1.2.1瓜蒌子饼粕的制取
先将瓜蒌子在65?恒温干燥箱中干燥3h,去皮。用捣碎机将瓜蒌子仁粉碎。利用微博辅助的方法去除粉碎仁中的油脂,有机溶剂为正己烷,操作时料液比1:7,中火,提油时间9min。之后提取液用真空泵抽滤,滤渣即为瓜蒌子饼粕。
1.2.2提取液浓度的选择
参考文献得出初步试验条件。按10:1的液料比,称取饼粕4g和量取HaOH提取液40ml,混匀于烧杯中。将烧杯被至于60?水浴锅内,同时设定烧杯内转子搅拌速度200RPM,提取蛋白120min。在0.05%,0.1%,0.5%,1%,1.5%五个水平下提取蛋白。将每个水平下的提取试验完成,后用冷冻离心机离心提取液,离心条件为12000r/min,4?,离心15min。离心完成,取上清液100ul于具塞试管1号中,用pH=6.81的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释100倍,因为浓度
-1为0.02~0.5mol?LpH为6.8的磷酸缓冲液为蛋白溶剂,对蛋白与考马
[7]斯亮蓝结合后的线性无影响,用漩涡混匀器混匀后取60ul溶液于具塞试管2号中,加入考马斯亮蓝溶液,漩涡混匀器混匀后在波长595nm下测吸光值,加考马斯亮蓝液到测吸光值的过程要在3min内完成,因为溶液刚倒入比色杯时,溶液吸光变化比较大,在3min到5min
[7]内比较稳定。测三组平行吸光值,取平均值。用提前做好的BSA(牛
2血清白蛋白)标准曲线,R=0.991,回归方程y=0.007x+0.039,算的吸光值对应的蛋白量Pr。
A,0.039提取液蛋白含量Pr(ug)= 0.007
——A,是提取液稀释后的吸光值
算得的五水平下提取液蛋白含量相比较。蛋白含量最高组对应的提取液浓度即是选定的提取液浓度。
来自任丽的论文
[9]1.2.1 瓜蒌籽种仁脱脂
将瓜蒌籽手工脱壳后将种仁破碎研磨成浆状,用其质量体积比1:7的正己烷微波萃取9分钟,为避免萃取瓶温渡过高产生安全隐患可将操作时间分三段进行,第一次4分钟,第二次3分钟,第三次2分钟。然后将得到的蛋白正己烷溶液进行抽滤,滤渣保存下来用于试验后面步骤种仁蛋白的提取,滤液为瓜蒌籽油脂正己烷溶液,正己烷可回收重复利用一次。此脱脂过程进行三遍。最后将脱脂粉于-60?冷冻干燥24小时,再磨成细粉直至通过60目筛子(0.3mm),粉末于阴凉处保存用于种仁蛋白质的提取和加工性质、氨基酸、蛋白质二级结构的分析。
1.2.2 瓜蒌籽种仁分离蛋白的制备
使用传统的碱溶酸沉法获得分离蛋白。首先将瓜蒌籽种仁粉末用去离子水(w:v=1:10)溶解,得到的水溶液用1mol/L NaOH调pH值至10后在室温下用磁力搅拌器轻轻搅拌1h,于5000rpm、4?离心15min,此提取过程重复两次,以最大限度提取滤渣中的蛋白质。提取完成后将第一次和第二次提取的上清液均匀混合,用1mol/L HCl调pH值至4.5后在4?条件下保存1小时进行等电沉淀(清蛋白的
等电点约为pH=4.3,球蛋白的等电点约为pH=5.1,醇溶蛋白的等电点约为约为pH=4.7,谷蛋白的等电点约为pH=4.5)1小时后将得到的沉淀在5000rpm、4?条件下离心15min,用去离子水洗涤沉淀使蛋白恢复,然后将溶液的pH值调至7.0,60?下冷冻干燥48h,于4?贮存直至使用。
蛋白质提取方法
三色竹芋的蛋白质组学研究 一、蛋白质的提取 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20?的条件下过夜,然后离心(4?8000rpm以上1小时)弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4?8000rpm以上1小时),然后真空干燥沉淀,备用。 4、上样前加入裂解液,室温放置30分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(15?8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4?待用。 5、用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入-80?备用。 药品: 提取液:含10TCA和0.07的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml),使用前再加入1M的DTT65ul/ml。 种苗蛋白质样品的提取按Davermal等(1986)的方法进行。 100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40聚乙烯吡咯烷酮及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10 三氯乙酸(丙酮配制,含10mM即0.07β-巯基乙醇),混匀,-20?沉淀1小时,4?,15000 r/min离心15 min,弃上清,沉淀复溶于1.5ml冷丙酮含10 mMβ-巯基乙醇,再于-20?沉淀1小时,同上离心弃上清,(有必要再用80,丙酮含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。 按每mg干粉加入20μl(可调) UKS液9.5 M尿素,5mM碳酸钾,1.25SDS,0.5DTT二硫苏糖醇,2 Ampholine Amersham
Pharmacia Biotech Inc,pH3.5-10,6 Triton X-100,37?温育30min,期间搅动几次,28度 (温度低,高浓度的尿素会让溶液结冰)16000 r/min离心15 min,离心力越大时间长一点越好~上清即可上样电泳。或者-70度保存 二、蛋白质含量测定: (一)实验原理 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法(Bradford法),是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置(lmax),由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。 Bradford法的突出优点是: (1)灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质,染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 (2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 (3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K、Na、Mg2离子、Tris缓冲液、糖和蔗 糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是: (1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。 (2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干扰Lowary法一样)。 (3)标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 (二)试剂与器材 1. 试剂: (1)标准蛋白质溶液,用 g—球蛋白或牛血清清蛋白BSA,配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。 (2)考马斯亮兰G—250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G—250,
溶于50ml 95的乙醇后,再加入120ml 85的磷酸,用水稀释至1升。 2. 器材: (1)可见光分光光度计 (2)旋涡混合器 (3)试管16支 (三)操作方法 1. 标准方法 (1)取16支试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分为两组按表中顺序,分别加入样品、水和试剂,即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml,然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂,每加完一管,立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除)。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。 (2)加完试剂25分钟后,即可开始用比色皿,在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595,空白对照为第1号试管,即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。 注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色),可用塑料或玻璃比色皿,使用后立即用少量95的乙醇荡洗,以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 考马斯亮兰法实验表格: 管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 1.0mg/ml 未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 约1.0mg/ml 蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝 G,250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0
5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋 白质量(mg) 光吸收值 (A595) (3)用标准蛋白质量(mg)为横座标,用吸光度值A595为纵座标,作图,即得到一条标准曲线。由此标准曲线,根据测出的未知样品的A595值,即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。 2. 微量法 当样品中蛋白质浓度较稀时(10,100mg/ml)可将取样量(包括补加的水)加大到0.5ml或1.0ml 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O 考马斯亮蓝G,250试剂仍加5.0ml 同时作相应的标准曲线,测定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。 贮存液:由100ml 95乙醇,200ml 88磷酸,350mg考马斯亮蓝G-250 组成, 室温下可长期保持稳定。 工作液:由425ml双蒸水,15ml 95乙醇,30ml 88磷酸,30ml Bradford 贮存 液混合而成,用滤纸过滤后置于棕色瓶中保存于室温下,使用前再过滤。 测定标样和样品的平均吸收值,在Excel 工作表中,以吸光度为横坐标x,反应蛋白量(μg)为纵坐标y,将标准曲线测定数据用工作表中的Chart Wizard 绘制标准曲线,回归出线性方程yf(x)、线性相关系数r 平方值,将样品测定结果的平均值用Paste Function中Forecast返回出待测样品的预测值y,或用回归出的线性方程计算待测样品的反应蛋白量(μg)y值。 在酶学研究中酶的比活是以蛋白质的含量为基础的 。一般认为提取液的蛋白质浓度与组织重量呈正比与所加入的提取液体积呈反比因而在计算蛋白质含量时总是把检测液的蛋白质浓度乘以提取液总体积再除以组织重量 。 研钵经硫酸清洁液按配方2 浸泡24 h 流水冲洗180, 200 ?烘烤或装在器械盒中经1. 034×105 Pa 高压20m in 自然冷却 取出 放入- 80 ?冰箱备用。若用于提取RNA 则需经0. 1 焦碳酸二乙酯DEPC 水37 ?处理3, 4h 后高压。 从- 80 ?冰箱取出研钵 把冷冻新鲜组织0. 1 g 放入研钵捣碎 不断研磨把组织磨成粉状 用小钢匙或一次性手术刀片把粉末组织刮入1. 5 m l Eppendo rf 简称EP 管中。 组织用于提取DNA 时在EP 管中加裂解混合液 提取RNA 时在EP 管DEPC 处理 中加试剂TR IzO l GIB2 COBRL 公司产品 1 m l 方法见文献。提取的总蛋白质用于蛋白质印迹检测时则直接加1 十二烷基磺酸钠SDS500 Ll 剧烈振摇 然后煮沸10, 15 m in 立刻冰浴 以使蛋白质变性。- 85 ?保存备用。 提取的DNA 以B2Globin 为引物经PCR 扩增后 1 琼脂糖凝胶电泳见一清晰、无拖尾的条带。提取的RNA 用1琼脂糖
甲醛变性凝胶电泳见粗细不等但明亮无弥散的二条带。提取的蛋白质以SDS2PA GE
聚丙烯酰胺 凝胶电泳 考马斯亮蓝R250 染色在淡蓝色背景中有多条蓝黑色粗细不
同的条带。
植物蛋白质提取方法
一、 植物蛋白质提取
1. TCA-丙酮法
(1)称量一定量的样品置于液氮预冷的研钵中,加少许PVPP ,反复加液氮研磨至粉末。
(2)研磨好的样品用10 倍体积(w/V)的10%的TCA-丙酮溶液悬浮,加入0.1 M PMSF 、
1 M DTT 至终浓度为1 mM PMSF、10mM DTT,超声5 分钟,于-20℃静置6 小时或
过夜后,4℃,20000g 离心15 分钟,弃上清。
(3)沉淀用10 倍体积于样品的丙酮溶液重悬浮,于-20℃静置1 小时后,4℃,20000g 离
心15 分钟,弃上清。
(4)重复步骤(3)一次。
(5)沉淀用10 倍体积于样品的乙醇/乙醚=1:1 洗,于-20℃静置1 小时后,4℃,20000g 离
心15 分钟,弃上清。
(6)重复步骤(3)一次。
(7)取出沉淀真空干燥约5 分钟,除尽有机溶剂。
(8)按10mg 干粉末加200 微升裂解液的比例,加入1 mM PMSF、10mM DTT,超声5
分钟,充分溶解1 小时,10℃,35000g 离心30 分钟,上清为所需的蛋白溶液。
(9)用Bradford 法测定蛋白样品的蛋白浓度。
(10)蛋白样品溶液小量分装,-80℃保存。
注意事项:
(1) TCA 有利于去除酚类色素等物质,但不利于蛋白的抽提,使用浓度不宜过高,在后
面丙酮处理中,尽量除去。
(2) 蛋白样品保存:样品浓度不宜过高,建议将高浓度样品适度调整,为避免反复冻融
应分装保存,长期保存用-80℃,短期保存用-20℃。
(3) 1M DTT:0.1542g DTT 用1ml MilliQ 水溶解,-20℃保存。
(4) 0.1M PMSF:0.0174g PMSF 用1ml 异丙醇溶解,-20℃保存。
植物蛋白质提取方法总汇
1、根据样品重量(1g样品加进3.5ml提取液,可根据材料不同适当加进),预备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加进提取液中在冰上静置(3-4小时)。
3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清液,样品制备完成。
蛋白质提取液:300ml
1、1Mtris-HCl(PH8)45ml
2、甘油(Glycerol)75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g
这种方法针对SDS-PAGE,垂直板电泳!
氯醋酸—丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨叶片
2、加进样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。
3、加进等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时),然后真空干燥沉淀,备用。
4、上样前加进裂解液,室温放置30分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4℃待用。
5、用Brandford法定量蛋白,然后可分装放进-80℃备用。
药品:提取液:含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的往离子水中(终体积为5ml),使用前再加进1M的DTT65ul/ml。
这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点!当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少!
目的:WESTERNBLOT检测凋亡相关蛋白的表达
应用TRIPURE提取蛋白质步骤:
含蛋白质上清液中加进异丙醇:(1.5ml每1mlTRIPURE用量)
倒转混匀,置室温10min
离心:12000g,10min,4度,弃上清
加进0.3M盐酸胍/95%乙醇:(2ml每1mlTRIPURE用量)
振荡,置室温20min
离心:7500g,5min,4度,弃上清
重复0.3M盐酸胍/95%乙醇步2次
沉淀中加进100%乙醇2ml
充分振荡混匀,置室温20min
离心:7500g,5min,4度,弃上清吹干沉淀
1%SDS溶解沉淀
离心:10000g,10min,4度
取上清-20度保存(或可直接用于WESTERNBLOT)
存在的题目:加进1%SDS后沉淀不溶解,还是很大的一块,4度离心后又多了白色沉定,SDS结晶?测浓度,含量才1mg/ml左右。
解决:提蛋白试剂盒,另外组织大小适中,要碎,立即加2XBUFFER,然后煮5-10分钟,效果很好的。
1、200毫克样品置于冰上磨碎
2、加lysisbuffer,离心,10000rpm,4度,5min取上清
3、重复离心5min
lysisbuffer:ureanp-40ampholine2-mepvp-40
秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等(1986)的方法进行。
100mg材料剪碎后加进10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加进1.5ml10%三氯乙酸(丙酮配制,含10mM即0.07%β-巯基乙醇),混匀,-20℃沉淀1小时,4℃,15000r/min离心15min,弃上清,沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巯基乙醇),再于-20℃沉淀1小时,同上离心弃上清,(有必要再用80%丙酮(含10mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉加进20μl(可调)UKS液[9.5M尿素,5mM碳酸钾,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫苏糖醇),2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc,pH3.5-10),6%TritonX-100],37℃温育30min,期间搅动几次,28度(温度低,高浓度的尿素会让溶液结冰)16000r/min离心15min,离心力越大时间长一点越好!上清即可上样电泳。或者-70度保存
(1)sample,液氮研磨
(2)装1.5mlcentrifuge用tube
(3)加1MKH2PO4K2HPO4700ul
(4)12000rpm,4度,10-15minite
(5)取上层液,蛋白质就在里面
蛋白质提取方法总汇
蛋白质提取方法总汇
1、植物组织蛋白质提取方法
1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液,可根据材料不同适当加入),准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4小时)。
3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清夜,样品制备完成。
蛋白质提取液:300ml
1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml
2、甘油(Glycerol)75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g
这种方法针对SDS-PAGE,垂直板电泳!
2、植物组织蛋白质提取方法
三氯醋酸—丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨叶片
2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。
3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时),然后真空干燥沉淀,备用。
4、上样前加入裂解液,室温放置30分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4℃待用。
5、用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入-80℃备用。
药品:
提取液:含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮
裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml),使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点!当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少!
3、组织:肠黏膜
目的:WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达
应用TRIPURE提取蛋白质步骤:
含蛋白质上清液中加入异丙醇:(1.5ml每1mlTRIPURE用量)
倒转混匀,置室温10min
离心:12000 g,10min,4度,弃上清
加入0.3M盐酸胍/95%乙醇:(2ml每1mlTRIPURE用量)
振荡,置室温20min
离心: 7500g,5 min,4度,弃上清
重复0.3M盐酸胍/95%乙醇步2次
沉淀中加入100%乙醇 2ml
充分振荡混匀,置室温20 min
离心: 7500g,5min,4度,弃上清吹干沉淀
1%SDS溶解沉淀
离心:10000g,10min,4度
取上清-20度保存(或可直接用于WESTERN BLOT)
存在的问题:加入1%SDS后沉淀不溶解,还是很大的一块,4度离心后又多了白色沉定,SDS结晶?测浓度,含量才1mg/ml左右。
解决:提蛋白试剂盒,另外组织大小适中,要碎,立即加2X BUFFER,然后煮5-10分钟,效果很好的。
4、植物材料:水稻苗,叶鞘,根
1、200毫克样品置于冰上磨碎
2、加lysis buffer,离心,10000rpm,4度,5min取上清
3、重复离心5min
lysis buffer:urea np-40 ampholine 2-me pvp-40
5、蛋白质样品制备
秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等(1986)的方法进行。
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10% 三氯乙酸(丙酮配制,含10mM即0.07%β-巯基乙醇),混匀,-20℃沉淀1小时,4℃,15000 r/min离心15 min,弃上清,沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇),再于-20℃沉淀1小时,同上离心弃上清,(有必要再用80%丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉加入20μl(可调) UKS液[9.5 M尿素,5mM碳酸钾,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫苏糖醇),2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5-10),6% Triton X-100],37℃温育30min,期间搅动几次,28度 (温度低,高浓度的尿素会让溶液结冰)16000 r/min离心15 min,离心力越大时间长一点越好!上清即可上样电泳。或者-70度保存
6、植物根中蛋白质的抽取
(1) sample, 液氮研磨
(2) 装1.5 ml centrifuge 用tube
(3) 加 1M KH2PO4+K2HPO4 700 ul
(4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite
(5) 取上层液,蛋白质就在里面