范文一:农杆菌的提取
生物技术通报
?研究报告?
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2009年第7期
农杆菌质粒DNA的间接酶切鉴定
马滋蔓 王文治 杨本鹏 张树珍 杨志坚
1
1
1
1
2
(1中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室,海口571101;2福建农林大学,福州350002)
摘 要: 采用常规手段提酶切鉴定法,与普通大肠杆菌质粒小量抽提试剂盒提取农杆菌质粒酶切鉴定法(简称试剂盒法)和农杆菌质粒反导大肠杆菌间接酶切鉴定法(简称间接法)进行对比,发现本试验创新的试剂盒法和间接法可轻松做酶切鉴定,可为农杆菌质粒DNA提取经验不足者参考。
关键词: 农杆菌 质粒DNA 试剂盒法 间接法 酶切鉴定
IndirectRestrictionEndonucleaseoffrom
MaZiman W ZhangShuzhen YangZhijian
1
2
11112
(InstitueofBAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Haikou571101;
FujianandForestryUniversity,Fuzhou350002)
Abstract: ofplasmidDNAisolationfromAgrobacteriumtumefacienswasalkalinelysisandphenol2chloroform
method,butitsproductionislowandnotpurityenough.ItisavailableforPCRtesting,butusuallydifficultforrestrictionendonucleasetesting.Routinemethodwithkitmethodandindirectmethodwascompared,anditwasfindingthatthelatertwomethodsweregoode2noughforrestrictionendonucleasetesting.
midDNA Kitmethod Indirectmethod RestrictionendonucleasetestingKeywords: Agrobacteriumtumefaciens Plas
农杆菌质粒DNA的提取进行酶切鉴定是分子生物学研究中的一项常规技术,然较之与大肠杆菌质粒DNA的提取并进行酶切鉴定有一定的难度。经验不足者采用常规手提法提取农杆菌质粒DNA,产率较低,纯度不高,常带有影响酶切鉴定的大量蛋白质和盐等污染物,无法酶切鉴定,常常
[1~3]
因此小步骤而影响实验进展。针对此不足,本试验采用大肠杆菌质粒小量抽提试剂盒提取农杆菌质粒酶切法及农杆菌质粒反导大肠杆菌间接酶切鉴定法,发现这两种方法可轻松应用于质粒DNA导入农杆菌的酶切鉴定。大肠杆菌质粒抽提试剂盒一般用于大肠杆菌质粒的提取,少见有人将其拿来应用于农杆菌质粒的提取,然此法所提质粒DNA纯度够高,容易酶切鉴定。农杆菌质粒反导大肠杆菌间接酶切鉴定法则是将手提法(或
试剂盒法的)提取的农杆菌质粒通过冷冻法反导入大肠杆菌扩增,然后提取大肠杆菌质粒(手提法或试剂盒法可轻松提取大肠杆菌质粒DNA进行酶切鉴定)进行间接酶切鉴定。
1 材料和方法
111 材料
11111 菌珠和质粒 农杆菌EHA105,大肠杆菌
α,质粒表达载体PYDH5W,均为本实验室保存。11112 主要试剂 STE溶液,TEBuffer,Solution
Ⅰ,SolutionⅡ,SolutionⅢ,均按王关林《基因工程原
[4]
理与技术》书上说明配制,HindⅢ、EcoRⅠ及质粒DNA小量纯化试剂盒等购自宝生物工程(大连)有限公司。11113 主要仪器 离心机,电泳仪,干浴锅。
收稿日期:2009202227
基金项目:现代农业产业技术体系建设专项资金,国家自然科学基金(30560081),中央级公益性科研院所基本科研业务费作者简介:马滋蔓(19832),女,云南昆明人,硕士研究生,研究方向:植物基因工程通讯作者:杨本鹏,y_bp@163.com
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生物技术通报Biotechnology Bulletin
2009年第7期
11114 培养基LB、YEP培养基均按王关林《基因
2 结果和分析
211 3种方法所提质粒的电泳检测结果
工程原理与技术》书上说明配制。112 方法11211 PYW质粒转化到感受态EHA105中 根据王关林《基因工程原理与技术》上冻融法制备农杆
[4]
菌EHA105感受态。向农杆菌200μl的EHA105感受态细胞中加人1μg左右的纯化PYW质粒DNA,混匀,冰上放置5min。置于液氮速冻5min,
[4]
将常规法、试剂盒法、间接法所得质粒分别进行
电泳检测(图1)。1~6别展示了3种方法所得质粒的质量,1、2为常规法所得质粒,说明常规法所提质粒效率很低,且纯度差;3、4为试剂盒法所得质粒,说明试剂盒法所得质粒效率一般,纯度较好;5、6为间接法所得质粒,,纯度最好
。
立即37℃水浴热激5min,加入800μlYEP液体培养基,28℃,<200r>200r>
11213 试剂盒法提取EHA105中PYW质粒 挑取1.2.1中所长单菌落于YEP三抗液体培养基中培养36h左右。按照质粒DNA小量纯化试剂盒说明书
[4]
图1 3种方法所得质粒凝胶电泳
EHA105中的
212 3种方法所得质粒酶切结果
图2为PYW质粒图,此载体在HindⅢ和EcoRI
双酶切下,可切出8条不同大小的片段,大小分别为6396bp,2163bp,1996bp,943bp,845bp,755bp,670bp,112bp。为展示酶切效果,故而选择
HindⅢ和EcoRⅠ双酶多条带酶切
。
步骤提取EHA105中的PYW质粒。
11214 间接法提取PYW质粒 根据关林《基因工
α感受态[4]。取程原理与技术》制备大肠杆菌DH5
2μl常规法所提PYW质粒,加入100μl大肠杆菌感受态细胞中,轻弹管壁混匀,冰浴30min。42℃热休克90s,迅速转入冰浴1~2min。加入1mlLB培养基,混匀,37℃,250r/min,培养1h。4℃10000r/min离心30s,吸弃部分上清,重悬剩余菌液,吸μl左右涂板。37℃200培养12~16h,长出单菌落。
α单菌落,37℃挑取所长DH5摇菌过夜。按照质粒
α中的DNA小量纯化试剂盒说明书步骤提取DH5PYW质粒。
1.2.5酶切1.2.2、1.2.3、1.2.4所得PYW质粒 将1.2.2常规法所得PYW质粒用HindⅢ、EcoRⅠ双酶切,
μl,Buffer2μl,PY20μl体系:EcoRⅠ1μl,HindⅢ1W质粒16μl。因常规法所提PYW质粒效率低,故将酶
切底物PYW加到最大16μl,而不补水。将1.2.3试剂盒法与1.2.4间接法所得PYW质粒进行同等条件
μl,HindⅢ1μl,的酶切对比,20μl体系:EcoRⅠ1
Buffer2μl,PYW质粒10μl,ddH2O6μl。
图2 PYW质粒图
图3为常规法所提质粒的酶切效果图,因常规
法所提质粒纯度不够,效率很低,因此很难得到良好的酶切效果,容易出现酶切不完全,或酶切目的条带较暗的现象。
2009年第7期
马滋蔓等:农杆菌质粒DNA的间接酶切鉴定
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图4泳道2~5为间接法所得质粒酶切鉴定效果,即将所提转化后待鉴定的农杆菌菌株质粒反导回大肠杆菌,再用试剂盒法提取大肠杆菌质粒,然后再进行间接的酶切鉴定;6~9为试剂盒法所得质粒酶切效果,即直接用大肠杆菌质粒小量抽提试剂盒提取转化后待鉴定的农杆菌菌株质粒进行酶切鉴定;CK为大肠杆菌质粒小量抽提试剂盒提取转化前保存于大肠杆菌的PYW质粒酶切效果。相对于图3的常规法所得质粒酶切效果来说,因其提取效率和纯度都很高,所以间接法所得质粒酶切效果极佳,酶切条带从大到小6396bp,2163bp,1996bp,943bp,845bp,755bp,670bp,112bp,112bp看不见,其它条带清晰明亮,得质粒酶切效果一般,,起常规法,图 。根据本实
鉴定,可先用常规法提取农杆菌质粒,再将其反导回大肠杆菌,然后提取大肠杆菌质粒进行间接酶切鉴定。只要大肠杆菌所得质粒的酶切结果与正对照一致,即可间接的证明质粒载体转化农杆菌的成功。如不必要对转化过的农杆菌菌株质粒进行多条带的精确的酶切鉴定,可直接采取试剂盒法进行酶切鉴定。间接法相对于通常采用的直接手提转化过的待鉴定的农杆菌质粒进行酶切鉴定的方法在操作时间上,额外增加一步大肠杆菌的转化,所耗时间仅为12h左右,然而却可以得到效果极佳的酶切图片,因此此间接酶切鉴定法值得参考。
参考文献
1 陈章良,植物基因工程研究[M].北京:北京大学出版社,1992.2 萨姆布鲁克J,北京分子克隆实验指南(第3版)[M].北京:科
3 讨论
农杆菌质粒的提取并进行酶切鉴定相对于大肠
学出版社,2002.
3 单世华,李春娟.生物技术,2003,(4):19~20.
4 王关林,植物基因工程原理与技术[M].北京:科学出版社,2002.
图3
常规法所提质粒酶切图
范文二:农杆菌的扩繁
AB 培养基的配制:
① 配制 20倍的 AB buffer母液,单独灭菌
1 L 200 ml
K 2HPO 4 60 g 12 g
NaH 2PO 4 20 g 4 g
② 配制 20倍的 AB Salts母液,单独灭菌
1 L 200 ml
NH 4Cl 20 g 4 g
MgSO 4·7H 2O 6 g 1.2 g
KCl 3 g 0.6 g
CaCl 2 0.2 g 0.04 g(40 mg)
FeSO 4·7H 2O 50 mg 10 mg
待培养基温度降至 60℃以下加入经 0.22μm 膜滤器过滤 灭菌的卡那霉素(Kanamycin sulfate, Km ) 50 mg/L。
发根农杆菌培养基(YEB )
调整 pH 为 7.2, 待培养基温度降至 60℃以下加入经 0.22μm 膜滤器过滤灭菌的卡那霉素(Kanamycin sulfate , Km ) 50 mg/L。
LB Medium (LB 培养基 ) :
调整 pH 7.4, 待培养基温度降至 60℃以下加入经 0.22μm 膜滤器过滤灭菌的卡那霉素(Kanamycin sulfate , Km ) 50 mg/L。
范文三:农杆菌的转化流程
农杆菌的转化流程
方案一
1. 农杆菌的培养及感受态的制备
① 农杆菌菌株划YM平板,26-28℃培养48 h;
② 挑取单菌落接种到40 ml 无抗生素的YM液体培养基中,250 r/min, 26-28℃悬浮培养12-16 h;
③ 将菌液转入灭过菌的50 ml离心管中,4℃,8000 r/min,离心8 min; ④ 弃上清,加入用100 mM NaCl (4℃预冷)重悬收集的农杆菌;
⑤ 4℃,8000 r/min, 离心8 min;
⑥ 弃上清,加入原始菌液1/50体积(800μ l/管(此时的感受态农杆菌可以直接用于转化)并分装成100μ l)的20 mM CaCl2重悬菌体;
⑦ 置液氮中10 s,放入-20℃冰箱中保存备用。
2.农杆菌的转化(冻融法)
将感受态农杆菌置于冰上,加入1μg质粒DNA(体积不宜超过10 μ l),充分混匀,冰上放置30 min;
② 置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中,待其融化;
③ 加1 ml 无抗生素的YM 液体培养基于28℃,230 r/min 培养2-4 h;(或直接用1 mlμl,留500 μ l于管中④ 3000 r/min 离心2 min收集菌体,将上清吸去500 培养菌直接涂布含抗生素的YM平板);
⑤ 重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的YM平板上吹干, 28℃培养48 h;
⑥ 挑取单菌落接种到筛选液体YM培养基中,28℃,250 r/min 培养48 h,将菌液用于保存或转化;
注:EHA105抗利福平霉素,LBA4404抗硫酸链霉素。在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素,以防止杂菌污染。以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行。
3.转基因烟草体系的建立
⑴ 烟草无菌苗的培养:
① 70%乙醇消毒烟草种子30 s后,用无菌水清洗两次,更换NaClO处理25-30 min,无菌水清洗四次;
② 将灭菌后的种子移至1/2 MS固体培养基(大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4)、1.0 mg/L维生素、2.0 mg/L 苷氨酸、3% 蔗糖、0.6-0.7% 琼脂(KOH 调至pH 5.7-5.8),于25-26℃,14 h光照/10 h黑暗条件下萌发;
③ 14天后,将萌发出的烟草幼苗转移至含有相同1/2 MS培养基的组织培养盒中,同样条件下继续培养4-6周,小苗长出后可用于叶盘转化。
⑵ 农杆菌介导的烟草叶盘转化和愈伤组织的筛选
于无菌条件下将无菌苗的成熟叶片除去叶边缘和主要叶脉,切成0.5 cm的小方块,浸泡在MS液体培养基悬浮的用于转化的农杆菌菌液中;
② 10 min后取出叶片于灭菌的滤纸上吸去菌液,以叶片上表面接触培养基,8-9片/培养皿,排列于倒有共培养基(MS(大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4)、1.0 1℃光照培养箱中,14±mg/L维生素、2.0 mg/L甘氨酸、3% 蔗糖、0.6-0.7%琼脂、pH 5.7-5.8)的平皿中,置于24 h光照/10 h黑暗条件下共培养48 h; ③ 1℃恒温摇床上振荡漂洗45-60±当看到叶片与培养基接触边缘长出白色农杆菌时,将叶片转移至不加激素的MS液体培养基中,约28 min,夹出叶片放于灭菌的滤纸上除去多余的液体培养基;
④ 将叶片上表面朝向培养基,8片/皿排列于生芽筛选培养基(MS(大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4)、500 mg/L Carbincine、300 mg/L Kanamicine、0.1 mg/L NAA、1.0 mg/L BAP、0.59 g/L MES、1.0 mg/L 1℃光照培养箱中,14 h光照/10±维生素、2.0 mg/L甘氨酸、3%蔗糖、0.6-0.7%琼脂、pH 5.7-5.8)上,置于24 h黑暗条件下培养1个月;
⑤ 待愈伤组织长出绿芽时,切下绿芽并转入生根培养基(MS(大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4)、200 mg/L Carbincine、100 mg/L Kanamicine、1.0 mg/L维生素、2.0 1℃光照培养箱中,14 h光照/10±mg/L甘氨酸、1.5%蔗糖、0.6-0.7%琼脂、pH 5.7-5.8)中进行筛选(9棵/组培盒),置于24 h黑暗条件下培养筛选; ⑥ 将能在生根培养基中长出根的幼苗的芽切下,再次插入到生根培养基中,在相同培养 条件下继续筛选,挑选能长出根的烟草幼苗植入土壤生长。
根癌农杆菌转化烟草 方案二
1)农杆菌感受态细胞的制备
(1)挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基(含链霉素Sm 100ug/ml)中,28°C振荡培养过夜;
(2)取过夜培养菌液500ml接种于50ml YEB(Sm 100ug/ml)液体培养基中,28°C振荡培养至OD600为0.5;
(3)5,000rpm, 离心5min;
(4)加10ml 0.15M NaCl悬浮农杆菌细胞,5,000rpm, 离心5min;
(5)1ml 预冷的20mM CaCl2悬浮细胞,冰浴,分装成100 l,液氮中速冻1分钟,置-70°C保存备用。
2)植物表达载体向农杆菌感受态细胞的转化
取200ml感受态细胞,加入1mg构建好的质粒DNA,液氮中速冻1分钟,37°C水浴5分钟,然后加入1ml YEB培养基,28°C慢速振荡培养4小时;1,000 rpm离心30sec,弃上清,加入0.1ml YEB培养基重新悬浮细胞,涂布于含有100ug/ml Kan 和125ug/ml Sm的YEB平板上,28°C培养约48小时。
3)阳性克隆的鉴定
挑取平板上长出的单菌落,接种于YEB液体培养液(含有100ug/ml Kan 和125ug/ml Sm)中,28°C振荡培养过夜;小量提取质粒DNA,以质粒DNA为模板进行PCR扩增鉴定。
4)用于转化烟草的农杆菌菌液的准备
将含有植物表达载体的农杆菌接种于YEB液体培养液(含有100ug/ml Kan和125ug/ml Sm)中,28°C振荡培养至OD600为0.6~0.8;4000rpm,室温离心10分钟,用MS盐溶液(PH7.0)重新悬浮菌体,使用时采用MS盐溶液稀释至原体积的20~50倍。
5)烟草转化
(1)烟草叶片的无菌处理 取温室生长的烟草叶片,流水下冲洗掉表面杂物,再用蒸馏水洗涤;70%的乙醇灭菌30秒后,无菌水冲洗一次;2.5%次氯酸钠处理
8~10分钟;无菌水冲洗三次,备用;
(2)无菌的烟草叶片切去边缘和主要叶脉,切成0.4′0.6cm2大小;
(3)切好的外植体在农杆菌菌液中浸泡10分钟;
(4)用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液,转入上铺一层滤纸的MS基本培养基,28°C暗培养;
(5)三天后,将材料转到含有抗生素的分化培养基(MS+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+ Kan 75~100ug/ml + Cb 500ug/ml)中进行培养;
(6)待抗性芽生长至2~3cm高时,切下小芽转入生根培养基中诱导生根,生根培养基配方:MS基本培养基+ Kan 100ug/ml + Cb 500ug/ml。
范文四:农杆菌
农杆菌
农杆菌(Agrobacterium)是生活在植物根的表面依靠由根组织渗透出来的营养物质生存的一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。
分类
冠瘿瘤
农杆菌主要有两种:根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)。根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种或的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤的原因是,Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内表达,指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱,进而引起转化细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根,其特征是大量增生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒上有一段T-DNA,农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物基因组中。因此,农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系,被誉为“自然界最小的遗传工程师”[1]。可以通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合,然后通过细胞和组织培养技术,得到转基因植物。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中,近几年来,农杆菌的介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。此外,生物技术学家还可以通过发根农杆菌转化,在体培养基中培养高密度的根,作为一种在转基因植物中获得大量蛋白质的方法。生存与形状
根癌农杆菌生活在土壤——特别是耕种过的田地里,因为经过耕种的土壤疏松,适宜根癌农杆菌生长。根癌农杆菌的身体为棒状,有两三个微米长,靠几根鞭毛运动,鞭毛一般生在侧边。用显微镜放大到1000倍时,人们就能把它看得很清楚了。根癌农杆菌虽小,也有细胞壁,按以前的生物两界分类法,它当然属于植物界,就是说,它曾被当作是一种低等植物。在许多双子叶植物靠近地面的根茎交界处,根癌农杆菌能诱发一种帽状肿瘤,人们称之为冠瘿瘤病。这种病曾在法国、东欧和澳大利亚的葡萄等果树上大面积发生,造成很大的危害。在其他地方,甚至城市园林绿化中,也有不少植物患上此病。人们发现,根癌农杆菌所产生的冠瘿瘤病,与豆科植物根部的固氮根瘤细菌所产生的根瘤相似;然而,事实上,两者的作用方式并不一样。豆科植物的固氮根瘤菌会钻到植物细胞内部,与植物细胞共生,根瘤细菌为豆科植物提供氮肥,植物细胞则供给根瘤细胞其他各种营养。
作用
根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤的原因是,Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内表达,指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱,进而引起转化细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根,其特征是大量增生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒上有一段T-DNA,农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物基因组中。因此,农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系,被誉为“自然界最小的遗传工程师”[1]。可以通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合,然后通过细胞和组织培养技术,得到转基因植物。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中,近几年来,农杆菌的介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。此外,生物技术学家还可以通过发根农杆菌转化,在液体培养基中培养高密度的根,作为一种在转基因植物中获得大量蛋白质的方法。侵染植物
根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性,即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明,主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮,这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成,通常不存在于单子叶植物中,这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖,如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物,又可以作为农杆菌中Ti质粒上Vir区(毒性区)基因的诱导物,使Vir区基因活化,导致T-DNA的加工和转移,从而侵染植物细胞。需要注意的是农杆菌中不同的菌株,侵染能力有差别,在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时,是需要加上述酚类物质的,同时单子叶植物种类不同,农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。
基因工程
如果想将一个抗病毒基因转入小麦,也可以用农杆菌,但要注意两点:①要选择合适的农杆菌菌株,因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物;②要加趋化和诱导的物质,一般为乙酰丁香酮等,目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢(趋化性)和激活农杆菌的Vir区(诱导)的基因,使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。
范文五:农杆菌
1.1农杆菌感受态细胞的制备
1.1.1. 取 -70℃保存的 EHA105于含 50μg/ml链霉素平板划线, 28℃培养。
1.1.2. 挑取单菌落接种于 50ml YEB液体培养基中, 220rpm 28℃振荡培养 12-16 hr。
1.1.3. 取 2ml 菌液转接于 100ml (含有抗生素) YEB液体培养基中, 28℃ 220rpm 振荡 培养至 OD
600
=0.5。
1.1.4. (将菌液冰浴 30min 后) 转入无菌离心管, 5000rpm 离心 5min, 去上清液。
1.1.5. 加入 10ml 预冷的 0.1M 的 CaCl
2
溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置 20min 。 4℃ 5000rpm 离心 5min ,去上清。
1.1.6. 加入 4ml 预冷的含 15%甘油的 0.1M 的 CaCl
2
溶液,轻轻悬浮。
1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌 Eppendorf 管中,每管 200μl 冻存于 -70℃。
农杆菌感受态细胞的制备
(l)将农杆菌接种于 5一 10mlYEB 液体培养基中 (Str 100mg/L), 28℃震荡过夜。
(2)取 lml 活化的菌液接种于 50ml 含有抗生素的 YEB 培养基中,同样条件下培养至 OD600值为 0.4一 0.5左右。
(3)将菌液冰浴 30min 后,装至 50ml 离心管中。
(4)4℃, 5000g 离心 10min ,收集菌体。
(5)弃上清,用 lml 20mmol/L的冰预冷 CaCl2重悬沉淀,并加入 0.5ml , 80%的甘油,混匀。
(6)按每管 200ul 分装,液氮速冻后于一 70℃保存。
冻融法转化土壤农杆菌
(l)取 1ug 载体 DNA 加到 200ul 冰上溶化的感受态细胞中,轻混,冰浴 30min 。
(2)液氮中速冻 5min , 37℃水浴 5min ,再迅速冰浴 2min 。
(3)加入 800ul YEB液体培养基, 28℃轻摇 4一 6hr 。
(4)取 50一 200ul 菌液涂布于 YEB 选择平板上(含有相应的抗生素), 28℃倒置培养 2天。
1.2. 双元载体转化农杆菌 EHA105
取 1μg 左右的质粒 DNA 加入到 200ml EHA105感受态细胞中, 混匀后, 冰浴 30min , -70℃ 放置 10min 。再在 37℃水浴 5min 或 42℃水浴 1min ,接着冰浴 2min ,加入 800mlYM 液体培 养基 28℃, 175rpm 摇培 3hr 后涂在含 50μg/ml Kanamycin的 YM 平板上。 28℃培养到形成 单菌落。
其中 YM 可以用 LB 代替 ,第一次的 CaCl 2 溶液可用溶液(0.1MCaCl
2
0.01Tris-HCl
(7.0) 0.01 DTT)替代。 农杆菌的热击转化
(1) 将农杆菌从 -70oC 取出,置于冰上融化,大约 5分钟;
(2) 接入 2~3ul质粒,吸打混匀,冰上放置 30分钟;
(3) 液氮中冻 1min ;
(4) 37oC 水浴 5min ;
(5) 迅速接入冰上,放置 1-2min ;
(6) 于无菌台上加入 800ul 无抗 LB ;
(7) 28oC摇床 3-4小时,涂布平板(Kan+Rif);
(8) 28oC倒置培养 2-3天。
电击法 : 使用瞬时高压电(数千伏特)处理细胞悬液,微生物细胞膜在高压电的 作用下发生去极化, 产生微孔, 悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的孔洞进入 细胞内部。
做电击转化时,悬液中有近 70%的细胞会因电击而死亡,但是这种方法很直接, 转化效率很高。 当需要高的转化效率时, 比如制作基因文库, 可以采用电击转化, 另外,做酵母等真核生物转化时一般都是电击。
电击的时候要求溶液要有一定的电阻, 这样才能维持一定的电压、 较低的电流和 长一点的电击时间, 如果含有氯化钙, 就会增大溶液的导电性, 电击时电流过大 会使细菌受到伤害,所以电击液里要严格控制电解质的浓度。
加入甘油是为了保护细菌在冰冻储存的时候不至于受到太大伤害, 它可以减少细 胞内小冰晶的形成。
农杆菌(EHA105)电击感受态细胞的制备
1. 接种(eg.3ML ) overnight 28℃
2. 1:100放大培养(eg 。 300ML YEB中)至 OD=0.5
3. ice chilled 5000rpm 10min (冷冻离心机 , 预冷到 4℃)
4. Washed by 1mM HEPES (PH7.0) 3次 (每次 10ML)
5. 10%甘油洗一次
6. 溶于 3ML 10%甘油中 ,40u L 每管于 -70℃保存
备注 :离心管 ,dorf 管 ,HEPES, 甘油均须冰上预冷 , 所有的操作以在冰上进行为 好 .
农杆菌 EHA105感受态细胞的电击转化
(1)调节电击仪 , 使其电脉冲为 25u F, 电压为 2.5KV, 电阻为 400Ω
(2)从 -70℃冰箱中取出 EHA105感受态细胞 , 置于冰上使其融化 .
(3)加 1u L 质粒于感受态细胞中 , 轻轻混匀 .
(4)将上述菌液和 DNA 悬液加进电击杯的底部 , 迅速将电击杯放进电击仪 .
(5)按设定的参数 , 启动对细胞的电脉冲 .
(6)电击以后 , 尽快取出样品 , 加入 1ML 无抗 YEB 培养基 .
(7)将上述菌液转入 1.5MLdorf 管中 , 28℃ 2小时以上
(8)将菌液涂布在加有相应抗生素的 YEB 培养基上, 28℃培养 2-3天 , 直至菌落长 出 .
备注 :所有操作最好在冰上进行 , 电击杯电击之前在冰上预冷 .
农杆菌电击感受态的制备及电击转化
表达载体 pB-2mb-FRO-1.7A 和 pB-2mb-1.7A 空载体的农杆菌 (EHA105) 电击转 化
(1)抽提纯化 pB-2mb-FRO-1.7A 和 pB-2mb-1.7A 空载体的重组质粒
pB-2mb-FRO-1.7A 重组载体和 pB-2mβ-1.7A 空载体的 (DH5α) 菌种接种于 5ml LB (含卡那霉素 50mg/L)液体培养基中, 37℃, 200rpm 震荡培养过夜。按 V-GENE 公司的质粒提取试剂盒提取 pB-2mb-FRO-1.7A 重组质粒。
(2)取 200ml 型号的电击杯用无水乙醇浸泡,晾干。
(3)农杆菌 EHA105电击预备处理。
I. 接种于 5ml YEP (含链霉素 Sm50mg/L)液体培养基中, 28℃, 200rp m 震荡培养过夜至 OD600值为 0.4。 EHA105
II. 离心管中收集 1ml 菌液, 4℃, 8000rpm ,离心 30s 。 1.5ml
III. 去残液,沉淀用 200μl ddH2O 充分悬浮, 4℃, 8000rpm ,离心 30s 。 IV. 重复步骤ⅲ三次。
V. 去残液,沉淀用 200ml ddH2O 充分悬浮,即为电击用农杆菌 EHA105感受态。加入 200μl灭菌甘油混匀后置于 -80℃备用。
(4)电击
I. 分别取 10ml pB-2mb-FRO1-1.7A 和 pB-2mb-1.7A 重组质粒至 200μl EHA 105感受态中,轻打混匀,然后转移至电击杯中,置冰上。
II. 准备好电击装置(BioRad ),电压为 2.5V ,用手按住电击按钮,直到啪 的一声电击完毕。
III. 室温静置 2min 后加入 800ml YEP 培养液, 28℃静置 1h ,然后 28℃, 200 rpm 培养 2h 。
IV. 离心 30s , 收集菌液, 沉淀用 200ml ddH2O 悬浮, 用玻璃棒涂布含含卡那 霉素 50mg/L和含链霉素 Sm50mg/L的 YEP 固体培养基平板, 28℃培养 48h 。 80 00rpm