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;甲苯中苯如何去?”这是有机化学中一道普通的思考。当然，答案也很简单:苯酚先与氢氧化钠生成苯酚钠，然后分液。但，却很少有学生想过该法在际应用中的后，即大量含酚废水产生。研究道，当水中苯酚的含量达到10mg/L，会造成生生的死;用于灌溉时，易导致农作物减产;而人类如果长期使用被酚污染的水则会引起贫血、神经系统疾病乃至死亡。因此，对于含酚废水的污染防治具有十分重要意义。尽管目前，各新型物理、化学以及生物去酚方法有报道，但是这方法存

低共熔溶剂(deep eutectic solvent，DES)作

为一类型绿色溶剂引起了人们的广泛关注。该类溶剂主要由一定学计量比的季铵盐和氢键给体(例如酰胺、醇、酚等)通过氢键作合而成。其不仅具有蒸压低、无性、可生物降解、解性和导电优良、电化学稳定、窗等独特的理化学性，且制过程简单，只需将一定摩尔的季铵盐和氢键给体混合，并于一定温度下加热搅拌直至形成均一的无色液体，无需纯化就可以获得纯度较高的产品。此外，由于低共熔剂的成原料均为很常见的化合物，来源丰富且价低廉，

基于述背景，作者设想，既然季铵盐与酚能形成氢键而成低共熔物，那么是否可以利用这一原理实现甲苯中的去除呢?因此，作配制了同浓度的含酚甲溶液，尝了物料比、温度等因的去酚果，取了好结果。研究发现，该法仅去酚效率高，且操作简单，无需碱水处理，避免了二次污染，是一种较为绿色的途径。另外，该验不仅可以拓宽生的知识面，也可为工业上酚的去除提一定

1 仪器与试剂

1.1 主要试剂

氯化胆碱(分析纯)、四甲基氯化铵(98%)、四乙基氯化铵(98%)、四丁基氯化铵(97%)、化铵(99%)、三胺盐盐(99%)，上海阿拉试剂有限公司;甲苯(分析纯)、正己烷(分析纯)、对二甲苯(分析纯)、苯酚(分析纯)，国药集化学

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计(UV-1201)，北京瑞利分仪器有限公;WT1003电子析平，常州万泰天平仪器有限公司;DK-S24数显电热恒温水浴锅，上海苏达验仪器

2 实验原理

其中，低共熔物由季铵盐(氯化胆)与给(苯酚)通过Cl- 与酚羟基之间的氢键作

3 实验部分

3.1

以分光光度计在210,300nm 范围内进行描，确定苯酚最大收波，为270nm，有关文献相符。设置浓度梯度(0,6mg/L)，在最大吸收波长下测定吸光值，进而绘制

3.2 实验步骤

配制20mL一定浓度的苯酚/甲苯溶液，置于玻璃试管中。入一定量的季铵，在水中搅一定时间。反应束后，静置溶液10min，溶液分成两相。取上层清液，并稀释至一定浓度，在波长270nm处测定吸光度计

4 结果与讨论

4.1 季铵盐

先，在20mL浓为97.7g/L含酚甲苯溶液中加入了1摩尔当量(相对于苯酚)的季铵盐，25?条件下搅拌15min，考察了不同季铵盐对苯酚去除率的响，结果见图2。实验发，当氯化铵和三乙胺盐酸盐加入甲苯液中时，季铵盐沉淀在溶液底部，未与苯形成低共熔物，可是由于这2种铵盐与苯酚之间氢键作用较。溶液中加入四基氯铵(TMAC)，乙基氯化铵(TEAC)以化胆碱(ChCl)后，甲苯中的苯酚含量迅速降低且形成了明的低共熔物层，其苯酚去除率分别为86.2%、90.3% 和90.9%。而当溶液中加入四丁化铵(TBAC)时，同未得到相的低共熔物，这可能是由于随着季铵盐烷基链的增长，其与苯的混溶性强，而与苯酚之间的

4.2 氯化胆碱

在20mL浓度为97.7g/L含酚甲苯溶液中加入1摩尔当量(相对于苯酚)的氯化胆碱，在25?下搅拌一定时间，察了不同间对苯酚去除的影响，结果见图3。由图3知，当入氯化碱，苯中的苯酚含量迅速降至8.9g/L(去除率90.9%)，且平衡时间仅为3min。当静置10min后，液出现了明显的分层。这说明，苯酚与氯化碱之间发生氢键作

4.3 氯化

配制同浓度的含酚甲苯溶液，分别为177.8、97.7、47.2g/L，在25 ?条件下搅15min，考察了不同料比对苯酚去率的影，结果见图4。从中可以出，尽酚初始浓度不同，随着化胆碱用量的增加，苯酚的去除率也逐渐增加。当氯化胆碱和苯酚的物质的量之比达到1?1时，苯酚的去除率基本恒定，继续增氯化胆碱用量

4.4 温

温对苯酚去除率的影响见图5。由图5可，当氯化胆碱/苯酚的物质的量之比为1?1，反应温度为10?时，酚的去除率达93.1%，这说明该在室温件下能效实现苯酚的去除。续升高温度至40 ?时，苯酚的去除率降低至86.4%，这有可能是因为温的提高削弱了氯化胆碱与苯酚之间氢键作用，导致

4.5

相于传统的苯酚去除方法，该法的另一优势在氯化胆碱可以回收利用。在反应结束以后，将下的低共熔物进行分离，并入一定量的醚。在醚反溶剂的作用下，低共熔的氢作被坏，导致氯化胆碱溶液中析出。从图6可以看出，氯化胆碱可重复使用且对苯酚的去除率无明显影响。因此，该法不仅可以用于有效去除甲苯的苯酚，而氯化

最后，研究了该法的应用范围。通常，实验用甲苯、二甲苯以及己烷来为型油。将物的量

5 结论

(1)利用低共熔物法可有实现甲

(2)该法只需简单的分液操作，无需规酸碱处，了大量废水的产生，所需原料氯化胆碱价格低廉且可以回

(3)该法利用前沿科学解决老问题，不仅以宽学生及研者的思路，而且也可为工业上苯酚的去除提供一定的理论和实践

少量甲苯存在下2,6-二甲基苯酚在水介质中的氧化聚合

少量甲苯存在下2,6-二甲基苯酚在水介质中

的氧化聚合

第22卷第5期

2008年l0月

高校化学工程

JournalofChemicalEngineeringofChineseUniversities

NO.5,,01.22

0Ct.2008

文章编号:1003-9015(2008)05?0906-05 少量甲苯存在下2,6.二甲基苯酚在水介质中的氧

刘群,申屠

(浙江大学化学工程与生物工程学系化学工程国家重点实验室,浙江杭州310027) 摘:研究了苯水介中合成的聚2,6-二甲基-l,4.苯醚(PPO)分子量及聚合物粒子形态的影响.研究

二甲基苯酚(DMP)氧化聚合过程中引入一定甲苯后,显

甲苯混台物的玻璃化温度,发现PPO/甲苯合物的温度随甲苯用量的增加而降低,其与甲苯用量的关

Fox方程.关联了PPO分子量与PPO/~a苯混合物化温度的关系,结果显示玻璃化温度对PPO分子量起

用,这可能是由于在搅拌作用下甲苯能够溶胀合物,低其玻璃化温度,导致预聚物分子链的活动性增

进预聚物的后氧化聚合采用透射电镜研究了介质中聚合物粒子形态,发现加入甲苯后聚合物最终粒

密的鹅卵石形,甲苯使初级粒子融合在一起,初级粒子的轮廓模糊至消失. 关键:2,6.甲基苯酚:2,6.甲基-l.4.苯醚;玻璃化温度;分子量;甲苯 中图分类号:0643.12;TQ3l6.325

OxidativePolymerizationof2,6一DimethylphenolinthePresenceofaSmall

AmountofTolueneinanAqueousMedium

LIUQun,SHENTUBao-qing,WENGZhi-xue

(StateKeyLabofChemicalEngineering,DepartmentofChemicalandBiochemicalEngineering,

ZhejiangUniversity,Hangzhou310027,China)

Abstract:Theeffectsoftolueneonthemolecularweightofpoly(2,6-dimethyl-1,4-phenyleneoxide)(PPO)

andthemorphologyofpolymerparticlessynthesizedinanaqueousmediumwerestudied.Itwasfoundthatthe

molecularweightofPPOincreasesafteraddingacertainamountoftolueneduringtheoxidativepolymerization

of2,6?dimethylphenol(DMP).Theglasstransitiontemperature(ofPPO/toluenemixturesWasstudiedby

differentialscanningcalorimetry.Itshowsthatdecreaseswiththeincreaseoftoluenecontentandtherelation

betweenandtoluenecontentobeysFoxequation.ThemolecularweightofPPOWascorrelatedwithof

PPO/toluenemixture,anditrevealsthatplaysanimportantroleinthemolecularweightofPPO,whichis

probablybecausetolueneCanswellpolymerparticlesundertheactionofagitationandlowerits,thelatter

resultsintheincreaseofthemobilityofoligomerchainsandthefacilitationoftheoxidativepolymerizationat

thelaterperiod.ThemorphologyofthepolymerparticlesynthesizedintheaqueousmediumWasobservedby

transmissionelectronmicroscopeanditwasfoundthataftertheintroductionoftoluenethefinalpolymer

particleshowscompactcobblestonemorphology.Toluenemakesprimaryparticlesfusetogetherandtheprofile

ofprimaryparticlesisSOambiguousthatcannotbeseen.

Keywords:2,6一dimethylphenol;poly(2,6-dimethyl一1,4-phenyleneoxide);glasstransitiontemperature;

molecularweight;toluene

1前言

2004年Nishide等采用铁氰化钾作氧化剂,水质中使2,6?二甲基苯酚(DMP)氧化聚合,

收稿日期:2007-o6.13:

纂金项目:国家自然科学基金资助项目(20674075):浙江省自然科学基金资助项目(Y404299)

作者简介刘群(J98lI),女,四川仁寿人t江学博士生联

第22卷第5期刘群等:少量甲苯存在下2,6二甲基苯酚在水质中的氧化聚907 聚2,6.二甲.1,4.苯醚(PPO)【'.在得到PPO的同时,还生成少量的3,3,5,5一四甲基-4,4一苯

副产物.但水介质中合成的PPO分量较,

申屠等研究发现氧化聚合过程中DMP速氧

成聚合物粒子.为抑制碳.碳偶合副反应,化聚合度常控制在80~C以下【4】,由于PPO的

度高达210~C【,使聚合物粒子中预物分活

低.

本文针对在水介质中合成的PPO分子较低

PPO的甲苯作为溶胀剂,研究在水介质DMP化

苯对PPO粒子形态的影响.外,该

后,PPO

离.

2实验部分

2.1试剂和仪器

DMP,分析纯,Aldrich公司产品:氢氧化(NaOH),分析纯,杭州萧山化学试剂厂:十二

酸钠(SDS),化学纯,广东汕头市西陇化工:铁氰

钠fNaC1),分析纯,宁波市化学试剂';,

扫描量热仪(DSC),Perkin-Elmerl32DSC.7,美

l525/2414,美国Waters公司:分光计,72l,

公司.

2.2PPO的合成

在带育搅拌桨,温度讨.的玻璃反应釜中,加含有2gNaOH,0.244gDMP和00576gSDS

水95mL,搅拌均匀后升高反应釜的温度全50.C,入

r.min.'的搅拌速度下反应lh,再加一定

空干燥至恒重.

2.3PPO/甲苯混

称取被不同用量甲苯溶胀后的PPOl0mg左右,

化温度(,测定时先用液氮冷却至一50~C后,再

2.4PPO分子量的测定

采用GPC测定PPO分子量,以甲苯为溶剂,测定温

以.分散聚苯

2.5DPQ含量的测定

制同浓度的DPQ甲苯溶液,采用分光度计测

光率7'L…,根据Beer-Lambert律计算不DPQ甲苯溶液的吸光度(D),从而得到DPQ在甲

消光系数为65000L.mol-1om,.根光数可由实验测得的71L计算产物中DPQ的

2.6PPo

待氧化聚合反应结束后,有接过滤得产物,

的PPO粒子包埋在环氧树脂中,用超薄片机切

粒子形态.

3结果与讨论

3.1甲苯对PPO分子量的影响

Nishide等研究表明,全水介质中DMP化

高校化学工程2oo8年lO月

合为二聚体,二聚体通过再分配以及链长反应

粒子,结果使得氧化聚合反应从均相变成

角度出发,采用与PPO溶度参数和极性近的

量的影响规律.

PPO分子量随甲苯用量(甲苯质量百分数,w.)

的变化如表l和图l所示.

量随甲苯用量的变化呈S

下时,PPO分子量随甲

量大于l5%时,PPO

增加:当甲苯用量超过30%时,甲苯用量对PPO的

分子量影响不大.当甲苯

均分子量达到7-3万,

表l甲苯用量对PPO

TablelTheinfluenceoftoluenecontent(onthe molecularweightandyieldOfPP0 由表1可知,PPO和DPQ的得率基本不受甲苯用的影响,DPQ得率小于0.4%;

PPO分子量分布指数略有增加,但变化度不,

PPO分子量分布指数随

图l甲苯用量(ws)对PPO数均分子量(^矗)的影响

Fig.1Theinfluenceoftoluenecontent(ws)onthe numberaveragemolecularweightofPPO(I) 图2甲苯用量对PPO/甲苯合物璃

Fig2Theinfluenceoftoluenecontent(ws)onof PPO/toluenemixture

3.2甲苯对PPO/甲

为探究甲苯用量对PPO分子量的影响,制了不

让甲苯充分溶胀到PPO粒子中,采用差示描量热(DSC)N定PPO/甲苯混合物的玻璃化温度.

前称重,以计算测定样品中甲苯的含量.苯含

随甲苯含量增加,PPO/

根据文献【一,甲苯的玻璃化温度(.)为113K,PPO的玻璃化温度(Po)为483K,采用Fox方程

式(1)【】计算得到PPO/~苯混合的玻璃

:+(1)7

,,pPo

一

从图中可以看出,DSC法

璃化温度与Fox方程计算得

为PPO/甲苯混合物的玻

Fox方程.Roberts【等

基丙烯酸甲酯核壳结构聚合

表2不同甲苯用量下PP0/甲苯混合物

的玻璃化温度

Tahie2ofPPo,toluenemixtureatthevarious toluenecontents(

w/%(,)101520304050

.

/K364324292244209183

度.根据Fox方程计算得到不同甲苯

第22巷第5期刘群等:少量甲苯存在下2,6.二基苯酚水中的氧化聚合 苯混合物玻璃化温度的降低而变化,表明

Fig.4T4m誊嚣.瞍降低到一定程度后,预聚物分子的活动性不再..m.dim 足控制PPO分子

3.4甲苯对PPO粒子形态的影响

DMP氧化聚合过程中未添加和添加甲时形

拌作用下,未加甲苯时形成的合物最

轮廓清晰,且初级粒

子问存在fHj隙,证明最终粒子主要由初粒子聚,与前文报道的结果一致【]1.DMP氧化聚

巾加入甲苯后,形成的聚合物最终粒子紧密的

这可以认为是由于甲苯的溶胀作用使初级粒子合在一起故. 以上结果明,DMP氧化聚合过程中,引入甲苯作为溶胀剂,在搅拌作用下甲苯能够溶胀

粒子巾,并使初级

4结论

水介质中DMP氧化聚合过程中,由甲苯的

内预聚物分子链的活动性,促进了聚合物子内氧

苯用量的增加呈S形变化.DMP氧化聚过程,

粒子的轮廓,粒子问存在间隙:添加甲后,甲

作用下模糊甚至消失,融合在一起形最终

符号说明:

.一PPO

,

PPO重均分子量

,

/M,一PPO分子量分布

一

PPO/~苯混合

PPO—PPO

一

甲苯的玻璃

'一甲苯质量百

9lO高校化学工

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污泥中苯酚降解方法

污泥中苯酚降解方法

1 引言

目前，随着现代工业的不断发展，量有

油、制药、焦碳原料等工业过程中的要工

要有害物质，会对动、植物产生有毒至致

体中5~25 mg · L-1的浓度可对鱼

酚蒸汽或会引起长期累积性中毒，而用高

尤其对人体神经系统危害较大. 美国保署把

我国也把苯酚列入中国环境优先处理污染“

污染物已成为污

降解酚类的方法主要包括吸附法，化学

本低、二次污染小、处理效率高等优，因

方面进行了大量的研究，从被酚类物污染

要有根瘤菌、酵母菌、醋酸钙不动杆、假

大部分研究主要集中于酵母菌、芽孢杆菌以假单菌，对Acinetobacter 属的细菌较

生物降解法处理有毒和难降解的工业水时，

选育高效微生物降解利用有毒有害物，但

冲击，使其中的高效降解微生物菌群死、

有效去除水体中的苯酚，但降解过程影响

的影响因素，控制生物降解系统能较的耐

定主次因素的差别，而Plackett-Burman 实验广泛应用于生物过程重要参数的筛选，通

进行统计学设计和数据分析，筛选出对标值影

surface methodology，RSM) 是一化程的有效方法，其中的Box-Behnken 实验

常用，可用于确定实验因素及其交互用在

值之间的关系. 该法与正交设计比，所

本研究从株洲某化工厂污水处理车氧化

细菌菌株YH8，根据其形体特征、生理生化状、BIOLOG 鉴定、16S rDNA和gyrB 序列

分类鉴定，研究了该菌株降解苯酚的性和

(RSM)优化菌株YH8

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 样品来源

从株洲市某化工厂废水处理车氧化池

2.1.2 培养基

种子培养基(LB):每升含酵母粉5 g，胰白胨10 g，NaCl 10 g，pH 7.0~7.2.无

基(MS):每升含K2HPO4 0.4 g、KH2PO4 0.4 g、NaCl 0.1 g、(NH4)2SO4 0.04 g、MgSO4 · 7H2O

0.1 g、MnSO4 · H2O 0.01 g、Fe2(SO4)3 · H2O 0.01 g、NaMoO4 · 2H2O 0.01 g，加水定容

至1000 mL. 选择培养基:在已灭菌MS 养中，按浓度要求加入经0.22 μm 微孔滤

苯酚母液(10 g · L-1水溶液) ，pH 7.0.以上固体培养基需加入1.8%的琼脂粉，经121 ℃、

20min

2.2 实验方法

2.2.1

准确称量氧化池活性污泥10 g，入到

r · min-1恒温摇床中振荡培养1 h.重

浓度按100、200、500、1000、1200、1500、2000 mg · L-1依次提高以梯度驯化与富集

经过多次转接培养，梯度稀释培养液涂布

倒置培养12 h.挑取菌落形态不同单菌落

存于4 ℃

2.2.2 降解菌的筛选

将保藏的纯化菌株接种至LB 平板上，划线

30 ℃、200 r · min-1振荡培至OD600为2.0(对数生长期末期). 连续活化3代后，

水将发酵液离心洗涤2次并重悬菌体. 以2%

测培养液中苯酚含量，从中

2.2.3 形态特征鉴定

肉眼观察降解菌的菌落形状、大小、颜色、

否产色素等，菌体染色后用高倍显微观察

立S-3400N 型扫描

2.2.4

参照文献进行生理生化鉴定，另采用BIOLOG 全自动鉴定仪比对代谢指纹进行鉴定. 采用添加

5 μg · mL-1的抗生素，浓度梯度为50、100、400、500、800、1000、1200、1500、2000

mg · L-1的重金属盐LB

2.2.5 16S

rDNA 基因序列的测定及分子系统发育树的建 细

.16S rDNA基因序列的获取参照文.PCR 物经琼脂糖电泳检测纯Kit 试剂盒，依据说

化，送上海生工进行双向测序并拼接输出

性比对，采用ClustalX 1.8进行列匹配

Joining method)构建系统发树，利Bootstrap(1000次重复) 检验各分支的

2.2.6 gyrB基因序

gyrB 基因是普遍存在于细菌中编促旋

的平均碱基替换率为0.7%~0.8%，gyrB 因补了非蛋白编码基因16S rDNA无法区分

缺陷. 以提取的细菌基因组DNA 为模板，采用gyrB 的保守引物对UP-1F/UP-2R进行PCR 扩增，

PCR 反应体系及反应步骤参照文献. 利用序

UP-2sr: 5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3′双向测序并连接，gyrB 序列构建系统发

同上.

2.3

经单因素实验确定影响YH8降解苯的环

苯酚降解的优化. 首先，利用Plackett-Burman 设计选出对菌株降解苯酚效率影响较大

然后利用最陡爬坡设计逼近最佳区域，最后用响面中的Box-Benhnken 设计进行实

过实验数据拟合响应面模型，最终确定最降解并

Expert 软件进行分析.

2.4 苯酚

2.4.1

将筛选到的菌株YH8接种至选择培养基(

200 r · min-1振荡培养32h ，取数生长末

min ，上清液即为胞外粗酶液，于-20 ℃. 菌体沉淀用pH 7.0的磷酸缓冲液清洗两

悬于磷酸缓冲液中. 在冰浴中，用HUP-400A

30 s，连续处理10 min.于4 ℃、13000 r · min-1离心20 min，上清液即为胞内粗酶

20 ℃冻存.

2.4.2 菌株降解苯

以细菌基因组DNA 为模板，扩增苯酚

二酚1，2-双加氧酶(C12O)基因片段.LmPH

3′;Lph2:5′-CGCCAGAACCATTTATCGATC-3′. C23O引物为C23OF:5′-

GGTCTGATYGAAATGGAYCGCGA-3′;C23OR:5′-CGTTCGTTSAGCACCCGGTCGTG-3′. C12O引物为

C12OF:5′-CCTGARCBGTHGGYTTT GCNCGTATGGATGA-3′;C12OR: 5′-TCACGRGTW GCRWARGCAAAGTC-

3′.上述基因片段扩增体系与16S rDNA

为:94 ℃预变性5min;94 ℃变性30s ，52 ℃退

10min.C12O 和C23O 的引物的PCR 反应程序

72 ℃延伸1min ，30个循环;72 ℃延伸10min.PCR 产物经琼脂糖电泳检测、纯化、测序，测序结

果用BLAST 软件与Genbank

2.4.3

采用碱裂解法抽提质粒. 质粒消除采

LB 和选择培养基的平板上，对能在LB

测. 挑取质粒消除突变菌株利用LmPH C12O

C12O 基因.

2.5 分析方法

2.5.1

采用可见分光光度法在600 nm

2.5.2

采用4-氨基安替比林直

2.5.3

苯酚羟化酶活性的测定参照文献. 分参考文

酚2，3-双加氧酶(C23O)催化降邻苯二

和375 nm处有最大吸收峰.C12O C23O 酶力测定以单位时间内反应产物分别在260 nm

nm 处吸光度变化表示. 反应体系为8.01 mL邻

酶液，以缓冲液为参比. 定义C12O(或C23O) 活

产物所需酶量. 总蛋白含量用Bradford 法

Quantitative Kit试剂盒明书. 酶比活力以每毫克的蛋白质中所含酶的活力单位

3 结果与讨论

3.1 菌

从活性污泥中分离纯化得到单菌落，线分

酚降解能力最强的菌株，命名为YH8. 驯化前，

培养基中，经30 ℃、200 r · min-1培2d 可使苯酚降解率达到78.54%.采用梯度浓度

菌株YH8可在4d 内使1200 mg · L-1的苯酚降解89.47%.

3.2 菌株的鉴定

3.2.1 形态特征鉴定

菌株YH8的菌落呈圆形、浅白色、中间

产色素. 菌株细胞呈短杆状，有荚膜，无鞭毛

长的菌株细胞差异，正常细胞表面较光，而苯

酚在水溶液水解成酸性，高浓度的苯对细

出现破损等现象.

图1 YH8在LB 中的

图2 YH8在苯酚中的

3.2.2 生理生化鉴定

菌株YH8生理生化指标如下:革氏染

氨酶阴性、吲哚实验阴性、淀粉水解性、硫

验阴性、甲基红阴性、明胶液化阳性、纤维素

动性. 将菌株YH8细胞悬浮液接种至BIOLOG GN2板微孔中，培养4h 和16h 后分别测定

指数. 经BIOLOG 细菌鉴定统分析，

guillouiae(Acinetobacter genospecies 11)的相似性为94%.

重金属抗性实验发现，菌株YH8能在分别添加1.0 g · L-1 Pb2+、1.5 g · L-1 Cr6+、

1.8 g · L-1 Cr3+、0.5 g · L-1 Cd2+、1.0 g · L-1 Sb3+、3.0 g · L-1 Mn2+、1.0

g · L-1 Cu2+和1.0 g · L-1 Zn2+

Zn2+可促进菌株的生长，而Cd2+、Hg2+、Ag+对菌株的生长有强烈的抑制作用. 同样，龚

一定浓度的Cd2+、Pb2+、Mn2+、Ni2+

可用于重金属污染水体的苯酚污染生物修. 药

的氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、霉素，

利发霉素敏感. 菌株在NaCl 浓度为1%~12%选择培养基中生长，表明菌株YH8可适应较

的环境.

3.2.3

菌株YH8的16S rDNA经PCR 扩增到一条1.5Kb 的DNA 片段，测序得到1448bp

其GenBank 登录

号为KM658327.16S rDNA序列BLAST 结表

Acinetobacter lwoffi的16S rDNA列有极高的同源性(99%).构建的16S rDNA序

树(图 3)表明菌株YH8

图3 菌株YH8的16S rDNA基因系统发育树

经PCR 扩增获得一段约1.3 kb的DNA 片，测得到1182bp 的序列，其GenBank

KM658329.gyrB 序列BLAST 果明，菌株YH8Acinetobacter baylyi的gyrB 序

的同源性(98%)，而与其它菌株gyrB 基似均在98%以下，系统发育分析(图 4)表

YH8与Acinetobacter baylyi同处一

guillouiae 的gyrB 序数据，

Acinetobacter guillouiae.综合16S rDNA和gyrB 基因序列分析以及菌株形态和生理

菌株YH8鉴定为Acinetobacter guillouiae.

图4 菌株YH8的gyr B 基因系统发育树

3.3 苯酚代谢途

3.3.1

按试剂盒说明从菌株YH8中提取到基因组DNA. 分

C12OR) 、C23O(C23OF/ C23OR)引物菌

C12O 有明显的扩增产物(图 5)，而C23O

因大小为691 bp的片段，C12O 基

基因序列与登录号为D85083.1的LmPH 同性最高，达到97%;该菌株的C12O 序列

为Z36909.1的C12O 序列同源性最

苯酚代谢途径的限速步骤由第一步的酚羟

苯酚羟化酶，而多组分苯酚羟化酶是自然环境的势类型(El-Sayed et al., 2014).(谭

2010) 通过染色体步移技术克隆得到 总长6 kb的苯酚羟化酶基因，其中ORF4(开放

编码苯酚羟化酶大亚基，与编码产碱杆菌(Alcaligenes sp.)苯酚羟化酶大亚基基因的

到93%，为构建高效基因

图5 苯酚羟化酶基因片段邻苯

3.3.2

通过测定菌株YH8粗酶液中LmPH 、C12O 和C23O 的活性，初步判断该菌株YH8降解

谢途径. 菌株YH8粗酶活性检测(表 1)表明，YH8在LmPH 的催化作用将苯酚转化为邻

邻苯二酚在C12O 的作用下通过邻开环裂

后的苯酚气体检测到的结果一致，推测苯的转式

的活性远高于未破碎菌体上清液中酶活，由

清液均未检测到酶活，而选择培养基中酶远大

为诱导酶. 在研究四溴双酚A(TBBPA)的微解特性时，降解TBBPA 的菌株H 粗酶液

测到一条明显区别于纯培养菌株的蛋白带，

性降解酶.

表1 不同基质中

3.3.3

质粒检测和消除结果

采用全式金transgen Plasmid MiniPrep Kit试剂盒抽提菌株细胞中的质粒，1%琼

电泳检测出现3条目的条带，说明菌株YH8具有5 kb左右的质粒. 经变温-SDS 法消除

通过点解法得到只能在LB 平板上生长而能在仅为1000 mg · L-1 苯酚的MS

板上生长的菌株(图 6)，质粒消除率

现质粒. 挑取质粒消除突变菌株培养并经PCR 增测，无LmPH 和C12O 基因扩增条带

7). 这说明经质粒消除后的菌株能利用

因位于质粒上. 结果与不动

图6 LB(a)

图7 质粒消除前后LmPH 和C 12O

3.4 菌株YH8

3.4.2 菌株YH8

将菌株YH8接种于含1000 mg · L-1 苯

养，定时取样测定菌体生长量及选择培基中

步于对苯酚的降解，且菌株的生长和降曲线的

成苯酚相关降解酶的诱导期. 菌株在12~96 h进入对数期，大约在 96 h最大菌体生长量达到

0.71，此时苯酚降

图8 菌株YH8利用

3.4.3 环境因素对菌

为了研究不同环境条件下菌株YH8对苯

pH 、外加碳源、外加氮源5个影响素作为

在苯酚浓度为1000~1200 mg · L-1时具高

苯酚降解率随苯酚浓度增加而迅速减小. 菌株YH8生长和降解苯酚的适宜温度范围为24~32 ℃，

在30 ℃时菌株生长量和降解率达到最

临界温度为36 ℃，超过该温度，菌YH8

而菌株YH8在pH 为9.0对苯酚的解率达

氮源可有效提高菌体的生长速度和降解，而

源的存在下才能降解氯代苯，而且不碳源

源时的降解效果最好，这可能与球形球菌

3.5 菌株YH8降解苯酚条件的优化

3.5.1 PB实验设计及结果

采用N=12 Placket-Burman 实研究菌株YH8对苯酚的降解率产生影响的7个

组实验重复3次.11个考察因素及编码水

实验设计软件Design Expert 7.1数分析，其结果如表 3所示. 通过比较各因素

水平，筛选出对苯酚降

表2 Placket-Burman设计各因素与水平

从表 3可以看出，实验组5的苯酚解率最，

35.78%.将实验数据采

Y= 71.02-9.87X2-0.91X3+6.33X5+9.56X6+10.23X8+1.44X9-1.69X10

式中，X2为苯酚浓度(mg · L-1);X3为(%);X5为NaNO3浓度(%);X6为山

(%);X8为初始pH;X9为温度(℃);X10养时间(h);X1、X4、X7、X11为空

表3 Placket-Burman实验设计与结果

应用Design Expert软件分析到模p 为0.0396，表明所得回归方程较显著，

在被研究的整个回归区域拟合性较好.

R2=0.7921，表明79.21%的实数据的

低，实验的可信度和精确度越高，Cv

度(Adeq Precision)是有效信和噪声

据回归分析结果(见表 4)，从表 4可知苯

著影响，其中初始pH 的p 值最小(p=0.0178)，对菌株YH8降解苯酚效率影响最显著，

酚浓度(p=0.0200)，再次为山梨醇

培养时间p 值均大于0.05，对苯酚解率明

为影响苯酚降

表4 Placket-Burman实验分析结果

3.5.2 最陡

响应面拟合方程只有考察临近区域才能

区域后再建立

根据Placket-Burman 实筛选

其他因素根据估计系数的正负效应分别PB

对苯酚降解率有显著正效应，应依次增.

种量5%、NaNO3浓度2%、温度30 ℃、培

梨醇浓度的增加及苯酚浓度的减小，苯降解率

浓度为1100 mg · L-1，山梨浓度5%，苯酚降解率达到最大. 因此，序号5的实

响应值区域，故以此为

表5 最陡爬坡实

3.5.3 响应面

响应面分析法是一种寻找多子

Box-Behnken 和Box-

Wilson 中心组合设计是两种较常的响应

因子范围后，以初始pH 、苯酚浓和山梨

计了3因素3水平的响应面分析试验. 第13~15次实验为3次重复的中心点实验，用于考察模型

的误差. 实验设

运用Design Expert 软对15

Y= 98.51-8.04A+6.15B+1.96C+2.89AB+1.82AC+5.80BC-7.45A2-10.07B2-10.80C2

式中，Y 为苯酚降解率;A 、B 、C 分别

R2=0.9972，说明方的拟合

表6 Box-Behnken 实验设计及结果

预测模型的p 值远小于0.0001，明该

的看出各因素之间的交互作用，各实各因

应值的影响

图9 菌株YH9各因

根据表 7方差分析数据可知，表明对酚降解

﹥山梨醇浓度(X8).其中，X2、X6、X8、X2X6、X6X8、X22、X26、X28对Y 的影响差异

X2X8对Y 的影响高度显著. 失拟项值为0.4185，远大于0.05，说明失拟不显著，该模

可以作为不同因素水平

根据模型构建的方程进行偏导微分处理，导得

C=7.81，即:初始pH 9.26、苯

苯酚降解率的最大预

表7 Box-Behnken 实验回归分析结果

3.5.4 验证试验

为了验证模型预测的准确性和有效，按

检测苯酚的降解率达到98.95%，验值

真实的预测各因素对菌株YH8降解苯的影

优化后的最佳降解条件可使菌株YH8苯酚的

研究了酵母浸出物、苯酚浓度、接种量3个因对菌株Candida tropicalis Z-04降解

酚效果的影响，拟合多元二次回归方，并

说明响应面法能有效预测并

4 结论

1) 本研究从株洲某化工厂污水处车间

生理生化、BIOLOG 微生物全自动鉴定

guillouiae ，命名为YH8. 该菌能利用为

养96 h可使初始浓度为1200 mg · L-1的苯酚降解率达到92.65%.

2) 在以苯酚为碳源和能源的培养中，

和邻苯二酚1，2-双加氧酶，证明菌株YH8

关降解酶研究表明，菌株YH8的相降解酶

双加氧酶的活性. 利用特异引物进行PCR 扩

测序比对结果显示该片段为邻

3) 通过质粒检测和消除发现菌株YH8具

与质粒有关. 此外菌株YH8可耐

4) 采用Placket-Burman 验设选

浓度和山梨醇浓度. 应用响应面法分析化设

1163.63 mg · L-1、山梨醇浓7.81%、种量5%、NaNO3浓度2%、温度30 ℃、培养

h ，在此条件下苯酚降解率可

苯酚

苯酚教学设计

一、 教材分析

1、 教材地位

本节是人版选修5第三章一节的内容，本节内容安排在苯和乙醇之后一种的生，在此位置其独有的作用。因苯酚的结构中含有羟基，通过苯酚质的学习可进一步加强生对羟官能团性质掌握。但是苯酚又由于羟与苯相连又与乙醇有一定的不同之处。从而使学生理解官能团所处的环境也会对其有一定的影响，从而使学够更加全面看待问题，为今后学

2、 教学目标 （一） 知

1、知道酚的物理性质并能说出苯

2、能够画出苯酚的结构，可将苯酚与常见酸比较酸性强弱 3、知道苯酚化学性质，并能写出主要的化学方程

（二） 过程与方法

1、阅读说明书猜想苯酚的物理性质，自学总结，使学

观察能力得到提升

2、在苯酚与乙醇的对比中加深学生对原团相作用的认识，以及环境对能团的影响用，从而培学生辩证的观点看待问题 3、在对比中学习苯酚的化学性质，从而使学生头脑中呈现晰地知体系，加

（三） 情感态度

1、 通过工业酚物质排放引发的环境问，促使学生养成

环境，树立良好的环

2、 体验结决定性质的化学学科思想，并将其运

二、 学情分析

学生在本节课之前的学习，已经掌握了研究有机化学的一般法以及与性质的关系。学生在学习学习乙醇时经对羟基有了较深的认识，通过苯的习，与相关的构与性质也已掌握。因以的学习方法以及知识基础对于本节课的学习很重要。但是对于苯酚的弱酸性和苯酚的三代反应的

三、 教学重难点

教学重点：1、苯酚的结构 2、苯酚

教学难点：苯酚的化

四、 教学流程

五、教学过程

五、 板书设计

烃的含氧衍生物---酚

苯酚

? 苯酚的结构：

? 苯酚的性质：

1．物理性质纯净苯酚是无色的晶体，露置在气里会被氧化而呈粉红色。苯酚具有特的气味，熔点43℃。室时，在水中的溶解度不大，当温高65℃时，则能与水以任意比互溶。苯酚易溶于乙醇、乙醚等有机，有毒，它的浓溶液对

2．苯酚的化学性质

苯酚的分子结构中既有苯环，又有基，它们相互影响。苯酚有酸性，能与溴水、硝酸等发生取代反应，也能与氢气发生加成反应，苯酚还能与FeCl3溶液生显色

(1)苯酚的弱酸性

实验步骤：取苯酚浊加氧化钠溶液，会变澄清。将得到的澄清液人两支试管中，分别加入盐酸通

实验现象：澄液加入盐酸和通入二氧化碳气体后

实验结论：苯环对基的影响结果是使羟基的性增强，在水溶液中

反应方程式：

注意：苯酚具有酸性，但是苯酚的性弱，它不能使酸碱指示显色，它与碳酸的电程度的大小为：因此，苯酚在与碳酸钠溶液反应时，只能生成碳酸氢钠和酚钠，而不能

由于苯酚的酸很弱，因此苯酚钠在溶液中水解而使

相同浓度时，

(2)苯环上的取

①卤代反应 溶液的碱性比溶液的

实验步骤：少量稀苯酚中加入饱和溴水，观察

实验现象：有白色沉淀

实验结论：由于羟基苯环的影响，使苯环上与羟基处在位和对位上的氢原子活性

反应方程式：

苯酚与溴的反很灵敏，可用于苯酚的定性检验

注意：2，4，6三溴苯酚不溶于水，但易溶于，若苯中溶有少量苯酚，

生白色沉淀，因而用溴验不出溶于苯中的苯酚，也不能用溴水来

②硝化反应

苯需用混酸进行化，而苯酚很容易硝化，浓硝酸反应即可生

反应生成的2，4，6一三硝基苯酚，俗称苦味酸，可

(3)苯酚的显色反苯酚跟FeCl3溶液作用显示色，利用这一反应可以

(4)氧化反应苯酚

(5)加成反应

苯酚可在苯环上发生加成反

(6)苯酚与甲醛的缩

苯酚和甲醛在酸碱的催化作用下发生反生成酚醛树脂，

4．苯酚的主要用途

苯酚是一种重要的化工原料，广泛用于制酚树脂、染料、医药、农药等。炼焦工业的水中常含酚类物质，这些物质是被制的水污染物之一，在排放前必须经过处理。 苯酚有毒，其稀溶可直接用

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