一、实验目的
通过同浓度的样品对酪氨酶活性的抑制作用来探究样品是否
二、实验原理
黑色素的形是氨酸在体内将L-酪氨酸羟化,产生临位二羟基苯酸(L-多巴),再将L-多巴氧化成多巴醌,进而产生一系列引起褐化的色素类物,终导致
三、实验材料
1、试:磷酸二氢钠(NaH 2PO 4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、左旋多巴、酪氨酸
2、样品:豆腐柴挥发油、柳叶蜡梅花
3、器:酶标仪、标板、烧杯、试管、细口瓶、移
四、实验步骤
1. 配制目标浓度的样品
2. 配置1/15mol/L的磷酸
(1)配置磷酸二氢钠(NaH 2PO 4)溶液
C=1/15mol/L,M=141.96,称取的药品质量和配置的溶液体积
(2)配置磷酸氢二钠(Na2HPO4)溶液
C=1/15mol/L,M=119.98,称取的药品质量和配置的溶液体积
3. 配置左旋多巴溶液
C=5mmol/L=0.005mol/L
溶质:左旋多巴 M=197.15,称取的药品质量和配置视
溶剂:1/15mol/L磷酸缓冲溶液,使用量视具体
4. 配置酪氨酸酶溶液
(1)氨酸酶中间液(1010unit/L)
溶质:酪氨酸酶505unit/mg,m=1.6mg
溶剂:1/15mol/L磷酸缓冲溶液,V=0.8mL
(2)氨酸酶使用液(100unit/L V= 1mL,2份)
稀释
1/15mol/L磷酸缓冲溶液,V=(1010-99)/1010mL,2份 注:配置好的酪氨酸酶溶液需
5. 样品对酪氨酸酶作用的测定
按
(1)50μL 缓冲溶液
(2)80μL 左旋多巴(底物)
(3)液(使用量视设置的样品浓
30μL ,40μL ,50μL ,因此对应的
(4)样(使用视设置的样品浓度梯度而定,
(5)20μL 酪氨酸酶溶液
(6)常温下反应10min 后,用酶标仪在475nm 条
模拟图如下:
① 酸酶浓度为100unit/L,左旋多巴浓度为5mmol/L(
0 10 20 30 40 50
A :50
μL 缓冲液
+80μL
多巴+50μ
L 缓冲液+20μ
L 酪氨酸酶溶液
B :50
μL 缓冲液+80
μL 多巴+40
μL 缓冲液+10
μL 样品
+20μL 酪氨酸酶液溶
μL 样品
+20μL 酪氨酸酶溶液
C :50
μL 缓冲液+80
μL 多巴
+30μL 缓冲液
+20
D :50
μL 缓冲液+80
μL 多巴+20
μL 缓冲液+30
μL 样品+20
μL 酪氨酸酶溶液
E :50μ
L 缓冲液+80μ
L 多巴+10μ
L 冲液+40μL 样品+20μL 酪
F :50μL 缓冲液+80μL 多巴+50μL 样品+20μL 酪氨酸酶溶液
② 氨酸酶浓度为100unit/L,不同浓度的左旋多巴(柳
0 10 20 30 40 50
2.5mmol/L多巴
5mmol/L多巴
10mmol/L多巴
A,a,1:50μL 缓冲液+80μL 多巴+50μL 缓冲液+20μL 酪氨酸酶溶液
B,b,2:50μL 缓冲+80μL 多巴+40μL 缓冲液+10μL 样品+20μL 酪氨酸酶液溶 C,c,3:50μL 缓液+80μL 多巴+30μL 缓液+20μL 品+20μL 酪氨酸酶溶液 D,d,4:50μL 缓冲液+80μL 多巴+20μL 缓冲液+30μL 样品+20μL 酪氨酸溶液 E,e,5:50μL 缓冲液+80μL 多巴+10μL 缓冲液+40μL +20μL 氨酸酶溶液 F,f,6:50μL 缓冲液+80μL 多巴+50μL 样品+20μL 酪氨
③ 旋多巴的浓度为5mmol/L,不同浓度的酪氨酸酶溶液(柳
50unit/L酪氨酸酶
100unit/L酪氨酸酶
200unit/L酪氨酸酶
A,a,1:50μL 缓冲液+80μL 多巴+50μL 缓冲液+20μL 酪氨酸酶溶液
B,b,2:50μL 缓冲+80μL 多巴+40μL 缓冲液+10μL 样品+20μL 酪氨酸酶液溶 C,c,3:50μL 缓液+80μL 多巴+30μL 缓液+20μL 品+20μL 酪氨酸酶溶液 D,d,4:50μL 缓冲液+80μL 多巴+20μL 缓冲液+30μL 样品+20μL 酪氨酸溶液 E,e,5:50μL 缓冲液+80μL 多巴+10μL 缓冲液+40μL +20μL 氨酸酶溶液 F,f,6:50μL 缓冲液+80μL 多巴+50μL 样品+20μL 酪氨
五、数据处理
(1)求出添加样品0μL 的OD 值的平均值AVE ;
(2)求出每组去除的黑色素量(百分):(1-ODS /AVE)*100,每对两反复
(3)求OD S 的方差。
酶反应动力学
? 第九章 酶应用的基本理论
? —— 酶的催化特性与反应动力学
? 第一节 酶的催化特性
一、酶催化作用的特点
? 专一性强、效率高、反应条件温和
二、影响酶催化活性的因素
? 度、pH 、辅助因子、激活剂
? 酶专一性的确定
?
? 最适反应条件下,测定物浓度对反应速度的影响,确定Km
? 用与该底物的结构类似一系列化合物逐个试验,确定该酶属于
相对专一性;
? 专一性的酶,进一步选
最适合的作用底物;
? 用不同光学异构体的物进行试验,确定酶是否具有立体
? 第二节 酶反应动力学
? 研究酶催化反应速度及其影响因素
? 酶反应速度:
指酶催反应的速率,一般用产物加(或底物减少) 的速率表示。单位:
? 酶反应速度的因素:底
剂等。
? 酶反应速度
酶反速度即曲线斜率,酶反应速度下
? 底物浓度降低
? 产物浓度升高
? 产物抑制
? 部分酶失活
因此究酶反应速度应以酶反的初速度为准,即底物转化量<>
? 一、动力学数据的获得与分析
? 通过改酶反应外条件,收集不同条件下酶促反应速度的动力据。 ? 酶促反应速率的测定方法很多,但在动力学研究中必须选择最方便的方法。 ? 确保
? 动力学数据分析
? 结论
? 二、单底物的酶促反应动力学
? 1902年,Henri ,
速度影响, 它们之间的关系呈现矩
? 2、中间复合物假说
? 1902年,henri (亨利)提出了“酶-底物中间
? 酶反应是由酶(E )与底
间产物的已为
? 3、快速平衡学说
? 1913年,Michaelis and Menten根据中间复合物学说,建立了
出米氏方程。
? [S]>>[E],[ES]分解为产物的逆反
? 4、稳态学说
? 1925年,Briggs and Haldane提出了稳态学说,对米氏方程做出了重要的修正。 ? 5、Km 和Vmax 的求取
? Lineweaver-Burk 双
? Eadie-Hofstee 作图法
? Hanes-Woolf 作图法
? Eisenthal & Cornish-Bowden
直接线性作图法
? Lineweaver-Burk 双
? Eadie-Hofstee 作图法
? Hanes-Woolf 作图法
? 直接线性作图法
? 7、单底物反应的抑制作用
? 凡能酶活性下而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的剂(inhibitor)。 ? 使酶变性失活(称为酶的钝化) 因素如强
? 制作用分为可逆性抑制和不可逆性
? a. 非专一性不可逆抑制
? 制剂与酶分子中一类或类基团作用,不论是必需基团与否,皆
于其必需基团也被抑制剂结合,从而导致酶的
? 某金属(Pb++、Cu ++、Hg ++) 及对氯汞苯甲酸等,能与酶分
适合,许多以巯基作为必需团的酶(通称巯基酶) ,会因此
? 二巯基丙醇或二基丁二酸钠等含巯基的化合物
? b. 专一性不可逆抑制
? 类抑制剂专一地作用于的活性中心或其必需基团,进行共价结
的活性。
? 机磷杀虫剂能专一作用胆碱酯酶活性中心的丝氨酸残基,使其
抑制酶的活性。
? (2) 可逆性抑制
? 抑制剂与酶以非共价键
复,即抑制剂与酶的结合是可逆的。
? 为:竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞
? a. 竞争性抑制
? 制剂I 和底物S 结构似,抑制剂I 和底物S 对游离酶E 的
互相排,已结合底物的ES 复合体,
? 竞争性抑制剂
? 很多药物都是酶的竞争性抑制剂。
? 如磺胺药与对氨基苯甲具有类似的结构,而对氨基苯甲酸、二
是某些菌合成二氢叶酸的原料,者能转变为四氢叶酸,它是细菌合成核酸
? 于磺胺药是二氢叶酸合酶的竞争性抑制剂,进而减少细菌体
成,使核酸合成障碍,导致细菌死亡。
? 增效剂-甲氧苄氨嘧啶(TMP)能特异地抑制细菌的二氢叶酸还原
能
? 磺胺药物的抑菌作用
? b. 非竞争性抑制
? 剂I 和底物S 与酶E 的结合完全互不相关,既不排斥,也不促
I 可以和酶E 结生成EI ,也以和ES 复合物结合生成ESI 。底物S 和酶E 合ES 后,仍可与I 结合生成ESI ,但一旦形成ESI 复合物,再不能释放形产物P 。 ? 特点:I 和S 在结上一
学基合,这种结合并不影响
? c. 反竞争性抑制
? 竞争性抑制剂必须在酶合了底物之后才能与酶与底物的中间产
剂
? 反竞争性抑制
? 三种可逆抑制的区别
? 8、pH 对酶反应的影响
? 响酶分子侧链基团的离子化状态,从而改变酶
? pH 改变时,酶催反应的Km 和Vmax 都
?
? 酶分子中存在双解离基团:
? 9、温度对催化反应的影响
? 温度过低,酶促反应速度下降
? 温度过高,酶变性失活
? 一定温度范围内,随着度的升高,活化分子数增加,酶促反应
阿累尼乌斯方程。
? k=A·e
酶促反应的动力学
酶促反应的动力学
酶促反应动力研究酶反速度及其影响因素的科学。这些因素主要包括底度、酶浓度、温度、PH、激活剂和抑制剂等。在研究某一因素对酶促反应速度的影响时,应该持应中其
一、酶与底物浓度
在酶浓度不变的情况下,物浓度对反应速度影响的作用呈现
4-2-1)。
图4-2-1 底物浓度对酶促反应速
在底物浓度很时,反应速度底浓度的增加而急骤加快,两者呈正比关系;当底物浓度高,反应速度虽然随着底物浓度升高而加快,但不再呈正比例加快;当底物浓度增高到一定程度时,如果继续大底浓度,反
酶促反应速度与物度之间的化关,反映了[ES]的形成与生成产物[P]的过程。在[S]时,酶的活性中心没有全部与底物合,增加[S],[ES]的形成与[P]的成均呈正比关系增加;当[S]增高至定浓时,酶全部
[ES],反应速度趋于恒定。
(一)米氏方程
为了解释浓度与促反应速度的关系,1913年Michaelis和Menten把图4-2-1归纳为酶促反应动力学基本的数
V=Vmax[S]/(Km+[S])
Vmax反应的最大速度,[S]为物浓度,Km是米氏常数,V是在某一底物浓度
(
1. 当反应速度为最大速度一半时,米氏方程可以
1/2Vmax=Vmax[S]/(Km+[S])
所
因此,Km值等于酶促反应最大速度一半时的
2.Km值可判断酶与底物的亲
3.Km是的特征常数,只与酶的结构、酶所催化的底物酶促反应条件有关,与酶的浓度无关。酶的种类不同,Km值不同,同一酶与不同
二、酶浓度、温度、PH的影响
(
在一定度和pH条件下,当底物浓度足
图4-2-2 酶浓度对酶促反应速
(
化学反应的速度温增高而加,但是蛋白质,可随温度的升高而变性。在温度较低时,前一影较,应速度随温度升高而加快。但温超过一定范围后,酶受热变性的因素占优势,应速度反而随温度上升而减慢。常将酶促反速度大的某一
图4-2-3 温度对酶促反应速度
人体内
温度对酶促反应速度的影在临践中具有指导意。低温件下,酶的活性下降,但低温一般不破坏酶,温度回升后,酶恢复活性。所以在护理技术操作对酶剂和检测标(如血清等)应放在冰箱中低温保存,需要时从取出,在室温条件下等温度回升后再使用或检测。临床上低温麻醉就是利酶的这一性质以减慢组织细胞代谢速度,提高机体对氧和营养物质的耐受力,利于进行手术治。温度超过80℃后,多数酶变性失活,床应用这一原理进行高
酶的最适温反应所间有关,酶可以在短时间内耐受较高的温度,相反,延长反应时间,最适温度便降低。据此,在生化检验中,可以采取适当提高度,缩短
(
酶反应介质的pH影分子,特是活中心上必需基团的解离程度和催化基团中质子供体或质子受体所需的子状,也可影响底物和辅酶的解离程度,从而响酶与底物的结合。只有在特定的pH条件下,酶、物和辅酶的解离情况,最适宜于它们互相结合,发生作用,使
图4-2-4 pH变化与酶促反应速
体内多数酶适pH接近中性,但也有例外,如胃蛋白酶的最pH约1.8,肝精氨酸酶最适pH约为9.8。溶液的pH值高于和低于适pH时
pH值时甚至致的变性活(图4-2-4)。所以测定酶的活性时,应选用适冲液,以保持酶活性的相对恒定。临床上根据胃蛋白酶的最适PH偏酸这一特点,配制助消化的胃蛋酶合时加入
三、激活剂与抑制剂
(
凡能高酶的活性或使酶原转成酶的物质均称做酶的激活剂。从化学
2+-括无机离子和小分子有机
剂;胆汁酸盐是胰脂肪酶的激活剂。
大多金属离子激活剂对酶促应不可缺少,称必需激活剂,如Mg;
-在
(
凡能使活性降低或丧失而不引起酶蛋白性的物质称酶的抑制剂。通常将抑制作用分为不可逆性抑
1.
这类抑制剂酶子中必基团以共价键的方式结合,从而使酶失活,其制作用不能用透析、超滤等方法解除,这种抑制称为不可逆抑制作用。在临床上这种抑作可以靠
例如,有机磷农能特性地与胆酯活性中心丝氨酸的羟基结合,使酶失活。当胆碱酯酶被有机磷药制,胆碱能神经末稍分泌的乙酰胆碱能及时分解,过多的乙酰胆碱会导致胆碱能神经度兴奋的症状,表现为一系列中毒的症状。床上碘解磷定(
图4-2-5 有机磷农药对羟基酶的抑制和解磷
2.
抑制剂与非共键结合,在用透析等物理方法除抑制剂后,酶的活性能恢复,即抑制剂与酶的结合是可逆的。这类抑制
(1)竞争性抑制(competitive inhibition):竞争性抑制剂(I)与底物(S)结构相似,因此者互相竞争与酶的活性中心结合,I与酶合,就不结合S,从而引起酶催化作用的抑制,称竞争性抑。竞争性抑制作用有以下特点:①抑制剂结构与底物相似;②抑制剂结合的位是酶的活性中心;③抑制作用的大小取决于抑制剂与底物的相对浓,在抑制度不变时,通过增底物浓度可以减弱甚至解除竞争性抑制作
例如,丙二酸是琥珀酸氢竞争性抑制剂。很多物是酶的竞争性抑制剂。例如磺胺药是通过竞争性抑作用抑制细菌生长的,某些菌在氢酸合酶的作用下,利用对氨基苯甲酸(PABA)、二氢喋呤及谷氨酸合成二氢叶酸,后者能转变为四氢叶酸,氢叶酸是细菌合成核酸不可缺少的辅酶。由于磺胺药与PABA结构,是二氢叶酸
图4-2-6 PAPA与磺胺药
抗癌药甲蝶呤(MTX)的结构与二氢叶酸似,是二氢叶酸还原酶的竞争性抑制剂,抑制四氢叶酸的合成,
(2)非竞争性抑制(non-competitive inhibition):非竞争性抑制(I)和底物(S)的结构相,I与活性中心外的部位结合,使酶催化作用抑叫做非竞争性抑制。这种抑制作用的特点是:①抑制剂与底结构不相似;②抑制剂结合的部位是酶活性中心外;③制作用弱取决于抑
++因抑制Na-K-ATP酶活性是非竞争性抑制;⑤Vmax下
图4-2-7 竞争性抑制与非竞争性抑制
酶促反应动力学
第九章
酶促反应动力学
第
一、化学动力学基础
1、反应分子反应级 1)反应分子数 指在反应中真正相互作用的分子。 A A+B 2)反应级数 指实验测得的反应速率与反应物浓度之间的关系,符合 哪种速率程,则这个反
蔗糖酶
P P+Q
葡萄糖 + 果糖
1
2、各级反应的特征 1)一级应的征 反应速率与反应物浓度次方成正比。反应物的半衰期与初始 浓度无关。初始浓度越大,反应速度越快,成一次方增加;要使 反应物减少一半所需完成的反应量同步加,因此后表半 衰与初始浓度无关。 2)二级反应的特征 反应速率与反应浓度二方(或两种反应物浓度的乘积)成 正比。反应物的半衰期与初始浓度成反比。初始浓越大,反应 度越快,成二次方增加;反应减少一半所需的时间就越短。 3)零级反应的特征 反应与反应物浓度。初始浓度增加,反应度不变, 要使反应物减少一半所需完成的反应量增加,因最后表现为半 衰期与始浓
二、底物浓度对酶促反应的影响
1、酶促应速度与物浓度之间的关系 1903年Henri以蔗糖酶水解蔗糖为例,研究底物浓度与酶促反 应速度之间关时,发现
v
Vmax 零级反应 混
2
2、中间合学说 根实验结果和催化剂的特性, Henri和Wurtz提出中间产物学 说,认为酶在催化反应的过程中,实际是参加了反应,并与底 成了中
S+E
k1 k2
ES
k3 k4
E+P
反应始时,产物浓度为零,反应方程式
S+E
k1 k2
ES
k3
E+P
在酶浓度恒时,如果物度很低,全部底物可迅速与酶 结合形成中复合物[ES],此时反应速度取决于底物浓度。当底 物再增加,酶开始成为反应限因子,
3、
[Et][S]
[S] + (k2+k3)/k1
S+E S+E
k1 k2 k1 k2
ES ES
k3 k4 k3
E+P E+P
Km= (k2+k3)/k1
酶反应速度 v = k3[ES] ES的生成速度 = k1([Et]-[ES])[S] ES的分解速度 = k2[ES] + k3[ES] 在保持ES浓度恒定稳
v=
k3[Et][S] Km + [S]
k3[Et] = Vmax
k1([Et]-[ES])[S] = k2[ES] + k3[ES]
v=
Vmax [S] Km + [S]
3
米氏方程的解释
v=
Vmax[S] Km + [S]
Km 称为米常,Vmax最大反应速。该方程完全符合 反映底物浓度与反应速间关系的实测双曲线。 当底浓度远小于Km时,反应速度与底物浓度成正比。 当底物浓度远大于 Km 时,酶被底
当反应速度等大反应度一半(即 v = 1/2 Vmax) 时,Km = [S] 。这说明米氏常数是反应速度达到最大反应速 度的一半时所需要的底物浓度。此,米氏常
2) 米氏常数的意 ① Km 是的一个重要特征常。只与酶性质有 关,与酶浓度无关。但其数值与测定条件有关,不同条件 下测的Km值不同。 ② Km值可以判断的专一和天底物。 ③ Km 值可近似地表示酶与底物之间的亲和力。 Km 表示亲和力弱,底物难与酶结合; Km值小表示亲和力强。 因此可判断酶的最底物。 ④ Km 值可助判断反应的方向。对于催化可逆反应的 酶,可以测定酶对(或产物)的Km值细胞中底 物(或产物)的浓度,来判断细胞中酶催化的反应是正 反应还是
4
3)kcat和kcat/Km意义 当 [S] >> Km 时,酶全部被饱和,[ES] = [Et],反应速度达到最 大,Vmax = k3 [Et],表示反应速度与酶浓度成正比,为一级反应。 k3 为一级反应的速度常数,即为
S+E
k1 k2
ES
k3
E+P
Km= (k2+k3)/k1
Km是[ES]的分解数与生成常的比。 Km的真正含义是, Km越大意着[ES]越不稳定,越容易分解。但不能说明[ES]是容 易分解成底物还是产。 kcat/Km可表示为 [k3/(k2 + k3)]k1, k3/(k2 + k3)代表[ES] 分解成产 物的分解常占[ES] 总分解常数的比值。 k3/(k2 + k3)越大,说明 [ES]越容易分成产物。 k1[ES] 生成常数。此, kcat/Km数 值大不仅表示[ES]容易生成,还表[ES]易分解物。真正代 表酶对某一定底物的催化效率。所以,也称为专一性常数。 极限值k1 ,意为[ES]不再分
4)氏常数Km的求算 Lineweaver-Burk作图法,也
v
v
v v
V v0
5
4. 高底物浓度对酶促反应的抑制作用
当底物浓度过高时,有促反应会现反速度 下降的现象,这种现象就是高浓度对酶反应的抑制。 如过的物酰乙酯会抑制羊肝羧基酯酶;过量 的ATP可抑制磷酸果糖激酶。 原因可能是一个酶分子时和几个底物分子结合, 导致结合多个底物中间不能转变为
5、多的酶促反应动力学 在酶催化的
AE AEB EB B A AE AEB P+Q P+Q
反
P A AE P
B B Q
不形成三 元复合物
6
2)双底物反应的动力学方程
B
形成三元物的
A
不形成
B
v=
KmA,KmB分别为底物A和B的米 氏常数; KsA为底物A与酶结
A
第
一、基本概念和抑制类型
1、抑制作用与抑剂 由某学物质的作用,酶变性,活性出现降低或 丧失的现象,称为酶的抑制作用。凡是可以弱、抑制甚至 破坏酶活性的物质称为的抑剂。 的抑制分为不可逆抑制和可逆抑制。 2、不可抑 抑制不能被解除,酶活性不能被恢复的抑制。能够导致不 可逆抑制的质就叫不可逆抑制剂。一般情况是抑制剂与酶 分子中的必需基团以键结合,酶活性降低或丧。 不可逆抑制剂又可分为专一性不可逆抑剂和非专一性不 可逆
7
专一性不可逆抑制仅与酶分活性的某些特定基团反应。 非专一不可逆抑制剂也能与酶分子活性部位以外的基团反应。 专一性不可逆抑制剂分为 ks 型不可逆抑制剂和 kcat 型不逆 剂(自性底物)。 ks型不可逆抑制剂是根据底物的结构而设计,有和底物相 似的结构,可以和相应的酶结合,并与酶的必需基团起反应而 抑制酶的活。 kcat型不可逆制剂,只有在被酶催化反应之后,才能形成不 可逆抑制剂。 kcat型逆抑制剂不仅要能够酶专一性结合, 还要能被酶催化化学反应之后才能生抑制作用,所以,其专
3、重要的不可逆抑剂 ① 有 农 药 : 如异 丙基 磷酰 氟 ( DFP )和敌百虫等均属此类。有 机磷农药能与 Ser - OH 牢固结合, 强烈地抑乙酰胆酯酶,使乙酰 胆碱累积引起神经中毒。 ② 有机汞、有机砷化合物:与作 用,抑制含-SH基的酶。如对氯汞 苯甲酸。 ③ 重金属离子:巯基、羧基生作 用。高浓度变性,浓度产生抑制。 ④ 氰化物 : 与含铁卟啉的酶铁结 合。和细胞色素氧化酶中铁结 合,而抑制呼吸链。 ⑤ 烷化剂:如碘乙可使酶中的巯基 烷化而使
8
4、可逆抑制 通过加其它或用物理方 法(透析、滤等)解除的抑 制,就称为可逆抑制。可逆抑制 通常又可分为三。 (1)竞争性抑制:抑制剂与物 竞性地酶的活部位结合。 如底物类似物。 (2)非竞争性抑制:抑剂和底 物可单独或同时与酶结合,而且 互不干扰。如重金属离子与酶分 中的-SH络合。 (3)反竞争性抑制:抑制剂只能 在底物与酶结合,才能与 结合。如L-Phe和L-同型Arg对 碱性磷酸酶的抑制作用;肼类化 合物对胃蛋白酶
二、可逆抑制动力学
1、竞争性抑制 Vmax
Vmax
9
某
对
药物(抑制剂) 磺胺 氨基蝶 抑制的酶 二氢叶酸合成酶 (细菌) 二氢叶酸还原酶 竞底 甲酸 二氢叶酸 尿嘧啶(胸腺嘧) 临床应用及机理 抗菌作用(抑制四 氢酸) 抗白血病 抗癌作用(抑制核 苷酸成) 抗痛风(抑
尿嘧啶磷酸化 5-氟尿嘧啶(5-FU) 酶(胸腺嘧啶核苷 磷酸化酶) 别嘌
黄嘌呤,次黄嘌呤
6-氨基已酸
纤溶酶
-赖氨酸-氨基酰
苯丙胺(麻黄素)
单胺氧化酶
肾
中枢兴奋,抗哮喘
2、非竞争性抑制 Vmax
Vmax
10
3、反竞争性抑制 Vmax Vmax
4、混合性抑制
v
=K
Vmax [S]
m (1+ Ki
[I]
) + [S](1+
[I] ) Ki′
11
混 合 性 抑 制
v
=K
Vmax [S]
m (1+ K i
[I]
) + [S](1+
[I] ) Ki′
第三节
影
一、温度对酶促反应的影响
1、温度对反应速度的响 度对酶促反应影响两方 面:一方面是,随着温度的升 高,活化分子增加,反应速度 加快;另方面,温度升 高,酶分子因热变性,催化活性 降。因此,温度对酶促反应初 速度的影响表现为钟罩形曲线。 到最大反应速度的温度,称 为最适温度。 动 物 酶 的 最
12
2、温度对酶稳性的影响 酶化本质是蛋白质,此,酶 温度具有高度的敏感性,随着温度 的升高,分子的构象会逐渐地破 坏,失去催化活性。 一般情况,温度低,越稳定。 所以,为了更好地保存酶的活性,应 将酶保存在尽低的温度下,如果 是干粉酶制剂可以保存在- 20℃或- 80℃温度下。 酶的稳定温度是受多种因素影响 的,如底物种类、酶浓度、pH、保存 质及作用等。因此,在研究和 测定酶的稳定温度时,一定要指明相 应的测条件,结果才有意义和可
二、pH对酶促反应的影响
1、pH对反应速度影 如果在不同pH测定酶促 反应的初速度,我们可以得到 如图所示的曲线。一般的酶都 会表个适pH,即在该 pH下,酶表现出最反应速度。 酶催化反应的最适pH也是受 多种因素影的。不同酶的最 适pH范围也不一样,有些酶的 适pH围很窄,而
木瓜蛋白酶
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2、pH影促反应原 pH 影响酶促反应的原因要比温度复杂得多, pH 不仅影响酶的解离状态,还影响底物甚至是中间过 渡态复合物的解离状态。归纳起来主有
基团的解离。 ② 影物的解离。 ③ 影响中间过渡态复合物的
3、pH对酶定的影响 pH对酶稳定性 的影响也与温度 对酶稳定性的影 响。因为不 管是过高还是过 低的 pH 都会引起 酶变性,所以, 酶只有在一定的 pH 范围稳。 过高
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1、激活剂的概念 是能使酶现化性或加强其催化效率物质就称 为酶的激活剂。激活剂对酶的激活作用是有选择性的。一 种物质对某种有激活作用,对其它的酶不一定有激活作 用,有甚至制作用。 2、激活剂的类型 (1)无机离子:包括阳离子(如K+、Na+、Ca2+、Mg2+、 Fe3+等)和阴离子(如Cl-、I-、CN-等)。 (2 )中小有机子:某些还原剂(半胱氨酸、巯基乙 醇、谷胱甘肽、抗酸等)和金合物(EDTA)。 ( 3 )蛋白质大分子:如蛋白酶对某些酶原的激和某些 蛋白激酶对酶分
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酶促反应动力学实验
酶动力学综合实验
实
【目的要求】
1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响
2.了氏方程、Km值的物理意义
碱性磷酸酶广分布人各脏器器官中,其中以肝脏为最多。其次为、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶,而是一组同功酶。本实验用的碱性磷酶从大肠
Michaelis-Menten 在研究物浓度与酶促反应速度的定量关系时,导出了酶促反应动
错误!
式
错误!未找到引用源。表示酶反应最大速度, [S]
错
3、 错误!未找到引源。测定主要采用图法,有下四种: ①双曲线作图法(图1-1,a) 根据式(1),以v对[s]作图,时1/2错!未找引用源。时的底物浓度[s]值即为Km值,以克浓度(M)表示。这种方法实际上很少采用,因为在实验条件下的底物浓很难使酶达到饱和。实测错误!未找到引用源。一个近似值,因而1/2错误!找到引用源。不精。此外由于v对[S]的关系呈双曲线,验数据要求较多,且不
② Lineweaver- Burk作图法双倒数作图法(图1-1,b) 实际工作,常将米氏方程(式(1))作学变换,使之成为直线形式,测定要方便、精确得多。其中之一即取(1)式
错误!未找到引用源。 (2)
以错误!未找到用。对错!找到引用源。作图,即为y=ax+b形式。此时斜为!未找到引用源。,纵截距为错!未找到引用源。。把直线外推与横轴相交,其截距相交,其截距即为—错误!找
把(2)式等号两边乘以错误!未找到引用
错误!未找到引用源。 (3)
以v错误!未找到引用源。作图,这时斜率为错误!未找到引
为错!未找到引用源。,横截
把(2)式等号两边乘以[S],得:
错误!未找到引用源。 (4) 以
对[s]作图,这时斜率为误!未找到引用源。,纵截距为错
源。。
(a) (b)
本实验以双倒数法,即Lineweaver- Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km
本实验以碱性磷酶例,用磷苯钠为其作用物,碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷,宜条件下(PH10.0,和60℃),准确反应13分钟。在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物,以波长620nm比。在一定
然后以光密接表同底物浓度时的酶反应速度,即以光密度倒数作纵坐标,以底物浓度的倒数作横坐标,按Lineweaver- Burk作
【
1. 恒温水浴
2. 721型分光光度计
试剂:
1. 酚试剂:称钨酸钠(误!未找到用源。W错!未找到引用源。·2错!未找到引用。O)100g,钼酸钠(错误!未找到引用源。Mo错误!未找到引用源。·2错误!未找到引源。O)25g置1500mL磨口回流装置内,加馏水700mL,85%磷酸50mL浓硫酸100mL。充分混匀,使其溶解。小火加热,回流10h(烧加玻璃珠数颗,以防溶液溢出),再加入硫酸锂(LiSO4)150g,蒸馏水50mL及液溴数。在通风橱中开煮沸15min,以除去多的溴。却后定容至1000mL,过滤即成,此液应为鲜黄色,不带任何绿。棕瓶中,可在长期保存。若此贮存液使用过,颜色由黄变绿,可加几滴液溴,煮沸几分钟,恢复原色仍可继续使。使用时用蒸馏水稀释一倍,最后酸
2. 2.5mM酸钠基质液:取625mg磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2?2H2O),溶于1,000ml容量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度,加数夜溴以防腐,置冰箱内可保存一年之久。 3. 碱缓冲液(pH10.0): 称取无水碳酸钠6.36g
4.
【结果处理】
的Km值。 【注意事项】
1) 加入碱性磷酸酶的量要准确 2) 保温
准确保温的方:第一管入液开始计时,每隔1分钟向下一只试管加酶液,直至,到准确13分钟立即向第管加酚试剂,以终止其反应,并每隔1分钟向下一只试管加酚试剂,直至完,这样保
1) Km 的意义及其影响因子
2) 么酶促反应速度以初速度表 3) 为什么O.D可直接代替V作图 4)
实
【实验目的】
了解度对酶活性及酶促反应
每种酶都有其适度,高或于此温度酶的活性都降低。一般而言,若酶处于过高环境中,会使酶活性永久丧;而若处于极低温度的环境中只会使酶活性受到抑制,一旦温度适宜,酶又全或部分的
1.冰箱 2.恒温水浴锅 3.试管和试管架 4.吸量管及吸量管架 5.移液枪及枪头 6.胶头滴管 7.烧杯
试剂:
1.PH6.8的冲液:量15.45ml的0.2M磷酸氢二钠和4.55ml的柠酸合摇匀即可。 2.0.5%粉的0.5%氯化钠溶液:0.5g可溶性淀粉和0.5g氯化钠,溶于100ml馏水(需
4.1M HCl溶
1.制管和预温
由于本实验对温应要求高,故每个温度梯度使用两支试管,分别标记为A管和B管,时欲温底物与酶。A管加入PH6.8的缓冲液和0.5%淀粉液;B管使用移液枪加入稀释100倍的液,对应的两
替
2.混合A、B管
将1号A管迅速入度对应的B管中(为了最大限度保证酶的),此时为计时的起点(使用秒表),摇匀后放回对应温度继续水浴。注意:移A管试剂
然后每隔1min2min(时间自定)按上作依次把2、3、4、5、6号的A、B管混合 ,严格控制好
准确反应13min,1管加入2滴1M HCl溶液,立即混匀,
在每中各加入2ml 0.03175g/L碘液并混匀,观察现
若不温度梯度间现象差别不明
记录象(或比较吸光度值),做出合理分析。 【
严格注意时控制物质的添加量。 【思考题】 如果某同(没有严格按照教案步骤)做出的实验结果为唾液淀粉酶的最适温度为70,请分析
实
【实验目的】
了解PH对酶活性及酶促反应
1.PH对酶活影的机理:PH响酶活性中心的某些必须基团的解离,而这些基团往往仅某解状态时才最容易同底物结合或具有大催化活性;PH影响可解离基团的底物和酶的荷电状态,从而影响酶对他们的亲和;PH还可以影
2.本实验用唾液淀材料来观察活性PH的影响的情况。淀粉在该酶的催化作用下会随着时间的延长而出现不程的解,而得到各种糊精乃至麦芽糖,少量葡糖等水解产物。碘液与淀粉及其不同程度的水解产物反呈现不同颜色,即淀粉(蓝色)、紫色糊精(紫色)、红色(红色)、
1、冰 2、电
5、移液管架及移液管
试剂:
1、0.2M磷酸氢二钠溶液:称35.61g含2个结晶水的磷酸氢二钠,
2、0.1M檬酸溶:称取21.01g含一个结晶水的柠酸,用水定容至1L。 3、唾液淀粉酶:将唾液分别稀释10倍、50和100
4、0.5%淀粉的0.5%氯化钠溶液:0.5g可溶性淀粉和0.5g氯化钠,溶于100ml
5、0.1%粉液:0.1g可溶性淀粉,加到100ml蒸中,加热溶解。 6、碘液:15g碘化钾和12.7g碘,加少许水使完全溶解
7、1%氯化钠溶液。 8、0.1%硫酸铜溶液。 【实验步骤】
(一)PH对酶活性的影响 1、缓冲
取只洁净的三角烧瓶,按表1编号和
表1 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲
取
表2 pH对酶活性的影响
【结果处理】
记现象(或比较吸光度值),做出合
【注意事项】
充
酶
实
【实验目的】
了解浓度对酶活性及酶促反
在适宜的条,若物浓度大大高于酶浓度时,反应速度随度增加而增加,两者间成正比。但若反应底物浓度较低,而且酶的浓度足高时,增
本实验采液淀酶为例。加入不同浓度的酶,比较在同一适当时间后,以碘检验淀粉的含量从而确认其反应程
仪器:
1.
3.试管与试管架 试剂:
1.
3.别稀释过10倍、50倍和100
【实验步骤】
1.取3支洁净试管,按下表加入粉液,缓冲液,加毕放入37度恒温水浴
2.保温,快速加不同浓度的稀释唾液,摇匀,立放入37度恒温水浴中,并计时。约3至4分钟后加入等量碘液一至两
记
实
【实验目的】
了解子对酶活性及酶促反应
酶的活性常常受某物影响,有物质使酶的活性增加,称为酶的激活剂;有些物质能使酶的活性降低,称酶抑剂。Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。其它阴离子,如Br-、NO3-和I- 对该酶也有激作用,但较微弱。而Cu2+对唾液淀粉酶具有制作。激活剂和
就本实验,低浓CI-可以加活性,高浓度的CI-或者低浓度的Cu2+则会抑酶,同时低浓度的Na+、SO42-等对酶活性没有影响。激活剂的作用机制是多种多样的,可能是作为辅酶或辅的
【仪器与试剂】
仪器:
1.恒温水浴锅 2.吸量管
3.试管与试管架
试剂:
1. 1%NaCI溶液 2. 0.1%CuSO4溶液 3. 0.1%淀粉液 4. 100倍
【实验步骤】
取3支洁净的试管,编号后按下表操作:
【结果处理】
记录
为什加入淀粉后有试管内颜显现为红色? (思考题可以总结起