工·学刊
Academic Periodical of Farm Products Processing No.8Aug.
文章编号:1671-9646(2011)08-0100-02
百合多糖的提取及含量测定方法
惠秋沙
(山东中医药大学,山东济南250014)
摘要:百合多糖是百合主要的有效成分,在药用和食用方面有着广泛的应用前景,综述了百合多糖的提取和含量测
定方法。
关键词:百合;多糖;提取;含量测定
文献标志码:A doi :10.3969/jissn.1671-9646(X ).2011.08.026中图分类号:TS241
Extraction and Content Determination of Lily Polysaccharide
Hui Qiusha
(Shandong University of Traditional Chinese M edicin ,Ji'nan ,Shandong 250014,China )
Abstract :The lily polysaccharide is the main effective component in lily, it has the widespread application prospect in for medicinal purposes and the edible aspect. This paper makes a summary to the lily polysaccharide extraction and the content determination method.
Key words :lilium brownii ;polysaccharides ;extraction ;content determination
百合是百合科百合属的多年生草本球根植物,百合品种很多,大多供观赏,少数品种可作为蔬菜食用和药用。百合味甘、微苦,性微寒,入心肺经,化学成分有淀粉、蛋白质、脂肪和活性多糖等,具有润肺止咳、清心安神的作用。水溶性成分多糖还能够作用于机体的细胞免疫系统,促进细胞免疫功能[1-2]。百合多糖的提取与测定已有很多报道,现对其进行下归纳总结。1
百合多糖的提取方法
1.1回流提取
热水回流提取法是目前最常用的方法。一般可将百合破碎后置于热水中浸渍,采用回流等辅助提取,然后经乙醇沉淀离心获取,提取的最佳工艺为:温浸温度65℃,溶剂体积15倍量,浸提3次,浸提时间4h [3]。该法在提取中方法简便、设备要求低、成本低廉,但操作时间长且提取效率低。1.2超声提取法
超声波提取过程是一个物理过程,利用超声波产生的强烈振动、高加速度、强烈的空化效应和搅拌作用等加速药物有效成分进入溶剂,从而提高了提取效率,缩短了提取时间,节约了溶剂,低温提取有利于有效成分的保护,是提取天然产物有效成
收稿日期:2011-05-25
分的较好手段。超声波法提取百合:称取一定量的百合粉末,加入蒸馏水在沸水浴中回流提取3次,滤去百合渣,合并提取液,减压浓缩至原溶液的25%,加入5倍量无水乙醇沉淀,得到多糖粗品。将多糖粗品溶解,采用Sevag 法除去蛋白质,得到百合多糖[4]。利用此方法对多糖进行提取,可以提高产率,是值得推广的方法。1.3酶法
滕利荣等人[5]研究了复合酶法提取百合多糖的最佳条件,发现复合酶法能显著提高百合多糖的提取率,可达31.03%。酶法选用纤维素酶、果胶酶、胰酶按2∶2∶1组成的复合酶系,提取百合多糖的最佳条件为:浸提液pH 值7.0,浸提温度50℃,酶促反应时间90min 。复合酶法提取百合多糖具有条件温和、杂质易除、提取率高和生物活性高等特点。利用酶法提取百合的研究很少,该方法虽然提取率高,但因为酶的特点具有很多局限性。如提取条件易受酶的种类、温度、pH 值等的影响。2
百合多糖的含量测定
2.1滴定法
由于多糖易分解为还原性单糖,故可采用滴定法对其进行定量测定。一般地可通过将多糖水解为
作者简介:惠秋沙(1952-),女,江苏人,副教授,研究方向:药物分析、中药复方及保健食品。
2011年第8期惠秋沙:百合多糖的提取及含量测定方法
·101·
单糖后以次甲级蓝为指示剂,滴定碱性酒石酸铜溶液,经计算得到其含量。近年来,也有学者[6]采用间接碘量法测定药物中总多糖的含量,试验证明,该法与苯酚硫酸法所得的结果基本一致,且操作简单合理,适合用于常量分析。但多糖在百合中含量较少,提取率也不高,此法只适用于理论研究。2.2紫外分光光度法
紫外分光光度法是目前测定百合多糖最常用的方法,且回收率高、误差较小、灵敏度和准确度较高。该法以葡萄糖为对照品,样品被水解为单糖后经显色剂显色,并在一定波长下测定其含量,常用的测定方法有苯酚硫酸法[7]、蒽酮硫酸法[8]和DNS [9]法,其中蒽酮硫酸法最易受蛋白的影响, 在测多糖时需要进行脱蛋白处理,所以在操作过程中相对苯酚硫酸法繁琐。
2.3高效液相色谱法
高效液相色谱法具有高效、高灵敏度、应用范围广、分析速度快及载液流速快等特点,目前,高效液相色谱法已经被广泛的运用到中药中多糖的含量测定。
2.4薄层色谱法
薄层色谱法可用于测定多糖的含量[10],该法对仪器要求不高,操作方便,但近年来已被测定更准确的紫外分光光度法和操作更简单的高效液相色谱法所代替。
2.5毛细管电泳法
毛细管电泳法是一种新兴的测定药物多糖含量的方法[11]。现代试验证明,该法用于多糖的组成分析, 精密度高,操作方便,可有效提高其分析效率及成果。3
结论与展望
起的方法,因其提取效率高,不会破坏天然产物的有效成分,将会被越来越多地运用。在酶提取法中,对于百合多糖的提取,酶还可以加入其他的酶,或是改变酶的比例来进行有效提取。超声辅助提取可以将超声波提取与微波辅助提取结合起来,这样能更进一步地提高提取率。
(2)测定多糖含量的方法亦有很多种,其中应用最为广泛的是紫外分光光度法,也是最常用的测定方法。近年来,高效液相色谱法、毛细管电泳法在测定过程中的优点也逐渐显露出来。这些新兴的方法将会被用于百合多糖含量的测定实验与研究中来,应用前景十分广阔。参考文献:
[1]
张继敏,匡永清,吴少华,等. 百合多糖对小鼠免疫功能的影响[J]. 中国中医药科技,1996(增刊):15-17. [2]苗明三,杨林莎. 百合多糖免疫兴奋作用[J]. 中药药理
与临床,2003,19(1):15-16.
[3]杨琳莎,李玉贤,李秋杰,等. 百合多糖提取、纯化工
艺优选[J]. 中医研究,2005,18(1):25-27.
[4]禹文峰,任凤莲,吴晓斌. 百合多糖的超声波提取工艺
研究[J]. 广州化学,2007,32(2):35-37.
[5]滕利荣,孟庆繁,刘培源. 酶法提取百合多糖及其体外
抗氧化活性[J]. 吉林大学学报,2003(4):538-542. [6]赵阳楠,常继东. 苯酚硫酸法和间接碘量法测定灵芝多
糖含量比较[J]. 食用菌,2007(3):58.
[7]张锦文. 紫外分光光度法测定枸杞中多糖含量[J]. 亚
太传统医药,2008,4(1):31.
[8]王黎明,夏文水. 蒽酮-硫酸法测定茶多糖含量的研
7):185-188. 究[J]. 食品科学,2005,26(
[9]王红英,钱斯日古楞. 3,5-二硝基水杨酸比色法测定麦
冬多糖含量[J]. 沈阳农业大学学报,2005,36(5):628-630.
[10]王亚娟,冯旭东. 双波长薄层扫描法测定乌灵胶囊中多
糖的含量[J]. 数理医药学杂志,2008,21(1):108. [11]高现朝,马宏伟. HPCE 法分析百合多糖的单糖组成[J].
中国实验方剂学杂志,2009,15(8):27.
(1)在百合多糖的提取中,沸水回流提取法是
传统的方法,超声辅助提取和酶提取法是最近刚兴
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
2011年中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会学术年会,拟定于2011年9月23-25日在重庆举行,届时来自全国农产品加工行业管理的各级领导,中外著名专家学者,科研院所、大专院校,龙头企业负责人将参加大会。
大会将举办主题报告、专题研讨、博士论坛、论文交流、院企互动、成果推介、机械设备及产品展览,充分展示全国农产品贮藏加工科技与食品安全新理念、新技术、新装备和现代物流等新成果,为行业交流、产学研结合和科技推广搭
2011年中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会学术年会暨全国食品科学与工程博士生学术论坛
9月23日—25日
重庆
建重要的舞台。
主办单位:中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会、西南大学研究生部。
承办单位:西南大学食品科学学院、企业集团。
支持单位:重庆市科
委、重庆市农委、重庆市商委、重庆市技术监督局、重庆市食品与药品监督管理局、重庆市卫生监督所、重庆出入境检验检疫局。
联系人:赵竹娟、雷德君邮箱:yflaiyi822@126.com 电话:023-68251298
传真:023-6825194
范文三:桂花多糖的提取及含量测定方法研究
摘 要:目的:利用溶剂法从桂花中提取出多糖,并对其含量进行测定。方法:使用乙醇对桂花进行脱脂处理,继用热水提取,醇析后得粗多糖,使用三氯乙酸除去蛋白质得精制多糖。利用多糖类化学成分在硫酸作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糠醛衍生物,后者和苯酚缩合成有色化合物的特性,以葡萄糖作为标准品,采用苯酚-硫酸法,在紫外分光光度计490 nm处其测定吸光度,绘制标准曲线。取适量精制多糖,按测定标准曲线同样方法测其吸光度值,根据公式计算出桂花的多糖含量。结果:采用苯酚-硫酸法对多糖的含量进行了测定,测得平均结果为34%。结论:水提醇沉法制得桂花粗多糖;TLA法除去蛋白质得精制多糖。苯酚-硫酸法对其多糖含量进行测定,结果令人满意。
关键词:桂花 多糖 提取分离
中图分类号:R284 文献标识码:A 文章编号:1672-3791(2013)01(c)-0087-01
1 仪器试剂
1.1 仪器
RE-52A 旋转蒸发仪器 上海亚荣生化仪器厂
SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司
UV-757CRT型紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司
KDM型调温电热套 鄄城华鲁电热仪器有限公司
1.2 试剂
分析醇95%、固体氢氧化钠,无水乙醇、丙酮、三氯乙酸、苯酚、铝片、硫酸、葡萄糖、桂花、(以上试剂为分析纯)
2 实验方法
2.1 桂花多糖的粗提取
2.1.1 溶剂提取法
从植物中提取多糖的常用方法是溶剂提取法。用水作溶剂时,可以用热水浸煮和冷水浸提提取多糖。或利用高浓度乙醇沉淀提纯不溶于高浓度乙醇的多糖;还可利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离。
2.1.2 多糖粗提过程
三份桂花等量干燥品,加95%乙醇8、6、6倍量分别回流提取3 h、3 h、2 h,药渣置通风处晾干,热水浴(90℃~100℃)10、8、8倍量依次提取3.5 h、2.5 h、2 h,过滤,合并滤液,浓缩至1/3,调含醇量至80%,静置过夜,抽滤得沉淀,依次用无水乙醇、丙酮洗涤,得粗多糖。
2.2 桂花多糖的精制
2.2.1 脱除蛋白质
本实验采用三氯乙酸法(TLA)。此法的不足是会引起某些多糖的降解。
2.2.2 脱色
一般可用弱碱性树脂DEAE纤维素吸附色素,若被DEAE纤维素吸附可进行氧化脱色。
2.2.3 多糖的精制过程
取粗多糖加水溶解至100 ml,加入等体积30%三氯乙酸溶液脱蛋白,静置2 h,离心,上清液用0.01 mol/L氢氧化钠调pH=7,溶液减压浓缩至适当体积,用95%乙醇调含醇量至80%,放置,沉淀用无水乙醇,丙酮,无水乙醚依次洗涤,真空干燥,得除蛋白精制多糖。
2.4 桂花多糖的含量测定
2.4.1 苯酚-硫酸法原理
多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解,产生单糖分子,并脱水成糠醛衍生物,衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应,生成橙黄色物质,在波长490 nm处和一定浓度范围内,其吸光度A值与糖浓度C呈线性关系,从而可用比色法测定含量。
2.4.2 标准溶液的配制
精密称取105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖适量,配得试验浓度为0.08 mg/ml的标准溶液。
2.4.3 供试品贮备液的配制
精密称取干燥的精制样品适量,配得试验浓度为0.08 mg/ml的待测溶液。
2.5 测定条件选择
2.5.1 苯酚及硫酸用量选择
分别吸取供试品液和对照品液测其A值,从苯酚液加入量达到某一值开始,A值基本保持不变,说明苯酚液量达到该值以上时,反应都能完成。另取根据A的稳定性,计算硫酸的最佳加入体积。
3 实验结果
3.1 多糖粗提
称取三份等量的桂花药品标记为1、2、3号,以不同的条件进行回流。得三份滤渣,称三份重量。
1号8.7900 g。
2号9.2158 g。
3号9.7766 g。
将三份药品以不同的条件提取,得三份滤液合并三份滤液282 ml。浓缩至1/3,即30 ml。浓缩后,用80%乙醇沉淀出多糖,过滤得粗品4.0732 g。
3.2 活性炭脱色
使用活性炭粉末趁热过滤。结果表明,活性炭对桑椹多糖的脱色效果不明显。
3.3 多糖精制
用三氯乙酸离心除去蛋白质后,得上清液约为172 ml。用浓度0.01 mol/L氢氧化钠调溶液至中性。浓缩后,以80%乙醇沉淀出多糖,过滤得精品3.2139 g。
3.6 标准溶液的配制
对比试验证明,浓度0.08 mg/ml的标准溶液,在紫外分光光度计490 nm处,吸光度值线性效果最好。
实验现象:多糖或寡糖生成橙黄色物质。颜色随浓度增大而加深。
3.7 标准曲线的绘制
3.7.1 绘制原理
用分光光度计在波长490 nm处测定吸光度。以A值对浓度C绘制标准曲线,进行线性回归,得标准曲线方程:A=aC+b。
回归方程:A=0.0125C+0.0162R2=0.9985
3.8 待测溶液的配制
待测溶液的配制方法与葡萄糖标准溶液的配制方法相同。
实验现象:有橙黄色物质生成且颜色随浓度增大而加深。
多糖含量%=CDf/W×100,式中C为样品溶液的葡萄糖的浓度(μg·ml-1),D为样品溶液的稀释因素,f为换算因素,W为样品的重量(μg)。
测得平均结果为34%。
4 讨论
本实验利用多糖类化学成分在硫酸作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糠醛衍生物,后者和苯酚缩合成有色化合物的特性,用分光光度测定含量。
在两次提取多糖实验中总结出应将活性炭脱色放在离心除去蛋白质之前。因活性炭粉末过细,未过滤干净的部分在离心过程中进一步净化。
如果供试品溶液有较深的颜色,溶液中有其它组分在波长490 nm处有吸收,则可采用导数法测定含量。
以葡萄糖为对照、采用苯酚-硫酸法测多糖含量时关键的操作环节是显色。本试验即以490 nm处的吸收值大小为指标,考察主要因素对缩合反应影响。结果表明,苯酚和浓硫酸的用量、反应温度和时间对测定结果的影响并无显著意义。
5 结论
本实验用水提醇沉法对桂花中的多糖进行提取。用三氯乙酸除去蛋白质得精品。在多糖含量测定过程中,采用苯酚-硫酸法进行含量测定,效果明显。
参考文献
[1] 朱石金,李平途,叶树范.茉莉花多糖的提取及含量测定[J].海峡药学,2007,9(6):53-54.
[2] 陈怡.天然多糖的研究概况[J].深圳市药品检验所,2000,2(6):52-53.
[3] 任全进,朱洪武,于金平.桂花资源的利用价值[J].中国野生植物资源,2002,18(4):32-33.
[4] 李小平.红枣多糖提取工艺研究及其生物功能初探[D].西安:陕西师范大学,2004.
[5] 孙英,司黎.分光光度法测定桑椹中多糖含量[J].中国卫生检验杂志,2002,12(3):299.
范文四:亚硝基盐的测定方法及原理
(1)亚硝基氮测定
试剂配制
亚硝酸盐(NO 2-)标准贮备液:1000ug/mL。准确称取1.4998亚硝酸钠(125℃干燥24h ),溶于水,并定容至1000mL 。
亚硝酸盐标准使用液:10ug/mL。准确吸取5.00mL 亚硝酸盐的标准贮备液于500mL 容量瓶中,用水稀释至刻度,使用时稀释配制。
盐酸溶液(1+6):量取50mL 浓盐酸加入到300mL 水中,摇匀。
对氨基苯璜酸溶液:10g/L,称取5g 对氨基苯璜酸,容于350mL(1+6)盐酸溶液中,用水稀释至500mL ,此试剂可稳定数月。
盐酸N-(1-萘基)-乙二胺:1g/L,称取0.5g 盐酸N-(1-萘基)-乙二胺(C 10H 17NHCH 7CH 2NH 2·2HCL )溶于500mL 水中,贮存于棕色瓶中,在冰箱中保存。
此试剂可稳定数周,如变成深棕色则弃去,重新配制
标曲制作
取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL 亚硝基氮标准使用液放于50ml 比色管中,加蒸馏水至标线,再加1.0ml 对氨基苯璜酸溶液,混匀。加1.0ml 盐酸N-(1-萘基)-乙二胺后混匀。放置5min 后,在波长540nm 处,用光程10mm 比色皿,测量吸光度。由测得的吸光度,再减去零浓度空白管的吸光度得到校正吸光度,绘制由氨氮含量(mg )对校正吸光度的标准曲线。
(2)氨氮测定
原理:以游离态的氨或铁离子等形式存在的铵氮与纳氏试剂反应生成黄棕色络合物,该络合物的色度与铵氮的含量成正比,可用目视比色或者用分光光度法测定。
1、试剂配制
纳氏试剂:称取16g 氢氧化钠(NaOH) ,溶于50mL 水中冷至室温。称取7g 碘化钾(KI)和10g 碘化汞(HgI2) 溶于水中然后将此溶液在搅拌下缓慢地加入到氢氧
化钠溶液中并稀释至100mL 贮于棕色瓶内用橡皮塞塞紧于暗处存放有效期可达一年。
酒石酸钾钠溶液:称取50g 酒石酸钾钠(KNaC4H 6O 6. 4H 2O) 溶于100mL 水中加热煮
沸以驱除氨充分冷却后稀释至100mL 。
氨氮标准贮备溶液(C N =1000ug/mL):称取3.819±0.004g 氯化铵(100℃~105℃干燥2h) 溶于水中移入1000mL 容量瓶中稀释至刻度。
氨氮标准使用溶液(C N =10ug/mL):吸取10.00mL 铵氮标准贮备溶液于1000mL 容量瓶中稀释至刻度,临用前配制
标曲制作
取0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00mL 氨氮标准使用液放于50ml 比色管中,加蒸馏水至标线。用移液枪吸取1.0ml 酒石酸钾钠溶液,摇匀后再加入1.0ml 纳氏试剂,充分混匀。静置10min 后,在波长420nm 下,用光程10mm 比色皿,以无氨水清零,测量吸光度。由测得的吸光度,再减去零浓度空白管(空白管为无氨水添加显色剂)的吸光度得到校正吸光度,绘制由氨氮含量(mg/l)对校正吸光度的标准曲线
范文五:粗多糖测定方法的比较
一)苯酚法测定可溶性糖
【实验原理】
植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶
性糖的原理是:糖在浓硫酸作用下,脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合
成一种橙红色化合物,在10-100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比,且
在485nm波长下有最大吸收峰,故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于
甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定,方法简单,灵敏度高,实验时基本不受蛋白
质存在的影响,并且产生的颜色稳定160min以上。
【实验仪器及试剂】
1.仪器:分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸
水纸适量。
2.试剂:
(1)90%苯酚溶液:称取90g苯酚(AR),加蒸馏水10mL溶解,在室温下
可保存数月。
(2)9%苯酚溶液:取3mL 90%苯酚溶液,加蒸馏水至30mL,现配现用。
(3)浓硫酸(比重1.84)。
(4)1%蔗糖标准液:将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重,精确称取1.000g。加
少量水溶解,移入100mL容量瓶中,加入0.5mL浓硫酸,用蒸馏水定容至刻度。
(5)100ug/L蔗糖标准液:精确吸取1%蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶
中,加水定容。
【实验步骤】
1.标准曲线的制作: 取20mL刻度试管11支,从0-10分别编号,按表27
-1加入溶液和水,然后按顺序向试管内加入1mL 9%苯酚溶液,摇匀,再从管
液正面以 5-20s。加入5 mL浓硫酸,摇匀。比色液总体积为8 mL,在恒温下
放置30min。显色。然后以空白为参比,在485nm波长下比色测定,以糖含量
为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线,求出标准直线方程。
2.可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片,擦净表面污物,剪碎混匀,称取0.10-
0.30g,共3份,分别放入3支刻度试管中,加入5-10mL 蒸馏水,塑料薄膜封
口,于沸水中提取30min(提取2次),提取液过滤入25mL容量瓶中,反复冲
洗试管及残渣,定容至刻度。
3.测定吸取0.5mL样品液于试管中(重复2次),加蒸馏水1.5mL,同制作标
准曲线的步骤,按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液,显色并测定光密度。由标准
线性方程求出糖的量,按下式计算测试样品中糖含量。
式中:C一标准方程求得糖量(ug)
α一吸取样品液体积(mL)
V-提取液量(mL)
n一稀释倍数
W一组织重量(g)
可溶性糖含量(%)=从标准曲线查得糖的量(μg)×提取液体积(ml)×稀
释倍数/[测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106]×100
粗多糖的检验方法
1、方法原理
粗多糖在硫酸的作用下,水解成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,与苯酚
缩合成有色化合物,用分光光度法测定样品在粗多糖含量。
2、主要设备和仪器
设备721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)
试剂
葡萄糖标准液:精确称取105℃干燥恒重的标准葡萄糖0.1000g,置100mL容量瓶中加热蒸馏水溶解稀释至刻度,其浓度为1.0mg/mL,用稀释成浓度为0.1mg/mLd的标准工作液。
5%苯酚溶液:取苯酚100g,沙浴蒸馏,收集180℃-182℃溜分,称取此馏分5g,用水溶解后,定容至100mL棕色容量瓶中备用(现用现配)。
3、测定步骤
3.1、最大吸收波长的选择
精密吸取0.04mg/mL无水葡萄糖溶1.0 mL,置10mL具塞试管中,加入蒸馏水使体积为2.0mL,再加苯酚试液1.0mL,摇匀,迅速滴加浓硫酸5.0mL,摇匀后放置5min,置沸水浴中加热15min,取出后冷却至室温。以蒸馏水代替糖溶液如加上法配制空白。用721分光光度计在470-510nm测定吸光度,测定最大吸收波长为490±nm。
3.2、标准曲线的绘制
精密吸收浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准标准工作液0、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mL,分别置于10mL具塞试管中,各加蒸馏水使体积为2.0mL,再加苯酚试液1.0mL,摇匀,迅速滴加浓硫酸
5.0 mL,摇匀后放置5min,置沸水浴中加热15min,取出后冷却至室温。以蒸馏水代替糖溶液如上法配制空白。用721分光光度计,1cm比色皿,在490nm处测定吸光度,绘制葡萄糖浓度-吸光度工作曲线。结果浓度在0.010-0.04mg/mL范围内与吸光度呈现性关系。
回归方程Y=7.52×10-3X+1.13×10-3, Y=0.9997(n=6)。
3.3、含量测定
3.31、多糖的提取与精制 取300mL,用氟仿多次萃取,以除去蛋白质,加活性炭1%脱色,抽滤,滤液加入95%乙醇,使含醇量达80%,静置过夜。过滤,残渣用无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤,真空干燥,即得粗多糖。
3.32、供试液的配制 精密称取粗多糖粉末0.2000g,置于50mL容量瓶中,定容,摇匀,即得供试品溶液。
3.33、样品含量测定 精密度吸取供试品溶液2.0mL,按“标准曲线绘制”项下方法分别测定吸光度。
结果计算:
多糖含量(%)=(C·D)/V×100
式中:
C-供试液葡萄糖浓度(mg/mL);
D-代试液的稀释因素;
V-供试液体积(mL)。
粗多糖测定方法的研究
摘要:应用硫酸-苯酚比色法测食品中的粗多糖的含量而且分别用葡萄糖做标准品和用葡聚糖做标准品。结果表明前者测的结果稍偏高,大约高于4.8﹪。此方法简便快捷,准确度高,重现性好,可适用于各种粗多糖的测定。
关健词:枸杞多糖;灵芝多糖;分光光度法;
由十个以上单糖通过糖苷键连接而成的碳水化合物称为“多糖”。它一般都是天然高分子化合物。多糖包括活性多糖和膳食纤维两大类。活性多糖专指具有某种特殊生物活性的多糖化合物,如真菌多糖、植物多糖和壳聚糖等。这些多糖具有复杂的、多方面的生理活性和功能,如:免疫调节功能;抗肿瘤作用;延缓衰老作用;降血脂、抗血栓作用等功能[1-2],因而越来越引起人们的关注。 多糖的测定方法目前还没有国家规定的方法,文献报道的方法基本上是苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法,在作标准曲线大部分都是用葡萄糖来做标准品,而不是用葡聚糖(MW500,000),因为葡聚糖标准品在国内难于获得且价格昂贵。但是根据国内外大量研究资料表明:香菇、金针菇、云芝、冬草、夏草、灵芝、茯苓、猪苓中所含的具有增强免疫、抑制肿瘤、镇静、强心、消炎等生理活性的水溶性多糖均由β(1—3)或β(1—6)糖苷键连接葡聚糖构成主链和支链,有的甚至就是β-葡聚糖,那么用葡萄糖作标准品和用葡聚糖作标准品去测食品中的多糖含量时是否有差别且差别为多少,本文以枸杞多糖和灵芝多糖来进行上述实验。
1.材料与方法
1.1供试材料
枸杞多糖 由深圳思味特科技有限公司提供(多糖含量在40-60﹪,其含量由国家检测部门检测);
灵芝多糖 由深圳思味特科技有限公司提供(多糖含量在40-60﹪,其含量由国家检测部门检测);
葡聚糖(MW500,000) sigma公司;
1.2试剂
(1)铜储备液:
称取0.3gCuSO45H2O,3g柠檬酸钠,加水溶解并稀释至100ml,混匀,备用。
(2)铜试剂溶液:
取铜储备液50ml,加水50ml,混匀后加入固体无水硫酸钠12.5g并使其溶解。临用新配。
(3)洗涤剂:
取水50ml,加入10ml铜试剂溶液,10ml氢氧化钠溶液,混匀。
(4)乙醇溶液(80﹪):20ml水中加入无水乙醇80ml,混匀。
(5)氢氧化钠溶液(10﹪):
称取lOg氢氧化钠,加水溶解并稀释至100ml,加入固体无水硫酸钠至饱和,备
用。
(6)硫酸溶液:
取10ml浓硫酸加入到80ml左右水中,混匀,冷却后稀释至100ml。
(7)苯酚溶液(5﹪):
取苯酚100g,油浴蒸馏,收集180℃-182℃馏分。称取精制苯酚5.0g,加入溶解并稀释至100ml,混匀,溶液置冰箱中可保存一个月。
(8)葡萄糖/葡聚糖标准储备溶液:
精密称取在1050C于燥至恒重的葡萄糖/葡聚糖标准品1.0080g,加水溶解,并定容至100ml,混匀,置冰箱中保存。此溶液每ml含10.080mg葡萄糖/葡聚糖。
(9)葡萄糖/葡聚糖标准使用溶液:
吸取葡萄糖/葡聚糖标准储备溶液2.00ml,置于100ml容量瓶中,加水至刻度,混匀,置冰箱中保存。
1.3仪器
752C紫外分光光度计
离心机
旋转混匀器
1.4实验方法
1.4.1 葡萄糖标准曲线制备
精密吸取葡萄糖标准使用溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,(相当于葡萄糖0,0.04032,0.08064,0.12096,0.16128,0.2016mg)分别置于25ml比色管中,准确补充水至2.0ml,加入苯酚溶液2.0ml,在旋转混匀器上混匀,小心加入浓硫酸10ml,于旋转混匀器小心混匀,置沸水浴中煮沸15min,冷却后用分光光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比,1cm比色皿测定吸光度值。具体结果见表1。
表1 葡萄糖标准与浓度的关系
__________________________________________________________________ 标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
浓度(mg/ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
吸光度(A) 0 0.166 0.343 0.514 0.690 0.882
___________________________________________________________________ 以葡萄糖质量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘标准曲线(图1)。
图1 标准回归曲线方程图
其回归方程Y=4.4122X-0.0147,相关系数r=0.9996。
1.4.2 葡聚糖标准曲线制备
精密吸取葡聚糖标准使用溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,(相当于葡聚糖0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10mg)分别置于25ml比色管中,准确补充水至2.0ml,
用。
(6)硫酸溶液:
取10ml浓硫酸加入到80ml左右水中,混匀,冷却后稀释至100ml。
(7)苯酚溶液(5﹪):
取苯酚100g,油浴蒸馏,收集180℃-182℃馏分。称取精制苯酚5.0g,加入溶解并稀释至100ml,混匀,溶液置冰箱中可保存一个月。
(8)葡萄糖/葡聚糖标准储备溶液:
精密称取在1050C于燥至恒重的葡萄糖/葡聚糖标准品1.0080g,加水溶解,并定容至100ml,混匀,置冰箱中保存。此溶液每ml含10.080mg葡萄糖/葡聚糖。
(9)葡萄糖/葡聚糖标准使用溶液:
吸取葡萄糖/葡聚糖标准储备溶液2.00ml,置于100ml容量瓶中,加水至刻度,混匀,置冰箱中保存。
1.3仪器
752C紫外分光光度计
离心机
旋转混匀器
1.4实验方法
1.4.1 葡萄糖标准曲线制备
精密吸取葡萄糖标准使用溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,(相当于葡萄糖0,0.04032,0.08064,0.12096,0.16128,0.2016mg)分别置于25ml比色管中,准确补充水至2.0ml,加入苯酚溶液2.0ml,在旋转混匀器上混匀,小心加入浓硫酸10ml,于旋转混匀器小心混匀,置沸水浴中煮沸15min,冷却后用分光光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比,1cm比色皿测定吸光度值。具体结果见表1。
表1 葡萄糖标准与浓度的关系
__________________________________________________________________ 标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
浓度(mg/ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
吸光度(A) 0 0.166 0.343 0.514 0.690 0.882
___________________________________________________________________ 以葡萄糖质量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘标准曲线(图1)。
图1 标准回归曲线方程图
其回归方程Y=4.4122X-0.0147,相关系数r=0.9996。
1.4.2 葡聚糖标准曲线制备
精密吸取葡聚糖标准使用溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,(相当于葡聚糖0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10mg)分别置于25ml比色管中,准确补充水至2.0ml,
加入苯酚溶液2.0ml,在旋转混匀器上混匀,小心加入浓硫酸10ml,于旋转混匀器小心混匀,置沸水浴中煮沸15min,冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比,1cm比色皿测定吸光度值。具体结果见表2。
表2 葡聚糖标准与浓度的关系
______________________________________________________________________
标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
浓度(mg/ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
吸光度(A) 0 0.083 0.171 0.256 0.352 0.456
__________________________________________________________________ 以葡聚糖质量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线(见图2)。
图2 标准回归曲线方程图
其回归方程Y=4.635X-0.0145,相关系数r=0.9983。
1.5样品的测定
1.5.1样品提取
称取混合均匀的含粗多糖样品(M)2.0g,置于100ml(V1)容量瓶中,加水80ml左右,于沸水浴上加热2h,冷却至室温后补加水至刻度,混匀,过滤,滤液供沉淀多糖。
1.5.2沉淀粗多糖
精密取1.5.1项下滤液4.0ml(V2)(作四组平行实验)或液体样品(V2)4.0ml(即被测多糖就是液体而不是固体样品)置于50ml离心管中,加入无水乙醇16ml,混匀后,以4000rpm离心15min,弃去上清液。沉淀用乙醇溶液数毫升洗涤,离心后弃去上清液,反复3-4次操作。接下来沉淀用水溶解并定容至5.0ml(V3),混匀后,供沉淀葡聚糖。
1.5.3沉淀葡聚糖
精密取1.5.2项溶液2ml(V4)置于20ml离心管中,加入NaOH溶液2.0ml,铜试剂溶液2.0ml,沸水浴中煮沸3min,冷却后以4000rpm离心15min,弃去上清液。沉淀用洗涤剂数毫升洗涤,离心后弃去上清液,反复3次操作后,沉淀用硫酸溶液2.0ml溶解并转移至50ml(V5)容量瓶中,加水稀薄至刻度,混匀。此溶液为样品测定液。
1.5.4 测定
精密取1.5.3项的样品测定液2.0ml(V6)置于25ml比色管中,加入苯酚溶液2.0ml,在旋转混合器上混匀后,小心加入浓硫酸10.0ml后于旋转混合器上混匀后,置于水浴中煮沸10min,冷却至室温用分光光度计在490nm波长处,以试剂空白为参比,1cm比色皿测定吸光度值,同时做样品空白实验。从葡萄糖/葡聚糖标准曲线上查出葡萄糖/葡聚糖质量,再计算样品中粗多糖含量(见表3)。
表3.以葡萄糖计和以葡聚糖计来确定粗多糖含量
_________________________________________________________________________________
编号 吸光度 样品中枸杞多糖含量(mg/g) 样品中灵芝多糖含量(mg/g) ______________ ________________________ _____________________ 枸杞多糖 灵芝多糖 以葡萄糖计 以葡聚糖计 以葡萄糖计 以葡聚糖计 1 0.150 0.146 0.453 0.431 0.423 0.403
2 0.145 0.148 0.440 0.417 0.429 0.408
3 0.139 0.142 0.423 0.402 0.413 0.394
4 0.150 0.151 0.453 0.431 0.437 0.416
___________________________________________________________________________________
2.计算公式
X=(W1-W2)×V1×W3×W5/M×V2×V4×V6
式中: X-----样品中粗多糖含量(以葡萄糖/葡聚糖计),mg/g
W1----样品测定液中葡萄糖/葡聚糖质量,mg
W2--- 样品空白液中葡萄糖/葡聚糖质量,mg
M----样品质量,g
V1----样品提取液总体积,ml
V2---沉淀粗多糖所用样品提取液体积,ml
V3----粗多糖溶液体积,ml
V4---沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液体积,ml
V5---样品测定液总体积,ml
V6---测定用样品测定溶液体积,ml
3.稳定性试验
样品显色后,每隔一定时间测定吸光度,结果见表4。
表4 吸光度稳定性试验
________________________________________________________________________________
时间 10min 20min 30min 1h 1.5h 2h
A 0.150 0.151 0.148 0.151 0.150 0.147
____________________________________________________________________________________
结果表明,该显色反应稳定。
4.回收率测定(采用加样回收法)
吸取多糖样品溶液0.5ml,分别加入标准葡萄糖溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml,分别置于25ml试管中,各加水1ml,加入苯酚溶液2ml,缓缓加浓硫酸10ml于旋
转混匀器小心混匀,置沸水浴中煮沸15min,冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比,1cm比色皿测定吸光度值。结果显示回收率是93.15-99.7﹪。
5.小结
(1)由表3可知,用葡萄糖来做标准品和用葡聚糖做标准品测食品中的粗多糖含量时,前者测的结果稍偏高,大约高4.8﹪,但葡聚糖标准品的价格昂贵且在国内难于买到,故可以用葡萄糖来代替葡聚糖做标准品。
(2)食品中分子量>10000的高分子物质在80﹪乙醇溶液中沉淀,与水溶性单糖和低聚糖分离,用碱性二价铜试剂选择性的从其它高分子物质中沉淀具有葡聚糖结构的多糖,粗多糖在硫酸的作用下,水解成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,与苯酚缩合成有色化合物,用分光光度法测定样品在粗多糖含量。
(3)此方法可很好的用于食品中粗多糖含量的测定,因为不需要对多糖进行纯化和脱色处理。
(4)洗涤粗多糖沉淀时,一定要将离心管壁上玷污的其它糖分和碳水化合物用80%乙醇洗净,否则结果会受影响。
参考文献:
[1]方积年,多糖的研究现状,药学学报,1986,21(12):944-949
[2]刘美琴,灵芝多糖的研究进展,微生物学通报,1998,25(3):173 STUDY ON CONTENT DETERMINATION OF CRUDE POLYSACCHARIDE
Hu Juwu,Fan Qingsheng xiao xiaonian
(Sino-Germen Joint Research Institute,The key Laboratory of Food Science of MOE,Nanchang University,Nanchang,330047 )
Abstract:The content of crude Polysaccharides were determinated by the means of UV spectrophotometry and using the criterion of Glucose and the criterion of dextran,respectively.The result is showed: the former’s result is higher than the latter’s and the method is
simple,rapid ,accurate and reproducible and can be used to many Polysaccharides.
Key words:Ganoderma Lucidum Polysaccharide;Lycium Barbarum
Polysaccharide; UV spectrophotometry;
粗多糖的测定方法
1. 原理
分子量大于10,000道尔顿的多糖经80%乙醇沉淀后,加入碱性铜试剂,选择性地从其他高分子物质中沉淀出葡聚糖,沉淀部分与苯酚-H2SO4反应,生成有色物质,在485nm条件下,有色物质的吸光度值与葡聚糖浓度成正比。
2. 适用范围
参照AOAC方法。适用于检测含有分子量大于10,000道尔顿葡聚糖的样品。
3.仪器
(1) 分光光度计
(2) 离心机
(3) 旋转混匀器
(4) 恒温水浴锅
4.试剂
除特殊说明外,实验用水为蒸馏水,试剂为分析纯。
(1) 80%乙醇:800ml无水乙醇加水200ml。
(2) 2.5 mol/L NaOH溶液:100 g NaOH加蒸馏水稀释至1 L,加入固体无水硫酸钠至饱和。
(3) 铜贮存液:称取3.0 g CuSO4 ·5H2O,30.0 g柠檬酸钠加水溶解至1 L。溶液可贮存2周。
(4) 铜应用溶液:取铜贮存液50 ml,加水50 ml混匀后加入无水硫酸钠12.5 g,临用新配。
(5) 洗涤液:取水50 ml,加入10 ml铜应用溶液,10 ml 2.5 mol/L NaOH溶液,混匀。
(6) 1.8 mol/L H2SO4:取100ml浓硫酸用水稀释至1L。
(7) 20 g/L苯酚溶液:称取2.0g苯酚,加水溶解并稀释至100ml,混匀备用。
(8)葡聚糖标准液:称取500mg葡聚糖(分子量500,000D)于称量皿中,105℃干燥4h至恒重,置于装有干燥硅胶的干燥器中冷却。准确称取100mg干燥后的葡聚糖,用水定容至100ml,葡聚糖标准浓度为1.0mg/ml。
(9) 葡聚糖标准应用液:吸取葡聚糖标准液10ml,用水稀释10倍,葡聚糖终浓度为0.1mg/ml。
5. 操作方法
5.1 样品处理
(1) 样品提取:称取样品1~5g,加水100ml,沸水浴加热2h,冷却至室温,定容至200ml(V1),混匀后过滤,弃初滤液,收集余下滤液。
(2) 沉淀高分子物质:准确吸取上述滤液100ml(V2),置于烧杯中,加热浓缩至10ml,冷却后,加入无水乙醇40ml,将溶液转至离心管中以3000rpm离心5min,弃上清液,残渣用80%乙醇洗涤3次,残渣供沉淀葡聚糖之用。
(3) 沉淀葡聚糖:上述残渣用水溶解,并定容至50ml (V3),混匀后过滤,弃初始滤液后,取滤液2.0ml(V4),加入2.5mol/L NaOH2.0ml,Cu应用溶液2.0ml,沸水浴中煮沸2mim,冷却后以3000rpm离心5min,弃上清液,残渣用洗涤液洗涤3次,残渣供测定葡聚糖之用。
(4) 测定葡聚糖:上述残渣用2.0mL 1.8mol/LH2SO4溶解,用水定容至100mL(V5)。准确吸取2.0ml(V6),置于25ml比色管中,加入1.0ml苯酚溶液,10ml浓硫酸,沸水浴煮沸2分钟,冷却比色。从标准曲线上查得相应含量,计算粗多糖含量。
5.2 标准曲线制备:
精密吸取葡聚糖标准应用液0.10,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.50,2.00ml(分别相当于葡聚糖0.01,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.15,0.20mg),补充水至2.0mL,加入苯酚溶液1.0ml,浓硫酸10ml,混匀,沸水浴2分钟,混匀,沸水浴2分钟,冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比,测定吸光度值
(A),以葡聚糖浓度为横坐标,A为纵坐标绘制标准曲线。
6.计算
从标准曲线上查得样品相应含量,计算粗多糖含量。
葡聚糖( % ) =
c× V5×V3×V1×0.1
=
c× 250
………………………
(1 )
V6×V4×V2×m
m
公式中:c--从标准曲线上查得样品测定管中葡聚糖含量,mg;
V1--样品提取时定容体积,ml;
V2--沉淀高分子物质取液量,ml;
V3 --沉淀葡聚糖时定容量,ml;
V4 --沉淀葡聚糖时取液量,ml;
V5 --测定葡聚糖时定容体积,ml;
V6 --样品比色管中取样液体积,ml;
m--样品称量质量,g;
0.1--将mg/g 换算成g/100g 的系数。
7.注意事项
(1) 苯酚-H2SO4溶液可以和多种糖类进行显色反应,常用于总糖的测定。所以测定过程中应注意容器及试剂中其他糖类的干扰。
(2)苯酚-H2SO4溶液和不同类的糖反应,显色的强度略有不同,反映在标准曲线的斜率不同。如果已知样品中糖的结构,应尽量以同类糖的纯品做标准品,或以含
有已知浓度的同类产品做对照品进行检测分析;如果样品中糖的类型未知或结构多样,则只能以葡萄糖计或其他糖计报告结果。
(3) 试验证明葡萄糖、果糖等单糖,蔗糖、乳糖等双糖、低聚糖--棉子糖,淀粉、糊精等多糖及甜味剂糖精不干扰粗多糖测定。
转载请注明出处范文大全网 » 桂花多糖的提取及含量测定方法