范文一:犬细小病毒的分离鉴定_辛秀
犬细小病毒的分离鉴定
辛
秀,常灵竹*,崔
成,邵媛媛,邹艳茹,李福强
132101)
(吉林农业科技学院,吉林吉林
摘要:从吉林市某动物医院疑似犬细小病毒感染犬的粪便样本中分离出一株病毒,该病毒能在猫肾细胞上
增殖,产生CPV 典型性细胞病变。通过血凝效价测定、血清中和试验及PCR 扩增对该病毒株进行鉴定。结果表明,该病变细胞的血凝效价为28,可被CPV 阳性血清所抑制,PCR 扩增可见650bp 目的条带,说明所分离的病毒株为CPV 。动物试验结果显示,1.5月龄犬感染CPV 第5代细胞培养物后,幼犬出现典型的临床特征,表明该毒株具有一定的致病性。
关键词:犬细小病毒;分离;鉴定中图分类号:S829.2;S852.34
文献标志码:A
文章编号:1001-0084(2012)01-0050-03
Isolation and Identification of Canine Parvovirus
XIN Xiu, CHANG Lingzhu *, CUI Cheng, SHAO Yuanyuan, ZOU Yanru, LI Fuqiang
(College of Jilin Agricultural Science and Technology, Jilin 132101, Jilin China )
nine parvovirus in an animal hospital of Jilin city. The isolate replicated on culture F81cell, and produced typical cytopathic of CPV. The virus isolate was identified to be an CPV strain by hemagglutination test, virus neutralization assay, and PCR. The results showed that HI titer was 28, the virus isolate can be inhibited by CPV positive serum, that the newly isolated was virulent to dog.
PCR detected expected 650bp band. Using the isolate at the 5th passage, an experimental infection was conducted
Key words:canine parvovirus; isolation; identification
病后的动物症状是从厌食和精神压抑开始,很快出
现大量呕吐和带血的腹泻症状,其中排泄物具有恶臭和呈现水样状,并出现下腰部疼痛、抗拒饮水、脱水、衰弱、淋巴减少等症状;患病后期则出现黄疸过低、静脉凝固等现象。病犬常由于脱水、电解液不平衡及病毒感染而造成死亡,其中幼犬因易患其他并发症而死亡率较高[4]。本试验于2010年7~9月收集吉林市某动物医院疑似CPV
感染犬的粪
Abstract:A strain of virus was isolated from the feces samples collected from the sick dogs infected with ca ?
in CPV antibody-free dogs with age of 1.5months. The dogs showed typical clinical syndromes of CPV, indicating
犬细小病毒病是由犬细小病毒(CPV )引起的一种急性、以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征的犬科和鼬科动物的传染病[1]。犬细小病的潜伏期为7~14d ,多发生在动物刚换环境后,一般来说饮食过多是导致该病的原因。该病多数呈现肠炎综合征,少数呈现心肌炎综合征,且心肌炎多以幼犬出现,发病率为50%~100%,死亡率为10%~50%,对养犬业危害很大[2-3]。临床检验发现,患
收稿日期:2011-04-02
基金项目:吉林农业科技学院大学生科技创新项目(2010026)
作者简介:辛秀(1988—),女,吉林辽源人,研究方向为预防兽医学。*通讯作者:副教授。
50
饲料博览2012年第1期
便,从中分离到1株CPV 的流行毒株。1材料与方法1.1试验材料
从吉林市某动物医院病例中选择临床表现有体温升高、呕吐、血样腹泻、脱水等症状的疑似CPV 感染的病例中采集粪样。猫肾细胞(F81)由吉林大学病理实验室惠赠。试验动物购自吉林市某养犬场同窝、未免疫幼犬,CPV HI 抗体均<2。mem 购自gibco="" 公司,8%mem="" 生长液,2%mem="" 维持液,消化液为0.25%胰蛋白酶edta="" ,胶体金试纸条购自北京世纪元享动物防疫技术有限公司。cpv="">2。mem>
取疑似CPV 感染犬的粪便,按照胶体金试纸条的使用说明进行检测。1.2.1病毒分离
将胶体金试纸条检测呈阳性犬的粪便用500μL 生理盐水稀释,在离心机上离心20min ,取上清液,加入双抗200μL ,4℃过夜,离心20min ,取上清接毒。将处理过的病料接种于F81细胞,将长满的细胞单层弃上清,胰蛋白酶消化液消化,弃消化液,用适量2%MEM 液充分吹散细胞,按1%接毒量接种处理过的病料,置于37℃5%CO 2恒温箱中培养,逐日观察细胞病变(CPE ),整个过程设有对照[5]。培养5d 后,若无病变则继续盲传7代,仍无病变者废弃。1.2.2血凝效价的测定
将出现明显病变的细胞培养物进行血凝效价的测定。用滴管向V 型96孔微量血凝板第1排的1~12孔内各加稀释液25μL ,随后用微量稀释棒蘸取待检培养物,放入第1孔,充分捻转混合后移至第2孔,如此逐孔捻转稀释到第11孔,第12孔不加待检培养物,作为红细胞对照。随后每孔再加稀释液25μL 和1%猪红细胞悬液50μL ,于微型振荡器上振荡混匀,静置1h 后观察结果,以能凝集50%红细胞的最高稀释倍数为凝集终点[6-7]。1.2.3血清中和试验
56℃水浴30min 灭活阴性和阳性血清,并将病毒液稀释至200TCID 50·100μL -1作为抗原,将灭活的CPV 阴性、阳性血清用MEM 培养液2倍稀释,加在96孔U 型细胞培养板的孔中,加入等体积的抗原,混匀后37℃感作1h ,接种长满单层
的F81细胞于U 型细胞培养板,每个稀释度接种4孔,100μL ·孔-1,设抗原对照孔,逐日观察细胞病变。
1.2.4PCR 鉴定
参照易立试验的引物序列合成1对引物,扩增片段为650bp ,由上海生物工程技术服务有限公司合成[8]。引物1:5′-GAAGAGTGGTTGTAAATA ?ATT-3′,引物2:5′-CCTATATAACCAAAGTTAG ?TAC-3′。
1.2.5动物接种
将6只幼犬分成试验组和对照组,每组3只。试验组动物口服分离细胞培养病毒3mL (病毒效价为200TCID 50·100μL -1);对照组动物口服生理盐水3mL ;在感染后分开饲养,每天观察临床表现,检查其体温、呼吸、精神、食欲与粪尿等情况。2试验结果
2.1病毒分离结果
将处理后的病料接种F81细胞后,盲传5代出现细胞病变,表现为细胞圆缩、游离、脱落,见图1-b ,对照的F81细胞呈多角形紧密排列、折光性强,生长旺盛,见图1-a 。
a. 未接毒细胞形态
a
b. 接毒后病变细胞形态
b
图1CPV 致F81细胞株单层细胞病变
2012年第1期饲料博览
51
2.2
血凝效价的测定结果
用新鲜的猪红细胞测得盲传5代后的CPV 分离株的血凝效价为28。2.3血清中和试验结果
盲传5代后的CPV 分离毒株与CPV 阳性血清作用后,未出现细胞病变;分离毒株与CPV 阴性血清作用后,出现病变;抗原对照的F81细胞全部出现病变;正常细胞对照生长正常,说明该分离毒株可被CPV 阳性血清中和。2.4PCR 鉴定结果
将CPV 病毒分离株提取核酸经过PCR 检测,在650bp 的位置有目的带出现,见图2。
20001000750500200
100
1
2
CPV 能在原代、次代猫肾细胞、犬胎肾细胞、脾细胞、胸腺细胞、肠管细胞和水貂肺细胞等细胞内增殖和传代[9]。本试验选用猫肾细胞F81进行病毒的增殖和分离,结果显示病料接种F81细胞后,盲传5代出现细胞病变,表现为细胞圆缩、游离、脱落。
通过对吉林市宠物医院病犬的调查发现,CPV 感染仍然较为普遍,病犬常表现为肠炎和心肌炎,抗拒饮水、脱水、衰弱、淋巴减少等症状,也会出现呕吐、腹泻等临床症状,严重时还会出现神经症状。CPV 疫苗的应用曾控制了本病的流行,但近年来接种过CPV 疫苗的幼犬也常患病,这多是由免疫覆盖率不够及免疫失败所造成的[10]。且CPV 在免疫选择压力下易通过抗原变异而产生新的突变株,这为犬细小病毒病的防治带来很大不便[11]。本研究分离得到的病毒株为犬细小病毒的流行毒株,为犬细小病毒疫苗的研制提供了新的材料基础。
[参考
文
献
]
图2病毒分离PCR 检测结果
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2.5
动物试验结果
用病毒分离株感染幼犬后第5天,试验组均发病,表现为连续拉稀便、身体脱水、精神沉郁、食欲废绝;对照组健康。在感染后第10天将病犬扑杀剖检,发现空肠和回肠局部充血、脾肿大、肠系膜淋巴结水肿,符合犬细小病毒病剖检特征。说明该分离株有较强的致病性。3讨论
本试验通过采集疑似CPV 感染犬的粪便,经处理后接种于猫肾细胞分离病毒,然后通过血凝试验、血清中和试验、PCR 扩增试验、动物接种试验等方法对所分离的病毒株进行了鉴定。结果表明,该CPV 分离株血凝效价>128,可被CPV 阳性血清所抑制,PCR 扩增可见650bp 目的带。动物试验结果显示,1.5月龄犬感染该CPV 分离株后,出现明显的临床病变特征,说明所分离株有较强的致病性。因此,所分离的病毒株是有致病性的犬细小病毒。
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sis reveals the emergence, evolution and dispersal of carnivore
52
饲料博览2012年第1期
范文二:犬细小病毒的分离鉴定_杜强
动物医学进展,2009,30(3) :55258Progress in Veterinary Medicine
犬细小病毒的分离鉴定
杜 强1, 邱 薇2, 范泉水2, 刘 华1, 李作生1, 郑 颖1, 张富强1
(1. 云南农业大学动物科技学院, 云南昆明650201;2. 成都军区疾控中心军事医学研究所, 云南昆明650032)
摘 要:用猫肾(F81) 细胞从沈阳某养犬场病死犬的肠内容物中, 分离到1株细小病毒。根据犬细小病
毒(CPV ) V P2基因的核苷酸序列设计合成了两对特异性引物, 对分离的病毒株进行PCR 扩增, 分别得到846bp 和815bp 的2个片段,PCR 产物经纯化后测序, 测序结果与GenBank 中已发表的CPV 参考株PL I 2IV (typeFPV ) 、CPV 2b (type2) 、V154(type2a ) 、L CPV 2V204(type2b ) 、L CPV 2V139(type2c (a ) ) 和L CPV 2V203(type2c (b ) ) 的V P2基因序列相比较, 根据分析比较的数据结果, CPV 22a 亚型。
关键词:犬细小病毒; 分离; 鉴定
中图分类号:S852.659. 2;S858. 292
文献标识码:A
:100725038(2009) 0320055204
犬细小病毒病(Canine parvovirus ) 犬细小病毒(Canine parvovirus , ) 急性、1、发病急、病程短、、病死率高, 是危害养犬业最为严重的传染病之一, 可造成严重的经济损失。
CPV 为无囊膜、单链负股病毒, 基因组长5323bp , 由3个结构蛋白V P1、V P2和V P3组成。其中V P2是其保护性颗粒抗原。已有研究表明V P2可诱导犬产生中和抗体, 并能保护犬抵御强毒
1. 1 试剂和细胞
Taq 酶及其他分子生物学试剂购自上海生工生
物工程技术服务有限公司; 猫肾细胞(F81细胞) 、细小病毒毒种由本室保存。1. 2 引物
根据CPV V P2的全基因组核苷酸序列, 用DNA Man 软件设计并合成了两对引物:
P1:5′2GGA T GGGT GGAAA TCACA G 23′P2:5’2A TAACCAACC TCA GCT GGT 23′P3:5′2TCCA GAA GGA GA T GGGA T T 23′P4:5′2CCAACCAACCACCCACACCA T 23′1. 3 CPV 的分离
的攻击。该病毒粒子很小, 直径20nm ~22nm , 呈
二十面体对称。在氯化铯中的浮密度较大, 为1. 39g/cm 3~1. 42g/cm 3。核酸分子质量为1. 5×106~2. 0×106, 碱基中G +C 的含量占总量的41%~53%。1978年Apple M J G 等首先于美国分离到犬细小病毒(CPV ) , 因其与1970年Binn 等分离的犬细小病毒1型(CPV 21) 型不同, 所以定名为CPV 22型。随后又出现CPV 22a 和CPV 22b 两个亚型[3]。1982年徐汉坤等[4]首先报道了该病的流行。目前, 在国内由于疫苗的广泛使用, 犬细小病毒病的流行基本得到控制, 但仍时有发生, 呈散发的特点。
本试验从1只病死犬的肠内容物中分离到1株细小病毒, 通过对该株病毒V P2基因的序列分析, 为近期CPV 的流行调查提供一定的参考依据, 并为进一步探讨CPV 的抗原变异奠定基础。
[1]
[2]
取病犬的肠内容物, 用Hanks 液制成1∶10的乳剂, 离心10min , 取上清, 经0. 22μm 微孔滤膜过滤后, 按培养液体积的1/10量接种刚传代的F 281细胞,37℃吸附1h 后, 换维持液继续于37℃静置培养4d ~5d , 每天观察有无细胞病变。如无病变, 则于培养的第4天至第5天收取上清, 细胞继续按常规传代培养, 至第5代仍无病变视为分离阴性, 出现细胞病变的经-20℃/37℃反复冻融3次收毒, 置-20℃备用。用此方法反复增殖病毒, 用于提纯病毒。1. 4 电镜观察
细胞液中病毒反复冻融3次后收毒, 经20g/L
3收稿日期:2008210227
作者简介:杜 强(1982-) , 男, 山东泰安人, 硕士研究生, 主要从事分子病毒学研究。
56动物医学进展 2009年 第30卷 第3期(总第188期)
磷钨酸负染后, 电子显微镜观察病毒粒子的形态。
1. 5 血凝效价的测定
取干净的V 型96孔微量血凝板一块, 用滴管向第1排的1孔~12孔内各加稀释液1滴(25μL ) , 随后用微量稀释棒蘸取待检培养物, 放入第1孔, 充分捻转混合后移至第2孔, 如此逐孔捻转稀释到第11孔, 第12孔不加待检培养物, 作为红细胞对照。随后每孔再加稀释液1滴(25μL ) 和1%猪红细胞悬液2滴(50μL ) , 于微型振荡器上振荡混匀约1min , 再于4℃静置2h 后判定。以能凝集50%红细胞的最高稀释倍数为为凝集终点。1. 6 模板病毒DNA 抽提
用“小量组织/细胞基因DNA 抽提试剂盒”进行抽提, 制作模板DNA 。1. 7 PCR 扩增
μL , MgCL 25L PCR 反应体系:10×buffer 5dN TP 4μL , 上游引物1μL , L , 0. 5μL , 无菌蒸馏水, μ。用
回收, 回收产物由上海生工生物工程技术服务有限
公司进行序列测定。1. 9 序列分析
用DNA Man 软件对测序结果进行比较分析。
2 结果
2. 1 病毒的分离
正常猫肾F81细胞传代48h 后可长成致密的单层, 细胞呈多角形, 紧密排列, 细胞折光性强, 呈旺盛的生长趋势(图1) 。接种病毒24h 后胞核有明显空泡样变, 细胞从培养瓶壁上脱落, 贴壁细胞边缘界线呈梭形, 细胞呈拉网状。72h , 细胞间隙明显, , 核空泡(, 剩余的细小病毒样粒子, 大小约nm (图3) 。2. 2 血凝效价
用新鲜的猪红细胞测得该细小病毒分离株第5代毒的血凝效价为27, 本室保存的另两株细小病毒血凝效价分别为26和28。2. 3 PCR 扩增结果
用合成的两对引物, 对分离的细小病毒株进行PCR 扩增,P1和P2扩增得到846bp 的片段, P3和P4扩增得到815bp 的片段(图4)
。
石蜡油覆盖。反应条件:96℃3min ;96s ,5230s ,72℃60s ,30个循环; 最后再72延伸10min 。取10μL PCR 产物加1μL 电泳上样缓冲液上样, 以70V/cm ~80V/cm 进行琼脂糖凝胶电泳后, 在紫外灯下观察
结果。
1. 8 PCR 产物的回收及序列测定
将PCR 产物进行电泳后, 用胶回收试剂盒进行
) ) 图1 正常F81细胞(400×图2 接毒48h 后病变F81细胞(400×
) Fig. 2 The cytopat hic cells 48h after viral inoculation (400×) Fig. 1 Normal F81cells (400×
2. 4 序列分析
对该株病毒的PCR 产物进行回收和序列测定,
将其核酸序列及推导的氨基酸序列与CPV 参考株PL I 2IV (D88287) 、CPV 2b (M38245) 、V154(AB054217) 、L CPV 2V204(AB054221) 、L CPV 2
V139(AB054222) 和L CPV 2V203(AB054224) 进行了比较(表1和表2) , 并且对各毒株V P2基因在氨
基酸水平上的变异数量及同源性进行了比较(表3) , 从表中可看出此次分离到的该株CPV 为CPV 22a 亚型。
杜 强等:犬细小病毒的分离鉴定57
M. DNA 标准DL 2000;1. P1和P2扩增片段;2. P3和P4扩增片段
M. DNA Marker DL 2000;1. The fragment of P1,P2The fragment of P3,P4
) 图3 无囊膜的细小病毒粒子(80000×图4 PCR ) Fig. 4 elect product s Fig. 3 None 2capsular virion of CPV (80000×
表1 各毒株VP2Table 1 The comparison of base sites in CPV 毒株
St rains CPV PL I 2IV CPV 2b V154LCPV 2V204LCPV 2V139LCPV 2V203
239G A G G
259T A T T T T
279C A C C C
302C C C C
308C C C C C C
T T G G G G
G C C G G A A
T G G T T T T
967A G A A A A A
1276A A A A G A G
1684G C G G G G G
1691G A G G G G G
1703G C G G G G G
表2 各毒株VP2基因的氨基酸位置比较
Table 2 The comparison of amino asid sites in VP2gene among CPV strains
毒株
St rains CPV PL I 2IV CPV 2b V154LCPV 2V204LCPV 2V139LCPV 2V203
80R K R R R R R
87L M M L L L L
93N K N N N N N
101T T I T T T T
103A V A A A A A
氨基酸位置 Amino acid sites
297A S S A A A A
300G A A G G D D
305Y D D Y Y Y Y
323N D N N N N N
426N N N N D N D
562V L V V V V V
564S N S S S S S
568G A G G G G G
表3 各毒株VP2基因在氨基酸水平上的变异数量及同源性
Table 3 The mutations and homology of amino acids in VP2gene among different strains
毒株
Strains CPV PL I 2IV CPV 2b V154LCPV 2V204LCPV 2V139LCPV 2V203
CPV
CPV 22a 15/97. 43%10/98. 29%3/99. 49%6/98. 97%5/99. 14%6/98. 97%
PL I 2IV 15/97. 43%9/98. 46%12/97. 95%13/97. 77%11/98. 12%12/97. 95%
CPV 2b 10/98. 29%9/98. 46%7/98. 80%8/98. 63%6/98. 97%7/98. 80%
V1543/99. 49%12/97. 95%7/98. 80%3/99. 49%2/99. 66%3/99. 49%
LCPV 2V2046/98. 97%13/97. 77%8/98. 63%3/99. 49%3/99. 49%2/99. 66%
LCPV 2V1395/99. 14%11/98. 12%6/98. 97%2/99. 66%3/99. 49%1/98. 83%
LCPV 2V2036/98. 97%12/97. 95%7/98. 80%3/99. 49%2/99. 66%1/98. 83%
3 讨论
3. 1 关于电镜观察技术
按50∶1的比例混合, 容易观察到凝集的免疫复合体。如果不加高免血清而单纯负染观察, 只能观察到单个粒子或2个~3个粒子集在一起, 并且极难找到, 即使找到病毒粒子, 也很难确认。可以肯定, 猫
接毒的猫肾细胞培养物与兔抗CPV 高免血清,
58动物医学进展 2009年 第30卷 第3期(总第188期)
肾细胞培养物中含有大量的CPV 粒子, 兔抗CPV 高免血清以50倍稀释为宜。这给其他血清学检测方法提供了参考依据。3. 2 关于CPV 感染的季节性
CPV 极易在春秋和冬季天气骤变时易在犬群
酸变成了缬氨酸。这两处氨基酸变化是否引起生物学特性改变还有待研究。最后一处为555位氨基残基由异亮氨酸变成缬氨酸, 目前分离的CPV 22a 亚型毒株中第555位氨基残基一般都为此种变异。
本试验通过该株病毒V P2基因的序列分析, 为最近时期CPV 的流行调查提供了一定的参考依据, 并为进一步探讨CPV 的抗原变异奠定了基础。
中流行, 主要由于环境中的CPV 不能被自然界中紫外线杀死, 同时天气变化对幼犬产生应激, 导致CPV 易在春秋和冬季流行的特点。因此, 在CPV 易发季节要加强幼犬的饲养管理, 同时要注重对幼犬的免疫保护。
3. 3 关于序列比较
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道
[8]
,CPV 22到CPV 22a 、CPV 22b , 只有几个碱基发
生了变异, 抗原则发生了变异。本试验测定了CPV 2V P2基因的169bp ~1014bp 与1227bp ~1755bp 之间的序列, 参照分型标准[829]确定该株病
毒为CPV 22a 亚型。
与标准毒株CPV 2b (type2a ) 相比只有3个氨基酸发生了变异, 一处为第324位氨基残基由酪氨酸变成了异亮氨酸, 另一处为334位氨基残基由丙氨
国兽医学报,2004,24(5) :4212424.
[11] 邱 薇, 李作生, 范泉水, 等. 犬细小病毒VP2基因的比较及分
型研究[J].动物医学进展,2005,26(5) :69272.
Isolation and Identif ication of a C anine parvovirus Strain
DU Qiang 1,Q IU Wei 2,FAN Quan 2shui 2,L IU Hua 1,L I Zuo 2sheng 1,
ZH EN G Ying 1,ZHAN G Fu 2qiang 1
(1. College of A ni mal S cience , Yunnan A g ricult ural Universit y , Kunmi ng , Yunan , 650201, China;
2. T he Military Medical I nstit ute of Cheng 2du Military A rea , Kunming , Yunnan , 650032, China )
Abstract :A st rain of canine parvovirus was isolated f rom t he feces of a dead dog. Two pairs of primers of t he V P2gene were designed according to t he sequence of CPV p ublished in GenBank , two gene f ragment s about 800bp were amplified in t his st udy. After sequencing and analysing t he sequence of t hese frag 2
ment s ,t he result was compared wit h GenBank CPV reference st rains PL I 2IV (typeFPV ) , CPV 2b (type2) , V154(type2a ) ,L CPV 2V204(type2b ) L CPV 2V139(type2c (a ) ) and L CPV 2V203(type2c (b ) ) . This st rain was defined as a CPV 22a hypotype according to t he data of t his st udy. K ey w ords :Canine parvovirus ;isolation ;identificatio n
范文三:犬细小病毒的分离与鉴定
犬细小病毒的分离与鉴定
摘要:采用细胞培养法对疑似犬细小病毒的粪便和内脏进行了分离和鉴定,并对分离到的病毒进行生物学特性鉴定和动物回归试验。结果共分离到3株CPV ,分离株在猫肾细胞F81产生明显细胞病变,血凝效价达1∶27~1∶210,细胞病变能被犬细小病毒阳性血清所抑制,接种幼犬后,分离株3可以引起试验犬发病死亡。
关键词:犬细小病毒;分离;鉴定
犬细小病毒(Canine parvovirus ,CPV )属于细小病毒科细小病毒属,为单股、负义、线形无囊膜的DNA 病毒[1]。CPV 可引起犬的出血性肠胃炎和心肌炎,并使白细胞大量减少,在幼犬中的发病率和死亡率都很高[2]。CPV 对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力,在4~10 ℃存活6个月,37 ℃存活2周,56 ℃存活24 h ,80 ℃存活15 min ,在粪便中可存活数月至数年[3];该病毒对乙醚,氯仿和醇类有抵抗力[4]。CPV 一年四季均可发病,以冬、春多发[5],饲养管理条件骤变、长途运输、寒冷、拥挤均可促使该病发生[6]。病犬是主要传染源,其呕吐物、唾液、粪便中均有大量病毒[7]。根据临床症状和血清学反应,可做出准确诊断[8-13]。本研究通过对山东毒株分离,并对其部分生物学特性进行研究,为该病的防治和后续研究提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 DMEM 培养基为Gibco 产品;小牛血清、谷氨酸胺、双抗、胰蛋白酶等购自大连宝生物TaKaRa 有限公司;其他化学试剂均为分析纯试剂。
1.1.2 病料 病料为2009~2011年聊城大学兽医院收集或其他养犬场送检的可疑CPV 病料,包括20份粪便样品和10份脏器。
1.1.3 试验动物和细胞 8只40~50日龄的山东细犬幼犬(抗CPV HI抗体效价小于1∶4),健康状况良好;猫肾传代细胞系(F81)和犬肾传代细胞系(MDCK )等由聊城大学农学院实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 试剂的配制
1)1%猪红细胞悬液的制备。用20 mL注射器内吸入阿氏液3~5 mL,于健康猪前腔静脉采血10~15 mL ,立即混匀,4 ℃保存备用。使用时用PBS 洗涤保存的猪红细胞,1 000 r/min离心5 min,洗涤3次,取红细胞泥1 mL 加稀释液100 mL,再加入小牛血清白蛋白0.1 g,即为1%猪红细胞悬液。
2)HA 抗原配制。用移液器向V 型血凝板每孔加稀释液25 μL,然后吸取25 μL经福尔马林灭活的CPV 细胞培养物,在血凝板上倍比稀释,最后1孔不稀释,作为阴性对照;接着每孔加稀释液25 μL和1%猪红细胞悬液50 μL,于振荡器上振荡1 min混匀,于4 ℃冰箱静置1~2 h,待红细胞完全沉淀后判定。判定的方法是以50%红细胞凝集为终点,在对照孔红细胞完全不凝集,呈圆形小点
范文四:犬细小病毒的治疗方法
犬细小病毒的治疗方法
犬细小病毒的治疗方法:
一体温正常型:吐、拉血
1.庆大霉素、三磷酸腺苷、VB6葡萄糖盐水或氯化钠生理盐水混合静滴。呕吐次数多加氯化钾静滴或白金素(前期)、干扰素(中后期)。
2.静注止血芳酸或抗炎双因子(快速修复受损的胃肠黏膜,恢复功能,止吐止血,消炎抗菌)。
3.混合肌注安络血、维生素K3 4.肌注盐酸消旋山莨菪碱(即6542)原理:通过抑制胃酸分泌和胃肠剧烈蠕动来达到止吐目地,给口服药物一个吸收机会来发挥药效。
5.内服犬病一剂康口服液 (主要成分:黄连、白头翁、霍香、云南白、人参、免疫诱导剂、胸腺肽、转移因子、增效因子、黄芪多糖)连服5-7天。
应用原理: 免疫诱导剂、能诱导产生干扰素,抑制病毒神经氨酸酶的活性,抑制病毒DNA.RNA的复制,从而抑制病毒在细胞内的繁殖及扩散,同时能刺激机体B细胞和T细胞,增强淋巴细胞杀伤靶细胞的功能,具有广谱抗病毒作用。对变异性犬细小病毒病毒亦有效,转移因子、胸腺肽解除特别是犬长途运输等引起的免疫抑制,让病犬自行提高抗体水平,缩短疗程。
同时黄连、白头翁杀菌、止泻、霍香止呕、肠壁维护因子快速在胃、肠表面形成保护膜,云南白药止血、促进胃肠粘膜再生、溃疡面愈合,人参生脉引抗贫血、防止体温下降、心衰,等多种作用,抗病毒,提高免疫,止血,止吐,止泻,保护胃肠粘膜多种功能,这正是犬细小病毒,冠状病毒性胃肠炎对症治疗的需求。既减少了用药种类,保护了肝肾,又减少了医生临床对症治疗用药种类繁多的麻繁。
6.禁水4-----5天首先,在呕吐及下痢症状缓和前应该让病患禁水,因为水会刺激发炎的胃肠道,反而会引起更激烈的呕吐及下痢的发生。
二.休克状态或体温降低型: 1.静滴复方氯化钠、干扰素和胸腺素,抵抗病毒提高免疫力。
2.庆大霉素、三磷酸腺苷、VB6葡萄糖盐水或复方林格氏液混合静滴。
3.静注止血芳酸或抗炎双因子(快速修复受损的胃肠黏膜,恢复功能,止吐止血,消炎抗菌)。
4.混合肌注安络血、维生素K3。
5.肌注盐酸消旋山莨菪碱(即6542)原理:通过抑制胃酸分泌和胃肠剧烈蠕动来达到止吐目地,给口服药物一个吸收机会来发挥药效。
6.内服犬病一剂康口服液(主要成分:黄连、白头翁、霍香、云南白、人参、免疫诱导剂、胸腺肽、转移因子、增效因子、黄芪多糖)连服5-7天,禁水4-----5天。
三.发烧气喘吐泻混合型: 1.静滴0.9%氯化钠、头孢曲松钠、地塞米松或抗炎双因子,应用原理:(防止继发心肌炎)。
2.干扰素和胸腺素,抵抗病毒提高免疫力。
3.混合肌注安络血、维生素K3。
4.肌注盐酸消旋山莨菪碱(即6542)原理:通过抑制胃酸分泌和胃肠剧烈蠕动来达到止吐目地,给口服药物一个吸收机会来发挥药效。
5.内服犬病一剂康口服液,连服5-7天,禁水4-----5天。
德米奇注射液(进口原料分装) 主要成份:多西环素、进口原料 应用原理:杀灭细菌与付红体、弓形体混合感染 产品特点:进口佐剂吸收率高、注射后犬脖子不肿,应激小。
临床应用: 犬肺炎,喘气病,鼻炎,付红细胞体,弓形体,产后感染,乳房炎,脐带炎,子宫内膜炎,细菌性肠炎,下痢,关节炎,水肿及病毒性疾病并发,每公斤体重0.2ml。
呼原净注射液(进口原料分装) 主要成份:红霉素、磺安间甲氧进口原料,连续注射三天。
应用原理:杀灭细菌与支原体混合感染 产品特点:进口佐剂吸收率高、注射后犬脖子不肿。
复方抗感染,主要用于各种急慢性呼吸道病,鼻炎,弓形虫病,各种复杂混合性感染和病毒性感染并发症.每公斤体重0.2ml。
治疗大计量注射单克隆抗体,假如是小型犬一天2支中大型4只,用个10天15天就不用再扎了,没有用了,换成人用药小牛胸腺肽是增强免疫力的 抗病毒的:利巴伟林,病度灵(利巴是最好的) 消炎的:先从最不好的青霉素类开始用,然后用一代头孢,二代,三代没种不能超过7天要不会出现耐药现象。
注意事项 1.拉稀可以口服磷霉素钙还有庆大往屁股眼里注射; 2.发烧用地塞米松发的时候扎不发不扎; 3.建议点滴比皮下快的多的多; 4.口服清开灵或双簧连; 5.要是抽搐了但是还有吃饭的欲望; 6.不要放弃:用吡拉西坦,苯妥英纳,笨巴比妥具体用药应看狗的症状去咨询当地宠物医生来配计量中药可以用牛黄安宫丸和羚羊角注射液; 7.再加点营养神经的三磷酸腺酐和辅酶A; 8.千万记住要是见好不能停药,要是到后期狗贫血还没好的话,那就没够戗了; 9.这个病主要是防止继发感染,犬瘟热都是死于并发症; 10.环境好要,勤清洗犬笼,吃增加抵抗力的东西加油吧;
范文五:犬细小病毒的治疗方法
犬细小病毒的治疗方法.
本来早就想把细小病毒的治疗方法写出来了,但是一直没有时间,这段时间由于我身体不好,在家休息,所以就有大把的时间了.
首先说明几点:1:本人不是宠物医生,只是在我很小的时候家里就养猫和狗,积累的一些经验,至少比那些庸医要强一些.
2:用人不疑,疑人不用.持怀疑态度的不要来,不要多问,我懒烦得.
3:本文只是个参考作用,还有很多很好的方子.
家里的狗出现以下症状就要注意了,因为越早治疗,治愈的机会越大.
频繁的呕吐,拉稀.等到拉肠黏膜了,拉血了,就有些晚了.所以一发现有这些症状就要赶快就医了.等到症状明显了,其实是很难治疗的,钱也白花了.
细小的症状有二: 1:肠炎型:自然感染的潜伏期为7-14天,病初表现发热(40℃以上)、精神沉郁、不食、呕吐。初期呕吐物为食物,即之粘液状、黄绿色或有血液。发病一天左右开始腹泻。病初粪便呈稀状,随病状发展,粪便呈咖啡色或番茄酱色样的血便。以后次数增加、里急后重,血便带有特殊的腥臭气味。血便数小时后病犬表现严重脱水症状,眼球下陷、鼻境干燥、皮肤弹力高度下降、体重明显减轻。对于肠道出血严重的病例,由于肠内容物腐败可造成内毒素中毒和弥散性血管内凝血,使机体休克、昏迷死亡。血相变化,病犬的白细胞数可少至60-90%(由正常犬的1.2 万/立方毫米减至4000个以下)。
2:心肌炎型,多见于40日龄左右的犬,病犬先兆性症状不明显。有的突然呼吸困难,心力衰弱,短时间内死亡;有的犬可见有轻度腹泻后而死亡。
细小主要是通过粪便和尿液传播.所以得了细小的狗也要注意不要再继续传染给别的狗了.得病之后一定要禁食禁水.因为此时肠胃已经受到细小病毒的侵害了,不要在继续刺激肠胃.
用药:
这是最基本的药,和葡萄糖一起吊针.可上午吊一次,也可上下午个一次.
如果狗拉的很厉害的话,就上午吊葡萄糖,下午吊一瓶
这个效果其实是很好的,我家的狗上午拉的和流水一样,吊了一瓶之后马上就止住了,当然,我们家的狗是成年狗,抵抗力比较强,而且发现的早,送医及时.
另外这俩种药也是止拉稀的:
下面再说俩种关键性的药,也是必不可少的,价钱也有点小贵.
血清和白蛋白可以一天一次,也可以一天俩次,可以根据狗的病情.这个是肌注的,自己在家就可以完成,我家的狗是我打的,还好,没叫,只是白蛋白打了很疼.
有很多庸医现在给狗治细小都不知道打血清,那只有等死.
这俩种药是非常非常重要的.虽然贵(血清50一瓶),但是效果也非常的好,一般需要十瓶.按5天的量算的.
有的狗会拉血拉的非常厉害,就用这个止住:
光是靠简单的消炎是止不了拉血的.
还有的狗是呕吐的特别厉害,这也是很不好的,对胃的刺激非常大,这时用:
一定要积极的治疗,不可以偷一点点的懒,狗病的这一个星期我由90斤降到87斤,对我们也是很大的折磨和考验.不过现在我又长回来啦.走出那个宠物医院的时候,我发下誓言:今生今世再也不踏进此地一步.
我也经常对我家的狗宝说:你一定要争气一点,不要再生病了,医生宰我们太狠了.
在这个重要的时刻我也很想问候一下,那位医生:你真他妈的不是东西~!真他妈的缺德.
我家狗只打了四天的针,因为好的实在是太快了,之后还要注意狗的饮食问题和消毒问题.也不容忽视哟,也是非常非常重要的.下次再来听我的讲座吧.
以上只是个人意见,只供参考,没有搬门弄斧之意.
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