克隆食品和转基因食品的区别
摘 要:本文探讨克隆食品和转基因食品在原理、种类和安全性等方面的差异。
关键词:克隆食品;转基因食品
随着生物技术不断地应用于食品领域,转基因食品和克隆食品都是从基因层面上改造着我们的食品原材料,但他们之间存在一定的差异。
1(克隆食品
1.1克隆
克隆是英文"clone"或"cloning"的音译,而英文"clone"则起源于希腊文"Klone",原意是指以幼苗或嫩枝插条,以无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物,如扦插和嫁接。克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖,以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。通常是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组织后代的过程。
克隆技术不需要雌雄交配,不需要精子和卵子的结合,只需从动物身上提取一个单细胞,用人工的方法将其培养成胚胎,再将胚胎植入雌性动物体内,就可孕育出新的个体。
1.2克隆的种类
克隆的种类主要有:一是由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系(即每个基因彼此相同);二是先将含有遗传物质的供体细胞
的核移植到去除了细胞核的受体卵细胞中,利用微电流刺激等使两者融合为一体(即与提供细胞者基因相同)。
1.3克隆食品
克隆食品(Klone Food)是以克隆动物为原料制作的食物,主要是克隆动物的肉和奶。
2(转基因食品
2.1转基因技术
转基因技术是指使用基因工程或分子生物学技术(不包括传统育种、细胞及原生质体融合、杂交、诱变、体外受精、体细胞变迁及多倍体诱导等技术),将遗传物质导入活细胞或生物体中,产生基因重组现象,并使之表达并遗传的相关技术。
2.2转基因食品
转基因食品是以转基因生物为直接食品或为原料生产加工的食品。
2.3转基因食品的种类
转基因食品主要包括转基因植物性食品、转基因动物性食品、转基因微生物食品和转基因的特殊食品(疫苗食品)四大类。
3(克隆食品与转基因食品的异同
3.1原理不同
克隆动物是指不经过有性繁殖,通过对母本动物进行基因复制而得到的一模一样的另一只动物,它和母本动物就像不同时出生的双胞胎。世界上第一只体细胞克隆动物是1996年出生于英国的克隆羊多
利,随后克隆牛、克隆猪等不断诞生。克隆动物技术可以使一些优良动物品种快速产出大量“后代”,比起传统培育和繁殖方法,采用这种技术有时间和数量上的优越性。
转基因食品是指通过基因技术改造一些传统食品来源,加入一些外来基因或去除一些原有基因后得到的食品。转基因食品同时涉及动物和植物,目前讨论最多的转基因食品还是玉米等农作物食品。在经过基因改造后, 可增加作物单位面积产量;可以降低生产成本;通过转基因技术可增强作物抗虫害、抗病毒等的能力;提高农产品的耐贮性,延长保鲜期,满足人民生活水平日益提高的需求;可使农作物开发的时间大为缩短;可以摆脱季节、气候的影响,四季低成本供应;打破物种界限,不断培植新物种,生产出有利于人类健康的食品。
3.2种类不同
克隆食品主要是克隆动物的肉和奶,是动物性食品。转基因食品主要有转基因的植物性食品、动物性食品和微生物食品。虽然转基因植物性食品早已进入平常百姓家,但有关转基因动物食品(包括药品)却被炒得沸沸扬扬,迄今为止全世界还没有任何一种转基因动物食品被批准上市,也没有转基因微生物被批准进入市场。
3.3安全性不同
不管是克隆食品还是转基因食品,都是新生的食品资源,所以他们的安全性都颇有争议。
克隆食品可能导致早产、致畸或夭折,可能导致新的疾病由动物传染给人类,这是许多人反对克隆食品的原因。伦敦遗传学家库兰博士说只要动物本身是健康的,它产出的奶也应该是健康的。
转基因食品可能带来许多安全问题,像转基因农作物的超级杂草问题以及可能对人体造成的危害等等。但是任何一种转基因食品在上市之前都进行了大量的科学试验,国家和政府有相关的法律法规进行约束,而科学家们也都抱有很严谨的治学态度。另外,传统的作物在种植的时候农民会使用农药来保证质量,而有些抗病虫的转基因食品无需喷洒农药。还有,一种食品会不会造成中毒主要是看它在人体内有没有受体和能不能被代谢掉,转化的基因是经过筛选的、作用明确的,所以转基因成分不会在人体内积累,也就不会有害。
经合组织(OECD)提出了转基因食品的评价原则——“实质等同”的原则,即:如果对转基因食品各种主要营养成分、主要抗营养物质、毒性物质及过敏性成分等物质的种类与含量进行分析测定,与同类传统食品无差异,则认为两者具有实质等同性,不存在安全性问题;如果无实质等同性,需逐条进行安全性评价。
4(总结
总之,克隆和转基因都是利用基因手段来获得所需的动植物品种优越性,它们之间的最大区别就是,前者只是复制,而后者是对基因进行改造。由于相关的生物技术都还存在很多未知因素,克隆动物食品和转基因食品现在都还面临安全性质疑。一些专家认为,从克隆只是
复制而转基因要进行基因改造来看,或许克隆动物食品面临的安全风
险相对要小。
转基因植物论文关于植物生长的论文
第 9卷 第 4期 2010年 8月 广州大学学报 (自然科学版 ) Journa l of G uang
zhou U n ive rsity( N atura l Sc ience Edition) V o.l 9 N o 4 . Aug . 2010 文章编号: 1671 4229( 2010) 04 0037 04 拟南芥 A tJ 2基因植物超量表达载体的构建 杨礼香, 王正询 , 柯德森, 巫锦雄, 黎钰汝 (广州大学 生命科学学院, 广东 广州 摘 510006) 要: 在胁迫条件下, 分子伴侣可以稳定蛋白质结构, 防止蛋白质凝聚变性, 并修复受伤害蛋白. J蛋白是一类 * 重要的分子伴侣. A tJ 2是拟南芥 ( A rabidop sis thaliana ) J蛋白中的一种. 为研究该基因的功能, 提取了拟南芥幼苗 的总 RNA, 经过 RT PCR 获得了 A tJ 2的全长. 并将其构建入表达载体 pMD 中, 得到重组质粒 p D /A tJ 2 通过农杆 M . 菌 (Agrobacterium tumefaciens)将此重组质粒转化入拟南芥, 得到了转基因植株, 为后续该基因的功能研究奠定基础. 关键词: 转基因; 拟南芥; A tJ 2 中图分类号: Q 942 文献标志码: A 分子伴侣, 参与底物多肽的正确折叠、 组装、 转 运等, 对维持细胞内蛋白的内稳态非常重要 . 热 休克蛋白 70 ( H sp70s) 和相应的 J蛋白共同组成分 子伴侣机器, 其中 J蛋白的作用是作为 H SP70的同 [ 2] 伴蛋白刺激 H SP70的 ATP 酶活性和催化活性 . J蛋白也称为 H sp40s或 DnaJ 到目前为止, 报道拟 . 南芥 ( A rabidop sis thaliana )中的 J蛋白共有 120种, 其中 116种具有典型的 J蛋白结构, 4种有类似 J蛋 [ 3] 白的结构 . 根据这些蛋白的结构不同, 将它们分 为 4类. 第 1类含有 DnaJ蛋白所有的结构域 ( J结 构域, G / F结构域, 锌指结构域, C 端结构域 ), 第 2 类缺少锌指结构域, 第 3类指含有 J结构域, 第 4 类是一类与 J蛋白在重要序列和结构上都类似但 缺少 H PD 结构的蛋白 . 除了在维持细胞内蛋 白的内稳态中起重要作用外, 拟南芥 J蛋白的功 能还涉及到膜蛋白的降解、 线粒体的产生、 配子体 [ 3] 的形成、 花粉的萌发以及信号转导等许多方面 . A tJ2是最早从拟南芥中发现的 J蛋白之一 , 包含典型的 J蛋白特征结构域: J结构域、 /F 结 G 构域和锌指结构域, C 端还有一个法 尼基化信号 ( CAAQ ) . 纯化的重组 A tJ 2能刺激玉米 H SP70的 AT P酶活性提高 10倍 , 这表明它具有同伴蛋白 的功能. A tJ 2在植物的根、 叶、 茎、 花和角果中都有 表达, 并在植物整个生长周期中都有表达. 研究表 明, 37 热激、 冷处理、 水分胁迫都能提高拟南芥 叶中 A tJ 2基因的表达水平, 因此 A tJ 2可能参与多 收稿日期: 2009- 12 - 18; 修回日期: 2010- 03- 24 [ 7] [ 6] [ 4- 5 ] [ 1] 种环境刺激的响应, 其功能可能与多种胁迫的 抗 性相关 . 为进一步 研究该基因的功 能, 本研 究 从拟南芥中克隆了拟南芥 A tJ 2基因, 并将其构建 到植物超量表达载体中, 转化了拟南芥, 为进一步 对该基因的功能研究奠定基础. [ 8] 1 材料与方法 1 1 材料 . E. coli DH 5 、 3101菌株, p GV MD 质粒, C olum bia 生态型拟南芥 ( A rabid op sis th aliana Co l 0) 种子 为本实验室保存. 总 RNA 提取试剂盒、 质粒提取 试剂盒、 DNA 回收试剂盒等购自上海生工, RTPCR 试剂盒、 MD18 T、 p 限制性内切酶、 连接酶、 DNA 分 子质量标准等购自 大连宝生物公司, 其它化学 试 剂为国产分析纯. 1 2 总 RNA 的提取 . 取 4~ 5叶龄期幼苗叶片, 按照总 RNA提取试剂 盒的操作说明书进行, 提取拟南芥幼苗的总 RNA. 1 3 A tJ 2基因的扩增 . 根据 GenB ank的 A tJ2基因序列 ( A t5G22060), 设计和合成引入限制性内 切酶位点的引物 A tJ 2F ( 5 CGGGATCCAAGTTAGCAGCCACAACA 3 ) 和 A tJ 2R ( 5 CGGGATCCAGGAGAAAAGACAGAAGC 3 ). 以前面提取的拟南芥幼苗的总 RNA 为模板, 以 A tJ 2F 和 A tJ 2R 为引物, 通过 RTPCR ( 参照试剂 基金项
目: 广东省自然科学基金项目 ( 8451009101001243) ; 广州市属高校科技计划项目
( 08C029) 资助 作者简介: 杨礼香 ( 1972 - ) , 女, 讲师, 博士. E m ai: yanglx@
gzhu. edu cn l . * 通讯作者. E m ai: w angzhengxun@ 163 com l .
38 广州大学学报 ( 自然科学版 ) 第 9卷 盒说明 ) 扩增 A tJ2 全长基因. 扩增产物经琼脂糖 凝胶电泳检测并纯化后, 与 p D18 T 过夜连接, 再 M 转化进 DH 5 . 取筛选的阳性克隆送交上海生物 工程公司测序. 1 4 表达载体 p . MD A tJ 2的构建 用 BamH I酶切重 组质粒 p MD18 T A tJ 2 回 , 收长度约 1. 3 kb 的片段 ( A tJ 2). 用 BamH I酶切 植物表达载 体 p MD, 回收并进 行去磷酸化 处理. 质粒 p MD 的结构如图 1 多克隆位点 ( MCS) 中包 , 含 BamH I酶切位点. 将 A tJ 2片段与经过酶切和 去磷酸化处理后的 p MD 连接, 转化入 DH 5 , 在含 卡那霉素的 LB 平板上培养过夜. 分别用 A tJ 2基 因的上游引物 ( A tJ 2F ) 和 p MD 载体上的 35S引物 与 A tJ 2基因下游引物 ( A tJ 2R ) 配合进行菌落 PCR 鉴定, 并进行酶切鉴定, 筛选阳性克隆. 重组质粒 命名为 p MD A tJ 2 . 在 紫 外 光 下 清 晰 呈 现 28Sr NA、18Sr NA 及 R R 5SrRNA 等特异条带 ( 图 2) . 分光光 度计检测 的 A260和 A280比值为 1 94 表明 所提取的总 RNA 符 , 合要求, 可进行下一步的实验. 通过 RTPCR 扩增 并纯化回收 A tJ 2片段. 图 2 拟南芥幼苗总 RNA F ig. 2 T o tal RNA ofA rabidop sis seed lings p MD18 T A tJ 2 载体的构建 提取 10个菌落 (编号 1~ 10号 ) 进行菌落 PCR 检测, 其中 2 3 7 8 10号菌落都能扩增出 1 3kb左 、、、、 2 2 . 右的条带, 表明其中含有有 A tJ2基因
转基因食品的论文转基因玉米论文
农业生物技术学报,2010年,第18卷,第6期,第1208~1214页JournalofAgriculturalBiotechnology,2010,Vol.18,No.6,1208~1214
技术改进
UpdatedTechnology
转基因玉米MON88017转化事件特异性定性PCR检测方法及其标准化
2
瞿勇1,武玉花1吴刚1曹应龙1卢长明1*
1中国农业科学院油料作物研究所,农业部油料作物生物学重点开放实验室,武汉430062;2江西农业大学农学院,南昌330045*通讯作者,cmlu@oilcrops.cn
摘要转基因玉米(Zeamays)MON88017是美国孟山都公司通过DNA重组技术开发的具有抗玉米根叶
甲虫(Diabroticavirgifera)和抗草甘膦类除草剂特性的玉米品系,本研究的目的是建立该品系的转化事件特异性定性检测方法的标准。根据转基因玉米MON88017的旁侧序列信息,在左边界的结合位点处设计一系列引物组合,在筛选出最佳引物组合后,优化了该引物组合的反应体系,建立了转基因玉米MON88017转化事件特异性定性PCR检测方法。全国7家实验室的验证结果表明,该方法能够特异性检测样品中MON88017转化事件,检测灵敏度均达到0.10%以上,且检测结果具有良好的可重复性、可重现性。本方法符合标准检测特异性强、灵敏度高、重复性好的要求,为我国抗虫耐除草剂玉米MON88017检测和转基因生物安全管理制度的实施提供了相应的技术支撑。关键词
转基因玉米,MON88017,左边界,旁侧序列,定性PCR,循环验证
Event-specificPCRDetectionMethodofTransgenicMaizeLineMON88017andItsStandardization
QuYong1,2WuYuhua1WuGang1CaoYinglong1
LuChangming1*
1OilcropsResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofOilCropBiology,MinistryofAgriculture,Wuhan430062,China;2CollegeofAgronomy,JiangxiAgriculturalUniversity,Nanchang330045,China*Correspondingauthor,cmlu@oilcrops.cnDOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2010.06.027
AbstractGeneticallymodifiedcorn(Zeamays)MON88017isdevelopedbyU.S.MonsantoCompanythrough
recombinantDNAtechnology,whichischaracterizedbyresistancestomaizebeetles(Diabroticavirgifera)andtoglyphosateherbicide.Thepurposeofthisstudyistodevelopandstandardizetheevent-specificqualitativedetectionmethodofthislineinChina.BasedontheinformationoftheflankingsequencesGMmaizeMON88017,aseriesofprimercombinationsweredesignedintheleftmarginofthebindingsite.Thebestprimerpairwasselectedandthereactionsystemwasoptimizedwiththebestprimerpair.ThemaizeMON88017events-specificqualitativePCRdetectionmethodwasestablished.Aftervalidatedby7externallaboratories,resultsshowedthatthismethodcouldspecificallydetectthesamplesofMON88017eventwiththedetectionsensitivityabout0.1%,andhadagoodrepeatabilityandreproducibility,thussuitablefordetectionofthecornMON88017andatechnicalsupportfortheimplementationofthebiosafetymanagementregulationsinChina.Keywords
Geneticallymodifiedcorn,MON88017,Leftborder,Flankingsequence,QualitativePCR,Validation
种最多,有44个。在中国玉米是最重要的作物之一,
种植面积和总产均居第2位。
随着人口的增加和经
玉米是全球分布最广的粮食作物,目前获准商业化生产的144个转基因品种中,转基因玉米的品
DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2010.06.027基金项目:本研究由转基因生物新品种培育重大专项(No.2008ZX08012-003,No.2008ZX08012-005)和农业部农业行业标准制定和修订项目计划(农财发〔2008〕128号)共同资助收稿日期:2010-03-18接受日期:2010-05-24
转基因玉米MON88017转化事件特异性定性PCR检测方法及其标准化
1209Event-specificPCRDetectionMethodofTransgenicMaizeLineMON88017andItsStandardization
济的发展,中国粮食的进口特别是饲料的进口呈增加趋势,
2006年以来,中国玉米出口极显著下降,而进口增加,有趋势表明中国未来会增加饲料粮食的进口(王关林等,2002)。
转基因玉米MON88017是美国孟山都公司通过DNA重组技术开发的具有抗玉米根叶甲虫和抗草甘膦类除草剂特性的玉米品系。其含有两个外源基因(Cry13Bb1和Cp4epsps)表达盒,插入序列大小为7.1kb。Cry13Bb1基因表达盒含有35S启动子、小麦叶绿体A/B结合蛋白的非翻译前导链序列、actin1内含子和来源于土壤杆菌的基因Cry13Bb1、小麦HSP17蛋白的末端非翻译区编码序列,该表达盒产生玉米根叶甲虫抗性;
Cp4epsps基因表达盒则含有actin1启动子、actin1内含子、拟南芥叶绿体转移肽CPT2,Cp4epsps基因和NOS终止子,来源于农杆菌CP4菌株的Cp4epsps基因及其表达盒产生草甘膦除草剂抗性。
目前转基因玉米MON88017已在美国、加拿大、阿根廷和智利进行商业化种植,孟山都公司于2007年向我国递交申请《转Cry13Bb1和Cp4epsps基因抗虫和抗草甘膦玉米MON88017作为加工原料进口安全证书》
。由于该品种已经大面积商业化生产,其产品很可能已经出现在我国进口玉米及其产品之中,但是目前国际上尚未公布抗虫耐除草剂玉米MON88017及其衍生品种转化事件特异性定性检测方法的标准,相关检测方法的研究也尚未标准化(袁磊等,2010),制约了对该品种的监管,建立该品种的检测方法势在必行。
PCR技术是进行转基因产品检测时应用得最广泛的检测方法,包括筛选检测、基因特异性检测、载体特异性检测和事件特异性检测(Xuetal.,2005;许文涛等,2008)。筛选检测主要用于检测是否转基因,是以转基因产品的通用元件和标记基因为特异性扩
增片段,常见的筛选元件有CaMV35S启动子、CaMV35S终止子、Nos终止子、OCS终止子、Bar、NPTII等(聂淑晶等,2008);基因特异性检测是对目的基因进行检测,检测转的是什么基因;载体特异性检测是在转化载体中具有完整表达能力的目的基因的基因盒(genecassette)上设计引物,
是确定转基因品种来自什么转化载体(金芜军等,2004);转化事件特异性检测则是检测外源基因在受体基因组的插入位点,由于插入位点的唯一性特征,转化事件特异性检测可以准确判断转基因品种是来自哪个转化事件,因此可以区分来自相同转化载体的不同转化事
件(Yangetal.,2005;
Wuetal.,2008)。本研究的目的是根据转基因玉米MON88017的旁侧序列,建立抗虫耐除草剂转基因玉米MON88017及其衍生品种的定性PCR检测方法。
1结果与分析
1.1旁侧序列的确立
MON88017旁侧序列的左边界旁测序列长为1461bp,其中1~1112bp为玉米基因组序列,1113~1461bp为载体序列;右边界旁测序列长为3525bp,其中1~453bp为载体序454~3525bp为玉米基因组序列(图1A)。1.2MON88017检测体系建立1.2.1引物的设计及筛选
对MON88017的左右边界设计引物进行分析得出,MON88017左边界设计的引物质量更好,故本实验选用MON88017左边界来建立相关的检测体系,在结合位点处各设计4条正、反单向引物(表1),然后两两间组合,共16个组合。扩增外源插入载体和玉米基因组连接区的序列,扩增产物的大小均在200bp左右。应用通用的PCR反应条件,用组合的引物同时进行PCR扩增,
设置3个重复,重复3次实验,选择重现性最好、灵敏度最高、扩增条带最亮的引物。最后选定针对左边界旁侧序列设计的引物组合,扩增片段的大小为198bp(图1B):
MON88017-LF1:
5'-TTGTCCTGAACCCCTAAAATCC-3';MON88017-LR3:
5'-CCCGGACATGAAGCCATTTA-3'。为了进一步确定引物对MON88017-LF1/MON88017-LR3的扩增稳定性,对选定的引物对用SYBRGreen1染料法进行荧光定量反应进行验证。4
表1引物及碱基组成Table1Oligonucleotideprimers引物名称引物序列(5'~3')PrimernameSequence(5'~3')
Mon88017LF1TTGTCCTGAACCCCTAAAATCCMon88017LF2CTAAGCAGCAGAATCGTGTGACAMon88017LF3CTTCTAAATACCCGATCGAGCGMon88017LF4CTAGCACTCTCCTCCAACACAMon88017LR1CGCCTATAAATACGACGGATCGMon88017LR2AATAACGCTGCGGACATCTACAMon88017LR3CCCGGACATGAAGCCATTTAMon88017LR4
GCTGCGGACATCTACATTTTTG
1210JournalofAgriculturalBiotechnology
玉米基因组序列MaizeDNAsequence
F
bpbp
1112
198
349
453
3072
A
R
插入基因序列
InsertDNAsequence
玉米基因组序列MaizeDNAsequence
农业生物技术学报
947
1145
B
图1转基因玉米MON88017旁侧序列图示
A:MON88017旁侧序列载体图及引物设计位置,加粗箭头代表最佳引物的设计位置和方向;B:MON88017左边界旁侧序列,大写字母代表植物基因组序列,小写字母代表插入的基因组序列,箭头代表最佳引物的设计位置和方向Figure1JunctionfragmentofthetransgenicmaizeeventMON88017
SchematicdiagramoftheinsertedT-DNAregionofgeneconstructforeventMON88017.AdjacentsolidlinesrepresentrapeseedA:
genome,Theadjacentsolidarrowsshowthelocationandorientationoftheoptimalprimers;B:Characterisationofthetransgeniccornthep1antDNAsequenceincapitals,eventMON88017leftborderjunctionsite.TheinsertDNAsequenceisdepictedinlowercase,Thearrowsshowthelocationandorientationoftheoptimalprimers
0.5
荧光
Fluorescence
0.4荧光Fluorescence
0.30.20.100
10
20
循环数Cycle
30
40
A
75
80
T/℃
85
90
B
图2引物对MON88017-LF1/MON88017-LR3定量扩增曲线(A)及熔解曲线(B)
Figure2Real-timePCRamplificationplots(A)andmeltingcurves(B)forprimerpairMON88017-LF1/MON88017-LR3
个重复的实验结果表明,用MON88017-LF/MON88017-LR引物组合进行的扩增,有明显的扩增其溶解曲线也只有一个特曲线(图2A)且重复性好,
异的峰值(图2B),实验进一步证明该引物组合具有良好的扩增稳定性。1.2.2Mg2+浓度的优化
PCR反应体系中,Mg2+的浓度尤为重要,其直接影响着引物的退火的特异性,产物的特异性,以及酶1.50、2.00、2.50和3.00mmol/L6个浓度梯度进行PCR分析,结果显示,当Mg2+浓度低于1.50mmol/L
时,没有预期片段的扩增,高于2.00mmol/L时,均有目的片段的出现,但在2.50mmol/L时,效果最佳(图3)。
1.2.3引物浓度的优化
再对PCR反应体确立体系中最佳Mg2+浓度后,
系中引物的终浓度进行优化。对0.10、0.15、0.20、0.25、0.50和1.00μmol/L6个浓度梯度的PCR分析,结果表明,6个浓度梯度均能扩增出预期目的片带增加,当引物终浓度为0.20μmol/L时扩增效果最好(图4)。
1.00、段,的催化能力的准确性(王关林等,2002)。对0、低浓度时扩增的条带不亮,浓度过高时,非特异条
转基因玉米MON88017转化事件特异性定性PCR检测方法及其标准化
1211Event-specificPCRDetectionMethodofTransgenicMaizeLineMON88017andItsStandardization
1.2.4退火温度的优化
在体系中Mg2+终浓度和引物终浓度确立的基础
上,根据引物设计时所设置的Tm值范围,共设计了54、56、58和60℃4个退火温度,对反应体系进行PCR反应的扩增,结果表明4个温度梯度下均能获得预期的目的片段(图5),但在58℃时PCR反应效果最优。1.3实验验证1.3.1特异性检测
参照上述优化的体系,用转化事件特异性引物
MON88017-LF1/MON88017-LR3扩增6个转基因玉
米品种(Bt176、Bt11、MON810、NK603、T25和GA21)、3个非转基因玉米品种(苏玉糯1号、苏玉糯2号和超甜玉米2018)及其他一些非玉米品种(油菜、棉花、大豆、小麦和水稻)。扩增结果表明,引物MON88017-LF1/LR3能特异的从MON88017样品中扩增出预期的产物,而在其他样品中没有预期扩增产物(图6),表明该PCR扩增体系具有良好的扩增特异性。1.3.2灵敏度测试
将抗虫耐除草剂玉米MON88017的DNA和非转基因玉米DNA按不同比例(W/W)混合,MON88017DNA含量分别为10.00%、1.00%、0.10%、0.05%、0.01%和0%。用梯度稀释的MON88017DNA做模板,进行PCR扩增,检测方法的检测灵敏度。结果表明,在MON88017DNA含量大于0.10%时,均有明显的目标条带出现,在浓度为0.05%时,目标条带变得模糊,当DNA的浓度低于0.01%时,没有目标带的出现(图7),说明检测引物MON88017-F/R的检测灵敏度能够达到0.10%。1.3.3重演性验证
对实验研制的转基因玉米MON88017转化事件特异性序列的检测方法,首先在实验室内不同人员间,对其特异性和灵敏度进行比对实验,结果与预期相同,说明该方法在实验内部具有很好的可重复性。
为了测试方法的重演性,在全国7家同行实验室中对方法的检测特异性和灵敏度进行测试。农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(北京)、农业部转基因植物用微生物环境安全监督检验测试中心(北京)、农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(长春)、农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(济南)、农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心(合肥)、农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(上海)和农业部农产品质量安全及转基
bp
M123456
20001000750500250100
图3MON88017检测体系中Mg2+浓度的优化
M:2000bpDNAmarker;1~6:Mg2+浓度分别为0、1.00、1.50、2.00、2.50和3.00mmol/L
Figure3OptimizationofMg2+concentrationinMON88017detectionsystem
M:2000bpDNAmarker;1~6:Mg2+correspondto0,1.00,1.50,
2.00,2.50and3.00mmol/L,respectively2000bpM123456
1000750500250100
图4MON88017检测体系中引物浓度的优化
M:2000bpDNAmarker;1~6:引物浓度分别为0.10、0.15、0.20、0.25、0.50和1.00μmol/L
Figure4OptimizationofprimersconcentrationinMON88017detectionsystem
M:2000bpDNAmarker;1~6:Primerscorrespondto0.10,0.15,0.20,0.25,0.50and1.00μmol/L,respectively
M
1
2
3
4
2000bp1000750500250100
图5MON88017检测体系中Tm的优化
M:2000bpDNAmarker;1~4:Tm分别为54、56、58和60℃Figure5OptimizationofTminMON88017detectionsystemM:2000bpDNAmarker;1~4:Tmcorrespondto54,56,58and60℃,respectively
因生物产品成分监督检验测试中心(杭州)共7家第三方检测机构对该检测方法的特异性和灵敏度进行复核验证实验。
在特异性检测中,7家验证单位仅从转基因玉米MON88017样品中扩增出预期产物,而在其他转基因玉米、转基因油菜、转基因大豆、转基因棉花样品
1212农业生物技术学报
JournalofAgriculturalBiotechnology
bpM12345678910111213141516
20001000750500250100
图6MON88017事件特异性定性PCR检测
M:2000bpDNAmarker;1~16:分别以MOn88017、H2O、Bt176、Bt11、MON810、NK603、T25、GA21、苏玉糯1号、苏玉糯2号、超甜玉米2018、中油821、中棉35、中豆29、中麦9号和BT63为模板
Figure6Detectionforevent-specificMON88017usingPCRM:2000bpDNAmarker;1~16:CorrespondtoMOn88017,H2O,Bt176,Bt11,MON810,NK603,T25,GA21,Suyunuo1,Suyunuo2,Chaotianyumi2018,Zhongyou821,Zhongmian5,
Zhongdou29,Zhongmai9,andBT63,respectively
bp
M123456789101112131415161718
1000750500250100
图7MON88017事件特异性检测方法灵敏度检测
M:2000bpDNAmarker;1~3:MON88017DNA含量为10%;4~6:MON88017DNA为1%;7~9:MON88017DNA为0.1%;10~12:MON88017DNA为0.05%;13~15:MON88017DNA为0.01%;16~18:MON88017DNA为0%
Figure7SensitivitytestsoftheMON88017event-specificdetectionmethods
M:2000bpDNAmarker;1~3:10%;4~6:1%;7~9:0.10%;10~12:0.05%;13~15:0.01%;16~18:0%,respectively
及非转基因玉米样品中未扩增出预期产物,表明本研究建立的抗虫耐除草剂玉米MON88017及其衍生品种的定性PCR检测方法可以特异性地检出抗虫耐除草剂玉米MON88017,具有高度的特异性。
在灵敏度测试中,2家验证单位从MON88017含量为0.10%及以上的样品中检测出预期DNA片段,5家验证单位从MON88017含量为0.05%及以上的样品中检测出预期的DNA片段。表明该定性PCR检测方法具有高度的检测灵敏度,达到0.10%。
经重演性分析,7家验证单位的特异性检测结构和灵敏度测试结果非常吻合,表明我们研制的MON88017转化事件特异性PCR检测方法具有良好的重演性。
2讨论
为了防范农业转基因生物对人类、动植物、微生物和生态环境构成危险或潜在危险,依据《农业转基因生物安全管理条例》,对农业转基因生物的研究、试验、生产、加工、经营和进、出口活动要加强监管。孟山都公司研发的抗虫耐除草剂玉米MON88017已获准进口到我国用作加工原料(农基安证字(2007)第258号),该品种在进口、运输、加工或销售过程中存在流散到环境中的可能性,因此要对其加强安全监管。而建立转基因玉米MON88017的检测标准是进行安全监管的前提。
袁磊等曾经建立了转基因玉米MON88017的事件特异性检测方法,扩增产物446bp(袁
磊等,
2010)。由于转基因产品在加工过程中,随着加热温度的升高和加热时间的延长,DNA会出现不同程度的降解,如,玉米样品121℃加热60min,DNA被严重降解,降解后的DNA片段短于329bp(Chiuehetal.,2002)。因此,用于PCR检测的PCR产物要尽可能的短,通常要求用于定性检测的PCR产物的长度在200bp左右,而定量检测的PCR产物的长度在60~150bp之间(ISO21569)。因此袁磊等人研制的方法,由于扩增产物过长,不适宜作为检测转基因玉米MON88017的标准方法,而且袁磊等人研制的方法的特异性、灵敏度和重复性还有待实验室间的循环验证实验。
本研究展现了研制转基因玉米MON88017检测标准的完整过程。首先以转基因玉米MON88017的左边界序列为检测靶标,设计多条正向引物和反向引物,将正向引物和反向引物两两组合进行PCR扩增,筛选出最佳引物组合MON88017LF1/MON88017LR3;然后优化了引物组合MON88017LF1/MON88017LR3的反应条件如Mg2+,引物浓度、退火温度等,从而确定了最佳引物对和最适反应条件。然后,采用优化的反应条件,对引物对MON88017LF1/MON88017LR3的扩增特异性、灵敏度和重复性进行了分析,分析结果满足标准方法的要求,从而初步建立了检测抗虫耐除草剂玉米MON88017的事件特异性定性PCR方法。最后,邀请7家国内具有资质的实验室对本研究建立的方法进行循环验证,循环验证结果表明,本研究建立的抗虫耐除草剂玉米MON88017及其衍生品种事件特异性定性检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,
转基因玉米MON88017转化事件特异性定性PCR检测方法及其标准化
1213Event-specificPCRDetectionMethodofTransgenicMaizeLineMON88017andItsStandardization
具有合理性、准确性、可操作性的优点,因此本研究建立的定性PCR方法可以作为检测抗虫耐除草剂玉米MON88017的标准方法。
本研究建立的转基因玉米MON88017检测方法
形成国家标准后,可以作为我国转基因玉米MON88017及其衍生品种事件特异性定性检测的标准,利用该标准方法可以准确鉴定出利用MON88017作为亲本非法转育出的衍生品种,从而防止转基因玉米MON88017流散到环境中造成生态风险。因此,该标准方法的建立,不仅能够满足我国转基因生物安全管理的需要,而且可以进一步完善我国的转基因产品检测标准体系。
3材料与方法3.1材料
转基因玉米(Zeamays)MON88017及其受体品
种由孟山都公司提供,转基因玉米Bt176、Bt11、
MON810、NK603、T25、GA21、非转基因玉米品种苏
玉糯1号、苏玉糯2号、超甜玉米2018、甘蓝型油菜
(Brassicanapus)品种中油821、棉花(Gossypiumhirsutum)品种中棉35、大豆(Glycinemax)品种中豆29、小麦(Triticumaestivum)品种中麦9号和转基因水稻品种BT63的种子由本实验室收集保存。3.2样品制备
用DNA试剂盒(TaKaRa)提取实验材料的DNA,
提取样品的纯度和浓度用荧光光度计VersafluorTmFluorometer(BIO-RAD)进行检测。
3.3转基因玉米MON88017外源基因插入位点旁侧序列的获得
建立转基因玉米MON88017转化事件特异性的检测方法,要获取MON88017外源基因插入位点旁侧序列。通过网络查阅了转基因玉米MON88017的专利文件(UnitedStatesPatentApplication20080028482),通过该专利文件了解抗虫耐除草剂玉米MON88017的旁侧序列信息;然后搜索NCBI的核酸数据库,获取到MON88017的左边界旁侧序列(登录号DJ058150)和右边界旁侧序列(登录号DJ058151)的序列信息。3.4设计及筛选最佳引物组合
引物设计与合成:运用Primerpremier5.0在插入序列的左右边界分别设计单向引物,选择引物设
计最为合适的边界合成引物,引物由上海生工合成。引物筛选:对设计的引物进行筛选,以MON88017基因组为模板,引物每两两间相互组合进行扩增,筛选特异性强、灵敏度高、扩增稳定的引物组合。PCR在25μL的体系中进行,包括:40ngMON88017DNA1μL,10×PCRbuffer2.5μL,2.0mol/LMgCl22.0μL,200μmol/LdNTPS0.5μL,10
μmol/Lprimer0.25μL,0.5U的TaqDNA聚合酶(Fermentsa),反应条件:94℃2min,1个循环;94℃20s,60℃30s,72℃30s,40个循环;72℃2min,1个循环。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
对定性筛选合适的引物组合,应用SYBRGreen1染料法进行荧光定量反应进行验证,反应在
20μL体系:SYBRGreenReal-timePCRMaster10
μL,l0μmol/LMon88017正反向引物各0.25μL,40ng基因组DNA1μL,ddH2O7.4μL。反应程序:94℃
2min;94℃15s,62℃15s,72℃30s,读板,78℃2s,
读板,82℃2s,读板;40个循环;72℃5min;从65℃
到95℃绘制溶解曲线,每3s读取0.1℃。
3.5建立转化事件MON88017特异性检测体系筛选出最佳扩增引物组合后,设置不同的Mg2+
浓度,引物浓度,退火温度梯度对反应体系进行优化,令引物对在优化的体系下扩增特异性、灵敏度、稳定性更好,实验设置阴性对照,重复3次,反应在25μL的体系中进行。
3.6比对及循环验证实验对实验所确立检测方法的特异性和灵敏度,先进行实验室内不同人员间的比对,再进行循环验证实验,保证检测方法的先进性、合理性、准确性。
致谢
农业部科技发展中心基因检定处组织了本方法的循环验证,农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(北京),农业部转基因植物用微生物环境安全监督检验测试中心(北京);农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(长春),农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(济南),农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心(合肥);农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(上海),农业部农产品质量安全及转基因生物产品成分监督检验测试中心(杭州)参加了本方法的循环验证试验,特此致谢。
1214农业生物技术学报
JournalofAgriculturalBiotechnology
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转基因的利与弊论文
首先让我们来了解什么是“转基因食品”
转基因食品,我们知道,世界上所有生物的 DNA上都写有遗传基因,它们是建构和维持生命的信息和基础,每个基因所代表的功能也是不一样的,而转基因就是指把动植物的基因加以改变,再制造出具备新特征的食品种类,这是一个人为的过程。
但是,其实这种技术从一开始就是收到人们的排斥的,因为这样的做法是非自然的,是不应该的,而且这种技术仍然处于起步阶段,没有一种含有从其它动植物上种植基因的食物,实现了大规模的经济培植,这是一个很大的弊端。
世界上第一种基因移植作物是1983年的一种烟草,又过了十年,市场化的基因食物才在美国出现,它就是可以延迟成熟的番茄作物,而由它制造的食物是不允许的出售的。
而之所以那么多人认为转基因技术对人类健康有害,那也是因为我们对基因的活动方式了解还不够透彻,我们没有十足的把握控制基因调整后的结果,如果一旦因为转基因而引发各种不可预知的病,那是一种很不负责人的态度。
那么我们来详细分析转基因食品的利与弊,就我们现在所认知的转基因的优点为:
第一.解决粮食短缺问题,这是转基因当初研制的基础想法,也是转基因的最大优势,转基因是取优秀基因进行优化的。
第二.减少农药使用,避免环境污染,转基因食品取了其他基因的优点,这样可以减少农药的使用,从一定程度上避免了污染环境。
第三.节省生产成本,降低食物售价, 转基因食品因为成本低,所以它的售价也相对要低,这是人吗最看重的优点之一。
第四.增加食物营养,提高附加价值,增加附加值是转基因食品的特点,可以很大程度的提高食品营养。
第五.增加食物种类,提升食物品质,转基因从一定程度上,是在创造一种新的物种,自然也就能增加食物种类。
第六.促进生产效率,带动相关产业 ,转基因食品体验很大的促进生产效率,带动产业的发展。
第七。从某一方面对健康有保障。比如说,抗虫的转基因玉米不会被虫咬,这就减少了微生物侵害的几率,对我们的健康是一个保障。
转基因的缺点
第一,转基因违反自然,因而有很多的不确定因素。
第二,植物里引入了具有抗除草剂或毒杀害虫功能的基因后,它所提供的食物有许多的潜在威胁,这是很大的危害。
第三,这么轻率的推广转基因植物太不成熟,可能影响农业和生态环境,比如推广抗除草剂的转基因作物在一定程度上助长农民过量使用除草剂,从而使一些非主要作物受到伤害甚至灭绝。
第四,转基因技术有可能造成生物污染,特别是大量的生物技术公司为了保护自己的知识产权,对销售的转基因种子作了“绝育”处理,这是很严重的一种问题。
结言:转基因食品的利与弊到底怎样?目前各种说法都有,没有一个定论,我们只需要知道转基因食品最为一种新型发展起来的食品,有很多的优点,但是潜在的威胁也很多,我们希望社会能为转基因食品进行标识,为大众的生活提供保障。
转基因的利与弊论文
转基因的利与弊论文
只有服从大自然, 才能战胜大自然. --达尔文 转基因食品是指使用生物技术改进的动物、动物和微生物所制造或耗费的食品、食品原料及食品添加物等。针对某一或某些特性,以一些生物技术方式,改正动物、动物基因,使动物、动物或微生物具有或加强次特性,可以降低耗费本钱,添加食品或食品原料的价值。目前,全球的科学家们还无法为转基因食品安全成绩在短工夫内下一个定论。固然具有争议,但有一点是要提示您的,那就是各类转基因食品必须在商标中昭示。
关于转基因食品安全性的看法,如今的科学技术检测伎俩还不能肯定其对人类和环境的无害性,但随着工夫的展开和科学技术的不时进步。转基因食品安全性的辩论大概会有一个后果,我们当今的科技伎俩不能确保转基因食品将来的损害。由此,欧盟、日本等兴隆国度夸大GMO 的标识制度,让耗费者有知情权和挑选权。
一食品供给体系繁杂化
古代食质量量安全成绩的本质决议于古代食品耗费、呆滞及耗费方式。食品只来年感安全成绩的构成机制根本上是由于当今食品经济体系(foodsystem) 繁杂化、国际化及多元化。食品供给的链条越来越长、环节越来越多、范畴越来越广,加大了食品风险发作的概率。相关主体的行为亦是技术的、经济的、制度的内生或外生要素单独作用的后果。 一种食品从农场到餐桌,要经过耗费、加工、呆滞等诸多环节,食品的供给体系趋于繁杂化和国际化。在如此长的产业链条中,每一个环节都有食品被净化的可以。在农业耗费环节中,农业投入品如农药、化肥及抗生素的滥用会使生态均衡遭到毁坏,一些病虫的抗药性加强,使动动物病、虫避免难度加大。与此同时,耗费者为了片面追求产量,经常投入过多的添加剂、农药、化学肥料等,从而忽视了食质量量安全,在食品供给体系的源头形成了净化。化学性的食品净化,由于是临时的大批的进入人体,不象沙门氏菌只吃一次就可中毒,而且也不是天天接触到,它对安康的损害经常很久当前才发觉。这些净化物是不简单毁坏的,进入人体后临时积存存着,这是一种潜伏的风险。 在食品的加工环节中,作为经济感性人的厂商以追求本钱最大化为伎俩,尽量添加配备设备的投入和治理的投入。由此,陈腐过期的耗费加工配备简单遭到微生物等无害精神的净化,食品添加剂和防腐剂的滥用更添加了食品的风险性。有些不法商人为了使本钱最低、耗费本钱最大,在食品添加剂的安全控制上不把关,即便国度有这个规则,为了本身的利益也不去施行,这样安全系数就降落,大范围耗费后就简单发作净化并延长。更为严重的是一些厂商为了牟取暴利竟然耗费假冒伪劣食品,人为造假“掺”毒。 随着古代通讯运输的展开,食品供给方式发作了很大变化,长间隔运输、大范畴**PB**是微生物与无害精神净化的可以性增大。日趋加速的乡村化情况招致食品的运输、储存及制造需求的添加. 与过来相比,人们对食品种类的需求越来越广,非时令食品的耗费量巨增。非凡是在展开zhongguo 度,安康和社会环
境变化快,乡村化的扩展、对存储食品的依靠、安全卫生的短少使本来无穷的资源更为慌张。
二. 供求消息不对称
由于耗费者受学问教育水平和耗费习气的限制,对所耗费食品的安全消息不完好。另外抵耗费者来说,异常的产品假如不按照规则的食用办法,有可以会发作必定的食用风险。 三. 食质量量安全治理
目前,食质量量安部分系的构造已经成为世界各次要国度单独关怀的严重课题,近年来,欧盟盘绕食质量量安全对治理体制及治理伎俩中止了严重创新。例如,针对目前欧洲对疯牛病的害怕心境,欧盟委员会2000年11月29日推出几项最新措施,以控制疯牛病的延长。这些措施包括:临时遏止向一切动物喂食含有肉骨粉的饲料;对30个月龄以上的动物一概中止疯牛病检测以加强耗费者决心;将一切牛肠都列入必须保存或转移的非凡风险精神;除经检考证实没有感染疯牛病,并作为均衡市场供给而作非凡保证的牛肉外,一切牛龄跨越30个月的牛肉都为禁食产品,应将其列入“收购保存方案”。
日本和美国等也根据本国理论情况勤奋创新、加强本国的食品安全监管体系。例如,美国采用HACCP (Hazard analysis critical control point)损害分析与要害控制点。这种食品安全保证零碎,近年来遭到世界各国普遍重视,并作为食品行业的一种新的产品安全质量保证体系采用,是目前世界公认的无效的食品安全卫生质量保证零碎,是保证食品免受生物性、化学性及物感性损害的防止体系。她发作于20世纪60年代的美国宇航食品耗费企业,已被结合国食品法典委员会采用并向全球推行。它次要是经过科学和零碎的办法,分析和查找食品耗费进程的损害,肯定细致的防止控制措施和要害控制点,并施行无效的监控,从而确保产品的安全卫生质量。日本对转基因食品采取标识制度,让耗费者自行挑选。1999年11月29日,日本农林水产省地下了对出口大豆和玉米为次要原料的24种产品,必须做出贴示标签的标准标准。并对转基因与非转基因的原料施行辨别保送的治理零碎。欧委会拟对欧盟保持25年之久的食品安全卫生制度中止根本性的变革。根据和该倡议,食品链中的一切食品运营者将对食品安全付首要义务。考虑到欧盟现行17项相关食品卫生请求的指令精细且过于繁杂,新的法规将对其中止吞并、简化和和谐分歧,力图指定一项赞同的、通明的卫生政策,这一政策将适用于农场到餐桌的一切食品以及一切的食品运营者。同时还将建立无效的执法机构加强对食品安全成绩的监管,无效应对将来食品链中可以呈现的食品危机。
四. 可追踪零碎及其使用
食品消息可追踪零碎作为食质量量安全治理的次要伎俩,是有欧盟为应对疯牛病
(BSE )成绩于1997年开端逐步建立起来的。Codex 的一个非凡委员会对可追踪零碎的定
义表述为“食品市场各个阶段的消息流的持续性保证体系”。按照欧盟《食品法》的规则。食品、饲料、供食品制造用的家畜,以及与食品、饲料制造相关的物品,其在耗费、加工、呆滞的各个阶段必须确立这种可追踪零碎。该零碎对各个阶段的主题作了规则,以保证可以确认以上的各种提供物的根源与方向。可追踪零碎可以从耗费到**PB**的各个环节追踪反省产品。浅显地说,该零碎就是使用古代化消息治理技术给每件商品标上号码、保管相关记载,从而可以中止追踪的零碎。2000年7月17日,欧洲议会和欧盟理事会单独指定了(EC )第1760/2000号法规,建立了对牛的考证和注册体系,并对牛肉和牛肉制品的标签标识作出了规则。这一体系包括以下要素:牛耳标签、电子数据库、动物护照、企业注册。欧委会和各成员国政府主管部分将随时经过这一体系搜取相关消息。按本来的规则,一切于1997年12月31日之后出生的牛或1998年1月1日之后在欧盟区内中止**PB**的牛,都必须在牛耳上加挂标签,每一标签均有单独的校验码,如无标签,不得向外转运。对从欧盟之外第三国出口的牛,也异常须根据上述规则在牛的出口地加挂牛耳标签,未经成员国客观部分答应,牛耳标签不得挪动或改换。每头牛在七出生后14d 之内,成员国主管部分应为其签发一本护照。一旦这头牛忽然出生或被屠宰或出口到欧盟之外的第三国,其护照须交回成员国主主管部分。在**PB**的各个环节,运营者均需对牛肉加贴标签,标签方式须包括:参考号(据此保证牛肉和被屠宰牛之间的可联络性)、屠宰场赞同号、切割场赞同号、牛的出生地、豢养地所在国度(包括第三国)、屠宰地所在国度。而关于从欧盟之外第三国出口的牛肉,则须在标签上说明“产地:非欧盟国度”和“屠宰地:XX 国度。”
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