要点: 最关键的就是减少细胞碎片和单细胞悬液的制备!
1、细胞消化要理想,资料显示最好消化时加EDTA,可使流式做的很漂亮;
2、细胞消化后不可吹打过度,减少细胞破碎;以后的吹打也要注意,尤其是固定后的细胞容易破碎;
3、 细胞用PBS洗涤离心,转速不超过1000r/min,有文献用800r/min;可考虑在此过程中用300目的尼龙网过滤一遍细胞(有人主张用钢网,以 减少细胞与尼龙网粘连的损失,本人认为钢网易损伤细胞,DNA外溢也会造成细胞粘连,所以在细胞数足够的情况下,首选尼龙网);
4、离心后的固定,标准做法是将细胞悬液加入预冷70%酒精,而不是向细胞中加酒精,这样是为了减少细胞聚集,这一点很重要,很多人都忽视了!
5、一般选择4℃固定过夜;
6、加染液前的洗涤仍要注意离心转速的问题;
7、 关于PI染液的组成及配方,应主要以文献为主,PI(作用为DNA染色剂)的浓度从0.5μg/ml,20μg/ml,到50μg/ml都见报道,响应的 求助显示都可出良好结果,RNAs酶(由于PI也可染RNA,故要去除RNA)一般浓度为50μg/ml,配方中的Triton-X-100(曲拉通)主 要是通透细胞膜使PI能进入细胞核。
8、检测时细胞要达到1~2×106个细胞(实际检测是1万到2万个细胞),为了既保持初始条件相同,又可搜集到足够的细胞,应选用多孔培养板,在搜集细胞时,浓度大、抑制强的组可多搜集些孔,以保证检测的细胞数量。如果细胞数量太低,技师为了减少对流式细胞仪 的损伤,就会选择高速流(一般的检测用低速流,误差小),检测的质量就会大大下降,数据的说服力就下降了!
1. 收集细胞;
2.3000~5000rpm离心5min,收集沉淀,重悬于200ul的PBS中,再次离心收集沉淀;
3.75%冰冻乙醇(-20度保存)4度固定过夜or-20度固定1h;
4.离心收集沉淀,PBS洗一次(视沉淀量可忽略);
5.沉淀重悬于200~500ul的PBS,加入Rnase A 37度水浴1h;
6.400目纱布过滤至流式管,加入PI染色,4度避光30min-1h,上机器。
1、Q:要做胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查,但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查,请问:胃组织要怎样保存好呢?用低温保存,还是用乙醇固定?或者固定后再低温下保存?
A:我做过乳腺细胞的DNA含量测定,取得组织以后,先处理成单细胞悬液,然后再加70%冰乙醇固定,要保证冰乙醇的最终浓度为50%,这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时,最多可保存一个月,上机检测前再加PI综合染液。我就是这样做的,保存了将近三个星期,结果还可以,变异系数为5%.
2、实验中想用PI分析细胞周期及凋亡率,请教几个问题:
Q:(1)所用的RNAs酶用什么配制呢?用PBS配吗?
A:RNaseA用PBS配制没有问题,但是注意要沸水浴去除DNase的活性。
Q:(2)测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶,可以一起检测吗?
A:用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的,不用担心。
Q:(3)Triton-x-100是固定剂吧,用了70%的冷乙醇(是4℃吗?),是不是就不用Triton-x-100固定了?
A:Triton X-100是起透化作用的,不是固定剂,可以用75%的乙醇于-20度固定。
Q:(4)还要设什么内参标准(5%鸡红细胞)吗?
A:对照肯定是需要的,这个根据自己的需要进行设置。
Q:(5)不用试剂盒行不行啊?
A:完全可以不用试剂盒。
以下提供一个自己的实验步骤供参考:
(1)200×g离心10min收集细胞;
(2)弃去上清,PBS漂洗一次,将细胞重悬于预冷的80%乙醇中,-20°C固定24h以上;
(3)进行流式细胞仪检测前,200×g离心10min收集固定后的细胞;
(4)PBS洗涤一次,200×g离心10min收集细胞;
(5)将细胞重悬于含100ug/ml RNase A和50ug/ml PI的PBS中,室温孵育30min;
(6)将经PI染色和RNase A消化后的细胞悬液用300目的尼龙膜过滤后即可利用流式细胞仪进行细胞周期分布和凋亡细胞定量的分析。
3、Q:流式检测细胞周期时加RNA酶所需的温度?
A:其实有关RNA酶在凋亡检测制样过程中使用的必要性问题尚有人持不同意见,该观点的人认为RNA酶在环境中无所不在,常规制样过程中所接触的试剂和环境中的RNA酶已足以降解样品中的RNA,所以为了简便实验操作,也有人不加RNA酶或如你所参考的方法将其与PI染液一起使用。不过经典的方法还是“先加RNA酶37度孵育30min,然后加PI 4度孵育30min”。
至于染色时使用4度,是因为低温可减弱分子运动,增强荧光染料结合的稳定性和减少可能的荧光损耗。上流式前细胞用75%乙醇固定行吗?
4、Q:我养肿瘤细胞,测周期。看到帖子说70%乙醇必须用PBS和乙醇配,用水配细胞会碎裂,有帖子说PBS和乙醇配会出现絮状物。上流式前细胞用75%乙醇固定,就用买来的现成的瓶装75%乙醇,行吗?必须那么严格吗?
A:先用冷PBS悬浮细胞,大约1-2ml,充分悬浮,使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇,终浓度为70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是:直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象,很难重悬成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。
5、Q:我要做流式分析细胞周期,我大概收集了10的6次方细胞,但细胞在乙醇固定之后,还看到有细胞沉淀的,但PBS洗涤两次之后,就基本没什么细胞沉淀了,上机发现就发现不了细胞了。这是怎么回事啊?怎么解决这个问题啊?
A:很可能是洗细胞的过程中丢失了,解决办法有:
(1)尽量采用尖底的离心管和水平离心机
(2)离心后尽量用吸管吸取上清,不要倾倒;吸上清时最好残留1mm左右的水膜,不要吸完。
(3)离心的转速或时间可稍微增加一点儿
(4)每次加抗体时,吸头最好不要接触液面;混匀时最好不要用吸头吹打,以免吸头挂壁带走部分细胞。
6、Q:流式细胞PI单染中为什么用RNAse?
A:在测细胞周期时,因为已经在细胞膜打孔了,PI很容易透过细胞膜和DNA结合,但RNA也是核酸,也会被染色,为避免干扰染色前需用RNAse降解RNA。这样PI只染DNA,能精确以荧光强度反映DNA的含量。
7、最近做了几次流式细胞仪检测细胞周期,发现有几个问题:
Q:(1)我所用的是肿瘤细胞, 但是同样的细胞类型,同样的处理因素,虽然两次独立实验作出来的结果总体趋势都是在某种药物干预后,S期比例下降,但两次结果S期比列具体数值相差很大,同样,G2/M期在干预前后无变化,但两次独立实验数值却相差很大,那么可以说,做流式是每次细胞状态不一样,结果也会相差很大,是不是细胞密度会对结果产生很大影响,那么如果细胞密度在60-70%时和细胞已经长满(90%以上)也会导致各期数值的差异?如果是这样,长满的细胞(不再增殖)是表现的G1或S或G2/M上升还是下降?
A:应该是两批细胞在实验时本身所出周期不同所致,可以在实验前进行细胞的同步化处理,减少批间差异。实验细胞应处于对数生长期,而不能是完全长满,一般在50~80%比较好。自然状态下,不增殖的细胞应该处于G0/G1期。
Q:(2)其次就是结果分析,细胞周期特异性药物如抗代谢药作用后主要表现的是S期比例下降,细胞被阻滞在G1期,自然G1期比列升高。而有些植物药如长春碱类或紫杉醇类,主要作用于M期,那
么结果是否表现为G2期比例升高,还是S期也相应升高?还有就是细胞经抗肿瘤药物作用后反而出现的S期升高,可能是那些原因,如何分析?
A:周期特异性药物阻滞哪一期,哪一期就升高,不会使其它阶段细胞增多。
8、Q:我用流式做胃癌细胞周期分析时不出现S、G2/M峰?什么原因呢?自己分析可能为PI没染上色,是不是染色时间太短呢?
A:你用了多少PI染色多久呢?一般来说30分钟够了.我觉得可能是打孔或者rna没有处理掉没有成功,染色时间并不是关键。
9、Q:做流式细胞时,PI 染色,PI的浓度应该是多少?还有就是400目的筛网是什么?不用可以吗?谢谢。
A:100ug/ml,一般用400目的筛网是用来将粘在一起的细胞团滤掉的,否则会出现人为的多倍体干扰,分析的时候需要的是单个的细胞,不过如果经验丰富也可以gate掉的。如果你没有条件,建议在染色之前将细胞弹的很散,再进行染色
10、Q:流式细胞仪观察细胞周期样品怎样准备?
A:给你介绍一下我的实验方法,我做的是周期检测,要做平行样,六孔板做的。
(1)收集先弃液,将你要实验(你已经处理好的)的细胞PBS洗两次,加胰酶消化(注意:如果要是加药物或者其他处理过的细胞,弃液和PBS洗液均收集);
(2)加培养基终止消化,打匀在分别收到各自离心管中(注意,收集过程中及后续过程中枪头不要混用,要不平行样也就没意思了);
(3)离心,1000rpm,5min弃液;
(4)4度PBS(1到2ml)洗两次,离心,1000rpm,5min弃液;
(5)加入负20度70%酒精(1到2ml)打匀,固定,至少半个小时以上,(不做的话,可放入4度冰箱保存2-3周问题不大);
(6)离心,1000rpm,5min弃酒精;
(7)4度PBS(1到2ml)洗,离心1000rpm,5min弃液;
(8)4度PBS(1到2ml)洗,打匀后,将细胞悬液用100 目的纱布直接过滤到流式检测管中;
(9)离心,1000rpm,5min弃液;
(10)加PI染液染色(浓度为50ug/ml),PBS32.4ml ,PI 2.5mg,Rnase 0.5mg,(Triton-X-100 0.25ml,枸橼酸钠50mg,这两我没加也效果不错)加PBS至50ml,4度避光保存数月。106细胞中加入1ml PI染液, 振荡器振匀,避光染色至少30 min, 上机检测;
(11)统计分析。
流式检测细胞周期protocol
PI 染色检测细胞周期
1、HepG2细胞培养至70%左右,细胞铺板(60mm 小皿),8万/皿,饥饿48小时,加药处理96h (加药组10万/皿)
2、收集培养基,2ml 胰酶消化细胞,新培养基3ml 重悬,收集细胞悬液,1000rpm ,5min 离心
3、弃去上清,加入1ml 预冷的PBS 充分重悬细胞,转移到1.5ml 的EP 管
4、混匀,4°,600g ,5min 离心
5、弃去上清,用250ul 预冷的PBS 重悬细胞,充分重悬,加入至750ul 冰浴的无水乙醇,轻轻吹打混匀;
6、用封口膜封口,—20°,4h ,最好过夜,可在—20°保存1w 左右;
7、染色:
㈠、除去封口膜,加入500ulPBS 重悬细胞, 4°,600g ,5min 离心;
㈡、弃去上清,加入1ml 预冷的PBS 洗涤一次;
㈢、同上离心,弃去上清;
㈣、每管加入200ul PBS +2ul RnaseA(100μg/ml)溶液缓慢充分混匀后,室温,避光孵育30min, 再加 2.5ul PI(250μg/ml),室温避光15min ;
㈤、24h 内流式检测。
试剂:RnaseA ,beyotime,10mg/ml,ST576
PI,beyotime,20mg/ml,ST512
流式检测细胞周期的原理
一. 细胞周期的检测
1、原理:细胞在有丝分裂的过程中DNA会加倍。(n----2n)
2、我们使用PI来标记DNA。PI的通到是FL2
3、荧光信号的表示方法,有荧光的宽度(W),荧光的高度(H),和荧光信号的积分面积(A). 我们使用荧光的积分面积(A)来检测细胞周期的变化.因为,即使DNA的含量相同的两个细胞,如果细胞的形状差异较大,荧光信号的高度是不相等的。但是积分面积一定相等。
4.接下来我以二倍体细胞为例降解,流式检测细胞周期的过程。
首先,我们知道细胞分为处于静止期的细胞(G0)和处于分裂状态的细胞,分裂期状态的细胞又有G1期,S期,G2期和M期。我们来分析下各个时期DNA含量的变化。G0期DNA数目为n.
G1期细胞主要进行RNA和蛋白的合成, DNA数目为n.
S期DNA开始复制,直到复制结束进入M期,DNA数目从n变为2n.
G2期主要是RNA和蛋白的合成,为M期做准备 DNA数目为2n
M期细胞分裂的过程,直到M结束细胞一分为二,DNA数目也是2n.
从DNA的数目上,我们可以将细胞周期分为G0/G1期,s期,G2/M期.
我们利用荧光强度的积分面积来检测,利用直方图来表示,如果G0/G1期处于50的位置,那么G2/M期处于100的位置。期间的为S期。
4、但是有个问题值得我们注意。
我们的样本很容易聚集有时候两个G1期的细胞会聚集在一起形成粘连体,通过激光照射区时,其荧光强度会和G2期的相同,这就需要排除粘连体。我们BD公司的专利技术可以使粘连体通过检测区的荧光宽度比G2期的长。我们利用W对A的散点图分析,如果G0/G1期在50的位置,那么G2/M期在100的位置,其他的位置为粘连体和一些不符合检测的细胞及碎片等。我们通过画门来得到我们需要检测的细胞。
5、因此我们需要三个图就可以检测到我们的细胞周期变化情况,
第一个散点图,通过前向和侧向的变化,区分出我们要检测的细胞群。第二个散点图我们出去粘连体。第三个直方图得到我们的细胞周期变化。
注意我们这里标FL2是因为我们用的是PI染料。
6、下面是我们的试剂使用的原理,我们的细胞周期试剂盒有三种液体。
A.起固定破膜的作用。因为我们使用的是PI 染料无法过膜;
B.起除去RNA,因为我们的PI染料既能染RNA也能然DNA。
C.液就是PI
7、接下来是我们的一个实验步骤,我们使用的是外周血,首先通过裂解除去红细胞,裂解液10min. 1200r,5min. 沉淀的是我们需要的细胞。接下来是用鞘液,我们平时做实验的时候可以用PBS,洗我们的细胞。然后,离心获得我们需要的细胞。加A(250)固定破膜,加B液200除去RNA。然后加C液200染色。要注意的是,A液是250ul.B液和C液是200.还有加C液后要避光。最后要300目过膜。
二、 HLA-B27分析
利用试剂盒,首先看样本的制备,
1.50ul的外周血,加A液30ul(包含FITC标记的抗HLA-B27抗原的抗体和PE标记的CD3抗体和人类的T淋巴细胞特异性的结合),然后加血。避光(10min)
2、加B液,10X的细胞裂解液,使用前稀释到1X,2ml避光静止10min.裂解红细胞,立即低速离心。注意不要超过12min。以免破坏白细胞,1200r/5min,去上清
3.加鞘液2ml,混匀洗涤细胞一次,1200r/5min,去上清.
4.加500ul-1ml的鞘液,悬浮细胞,上机
三、 四色实验,
1、以两色为例,需要一个单阴管和两个阳性对照以及一个样品管,单阴管用于阴性对照。单阳管用于调补偿,
2、阴性管,100ul血(调电压和域值)
3、单阳管,100ul的血+CD4FITC 10ul
4、单阳管,100ul的血+CD8PE 10ul
5、样品管,100ul的血+CD4FITC 10ul+CD8PE 10ul---避光15min.--2ml裂解液避光10min.1200/5min去上清,2mlpbs洗细胞,1200/5min去上清,加500ulPBS混匀-上机,
四、TBNK(MutiSET)(占不清楚)
1、绝对计数管,准确加入MutiSET试剂10ul和50ul全血,避光15min,要注意,吸取血样的时候,和平时用枪相反,二档吸,应当放。450ul裂解液10min避光,上机(免清洗) 2、
关于流式做细胞周期检测是否一定用RNase(细胞周期)
细胞周期
标题: 关于流式做细胞周期检测是否一定用RNase(细胞周期)
摘要: [关于流式做细胞周期检测是否一定用RNase(细胞周期)] 请问各位大侠,用流式做细胞周期检测,我查阅了不少东东看了,有一个步骤是加不加RNase的问题,很多文献上都加了,但也有没加的,这里加RNase是不是主要起去RNA的作用啊,但PI单染并不对RNA染色啊,不知哪位可以解释一下,谢谢了! 关键词:[细胞周期]……
关键词: 细胞周期
请问各位大侠,用流式做细胞周期检测,我查阅了不少东东看了,有一个步骤是加不加RNase的问题,很多文献上都加了,但也有没加的,这里加RNase是不是主要起去RNA的作用啊,但PI单染并不对RNA染色啊,不知哪位可以解释一下,谢谢了!
回复
ding回复
流式细胞最初的应用之一便是检测细胞的DNA含量,它可快速将细胞循环中的其它阶段与有丝分裂期区别开来。这些检测是基于对细胞内DNA以化学定量方式的染色(染料着色数量直接与细胞内DNA含量相关)。有相当多的对DNA有高亲合力的染料可用于此应用。而不同的染料与DNA分子结合的位点不同。
现用得最多的两种DNA结合染料是蓝光激发的碘化匹啶(PI)(或偶尔也有用EB)和紫外激发的DAPI和Hoechst染料33342和33258。PI染料是一种插入性的与双链DNA和RNA(当要特异地检测DNA时,经常使用RNAse去除RNA)结合,而DAPI和Hoechst染料仅与DNA的螺旋结构的亚级凹槽结合并与RNA完全没有任何结合。Hoechst 33342是现唯一令人满意的能对活细胞DNA时行染色的染料。其他一些染料在染色前需要破坏细胞膜,故经常使用去污剂或低渗溶液处理或溶剂进行固定(酒精)。
所以若是细胞内双链RNA不多的话,可以不加回复
谢谢了!
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流式细胞仪检测细胞周期
流式细胞仪检测细胞周期的步骤
应用: 通过流式细胞仪分析各时期的细胞百分数,可检测细胞的增殖、凋亡。
原理: 通常用PI染细胞核,PI在一定波长的光下发出荧光,其强度与DNA含量成正比。绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白及其它发光基团也可作为标记物,分选细胞。
方法:
1)将细胞以1×106接种于60mm培养板,80%汇合后转染。
2)24小时后在新鲜培养液中加入适当的抗生素(真核表达载体上的抗性标记)进行培养(该步可选)。
3)48-72小时后用胰酶消化收集细胞,PBS洗两遍,弃上清,加入1ml 70%预冷乙醇中,吹打均匀,4℃固定12小时以上。
4)PBS洗涤去乙醇,1000rpm, 5min,洗两遍。
5)0.5mlPBS重悬细胞,加入PI和 RNaseA至终浓度50μg/ml,37℃温浴30 min。
6)用流式细胞仪测定周期。
PI:碘化丙啶,以PBS配成1mg/ml,4℃保存。
RNaseA:10mg/ml
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