范文一:微生物限度检测方法验证
微生物限度验证 1.概述 1.1试验背景
为保证微生物限度检验结果的准确可靠,当建立产品的微生物限度检查法时,应进行方法的试验,以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计,所采用的方法适合于该产品的微生物限度检查。按照《中国药典》2015年版要求,检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时,检查方法应进行重新试验。
根据15年版药典及药品微生物实验室质量管理指导原则要求,检测环境由原来的为C级背景下局部A级空气单向流,变更为在C级背景下,生物安全柜中进行微生物限度检测, 试验用菌株有原来的大肠埃希菌变更为铜绿假单胞菌、接种用培养基随之发生变化;实验组及对照组制备发生变更。现针对纯化水微生物限度试验方法确认,以证明所采用的方法适合该药品的微生物限度检查。 1.2方案说明
验证过程中严格按照经批准的方案规定的内容进行,若因特殊原因需要变更时,应填写方案变更申请及批准书(附件1),报验证领导小组批准。 2.试验目的及要求
按照《中国药典》2015年版规定对纯化水微生物限度检查方法进行试验,在现有检验程序、检测条件及培养条件下, 通过试验以确认所采用的方法适合于纯化水需氧菌的测定;根据样品特性制订检验方法和检验条件,按制定的方法进行试验,根据试验结果判断是否符合试验标准。 3.试验小组 4.风险分析: 4.1风险等级标准
A、严重程度(S):测定风险的潜在后果,主要针对可能危害产品质量、患者健康及数据完整性的影响,分为以下四级:
B、可能性程度(P):测定风险产生的可能性,为建立统一基线,建立以下四个等级:
C、检测能力(D):在潜在风险造成危害前,检测发现的可能性,设为以下四个等级:
4.2风险评估:根据确定的风险标准对已经识别并分析的风险进行评价,即通过评价风险的严重性和可能性从而确认风险的等级。 质量风险优先级别评价标准如下:
风险优先系数(RPN)计算:严重程度(S)×可能性程度(P)×检测能力(D)。 4.2.1风险识别
1) 产品组分或组成发生改变 2) 检验程序与检验条件发生改变
3) 产品存在抗菌活性,抗菌活性的去除影响微生物的生长 4) 微生物检验用物料影响检验结果 4.2.2风险分析及评价
4.3 依据风险分析及评价结果需实施的确认项目 5.试验前准备 5.1文件确认
5.2.仪器确认:·
5.2.1确认检测设备已经检定并在有效期内使用。 5.2.2确认检测设备运行良好,且满足检测需要。
5.3培养基和冲洗液的确认
5.3.1确认培养基是否在有效期内使用 5.3.2确认培养基储存条件、性状符合要求。
5.4试验用菌株及菌种要求
6.试验步骤 6.1.需氧菌计数 6.1.1.菌液制备
1)铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌液制备:接种铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌工作用菌种1白金耳接种至10ml胰酪大豆胨液体培养基中,30~35℃培养18~24小时。取该新鲜培养液1ml加入至0.9%无菌氯化钠溶液中(规格:9ml/支),10倍梯度稀释至10~10,制成每1ml含菌数不大于100cfu的菌悬液。 试验步骤:
6.1.2.供试液的制备
供试品:纯化水 储存条件: ;
取样点1: ;取样点2: ;取样点3: ; 稀释剂:0.1%蛋白胨水溶液 方法: 试验组:
A) 灭菌吸管吸取5ml供试品加入电动吸引器滤杯中,加入无菌0.1%蛋白胨水溶液50ml进
行过滤,滤干后,将薄膜用镊子夹到已凝固的R2A琼脂培养基上。每个样品做两个平行样。
B)供试品对照组:取制备好的供试液, 以稀释液代替菌液同试验组操作。
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C)菌液对照组:取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液,按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。
D)计数方法适用性试验进行3次独立平行试验(分别使用不同取样点的纯化水),并分别计算各试验菌每次回收试验的比值。 可接受标准:
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5~2 范围内。
计数结果(CFU/皿):
6.1.3计数结果计算(回收试验比值): 计算公式:
试验菌回收试验比值=(试验组菌落数—供试品对照组菌落数)/菌液对照组菌落数
检查人: 检查日期: 复核人: 复核日期: 6.1.4计数方法适用性试验结果汇总与分析: 7.试验结果汇总与评价: 8.试验过程中的偏差处理 9.再试验周期:
9.1检验程序或产品发生变化时 9.2生产厂家或其生产工艺发生变化时 9.3阳性试验不成立时 10.批准 11.附件
附件1试验方案修改申请及批准书
附件2偏差汇总调查处理表 附件3培训记录
范文二:微生物限度检测
微生物限度检查法
录入时间:2006-7-6 15:25:25 来源:其它
微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法,包括染菌量及控制菌的检查。
供试品应随机抽样。一般抽样量为检验用量(2个以上最小包装单位)的3倍量。
检查的全过程,均应严格遵守无菌操作,严防再污染。
除另有规定外,本检查法中细菌培养温度为30~35℃,霉菌、酵母菌培养温度为25~28℃,控制菌培养温度为36℃±1℃。
检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位。
培养基及其制备方法
除另有规定外,培养基制备的灭菌条件为121℃20分钟。
1.营养琼脂培养基与营养肉汤培养基 见无菌检查法(附录Ⅺ H)。
2.玫瑰红钠琼脂培养基
胨 5g 玫瑰红钠 0.0133g 葡萄糖 10g
琼脂 15~20g 磷酸二氢钾 1g 水 1000ml
硫酸镁 0.5g
除葡萄糖、玫瑰红钠外,取上述成分,混合,加热溶化后,滤过,加入葡萄糖、玫瑰红钠,分装,灭菌。
3.酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)
胨 10g 琼脂 15~20g 酵母浸出粉 5g
水 1000ml 葡萄糖 20g
除葡萄糖外,取上述成分,混合,加热溶化后,滤过,加入葡萄糖,分装,灭菌。
4.胆盐乳糖培养基(BL)
胨 20g 磷酸二氢钾 1.3g 乳糖 5g
牛胆盐(或去氧胆酸钠0.5g)2g
氯化钠 5g
磷酸氢二钾 4.0g
除乳糖、牛胆盐外,取上述成分,混合,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2,煮沸,滤清,加入乳糖、牛胆盐,分装,灭菌。
5.曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)
营养琼脂培养基 100ml
曙红钠指示液 2ml
20%乳糖溶液 5ml
亚甲蓝指示液 1.3~1.6ml
取营养琼脂培养基,加热溶化后,冷至60℃,按无菌操作加入灭菌的其他3种溶液,摇匀,倾注平皿。
6.麦康凯琼脂培养基(MacC)
胨 20g 1%中性红指示液 3ml
乳糖 10g 琼脂 15~20g
牛胆盐 5g 水 1000ml
氯化钠 5g
除乳糖、指示液、牛胆盐及琼脂外,取上述成分,混合,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余各成分,摇匀,分装,灭菌,冷至约60℃,倾注平皿。
7.4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronide,MUG)培养基
胨 10g 磷酸二氢钾 0.9g 硫酸铵 5g
磷酸氢二钠(无水) 6.2g
酸锰 0.5mg
亚硫酸钠 40mg
硫酸锌 0.5mg
去氧胆酸钠 1g
硫酸镁 0.1g
MUG 75mg
氯化钠 10g
氯化钙 50mg
除MUG外,各成分溶解于1000ml水中,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,加入MUG,溶解后,每管分装5ml,115℃灭菌20分钟。
8.三糖铁琼脂培养基(TSI)
胨 20g 硫酸亚铁 0.2g 牛肉浸出粉 5g
硫代硫酸钠0.2g 乳糖 10g 硫代硫酸钠 12.5ml
蔗糖 10g 琼脂 12~15g 葡萄糖 1g
水 1000ml 氯化钠 5g
除三糖、指示液、琼脂外,取上述成分,混合,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余各成分,摇匀,分装,灭菌,制成高底层(2~3cm)短斜面。
9.四硫磺酸钠亮绿培养基(TTB)
胨 5g 硫代硫酸钠 30g 牛胆盐 1g
水 1000ml 硫酸钙 10g
取上述成分,混合,微温使溶解,灭菌。
临用前,取上述培养基,每10ml加入碘溶液(取碘6g与碘化钾5g,溶于20ml水中)0.2ml和亮绿试液0.1ml,混匀。
10.沙门、志贺菌属琼脂培养基(SS)
胨 5g 硫代硫酸钠 8.5g 牛肉浸出粉 5g
中性红指示液 2.5ml
乳糖 10g
亮绿试液 0.33ml
牛胆盐 8.5g
琼脂 20g
枸橼酸钠 8.5g
水 1000ml
枸橼酸铁铵 1g
除乳糖、指示液、琼脂外,取上述成分,混合,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.2±0.1,滤过,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余各成分,摇匀,灭菌,冷至60℃,倾注平皿。
11.胆盐硫乳琼脂培养基(DHL)
胨 20g 枸橼酸钠 1g 牛肉浸出粉 3g
枸橼酸铁铵 1g 乳糖 10g 中性红指示液 3ml
蔗糖 10g 琼脂 18~20g 去氧胆酸钠 1g
水 1000ml 硫代硫酸钠 2.3g
除糖、指示液及琼脂外,取上述成分,混合,微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.2±0.1,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余成分,摇匀,冷至60℃,倾注平皿。
12.溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基
胨 10g
溴化十六烷基三甲铵 0.3g
牛肉浸出粉 3g
琼脂 15~20g
氯化钠 5g
水 1000ml
除琼脂外,取上述成分,混合,微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.5±0.1,加入琼脂,加热溶化后,分装,灭菌,冷至60℃,倾注平皿。
13.亚碲酸盐肉汤培养基
临用前,取灭菌的营养肉汤培养基,每100ml中加入新配制的1%亚碲酸钠(钾)试液0.2ml,混匀,即得。
14.卵黄氯化钠琼脂培养基
胨 6g
10%氯化钠卵黄液 100ml
牛肉浸出粉 1.8g
琼脂 23g
氯化钠 30g
水 650ml
除10%氯化钠卵黄液外,取上述成分混合,微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.6±0.1,灭菌,待冷至约60℃,以无菌操作加入10%氯化钠卵黄液,充分振摇,倾注平皿。
10%氯化钠卵黄液的制备 取新鲜鸡蛋1个,以无菌操作取出卵黄,放入10%灭菌氯化钠溶液100ml中,充分振摇,即得。
15.甘露醇氯化钠琼脂培养基
胨 10g
酚磺酞指示液 2.5ml
牛肉浸出粉 1g
琼脂 15~20g
甘露醇 10g
水 1000ml
氯化钠 75g
除甘露醇、指示液及琼脂外,取上述成分混合,微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2,加入琼脂,加热溶化后,滤过,分装,灭菌,冷至60℃,倾注平皿。
16.蛋白胨水培养基
胰蛋白胨 10g
水 1000ml
氯化钠 5g
取上述成分,混合,加热溶化,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,分装于小试管,灭菌。
17.磷酸盐葡萄糖胨水培养基
胨 7g
磷酸氢二钾 3.8g
葡萄糖 5g
水 1000ml
取上述成分,混合,微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,分装于小试管,121℃,灭菌15分钟。
18.枸橼酸盐培养基
氯化钠 5g
枸橼酸钠(无水) 2g
硫酸镁 0.2g
溴麝香草酚蓝指示液 20ml
磷酸氢二钾 1.0g
琼脂 15~20g
磷酸二氢铵 1g
水 1000ml
除指示液和琼脂外,取上述成分,混合,微温使溶解,调节pH值使灭菌后为6.9±0.1,加入琼脂,加热溶化,加入指示液,混匀,分装于小试管,灭菌,置成斜面。
注:所用琼脂应不含游离糖,用前用水浸泡冲洗。
19.糖、醇发酵培养基
基础液 胨 10g
0.5%酸性品红指示液 10ml
糖、醇 0.5%
(或溴麝香草酚蓝指示液6ml)
氯化钠 5g
水 1000ml
取胨和氯化钠加入水中,微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.4,加入指示液,混匀,分装每瓶100ml,121℃灭菌15分钟。
配制葡萄糖发酵培养基时,于100ml基础液加入0.5g葡萄糖,分装于含杜氏管(Durham)的小试管中,121℃灭菌15分钟。配制其他糖、醇发酵培养基时,将各种糖、醇分别配成10%溶液,与基础液同时于121℃灭菌15分钟。以无菌操作将5ml糖、醇溶液加入100ml基础液内,分装于灭菌小试管中。
注:糖、醇溶液亦可采用薄膜过滤法除菌。
20.脲(尿素)琼脂培养基
胨 1g
0.2%酚磺酞指示液 6ml
葡萄糖 1g
20%无菌脲溶液 100ml
氯化钠 5g
琼脂 20g
磷酸二氢钾 2g
水 1000ml
除脲和琼脂外,取上述成分,混合,调节pH值使灭菌后为7.2±0.1,加入琼脂,加热溶化并分装于锥形瓶,灭菌,冷至50~55℃,加入无菌脲溶液,混匀,分装于灭菌试管中,置成斜面。
21.氰化钾培养基
胨 3g
磷酸氢二钠 5.64g
氯化钠 5g
氰化钾试液 15ml
碳酸二氢钾 0.225g
水 1000ml
除氰化钾试液外,取上述成分,混合,调节pH值使灭菌后为7.5±0.1,灭菌,冷却后,加入氰化钾试液,分装于12mm×100mm灭菌试管内,每管4ml,立即用灭菌橡胶塞塞紧,置4℃保存。同时,以不加氰化钾试液的培养基作为对照培养基,分装于灭菌试管中。
22.赖氨酸脱羧酶试验培养基
胨 5g
1.6%溴甲酚紫指示液 1ml
酵母浸出粉 3g
L-赖氨酸(DL-赖氨酸) 0.5(1)g
葡萄糖 1g
水 1000ml
除赖氨酸外,取上述成分,混合,加热溶解后,加入L-赖氨酸(DL-赖氨酸),调节pH值使灭菌后为6.8,同时以不加赖氨酸培养基作为对照。分装于灭菌的小试管内,每管2.5ml并滴加一层液体石蜡,121℃灭菌10分钟。
23.绿脓菌素(pyocyanin)测定用培养基(PDP琼脂)
胨 20g
甘油 10ml
氯化镁(无水) 1.4g
琼脂 18~20g
硫酸钾 10g
水 1000ml
取胨、氯化镁和硫酸钾加入水中,微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,加入甘油及琼脂,加热溶化,混匀,分装于试管,灭菌,置成斜面。
24.明胶培养基
胨 5g
明胶 120g
牛肉浸出粉 3g
水 1000ml
取上述成分加入水中,浸泡约20分钟,随时搅拌,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,分装于小试管,灭菌。
25.硝酸盐胨水培养基
胨 10g
亚硝酸钠 0.5g
酵母浸出粉 3g
水 1000ml
硝酸钾 2g
取胨和酵母浸出粉加入水中,微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,加入硝酸钾和亚硝酸钠溶解,混匀,分装于含杜氏管的小试管,灭菌。
试药牛肉浸出粉 Beef extract powder
本品为米色粉末,在水中溶解。
牛胆盐 Ox bile salt
本品为淡黄色或黄棕色粉末,味苦而甜,具吸湿性,在水和醇中易溶。
玫瑰红钠(四氯四碘荧光素钠) Rose bengal〔C20H2Cl4Na2O5=1017.6〕本品为棕红色粉末。在水中溶解,溶液呈紫色,无荧光;在硫酸中溶解,溶液为棕色。
枸橼酸铁铵 Ammonium ferric citrate〔C12H22FeN3O14=488.16〕
本品为棕红色或绿色鳞片或粉末,易潮解,见光易还原成亚铁。在水中溶解,在醇和醚中不溶。 胰蛋白胨 Tryptone
本品为米黄色粉末,在水中溶解。
液状石蜡 Paraffin liquid
本品为无色油状液体。在水和醇中不溶,能与醚、苯、三氯甲烷、二硫化碳和油类相混溶。
DL-赖氨酸 DL-Lysine〔C6H14N2O2=146.19〕
本品为白色结晶,极易潮解。在水中溶解。
L-赖氨酸 L-Lysine〔C6H14N2O2=146.19〕
本品为白色针状结晶,在空气中易吸收二氧化碳。在水中易溶,在醇中微溶,在醚中不溶。
酸性品红 Fuchsin acid〔C20H17N3Na2O9S3=585.54〕
本品为绿色有金属光泽的颗粒或深红色粉末。在水中溶解,在醇中不溶。
磷酸二氢铵 Ammonium dihydrogen phosphate〔NH4H2PO4=115.03〕
本品为无色结晶或白色结晶性粉末。在水中溶解,在乙醇中不溶。
试液二盐酸二甲基对苯二胺试液 取二盐酸二甲基对苯二胺0.1g,加水10ml,即得。需新鲜少量配制,于冷处避光保存,如试液变成红褐色,不可使用。
无菌对氨基苯甲酸试液 取对氨基苯甲酸0.1g,加入含10ml水的带塞试管中,121℃灭菌20分钟。 亚碲酸钠(钾)试液 取亚碲酸钠(钾)0.1g,加新鲜煮沸后冷至50℃的水10ml使溶解。
玫瑰红钠试液 取玫瑰红钠试液0.1g,加水使溶解成75ml。
无菌枸橼酸钠-氯化钠试液 取枸橼酸钠0.5g,加0.9%氯化钠溶液10ml,121℃灭菌20分钟。 草酸铵试液 取草酸铵1g,加水溶解使成100ml。
亮绿试液 取亮绿0.1g,加水100ml使溶解。
氢氧化钾试液 取氢氧化钾40g,加水溶解使成100ml。
盐酸试液 取盐酸8.4ml,加水稀释成100ml。
α-萘酚乙醇试液 取α-萘酚6.0g,加无水乙醇溶解使成100ml。
氰化钾试液 取氰化钾0.5g,加水溶解使成100ml。
氯化三苯四氮唑试液 取氯化三苯四氮唑0.1g,加水溶解使成10ml。
靛基质试液 取对二甲氨基苯甲醛5.0g,加入戊醇(或丁醇)75ml,充分振摇,使完全溶解后,再取浓盐酸25ml徐徐滴入,边加边振摇,以免骤热导致溶液色泽变深,或取对二甲氨基苯甲醛1.0g,加入95%乙醇95ml,充分振摇,使完全溶解后,取浓盐酸20ml徐徐滴入。
稀释剂0.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g,加水溶解使成1000ml,121℃灭菌20分钟。
无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液 取1ml聚山梨酯80,加0.9%氯化钠溶液使成100ml,121℃灭菌20分钟。 无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2) 取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g,加水稀释至1000ml,121℃灭菌20分钟。
指示液
中性红指示液 取中性红1.0g,研细,加95%乙醇60ml使溶解,再加水至100ml。
变色范围 pH6.8~8.0(红→黄)。
甲基红指示液 取甲基红0.1g,加95%乙醇300ml,使溶解后,加水至500ml,即得。
亚甲蓝指示液 取亚甲蓝0.5g,加水溶解使成100ml。
酚磺酞指示液 取亚甲蓝0.5g,加1mol/L氢氧化钠溶液2.82ml,使溶解,再加水至100ml。
变色范围 pH6.8~8.4(黄→红)。
溴甲酚紫指示液 取溴甲酚紫1.6g,加95%乙醇溶解使成100ml。
变色范围 pH5.2~6.8(黄→紫)。
溴麝香草酚蓝指示液 取溴麝香草酚蓝0.4g,加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解,再加水至100ml。 变色范围 pH6.0~7.6(黄→蓝)。
酸性品红指示液 取酸性品红0.5g,加水100ml使溶解,再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml,每加1滴均应将溶液充分摇匀后再加第2滴,直至溶液呈草黄色;于沸水内保持15分钟,再静置2小时,滤过,即得。
变色范围 pH6.0~7.4(黄→红)。
曙红钠指示液 取曙红钠2.0g,加水溶解使成100ml。
供试品的检验量 每批供试品检验量一般为10g或10ml。化学膜剂为100cm2,贵重的或微量包装的供试品
检验量可以酌减,但口服药品不得少于3g,外用药品不得少于5g。
供试品须取自2个以上的包装单位,大蜜丸、膜剂除须取自2个以上的包装单位外,应取自4丸(片)以上样品。
供试液的制备
按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。
1.液体供试品 取供试品10ml,加入稀释剂90ml中,混匀,作为供试液。油剂可加适量聚山梨酯80;气雾剂以适宜方法使抛射剂导出后,加入适量稀释剂,混匀,吸取相当于10g或10ml供试品,再稀释成100ml作为供试液;合剂(系指含王浆或蜂蜜者,下同)与滴眼剂可用供试品作为供试液。
2.固体、半固体或黏稠液供试品 称取供试品10g,置0.9%无菌氯化钠溶液100ml中,用匀浆仪或其他适宜方法,混匀后,作为供试液。在制备过程中,必要时可加适量聚山梨酯80,并适当加温,但不应超过45℃。
(1)非水溶性供试品 取供试品5g(5ml),加入含溶化的无菌司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g混合物的烧杯中,用无菌玻棒搅拌成团后,慢慢加入45℃左右的0.9%无菌氯化钠溶液约80ml,边加边搅拌,使供试品充分乳化,作为供试液(1∶20)。
(2)不溶于水的膜剂供试品 取规定量,剪碎,加稀释剂100ml(必要时可增加稀释剂),浸泡,振摇,作为供试液。
(3)肠溶胶囊(片)供试品 称取供试品10g,置含无菌磷酸盐缓冲液(pH6.8)100ml的锥形瓶内,于45℃水浴中,保温,振摇,使溶解,作为供试液。
3.含抑菌成分供试品 供试品如干扰控制菌检验,按以下方法处理后,依法检查。
(1)稀释法 将供试液种入较大量的培养基中,使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。
(2)离心沉淀集菌法 取规定量的供试液,离心(每分钟3000转)30分钟,弃去上清液,留底部集菌液约2ml,再稀释成原规定量的供试液。如有不溶性药渣,可先离心(每分钟500转)5分钟,取全部上层液,再行集菌处理。
(3)薄膜过滤法 取规定量的供试液,置稀释剂100ml中,摇匀,以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45μm±0.02μm微孔滤膜的过滤器内,减压抽干后,用稀释剂冲洗滤膜3次,每次50~100ml,取出滤膜备检。
(4)中和法 凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品,可用相应的试剂钝化活性因子,中和毒性后制成供试液。
对照用菌液
控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验。对照菌株为大肠杆菌〔CMCC(B) 44 102〕、沙门菌
〔CMCC(B) 50 094〕、铜绿假单胞〔CMCC(B) 10 104〕及金黄色葡萄球菌〔CMCC(B) 26 003〕。 取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至营养肉汤培养基内,培养18~20小时后,稀释至1∶106。对照菌的加入量为50~100个。
检查法
1.细菌、霉菌与酵母菌计数
(1)平皿菌落计数法 取均匀供试液,进一步稀释成1∶102、1∶103等适宜的稀释级。
分别取连续三级10倍稀释的供试液各1ml,置直径约90mm的平皿中,再注入约45℃的培养基约15ml,混匀,待凝固后,倒置培养,每稀释级应作2~3个平皿。
营养琼脂培养基用于细菌计数,玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。在特殊情况下,前者同时点计霉菌、酵母菌菌落数,后者同时点计细菌菌落数。酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。合剂用玫瑰红钠琼脂培养基与酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基分别测定霉菌、酵母菌菌落数,合并计数。液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基同时点计霉菌菌落数及酵
母菌菌落数。
菌数测定阴性对照试验 取供试验用的稀释剂各1ml,置4个无菌平皿中,分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板,培养,检查,不得长菌。
细菌培养时间为48小时,分别在24小时及48小时点计菌落数,一般以48小时菌落数为准,霉菌、酵母培养时间为72小时,分别在48小时及72小时点计菌落数,一般以72小时菌落数为准。菌落如蔓延生长成片,不宜计数。
点计后,计算各稀释级的平均菌落数,按菌数报告规则报告菌数。
菌数报告规则 细菌宜选取平均菌落数在30~300之间的稀释级,霉菌宜选取平均菌落数在30~100之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。如有1个稀释级在30~300(30~100)之间时,将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告;如同时有2个稀释级在30~300(30~100)之间时,按下式计算两级比值。
当比值≤2时,以两稀释级的均值报告,当比值>2时,以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告;如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30~300之间时,以后2个稀释级计算级间比值报告;如各稀释级的平均菌落数均不在30~300之间,以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告;如各稀释级平
均菌落数均在300(100)以上,按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告;如各稀释级平均菌落数均小于30时,一般按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。如当1∶10(或1∶100)稀释级平均菌落数等于或大于原液(或1∶10)稀释级时,应以培养基稀释法测定,按测定结果报告菌数。
(2)培养基稀释法 取供试液(原液或1∶10、1∶100供试液)3份,每份各1ml,分别注入5个平皿内(每皿各0.2ml)。每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml,混匀,凝固后,倒置培养,计数。每1ml注入的5个平板的菌落数之和,即为每1ml的菌落数,共得3组数据。以3份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。
如各稀释级平板均无菌落生长,或仅最低稀释级平均菌落数小于1时,则报告菌数为小于10个。
2.控制菌检查 除另有规定外,取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种,经增菌、分离培养后,进行革兰染色、生化试验与血清凝集试验等项检查。
(1)大肠杆菌(Escherichia coli) 取胆盐乳糖培养基3份,每份100ml,2份分别加入规定量的供试液,其中1份加入对照菌50~100个作阳性对照,第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。培养18~24小时(必要可延至48小时)。阴性对照应无菌生长。取上述3份的培养物各0.2ml,分别接种至5ml MUG培养基管内培养,分别于5小时与24小时时,取未接种的MUG培养基管作本底对照,将各管置365nm紫外光下观察。阳性对照管呈现荧光,MUG阳性。供试液的MUG管呈现荧光,MUG阳性;无荧光,MUG阴性。然后加数滴
靛基质试液于MUG管内,液面呈玫瑰红色为阳性,呈试剂本色为阴性。
当阴性对照呈阴性,阳性对照正常生长,供试液胆盐乳糖培养基培养液澄明,并证明无菌生长,判未检出大肠杆菌。供试液MUG阳性,靛基质阳性,判检出大肠杆菌;MUG阴性,靛基质阴性,判未检出大肠杆菌。 如MUG阳性、靛基质阴性,或MUG阴性、靛基质阳性,均应取供试液胆盐乳糖培养基培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板,培养18~24小时,如上述供试液培养物的分离平板无菌落生长,判未检出大肠杆菌。或有菌落生长,应挑选2~3可疑菌落作靛基质试验(I)、甲基红试验(M)、乙酰甲基甲醇生成试验(V-P)、枸橼酸盐利用试验(C)及革兰染色、镜检,按表1规定判断结果。
靛基质试验(I) 取可疑菌落或斜面培养物,接种于蛋白胨水培养基中,培养24小时,沿管壁加入靛基质试液数滴,液面呈玫瑰红色为阳性,呈试剂本色为阴性。
甲基红试验(M) 取可疑菌落或斜面培养物,接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中,培养48小时±2小时,于管内加入甲基红指示液数滴,立即观察,呈鲜红色或橘红色为阳性,呈黄色为阴性。
乙酰甲基甲醇生成试验(V-P) 取可疑菌落或斜面培养物,接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中,培养48小时±2小时,于每2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml,混匀,再加40%氢氧化钾溶液0.4ml,充分振摇,在4小时内出现红色为阳性,无红色反应为阴性。
枸橼酸盐利用试验(C) 取可疑菌落或斜面培养物,接种于枸橼酸盐培养基的斜面上,一般培养48~72小时,培养基斜面有菌落生长,培养基由绿色变为蓝色时为阳性,培养基颜色无改变为阴性。
结果判断见表1。对与MUG-Ⅰ反应不符的可疑菌株(见注①、②),应重新分离培养,再作生化试验证实。 表 1 MUG的结果判断
MUG-Ⅰ 曙红亚甲蓝琼脂 IMVic 结果
+ + 检出大肠杆菌
- - 未检出大肠杆菌
+ - 无菌生长 未检出大肠杆菌
+ - 有菌生长 -+--① 检出大肠杆菌③
- + 有菌生长 ++--② 检出大肠杆菌③
注:①、②如①出现++--或②出现-+--,均应重新分离菌株,再作MUG-Ⅰ和IMVic试验。③革兰阴性杆菌。
(2)沙门菌(Salmonella apecies) 取营养肉汤培养基3份,每份100ml,2份分别加入规定量的供试液,其中1份加入对照菌液作阳性对照,第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。培养18~24小时,阴性对照应无菌生长。取其余2份培养物各1ml,分别接种于四硫磺酸钠亮绿培养基10ml中,培养18~24小时。分别划线接种于胆盐硫乳琼脂(或沙门、志贺菌属琼脂)培养基和麦康凯琼脂(或曙红亚甲蓝琼脂)培养基的平板上,培养18~24小时或延至40~48小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时,供试品的平板无菌落生长,或有菌落但不同于表2所列特征时,可判为未检出沙门菌。
如供试品平板生长的菌落特征有与表2所列菌落形态特征相符或疑似者,均应挑选2~3个菌落分别接种于三糖铁琼脂培养基斜面上,阳性对照同时接种该培养基,培养18~24小时后,阳性对照的斜面应为红色,底层为黄色,硫化氢阳性,而供试品的疑似菌斜面未见红色、底层未见黄色,可判为未检出沙门菌。否则,应继续做以下试验。
表 2 沙门菌菌落形态特征
培 养 基 菌 落 形 态
胆盐硫乳琼脂 无色至浅橙色,半透明,菌落中心带黑色或
全部黑色或无黑色
沙门、志贺菌属琼脂 无色至淡红色,半透明或不透明,菌落中心
有时带黑褐色
曙红亚甲蓝琼脂 无色至浅橙色,透明或半透明,光滑湿润的
圆形菌落
麦康凯琼脂 无色至浅橙色,透明或半透明,菌落中心
有时为暗色
靛基质试验 照大肠杆菌项下操作并判断结果。
脲酶试验 取疑似菌斜面培养物接种于脲琼脂培养基斜面,培养24小时,斜面变为红色为阳性,不变色为阴性。
氰化钾试验 取培养20~24小时的疑似菌株营养肉汤培养液,分别用白金耳沾取1环,接种至对照培养基及氰化钾培养基,立即以橡胶塞塞紧,培养24~48小时,对照管应有菌生长,试验管有菌生长者为阳性,无菌生长为阴性。
赖氨酸脱羧酶试验 取疑似菌斜面培养物分别接种于赖氨酸脱羧酶培养基及对照培养基,培养24~48小时,对照管应为黄色,试验管呈紫色为阳性,呈黄色为阴性。
动力检查 取疑似菌斜面培养物穿刺接种于半固体营养琼脂培养基中,培养24小时,细菌沿穿刺外周扩散生长,为动力阳性,否则为阴性。阴性培养物,应在室温保留2~3天后,再判断。
血清凝集试验 在洁净载玻片一端,以白金耳沾取沙门菌属A~F“0”多价血清2~3环,再取斜面上部的培养物少许,与血清混合,将玻片前后侧动,如出现凝集现象,应以0.9%氯化钠溶液与同株培养物作对照试验,无凝集现象时判为血清凝集阳性。时有反应迟缓,需将玻片与湿棉球置平皿内,约过20分钟,再观察。仍未出现凝集时,应取斜面培养物,置含少量0.9%氯化钠溶液的试管中,制成浓菌悬液,在100℃水浴中保温30分钟,待
冷,再作凝集试验。如出现凝集,应判为阳性,否则为阴性。
上述各项试验反应,一般应为硫化氢阳性(或阴性),靛基质阴性,脲酶阴性,氰化钾阴性,赖氨酸脱羧酶阳性,动力阳性,A~F“0”多价血清凝集试验阳性。各鉴定结果按表3判定。
表 3 沙门菌检查结果判定
序 号 血清凝集试验(A-F“0”血清) 生化试验 结 果
凝集反应 100℃30分钟 0.9%氯化钠
凝集反应 溶液对照
1 阳性 阴性 符合 检出沙门菌
2 阴性 阳性 阴性 符合 检出沙门菌
3 阴性 阴性 不符合 未检出沙门菌
上述各项试验任何一项不符合或有可疑反应的培养物,均应进一步鉴定后作出结论。
(3)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 取胆盐乳糖培养基3份,每份100ml,2份分别加入规定量的供试液,其中1份加入对照菌液作为阳性对照,第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。培养18~24小时,阴性对照应无菌生长,其余2份培养液划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上,培养18~24小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时,供试品的平板无菌落或无疑似菌落生长,可判未检出铜绿假单胞菌。
铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润,灰白色,周围时有蓝绿色素扩散。如生长菌落具有上述特征或疑似者,应挑选2~3个菌落,分别接种于营养琼脂培养基斜面上,培养18~24小时,取培养物革兰染色,并做氧化酶试验。
氧化酶试验 取洁净滤纸片置于平皿内,用无菌玻璃棒取营养琼脂培养基斜面培养物涂于滤纸片上,再滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液,在30秒内呈粉红色逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性,否则为阴性。
如证实为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性,均可判为未检出铜绿假单胞菌。否则,应进行绿脓菌素试验。
绿脓菌素(Pyocyanin)试验 取上述琼脂培养物,接种于绿脓菌素测定用培养基斜面上,培养24小时后,在试管内加氯仿3~5ml,搅碎培养基并充分振摇。静置片刻,将氯仿移至另一试管中,加入1mol/L盐酸试液约1ml,振摇后,静置片刻,如在盐酸溶液层内出现粉红色,即为绿脓菌素阳性。试验同时应作阴性对照。
当阴性对照试验呈阴性时,并为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素阳性,可判检出铜绿假单胞菌。 绿脓菌素阴性的培养物,应继续做以下试验。
硝酸盐还原产气试验 取营养琼脂培养基斜面培养物,接种于硝酸盐胨水培养基中,培养24小时,如在培养基的杜氏管中有气体产生,即为阳性。
42℃生长试验 取营养琼脂培养基斜面培养物于0.9%无菌氯化钠溶液中,制成菌悬液,再将菌悬液接种于营养琼脂培养基斜面,立即置41℃±1℃水浴中培养24~48小时,有菌苔生长者为阳性,否则为阴性。 明胶液化试验 以接种针沾取营养琼脂培养基斜面培养物,穿刺于明胶培养基内,培养24小时,取出置冰箱内10~30分钟。如培养基仍呈溶液状,为阳性。
当为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性、绿脓菌素试验阴性,其硝酸盐还原产气试验、42℃生长试验及明胶液化试验均为阳性时,应判检出铜绿假单胞菌。
(4)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 取亚碲酸钠肉汤(或营养肉汤)培养基3份,每份100ml,2份分别加入规定量的供试液,其中1份加入对照菌液作为阳性对照,第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。均培养18~24小时(必要时可延至48小时)。
阴性对照应无菌生长。取其余2份培养液划线接种于卵黄高盐琼脂培养基平板或甘露醇高盐琼脂培养基平板,培养24~72小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时,供试品的平板如无菌落生长,或有菌落但不同于表4所列特征,可判未检出金黄色葡萄球菌。
表 4 金黄色葡萄球菌菌落形态特征
培养基 菌落形态
卵黄高盐琼脂 金黄色,圆形凸起,边缘整齐,外围有卵
磷脂分解的乳浊圈,菌落直径1-2mm
甘露醇高盐琼脂 金黄色,圆形凸起,边缘整齐,外围有黄
色环,菌落直径0.7-1mm
如有菌落生长并与表4所列特征相符或疑似时,应挑选2~3个菌落,分别接种于营养琼脂培养基斜面上,培养18~24小时,取其培养物革兰染色,并作血浆凝固酶试验。
血浆凝固酶试验 取灭菌小试管3支,各加入血浆-无菌水(1∶1)0.5ml,1支加入被检菌株的营养肉汤培养液(或浓菌悬液)0.5ml,1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照,另1支加入营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照。将3管同时培养。3小时后开始检查,以后适当时间逐次观察直至24小时。阴性对照管的血浆流动自如,阳性对照管血浆凝固,试验管血浆凝固者为阳性;阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时,应另制备血浆,重新试验。
当阴性对照和阳性对照符合要求,供试品的菌株为革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阳性时,判定为检出金黄色葡萄球菌。
结果判断
细菌菌落数、霉菌(酵母菌)菌落数、控制菌三项均符合该品种微生物限度项下规定,应判供试品合格;其中任何一项不符合该品种项下规定,应判供试品不合格。
细菌菌落数、霉菌(酵母菌)菌落数第一次测定超过该品种微生物限度项下规定时,应从同一批号样品中随机抽样,复试2次,如3次结果平均值报告。
眼科用药的霉菌和酵母菌菌落数复试报告,须以2次复试结果均不得长菌,方可判供试品合格。
如营养琼脂培养基平板生长霉菌(酵母菌)菌落数或玫瑰红钠琼脂培养基平板生长细菌菌落数超过该品种微生物限度项下规定时,经复试2次,如3次结果平均值仍超过规定,应判供试品不合格。
各类制剂检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再抽样复试,即应判该供试品不合格。 表 5 微生物限度标准(单位:个/g或个/ml)
编号 剂 型 细菌数 霉菌、 大肠杆菌 铜绿假单胞菌
酵母菌数 金黄色葡萄球菌
1 片剂 1000 100
2 酊剂 100 100
3 栓剂 100 10
4 胶囊剂 1000 100
5 软膏剂 100 100
6一般眼膏剂 100
7一般滴眼剂 100
8丸剂(滴丸、
糖丸等) 1000 100
9 气雾剂 100 10
10 糖浆剂 100 100
11 膜剂 100/10cm2 100/10cm2
12 颗粒剂 1000 100
13口服溶液
剂、混悬剂
、乳剂 100 100
14 散剂 1000 100
外用散剂 100 100
15 滴耳剂 100 10
16 滴鼻剂 100 10
17 洗剂 100 100
18 搽剂 100 100
19 凝胶剂 100 100
注:“—”为每1g或每1ml中不得检出。
说明:
1.含动物组织来源的制剂(包括提取物),还不得检出沙门菌。
2.抗细菌的口服抗生素制剂应检查霉菌,每1g中不得过100个;抗真菌的口服抗生素制剂应检查细菌,每1g中不得过100个。
3.霉变、长螨者,以不合格论。
范文三:初始染菌检测方法(微生物限度检查法)
- C
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检
查项目包括细菌数、霉菌素、酵母菌数及控制菌检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进
行。检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境
应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标
准进行洁净度验证。
供试品检查时,如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂,应证明其有效性及对微生物
的生长和存活无影响。
除另有规定外,本检查法中细菌培养温度为30~35?,霉菌、酵母菌培养温度为25~2
8?,控制菌培养温度为36??1?。
检验结果的报告以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告。
2检验量:检验量即一次试验所用的供试品(g、ml 或 cm)。
2除另有规定外,一般供试品的检验量为10 g或10ml;中药膜剂为50cm;贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品,其检验应增加10g或10ml。
检验时,应从2个以上最小包装单位中抽取供试品,大蜜丸还不得少于4丸,膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。
供试液的制备:根据供试品的理化特性与生物学特性,可采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需用水浴加温时,温度不应超过45?。供试液从制备至加入检验用培养基,
不得超过1小时。
除另有规定外,常用的供试液制备方法如下。
1.液体供试品:取供试品10ml,加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀,作为1:10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体
制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2.固体、半固体或黏稠性供试品:取供试品10g,加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml ,用匀浆仪或其他适宜的方法,混匀,作为1:10的供试液。必要时加适量的无菌
聚山梨酯80,并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
3.需用特殊供试液制备方法的供试品
(1)非水溶性供试品
方法1:取供试品5g(5ml),加入含溶化的(温度不超过45?)5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中,用无菌玻棒搅拌成团后,慢慢加入45?左右的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,边加边搅拌,使供试品充分乳化,作
为1:20的供试液。
方法2:取供试品10g,加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯(制法见附录?-XIII B无菌检查法中供试品的无菌检查项下)和无菌玻璃珠的适宜容器中 ,必要时可增加十四烷酸异
丙酯的用量,充分振摇,使供试品溶解。然后加入45 ?的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,振摇5~10分钟,萃取,静置使油水明显分层,取其水层作为1:10的供试液。
(2)膜剂供试品:取供试品100cm2,剪碎,加50 ml或100ml的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(必要时可增加稀释液),浸泡,振摇,作为1:10或 1:20的供试液。
(3)肠溶及结肠溶制剂供试品: 取供试品10g ,加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)PH7.6无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂)至100ml,置45?水浴中,振摇,使溶解,作为1:10的供试液。
(4)气雾剂、喷雾剂供试品:取规定量供试品,置冰冻室冷冻约1小时,取出,迅速消毒供试品开启部位,用无菌钢锥在该部位钻一小孔,放至室温,并轻轻转动容器,使抛
射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液,加至适量的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(若含非水溶性成分,加适量的无菌聚山梨酯80)中,混匀,取相当于10g或10ml的供试品,再稀释成1:10的供试液。
(5)具抑菌活性的供试品:当供试品有抑菌活性时,应消除供试液的抑菌活性后,再
依法检查。常用的方法如下。
?培养基稀释法:取规定量的供试液,至较大量的培养基中,使单位体积内的供试品含
量减少,至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时,取同稀释级的供试液2ml ,每1ml供试液可等量分注多个平皿,倾注琼脂培养基,混匀,凝固,培养,计数。每1ml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数,计算每1ml供试液的平均菌落数,按平皿法计数规则报告菌数;控制菌检查时,可加大增菌培养基的用量。
?离心沉淀集菌法:取一定量的供试液,3000转/分离心20分钟(供试液如有沉淀,
先以500转/分离心5分钟,取全部上清液再离心),弃去上清液,留底部集菌液约2ml ,加稀释液补至原量。
?薄膜过滤法:见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。
?中和法:凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品,可用适宜的中和剂或灭活剂
消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。
细菌、霉菌及酵母计数
计数方法的验证
当建立药品的微生物限度检查法时,应进行细菌、霉菌 及酵母菌计数方法的验证,以
确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若药品的组分或原检验
条件发生改变可能影响检验结果时,计数方法应重新验证。
验证时,按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对
各试验菌的回收率应逐一进行验证。
菌种:验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌
种为第0代),并采用适宜的菌种保藏技术,以保证试验菌株的生物学特性。
大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44 102]
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26 003]
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B) 63 501]
白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98 001]
黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F) 98 003]
菌液制备:接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤
培养基或营养琼脂培养基中,培养18~24小时;接种白色念株菌的新鲜培养物至改良马丁
培养基或改良马丁琼脂培养基中,培养24~48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面
培养基中,培养5~7天,加入3~5ml0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后,吸出孢
子悬液(用管口带有薄的 无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内,用
0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100cfu 的孢子悬液。
验证方法:验证试验至少应进行3次独立的平行试验,并分别计算各试验菌每次试验的
回收率。
(1)试验组:平皿法计数时,取试验可能用的最低稀释级供试液1ml 和50~100cfu 试验菌,分别注入平皿中,立即倾注琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时 ,取规定量试验可能用的最低稀释级供试液,过滤,冲
洗,在最后一次的冲洗液中加入50~100cfu试验菌,过虑,按薄膜过滤法测定其菌数。
(2)菌液组:测定所加的试验菌数。
(3)供试品对照组:取规定量供试液,按菌 落计数方法测定供试品本底菌数。
(4)稀释剂对照组:若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处
理时,应增加稀释剂对照组,以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时,可
用相应的稀释液替代供试品,加入试验菌,使最终菌浓度为每1ml供试液含50~100cfu ,按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
结果判断:在3次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌回收率(稀释剂对照组的平均
菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%。若试验组的菌回收率(试验组
的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)均不
低于70%,照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数;若任一次
试验中试验组的菌回收率低于70%,应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、
中和 法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证。
验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。
检查法:计数方法包括平皿法和 薄膜过滤法。检查时,按已验证的计数方法进行供试
品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。
取按验证的方法制备的均匀供试液,用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1:10、1:100、1:1000等稀释级。
1.平皿法:采用平皿法进行菌数测定时,应取适宜的连续2~3个稀释级的供试液。
取供试液1ml,置直径90mm的无菌平皿中,注入15~20ml 温度不超过45?的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄琼脂培养基,混匀,凝固,倒
置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。
阴性对照试验:取试验用的稀释液1ml,置无菌平皿中,注入培养基,凝固,倒置培养。
每种计数的培养基各制备2个平板,均不得有菌生长。
培养和计数:除另有规定外,细菌培养48小时,逐日点计菌落数,一般以48小时的菌落数报告;霉菌、酵母菌培养72小时,逐日点计菌落数,一般以72小时的菌落数报告;必要时,可适当延长培养时间至5~7天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不
宜计数。点计菌落数后,计算各稀释级供试液的平均菌落数,按菌数报告规则报告菌数。
若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15,则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
一般营养琼脂培养基用于细菌计数;玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数;酵母
浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下,若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌,则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。
然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数,与玫瑰红
钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较,以菌落数较高
的培养基中的菌数为计数结果。
含蜂蜜、王浆的液体制剂,用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数,用酵母浸出粉胨葡萄糖
琼脂培养基测定酵母菌数,合并计数。
菌数报告规则 宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30~300之间、霉菌宜平均菌落数在
30~100之间的稀释级,作为菌数报告(取两位有效数字)的依据。
(1)当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定,以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的
值报告菌数。
(2)当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时,视两者比值(比值为高 稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值) 而定。 若比值不大于2,以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数;若比值大于2但不超过5时,以低稀释级的菌落乘以稀释倍数的值报告菌数,当出现比值大于5,或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时,应查明原因再行检查,必要时,应进行方法的重新验证。
(3)当各稀释级的平均菌落数均小于30,以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的
值报告菌数。
(4)如各稀释级的平板均无菌落生长,或仅最低稀释级的平板有菌落生长,但平均菌
落数小于1小时,以1000
+ + - 100 16mm 者为敏感,
五.肠毒素的测定 方法在GB/T4789.10-2003中。
当食品中检出金黄色葡萄球菌时,表明食品加工处理卫生条件较差,并不一定说明该食品导致了食物中毒。但当食品中未分离出金黄色葡萄球菌时,也不能证明食品中不存在葡萄球菌肠毒素。
2.4 沙门氏菌
沙门菌属分类属肠杆菌科,是肠杆菌科中最复杂的菌属,是一种重要的肠道致病菌,可从人和世界各地所有动物中分离得到,其致病性具有种系特异性,例如人是伤寒、副伤寒 A 、B 、
C 沙门菌的天
然宿主。有些专对动物致病,也有些对人和动物都能致病。沙门菌可致多种感染。
1生物学性状
形态染色 革兰阴性直杆菌,较细长,多具有周鞭毛,能运动,有时会出现无鞭毛的突变型。无芽胞,无荚膜。
1.1培养特性 兼性厌氧,最适生长温度 35 一 37℃,最适生长pH 6.8一 7.8,本菌属对营养的要求不高,在普通营养琼脂上生长的菌落为圆形、光滑、湿润、半透明、边缘整齐的菌落,
有时出现粗糙型的菌落。有些能产生硫化氢的菌株,在 SS琼脂上形成中心黑色的菌落。在亚硫酸铋琼脂上,不同沙门氏菌可形成如下三种不同的菌落,
在亚硫酸铋琼脂上,不同沙门氏菌可形成如下三种不同的菌落:深黑色菌落,大小为2mm,扁平的菌落,并有向周围扩散的灰褐色晕环,如伤寒沙门氏菌往往形成这样的菌落;灰黑色至灰褐色的菌落,大小为2mm~3mm,圆形、光滑、湿润、突起,周围有向外扩散的灰褐色晕环,多数沙门氏菌属于此类型;浅灰色菌落,一般较大,直径为2mm~4mm,突起黏液状,有向周围扩散或无扩散的灰色晕环。 在HE琼脂上,沙门氏菌培养24h后,可形成两种不同的菌落。一类菌落大小为2mm~3mm,绿色至蓝绿色,中央有黑色沉淀物。另一类菌落大小为2mm,绿色至蓝绿色,无黑心。
亚利桑那沙门氏菌,因为发酵乳糖,可形成橙黄色,带有黑心的菌落,直径为2mm。 在XLD琼脂(木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂)上,沙门氏菌培养24h后,大多数沙门氏菌形成浅粉色,大小为2mm,光滑、湿润、边缘整齐。而发酵乳糖的亚利桑那沙门氏菌形成带有黑心的黄色菌落。 在DHL-琼脂(胆硫乳琼脂)上,沙门氏菌培养24h后,产生硫化氢的沙门氏菌可形成带有黑心的菌落大小为2mm~3mm,圆形、突起、湿润、边缘整齐。不产生硫化氢的沙门氏菌,菌落中心无黑色沉淀物。亚利桑那沙门氏菌,因发酵乳糖和产生硫化氢,形成红色带黑心的菌落。
1.2生化反应
不发酵乳糖、蔗糖,对葡萄糖、麦芽糖和甘露醇发酵,除伤寒 沙门氏菌不产气外,其它沙门氏菌均产酸产气。
TSI上典型的沙门氏菌培养物显示斜面碱性(红色)或不变色和底部酸性(黄色),伴随着产气和(约90%情况下)硫化氢产生(K/A + +);当分离到乳糖阳性的沙门氏菌时,TSI的斜面是黄色的。因此,沙门氏菌培养物的初步确认并不能仅仅根据TSI琼脂实验的结果,还要再接种尿素琼脂或赖氨酸脱羧酶培养基。
尿素琼脂如果反应为阳性,尿素分解释放氨,其颜色由粉红变成玫瑰红,最后变成深樱红色。 赖氨酸脱羧酶培养基阳性反应为紫色,阴性反应为黄色。
对初步反应可疑为沙门氏菌属的TSI培养物进行生化试验。生化结果符合沙门氏菌属特性的进行血清学试验。
2.血清学特性
2.1抗原构造 本菌属的抗原结构主要有 3 种,即菌体( O )抗原、鞭毛( H )抗原及表面抗原( Vi 抗原等)。根据O 抗原、H 抗原双相抗原及Vi抗原的不同,可将沙门氏菌分为近 3000 种血清型。
( l ) O抗原:为多糖一类脂蛋白质复合物,具耐热性,能耐受 100℃ 2.5 h。O抗原共有 58 种,以阿拉伯数字顺序排列,现已排至第 67(其中有 9 种被删除)。每个沙门菌的血清型可含一种或多种O抗原。凡含共同抗原成分的血清型归为-个群,每个群以 0 加上阿拉伯数字及括号中大写的 26 个英文字母(A~Z)顺序编排,则可将沙门氏菌属分成A~Z 、051~063、O65~O67 42个群,引起人类疾病的沙门氏菌大多数在A~E群。 0 抗原是分群的依据。其刺激机体产生的抗体以Ig M 为主,与相应的抗血清反应时呈颗粒状凝集。
( 2 ) H 抗原为不稳定的蛋白质抗原,加热或用乙醇处理均被破坏。有两个相,第一相特异性较高称特异相,用小写英文字母 a 、 b 、
C 表示,沙门菌 H 抗原直至 z , Z 以后 z 加阿拉伯数字表示,如 21 、 22 、 23 . · · … 265 。第二相抗原为沙门菌所共有,称非特异,直接用 1、2、3 表示。同时有第一相和第二相 H 抗原的细菌称双相菌,仅有一相者用相称单相菌。 H 抗原是定型的依据。其刺激机体产生的抗体以 IgG 为主,与相应的抗血清呈絮状反应。
( 3 )表面抗原:在沙门菌属中已被证实的表面抗原有 Vi 抗原、 M 抗原和 S抗原三种:
l ) Vi 抗原:是一种不耐热的酸性多糖聚合物,加热 60℃30 分
钟或经石炭酸处理即被破坏,经人工培养基传代后也易丧失。新分离的伤寒及副伤寒丙沙门菌常带有此抗原。 Vi 抗原位于菌体的最表层,有抗吞噬及保护细菌免受相应抗体和补体的溶菌作用。 Vi 抗原存在时可阻止 0 抗原与相应抗体发生凝集,故在沙门菌血清学鉴定时应加以注意,需事先加热破坏 Vi 抗原之后, O抗原才得以与相应的 O 抗血清发生凝集。带 Vi 抗原的沙门菌亦可用 Vi 噬菌体进行分型,有助于流行病学调查和追踪传染源。
2 ) M 抗原:又称粘液抗原。多种沙门菌均可产生 M 抗原。 M 抗原有免疫原性,但各菌种之间无特异性,不能用于血清学分型。 M 抗原存在时亦可阻止 O 抗原与相应抗体发生凝集,同样可用加热的方法加以破坏。
3 ) S 抗原:过去认为 S 抗原是一种 O抗原,与O 抗原的区别是 S抗原可被 lmol / l的盐酸所破坏,故与O抗原不同,仍属表面抗原。
2.2抗原变异 沙门菌属在一定条件下可发生变异,主要表现为: ( 1 ) S一 R 变异:自临床标本初次分离的菌株一般都是光滑型,经人工培养、传代后可逐渐变成粗糙型菌落。此时菌体表面的特异多糖抗原丧失,在生理盐水中可出现自凝。
(2) H-O变异:是指有鞭毛的沙门菌失去鞭毛的变异。
( 3 )位相变异:具有双相 H 抗原的沙门菌变成只有其中某一相 H 抗原的单相菌,称位相变异在沙门菌血清学分型时,如遇到单相菌,特别是只有第Ⅱ相(非特异相)抗原时,需反复分离和诱导出第Ⅰ相
(特异相)抗原方可作出鉴定。
( 4 ) V-W变异:是指沙门菌失去 Vi抗原的变异。初次分离得到的具有 Vi 抗原、O不凝集的沙门菌称 V 型菌; Vi 抗原部分丧失,既可与O抗血清发生凝集又可与 Vi 抗血清凝集者称 VW 型菌; Vi 抗原完全丧失,与0抗血清发生凝集而与 Vi 抗血清不凝集者称 W 型菌。 V-W 变异的过程是 V 型菌经人工培养,逐渐丧失部分 Vi抗原而成为 VW 型菌,进而丧失全部 Vi抗原而成为 W 型菌。
3.检验方法:按照GB/T4789.4-2003 SN0170-1992进行检验。
2.5 大肠埃希氏菌
大肠杆菌是肠道的正常菌群。在一定条件下可引起肠道外感染,一部分血清型的大肠杆菌致病性强,引起腹泻,与人类疾病有关的大肠杆菌统称为致泻大肠杆菌。包括肠产毒素性大肠杆菌(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠集聚性粘附大肠杆菌(EAggEC)。
肠出血性大肠杆菌(EHEC)引起散发或暴发性出血性结肠炎,主要血清型是O157:H7 ,EHEC O157:H7的一个显著性特征是产生志贺样毒
素(Vero toxin,VT),是EHEC的主要致病因子。EHEC O157:H7不发酵
或迟缓发酵山梨醇。在山梨醇麦康凯琼脂平板上菌落呈无色半透明。绝大多数O157:H7大肠杆菌不具有葡萄糖醛酸酶,不能水解4-甲基伞
形酮-β-D葡萄糖醛酸苷(MUG),不能产生荧光。
肠产毒素性大肠杆菌(ETEC)能产生不耐热肠毒素(LT)和耐热
肠毒素(ST)。
卫生学意义:检出大肠杆菌,即意味着直接或间接地被粪便污染, 卫生学上被用于饮水、食品等的粪源性污染卫生细菌学指标;由于大肠杆菌在外界存活时间与一些肠道致病菌相近,它的检出也可能预示着某些肠道致病菌(沙门菌、志贺氏菌)的存在,因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。
2.5.1 形态与结构 革兰阴性直短杆状,多数有鞭毛,能运动,某些菌株尤其是引起肠外感染的菌株有荚膜(微荚膜)和周身菌毛。
2.5.2 培养和生化反应 兼性厌氧,营养要求不高,在普通营养琼脂上生长良好,形成较大的圆形、光滑、湿润、灰白色的菌落,在血琼脂上某些菌株可产生β-溶血,在肠道选择培养基上可发酵乳糖,形成有色菌落。
大肠杆菌能发酵乳糖、葡萄糖等多种糖类产酸产气,典型的大肠杆菌的吲哚、甲基红、V -P 、枸椽酸盐(I MViC )的生化试验结果为 + + - -,在三糖铁琼脂(TSI)上斜面和底层均产酸、产气, H2 S 阴性( A/A + -),不分解尿素。大肠杆菌一般不产生硫化氢,但近来发现产硫化氢的菌株,应引起注意。
大肠杆菌的血清学反应,往往是对经分离、鉴定、确证为大肠杆菌的进一步分型。
根据O 抗原、H 抗原及K抗原的不同进行大肠杆菌血清学分型。 表示大肠杆菌血清型的方式按O;K;H 排列。
检验方法:GB/T4789.6-2003;SN0169-92。
志贺菌属
志贺菌属与沙门菌属一样,是主要的肠道病原菌之一,是引起人类细菌性痢疾的病原体。在伯杰手册( 1984 )中将志贺菌属分为 4 个血清群(种) : A 群为痢疾志贺菌, B 群为福氏志贺菌, C 群为鲍氏志贺菌, D 群为宋内志贺菌)而沿用至今。
生物学性状 1 .形态结构和染色革兰阴性杆菌,菌体短小,无芽胞,无荚膜,无鞭毛,有菌毛。
2.培养和生化反应
发酵葡萄糖产酸不产气,大多不发酵乳糖,仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。不分解尿素,不产生H2S。TSI:(K/A - -)
2. 检验方法: 按照GB/T4789.5-2003标准检验。
三.生物安全基本知识
3.1生物安全柜的使用
(1)生物安全柜必须在运行正常时才能使用。
(2) 生物安全柜在使用中不能打开玻璃观察挡板。
(3) 生物安全柜内应尽量少放置器材或样品,不能影响后部压力排
风系统的气流循环。
(4) 生物安全柜内不能使用酒精灯,否则燃烧产生的热量会干扰气
流并可能损坏过滤器。允许使用微型电加热器,但最好使用一次性无菌接种环。
(5) 所有工作必须在工作台面的中后部进行,并能够通过玻璃观察
挡板看到。
(6) 尽量减少操作者身后的人员流动。
(7) 操作者不应反复移出和伸进手臂以免干扰气流 。
(8) 不要使实验记录本、移液管以及其他物品阻挡空气格栅,因为
这将干扰气体流动,引起物品的潜在污染和操作者的暴露。
(9) 工作完成后以及每天下班前,应使用适当的消毒剂对生物安全
柜的表面进行擦拭。
(10)在生物安全柜内的工作开始前和结束后,安全柜的风机应至少运行15min。
(11)在生物安全柜内操作时,不能进行文字工作。
3.2 移液管和移液辅助器的使用
1、应使用移液辅助器,严禁用口吸取。
2、所有移液管应带有棉塞以减少移液器具的污染。
3、不能向含有感染性物质的溶液中吹入气体。
4、感染性物质不能使用移液管反复吹吸混合。
5、不能将液体从移液管内用力吹出。
6、刻度对应(Mark-to-mark)移液管不需要排出最后一滴液体,因此最好使用这种移液管。
7、污染的移液管应该完全浸泡在盛有适当消毒液的防碎容器中。移液管应当在消毒剂中浸泡适当时间后再进行处理。
8、盛放废弃移液管的容器不能放在外面,应当放在生物安全柜内。
9、有固定皮下注射针头的注射器不能够用于移液。
10、在打开隔膜封口的瓶子时,应使用可以使用移液管的工具,而避免使用皮下注射针头和注射器。
11、为了避免感染性物质从移液管中滴出而扩散,在工作台面应当放置一块浸有消毒液的布或吸有消毒液的纸,使用后将其按感染性废弃物处理。
3.3废弃物处理
污染物处理的首要原则是所有感染性材料必须在实验室内清除污染,最有效和彻底的清除污染方法通常为高压灭菌或焚烧。
(1)所有含有微生物的污染材料(有潜在感染性)、污染的非可燃的废物(玻璃或锐利器具)在丢弃前必须放置在防渗漏的容器中高压灭菌。
(2)所有的液体废物在排入下水道前必须经过消毒处理。
(3)任何高温灭菌后重复使用的污染材料不应事先清洗,所有的清洗、修复工作必须在高压灭菌或消毒后进行。
(4)盛放锐器的一次性容器绝对不能丢弃于垃圾场。
(5)应在每个工作台上放置盛放废弃物的容器、盘子或广口瓶,最好是不易破损的容器(如塑料制品)。盛放废弃物的容器在重新使用前应高压灭菌并清洗。
3.4 感染性物质防护技术
(1)为了避免接种物洒落,微生物接种环的直径应为2mm~3mm并完全封闭,柄的长度应小于6cm以减小抖动。
(2)使用封闭式微型电加热器消毒接种环,以避免在酒精灯的明火上加热所引起的感染性物质爆溅。最好使用不需要再进行消毒的一次性接种环。
(3)在所有可能产生潜在感染性物质喷溅的操作过程中,操作人员应将面部、口和眼遮住或采取其他防护措施。
(4)鉴定可疑微生物时,个人防护设备应与生物安全柜及其他设施同时使用。
(5)在每一阶段工作结束后,必须采用适当的消毒剂清除工作区的污染。
3.5 微生物实验室容器破碎及感染性物质溢出的应急处理
当发生容器破碎感染性或潜在感染性物质溢出时,应采用下列溢出清除规程:
1、戴手套,穿防护服,必要时需进行脸和眼睛防护。
2、用布或纸巾覆盖并吸收溢出物。
3、向纸巾上倾倒适当的消毒剂,并立即覆盖周围区域(通常可以使用5%漂白剂溶液).
4、使用消毒剂时,从溢出区域的外围开始,朝向中心进行处理。
5、消毒剂作用适当时间后(例如30 min),将所处理物质清理掉。如果含有碎玻璃或其他锐器,则要使用簸箕或硬的厚纸板来收集处理过的物品,并将它们置于可防刺透的容器中以待处理。
6、对溢出区域再次清洁并消毒(如有必要,重复第2~5步)。
7、将污染材料置于防漏、防穿透的废弃物处理容器中高压灭菌。
8、在成功消毒后,通知主管部门目前溢出区域的清除污染工作已经完成。
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