名字十五个字实在太长我怕记不住
范文一：自噬流的检测方法
药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (1): 45?51 ? 45 ?
自噬流的检测方法
吕晓希, 胡卓伟*
(中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室,
新药作用机制研究与药效评价北京市重点实验室, 北京 100050)
摘要: 自噬是调节真核细胞生长、死亡和能量代谢的重要生物学机制。细胞自噬行使其生物学功能的前提是自噬流的活化。大量证据表明自噬流受损与多种慢性炎性疾病, 特别是肿瘤、神经退行性疾病及组织纤维化的发病密切相关, 目前对于自噬流的检测是自噬与其相关疾病研究领域的热点。由于自噬流是一个由多个步骤组成的动态过程, 因此往往需要精细的实验才能准确判断自噬流状态。本文将介绍自噬流的基本概念并总结目前常规使用的自噬流检测方法。这些方法将有助于自噬生物学机制的研究, 并为自噬相关药物筛选提供有效的解决方案。
关键词: 自噬流; 流式细胞术; 串联荧光; 长寿命蛋白; 微管结合蛋白1A/1B-轻链3 中图分类号: R965.2 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2016) 01-0045-07
New methods to detect autophagic flux
Lü Xiao-xi, HU Zhuo-wei*
(State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Beijing Key Laboratory of New Drug Mechanisms and Pharmacological Evaluation Study, Institute of Meteria Medica, Chinese Academy
of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China)
Abstract: Autophagy is a crucial biological process of eukaryotes, which is involved in cell growth, survival and energy metabolism, while the premise of the autophagy function is activated autophagic flux. It has been confirmed that impaired autophagic flux promotes pathogenesis of many chronic inflammatory diseases, especially cancer, neurodegenerative disease and tissue fibrosis, therefore the analysis of autophagic flux state is
important for revealing autophagy function and the mechanism of autophagy related diseases. Given that autophagy is a dynamic process with multiple steps, it is very hard to observe the real state of autophagic flux.
Summarized here is the novel concept and current approach to detect autophagic flux. This knowledge is crucial for the researching of the biological function of autophagy, and may provide some strategies for developing autophagy-related drug.
Key words: autophagic flux; flow cytometry; tandem fluorescent; long lived protein; microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3
?
自噬是真核细胞降解长寿蛋白、错误折叠蛋白
和受损细胞器的重要生物学过程[1]。细胞自噬由多个
收稿日期: 2015-10-09; 修回日期: 2015-11-10.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (81503128); 中央级公益性科
研院所基本科研业务费-创新药物与新技术专项资助项目 (2014CX09).
*通讯作者 Tel / Fax: 86-10-83165034, E-mail: huzhuowei@imm.ac.cn DOI: 10.16438/j.0513-4870.2015-0877
步骤组成, 其中包括: ① 吞噬泡的形成; ② 自噬体
的形成 ; ③ 自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体 ;
④ 自噬溶酶体的降解。自噬流是这些步骤在细胞内连续出现的动态过程, 自噬流中的任一环节出现障碍自噬将无法完成其生物学功能[2]。自噬流的活化或受阻往往可以造成截然不同的生物学效应。在不同组
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织器官中自噬流的阻断往往导致致病蛋白、错误折叠蛋白及受损细胞器清除障碍, 进而通过诱导炎症等生物学效应引发多种疾病发病, 其中包括神经退行性疾病、肿瘤、肌肉病、心血管疾病、自身免疫病和由于自噬流是细胞内不断变化的组织纤维化等[1,3?6]。
LC3B-II的含量则不会在使用Baf A1的基础上发生改变。除Baf A1外, 其他一些能提高溶酶体pH值 的自噬晚期抑制剂也可以用于自噬流的检测[9]。若待检测药物+Baf A1组LC3B-II处理组相 比显著增加则代表所检测药物可以增加自噬小体或自噬溶酶体的合成。相反, 若处理组与对照组相比, LC3B-II降低则代表处理药物减少自噬小体的合成[10]。
通常在使用Baf A1判断药物对自噬流影响时会设定4个组别, A: 空白组 (未处理组)、B: Baf A1处理组、C: 待测药物处理组、D: 待测药物与Baf A1了自噬小体的形成和自噬溶酶体降解的综合效应。而B组和D组则仅代表细胞自噬小体的合成水平。因此通过C组与D组比较可以部分判断待测药物对于自噬小体或自噬溶酶体降解的影响。
若结果显示LC3B-II含量A组< b组="C组=" d组,="" 则代表待测药物能够减少自噬体降解。由于lc3b-ii="" b组="D组," 因此说明待测药物不影响自噬体合成;="" lc3b-ii="">
一种动态过程, 因此通常在自噬流检测时存在诸多难点。可见熟悉自噬流快速、准确的检测方法是真正认识自噬生物学功能的关键。 1 微管结合蛋白1A/1B-轻链3的检测
目前使用最为广泛的自噬流检测方法是通过1B-light chain 3B (LC3B) 蛋白表达水平, 但是如果没有自噬工具药作为对照, 则观察到的LC3B改变无法真实反映细胞内自噬流状态。例如LC3B-II增加既可能是自噬活化后自噬小体增多而成, 也可能是自噬溶酶体清除失败所致。自噬流的检测方法较为复杂, 单独使用现有的某一种技术方法往往不能达到系统性检测自噬流, 因此需要选择多种不同实验方法, 综合评价其检测结果才能较为客观地反映细胞自噬流状态。
哺乳动物LC3B基因的同源性可高达94%, 这体哺乳动物细胞内LC3B的总量通常不会有巨大波动, 一般只会出现LC3B-I和LC3B-II间的相互转换, 或
Western blot检测microtubule-associated protein 1A/ 联合处理组。A、C组LC3B-I向LC3B-II转化代表
况下, 待测化合物能够抑制自噬体的降解。由此可见在待测药物仅影响自噬体降解时, LC3B-II C组与D
若结果显示LC3B-II含量C组<><>< d="" 组,="">
现了自噬体在生物进化当中的保守性和重要性。在 组并无差异 (图1A)。
是由于自噬溶酶体降解而导致的LC3B-II清除, 这 LC3B-II B组< d组说明待测药物可以增加自噬体合些现象都间接反映了细胞自噬流的状态[7]。通常认="" 成;="" 在待测药物可以增加自噬体合成的前提下,="" 为在western="" blot实验中观察到lc3b-i向lc3b-ii转化,="" 或是lc3b-ii含量增多代表了自噬流的活化;="" lc3b-ii含量降低代表了自噬抑制。然而lc3b-ii的减少存在两种原因,="" 一为自噬流的阻断,="" 即lc3b-i无法向lc3b-ii转化;="" 二是自噬流过度活化,="" lc3b-ii在自噬溶酶体降解消耗增多所致。这两种情况在western="" blot的检测中会得到类似的结果,="">
1.1 使用自噬相关工具药物检测LC3B-I/II转化 到目前为止伴随使用自噬晚期抑制剂, 通过检测当使用自噬LC3B-I/II转化是自噬流检测的金指标[8]。
晚期抑制剂巴弗洛霉素A1 (bafilomycin A1, Baf A1) 刺激细胞时, 细胞内自噬溶酶体降解被抑制, 此时观察到的的基础上进一步增加, 而当细胞自噬流阻断后,
LC3B-II含量C组< a组,="" 说明待测化合物能够增加自噬体降解。综合评判,="" 待测药物能够加快细胞自噬进程="">
若结果显示LC3B-II含量A组< b组="">< d组,="" 则说明待测药物能够增加自噬体合成。lc3b-ii="">< d组,="">
在待测药物可以增加自噬体合成的前提下, LC3B-II含量A组< c组,="" 说明待测化合物可能抑制自噬体降解。此时需要比较c组与d组间及b组与d组间的lc3b-ii含量差别。若待测药物抑制自噬体降解则d组与c组lc3b-ii含量之差应小于d组与b组之差;="" 若待测化合物仅增加自噬体合成则lc3b-ii含量d组?c组应等于d组?b组="">
通常图1A及1B中的状况较好判断, 然而图1C情况则较为复杂。由于受Western blot实验精度影响, 很难准确计算两组间LC3B-II含量的差值, 难免最终做出错误判断。因此仅判断待测药物是否促进自噬体合成较为容易, 若要同时检测其是否影响自噬溶酶
吕晓希等: 自噬流的检测方法
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降低, 其降解蛋白的能力进一步增强, 因此GFP标签蛋白也被逐渐降解消失。由此可见, 若观察不到游离GFP标签, 则有可能是由于自噬流阻断, 也有可能是由于自噬流过度活化所致。当自噬流过度活化时, 若想要观察到GFP标签条带则需要配合使用低浓度自噬抑制剂, 如氯化铵或氯喹。这些药物能中和溶酶体中的酸性环境, 又不完全抑制细胞自噬功能, 但当自噬流阻断时即使使用低浓度自噬抑制剂也无法观察到游离GFP标签[12]。
氯喹是一种常用的自噬抑制剂, 其可以通过提
Figure 1 Analysis of the regulatory effects of samples on
升细胞溶酶体内pH值进而剂量依赖性阻断细胞自噬
autophagic flux using bafilomycin A1. Cells were treated with
活性。使用低浓度氯喹处理GFP-LC3B过表达细胞时仍可以观察到单独的GFP标签条带。此现象并不是因为低浓度氯喹可以诱导自噬活性, 而是由于使
pound increases the synthesis and clearance of autophagosome;
用低浓度氯喹 (约10 μmol·L?1) 能够升高溶酶体中C: The compound increases the synthesis of autophagosome
体降解则需要更加谨慎的实验进行判断。
由于Baf A1对于LC3B-II的清除抑制极为显著, 若待检测药物仅微弱调节自噬反应, 则在Western blot检测时, LC3B-II的改变可能会由于Baf A1的效处理细胞4 h, 而长时间 (>8～饱和浓度的刺激很有可能会影响泛素蛋白酶体降解功能。
除Western blot外, LC3B蛋白还可以GFP-LC3B进行检测。这两种检测均需要使用荧光染料或荧光 蛋白进行标记。免疫荧光的优势是可以观察到LC3B的点状聚集, 而流式细胞术则可以分析大量单细胞内LC3B的表达水平。然而这两种方法均不能区分LC3B-I和LC3B-II, 只能观察到LC3B的总量。 1.2 应用GFP-LC3B剪切实验评价自噬流 GFP- LC3B融合蛋白不仅能够利用其荧光标签进行检测,
pH值, 同时又可保留部分自噬活性, 进而使得LC3B降解所致。当氯喹浓度超过50 μmol·L?1时, 自噬活性被完全抑制, 此时无法观察到GFP标签条带。同理, 低浓度Baf A1 (2.5 nmol·L?1) 处理细胞也可以观察到游离GFP标签条带 (图2)。
Figure 2 Analysis of autopahgic flux with Western blot using GFP-LC3 fusion protein. Cells were transfected with GFP-LC3
还可利用溶酶体对标签蛋白的切割通过Western blot
expressing plasmid, and the GFP-LC3 fusion protein or free GFP [11]
进行检测。GFP-LC3B蛋白进入到自噬溶酶体内 protein was detected with anti-GFP antibody
后LC3B部分对溶酶体中的蛋白水解酶较为敏感, 较容易被降解。而融合蛋白中的GFP部分则对于溶酶体中的蛋白水解酶敏感性较低, 不容易被降解。使用LC3B-I、GFP-LC3B-II和游离GFP标签三个条带, 若出现游离GFP[12]此外, 在检测同一细胞样品时还可以使用LC3B抗体检测内源性LC3B-I向LC3B-II转化。值得注意的是游离GFP标签的出现仅代表自噬流适度活化, 当自pH
雷帕霉素刺激和饥饿培养是最为常规的自噬流活化方法, 但两者在GFP-LC3B的Western blot检测理细胞或饥饿诱导自噬活化后LC3B-II蛋白均发生降解。与饥饿不同, 雷帕霉素属于温和的自噬活化方式, 使用Western blot检测可以观察到游离GFP标签条带, 且雷帕霉素的这一现象具有一定的时间依赖性和浓度依赖性。而在使用EBSS进行细胞饥饿培养后, 细胞需要大量内源性蛋白提供生存所需养分, 因
当使用雷帕霉素处GFP抗体进行Western blot检测可能会检测到GFP- 中却可以观察到截然不同的结果。
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此溶酶体中pH值急剧下降, GFP蛋白随即被降解, 因此无法观察到游离GFP标签条带[13]。但无论使用雷帕霉素还是饥饿处理细胞, 使用LC3B抗体均能够观察到内源性LC3B-II的表达增加。
1.3 应用流式细胞术检测细胞内LC3含量 使用流式细胞术观察GFP-LC3过表达细胞内LC3B含量变当自噬流活化时通常观察LC3B荧光强度的改变[14]。
化时, 细胞内LC3B-I会向LC3B-II进行转化, 定位于自噬体或自噬溶酶体膜表面的LC3B-II将随着自噬的活化而逐渐降解, 因此在流式细胞仪上会观察到LC3B荧光强度降低[15]。但由于细胞本身自噬活化后LC3B-I的产生也会增加, 因此LC3B荧光强度降低并不十分明显。若要在流式细胞仪上观察到明显的荧光变化需要将待检测细胞进行破膜处理。流式细胞术可以将破膜后的细胞内游离型LC3B (LC3B-I) 与结合型LC3B (LC3B-II) 相区分, 这一点有助于判断细胞自噬流的状态
[14]
可以持续发出红色荧光。另一方面, mRFP和mCherry的荧光强度和荧光稳定性也远高于GFP, 更易于进行免疫荧光检查。由此可见, 将绿色荧光蛋白及红色荧光蛋白串联在一起可利用两者在溶酶体中敏感性的不同, 观察并判断细胞自噬流状态[17, 18]。
mRFP/mCherry-GFP-LC3B串联荧光蛋白是专门用于检测自噬流水平的融合蛋白, 自噬活化时GFP荧光信号在进入溶酶体后由于pH值的下降会出现淬灭, 但是mRFP或mCherry荧光基团的pH值稳定性比GFP高, 在进入自噬溶酶体后仍能发出荧光。因此在使用mRFP/mCherry-GFP-LC3B融合蛋白进行细胞实验时, 同时观察红色荧光和绿色荧光的强度变化可以准确判断细胞自噬活性。若细胞内出现绿色荧光和红色荧光共定位, 即出现黄色荧光时表明mRFP/ mCherry-GFP-LC3B融合蛋白并未与溶酶体发生融合或自噬溶酶体中的pH值较高, 进而代表了自噬流的阻断。当细胞内仅出现红色荧光而无绿色荧光时, 代表mRFP/mCherry-GFP-LC3B融合蛋白定位于溶酶体或自噬溶酶体内, 即自噬流活化[19]。免疫荧光显微镜或活细胞工作站是观察融合蛋白的最佳仪器, 态观察细胞内荧光颜色的变化, 更加确凿地证实细胞自噬过程。使用mRFP/mCherry-GFP-LC3B串联荧光蛋白的最大优势在于, 仅通过荧光强度的改变就可以判断自噬流状态, 而不需要其他任何自噬工具药物参与。转染mRFP-GFP-LC3B质粒后的细胞经 饥饿处理, 会出现黄色荧光和红色荧光均出现点状
。由于LC3B-I是以游离形式弥散
于细胞浆中, 细胞在经过皂素破膜后LC3B-I会漏出到细胞外。而LC3B-II主要结合在自噬体和自噬溶酶体膜表面, 即使破膜也不会漏出。自噬流活化时自噬体数量增加, 且自噬体和自噬溶酶体由于体积的关系, 无法通过皂素在细胞膜表面所制造的微孔。因此当细胞自噬流活化时, 经过皂素处理的细胞内荧光强度会增加 (图3)。但当使用自噬抑制剂Baf A1处理细胞后, 由于大量自噬溶酶体无法得到清除, 在经过皂素处理后细胞荧光强度同样会增强。
1.4 串联荧光标签检测细胞内自噬流 除GFP外, 可以用于检测自噬流的荧光蛋白还包括mRFP及
[16]
聚集的现象, 其中黄色荧光的增加是由于自噬小体mCherry等。GFP或EGFP虽然对于溶酶体中蛋
数量增多导致的, 这一点与GFP-LC3B过表达细胞
, 但其荧光在自噬溶酶体中
内的绿色荧光点状聚集相类似。目前串联荧光这一技
容易由于pH与绿色荧光蛋白不同,
术也被用于进行自噬调节剂的药物筛选, 通过细胞
mRFP或mCherry对于溶酶体中的酸性条件并不敏感,
组学显微镜可以同时观察至少1 000个细胞的荧光强
当荧光蛋白本身没有被降解时, mRFP或mCherry
度, 进而达成高通量筛选的目的[20](图4)。
前文所述, 在使用Western blot进行GFP-LC3B
Figure 3 Analysis of autophagic flux with flow cytometry. Cells were transfected with GFP-LC3 plasmid, and the fluores- cence intensity was detected with flow cytometry after treatment with or without saponin
Figure 4 Analysis of autophagic flux with mRFP/mCherry- GFP-LC3 fusion protein. Cells were transfected with mRFP/ mCherry-GFP-LC3 expression plasmid, and the fluorescence intensity was detected with confocal or flow cytometry
吕晓希等: 自噬流的检测方法
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细胞自噬活性检测时, 使用低剂量氯喹刺激细胞可以mCherry-GFP-LC3B融合蛋白检测实验时, 低剂量氯因此在抑制溶酶体活性的同时还可以造成细胞绿色荧光淬灭及红色荧光聚集现象。若使用高剂量或饱和剂量氯喹或Baf A1刺激细胞时细胞内黄色荧光明显增加, 但绿色荧光淬灭并不明显, 因此当绿色、红色荧光合并后细胞内的红色荧光强度很低。这种现象代表高剂量自噬抑制剂造成的自噬流阻断完全抑制了GFP荧光的淬灭和其蛋白的降解, 可见自噬流活化和部分自噬阻断都可以检测到红色荧光强度增加的现象。两者之间的区别在于自噬流活化引发的红色荧光强度要高于部分自噬阻断时细胞内的荧光强度。鉴于以上两种情况时黄色荧光点状聚集均增强, 可以通过计算每个细胞内红色荧光点的百分比来确定自噬流状态。若红色荧光点百分比与对照相比增加, 则代表自噬流活化; 若红色荧光点数量增加, 而百分比没有明显变化, 且黄色荧光点数量同样增加, 则代表自噬流受到部分抑制; 若红色荧光点百分比下降则代表自噬流阻断。上述荧光点百分比可通过专业影像学软件进行分析并计算, 首先统计细胞内平均荧光点总数 (X), 随后统计细胞内平均红色荧光点总数 (Y), 则Y/X值显示了细胞自噬流状态。Y/X值越高表明自噬流活性越强, Y/X值越低则表明自噬流阻塞越严重。
转染mRFP/mCherry-GFP-LC3B的细胞除利用免疫荧光显微镜观察细胞内荧光分布外, 还可以通过流式细胞术对其进行分选。利用分选软件将每个细胞内mRFP或mCherry的发射光强度与GFP发射光强度进行比值处理, 比值高的细胞代表高自噬流活性; 比值低的细胞代表低自噬流活性。通过分选可以获得一个细胞群中高自噬流活性的细胞亚群和低自噬流活性的细胞亚群。然而某一细胞内的自噬流活性并不是固定不变的, 分选所得高自噬流活性细胞群和低自噬流活性细胞群在静息一段时间后, 其细胞内荧光比值会向中值偏移, 这种现象充分代表了自噬流是一种动态的过程[21]。通常的实验手段仅能够检测到自噬流的某一状态, 要想充分评价自噬流变化需要动态观察细胞内的自噬活性。可见在活细胞工作站下长时间观测mRFP/mCherry-GFP-LC3B融合蛋白细胞内荧光强度变化是评价自噬流的良好选择[6]。目前mRFP/mCherry-GFP-LC3B转基因小鼠也可用于体内自噬流检测, 将转基因小鼠的组织进行冰冻切片染
色能够很好地评价待检测药物在体内对于自噬流的2 SQSTM1/p62结合LC3B蛋白翻转实验评价自噬
自噬底物的清除必须要经过两个步骤, 一是自噬对于待降解底物的识别, 二是将待降解底物转运至自噬溶酶体。这两个步骤是自噬流活化与否的关键, 而自噬货车蛋白恰恰是操控这些步骤的关键因素。p62是选择性自噬最重要的货车蛋白, 其也被称之为选择性自噬受体, 它是连接LC3B与待降解泛素化底p62结合泛素化蛋白进入到自噬体后最物的桥梁[22]。
终与溶酶体融合形成自噬溶酶体从而得到清除。自噬流抑制时p62含量增加, 相反自噬流活化时p62水平下降。p62 Ser403位磷酸化可调控自噬对泛素化蛋白当的清除, 此现象可通过抗磷酸化p62抗体检测[23]。某些Atg基因缺失或自噬体与溶酶体融合受阻时, 此外p62还可以作为载体将待p62会显著性堆积[24]。
降解蛋白带入蛋白酶体内进行降解, 但总体来说其自噬调节作用更为重要。
通常检测p62蛋白时应当选择观察内源性蛋白, 因为在细胞内过表达p62会造成p62蛋白包涵体样堆积[6]。当自噬流受阻时, 内源性的p62也会出现不可溶性堆积, 且这种聚集体是Triton X-100不可溶的。此外p62还参与了蛋白酶体降解过程, 当蛋白酶体降解系统受阻时p62含量同样增加。在研究p62蛋白降解速率时, 应当适当使用蛋白酶体降解系统抑制剂来观察自噬对于p62蛋白的降解; 构建带有诱导型启动子的EGFP-p62也可以用来单独评价其蛋白的降解; 通过放射性同位素法也能评价p62蛋白的降解。然而, 当自噬流活化时也有可能观察到p62含量增加的现象, 这是由于自噬体和自噬溶酶体数量代偿性增加的原 因[25], 因此不能单独通过p62的表达来确定自噬活性。
在操作过程中, 通常可同时观察可溶性p62蛋白、不可溶性p62蛋白和LC3B-I/II转化综合判断自噬流状态。若是可溶性p62蛋白减少, 不可溶性p62无明显改变, 同时LC3B-I向LC3B-II转化增加则表明自噬流活化; 若观察到可溶性p62蛋白减少, 但不可溶性p62明显增加, 则无论LC3B是否发生I型向II型的转化均代表了自噬流阻断; 即使可溶性p62蛋白水平降低, 不可溶性p62无明显改变, 但LC3B没有发生I型向II型的转化, 也不能说明自噬流一定活化。获取不可溶性p62的方法主要是在常规细胞裂解离心后, 向离心沉淀中加入高浓度尿素或盐酸胍, 使形成包涵体的不可溶性p62溶解, 随后便可使用常规
检测到游离GFP标签蛋白条带。同理在进行mRFP/ 调节作用并观察这一作用的组织特异性。 喹或Baf A1部分抑制自噬后溶酶体内pH值升高, 流
吕晓希等: 自噬流的检测方法
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细胞自噬活性检测时, 使用低剂量氯喹刺激细胞可以mCherry-GFP-LC3B融合蛋白检测实验时, 低剂量氯因此在抑制溶酶体活性的同时还可以造成细胞绿色荧光淬灭及红色荧光聚集现象。若使用高剂量或饱和剂量氯喹或Baf A1刺激细胞时细胞内黄色荧光明显增加, 但绿色荧光淬灭并不明显, 因此当绿色、红色荧光合并后细胞内的红色荧光强度很低。这种现象代表高剂量自噬抑制剂造成的自噬流阻断完全抑制了GFP荧光的淬灭和其蛋白的降解, 可见自噬流活化和部分自噬阻断都可以检测到红色荧光强度增加的现象。两者之间的区别在于自噬流活化引发的红色荧光强度要高于部分自噬阻断时细胞内的荧光强度。鉴于以上两种情况时黄色荧光点状聚集均增强, 可以通过计算每个细胞内红色荧光点的百分比来确定自噬流状态。若红色荧光点百分比与对照相比增加, 则代表自噬流活化; 若红色荧光点数量增加, 而百分比没有明显变化, 且黄色荧光点数量同样增加, 则代表自噬流受到部分抑制; 若红色荧光点百分比下降则代表自噬流阻断。上述荧光点百分比可通过专业影像学软件进行分析并计算, 首先统计细胞内平均荧光点总数 (X), 随后统计细胞内平均红色荧光点总数 (Y), 则Y/X值显示了细胞自噬流状态。Y/X值越高表明自噬流活性越强, Y/X值越低则表明自噬流阻塞越严重。
转染mRFP/mCherry-GFP-LC3B的细胞除利用免疫荧光显微镜观察细胞内荧光分布外, 还可以通过流式细胞术对其进行分选。利用分选软件将每个细胞内mRFP或mCherry的发射光强度与GFP发射光强度进行比值处理, 比值高的细胞代表高自噬流活性; 比值低的细胞代表低自噬流活性。通过分选可以获得一个细胞群中高自噬流活性的细胞亚群和低自噬流活性的细胞亚群。然而某一细胞内的自噬流活性并不是固定不变的, 分选所得高自噬流活性细胞群和低自噬流活性细胞群在静息一段时间后, 其细胞内荧光比值会向中值偏移, 这种现象充分代表了自噬流是一种动态的过程[21]。通常的实验手段仅能够检测到自噬流的某一状态, 要想充分评价自噬流变化需要动态观察细胞内的自噬活性。可见在活细胞工作站下长时间观测mRFP/mCherry-GFP-LC3B融合蛋白细胞内荧光强度变化是评价自噬流的良好选择[6]。目前mRFP/mCherry-GFP-LC3B转基因小鼠也可用于体内自噬流检测, 将转基因小鼠的组织进行冰冻切片染
色能够很好地评价待检测药物在体内对于自噬流的2 SQSTM1/p62结合LC3B蛋白翻转实验评价自噬
自噬底物的清除必须要经过两个步骤, 一是自噬对于待降解底物的识别, 二是将待降解底物转运至自噬溶酶体。这两个步骤是自噬流活化与否的关键, 而自噬货车蛋白恰恰是操控这些步骤的关键因素。p62是选择性自噬最重要的货车蛋白, 其也被称之为选择性自噬受体, 它是连接LC3B与待降解泛素化底p62结合泛素化蛋白进入到自噬体后最物的桥梁[22]。
终与溶酶体融合形成自噬溶酶体从而得到清除。自噬流抑制时p62含量增加, 相反自噬流活化时p62水平下降。p62 Ser403位磷酸化可调控自噬对泛素化蛋白当的清除, 此现象可通过抗磷酸化p62抗体检测[23]。某些Atg基因缺失或自噬体与溶酶体融合受阻时, 此外p62还可以作为载体将待p62会显著性堆积[24]。
降解蛋白带入蛋白酶体内进行降解, 但总体来说其自噬调节作用更为重要。
通常检测p62蛋白时应当选择观察内源性蛋白, 因为在细胞内过表达p62会造成p62蛋白包涵体样堆积[6]。当自噬流受阻时, 内源性的p62也会出现不可溶性堆积, 且这种聚集体是Triton X-100不可溶的。此外p62还参与了蛋白酶体降解过程, 当蛋白酶体降解系统受阻时p62含量同样增加。在研究p62蛋白降解速率时, 应当适当使用蛋白酶体降解系统抑制剂来观察自噬对于p62蛋白的降解; 构建带有诱导型启动子的EGFP-p62也可以用来单独评价其蛋白的降解; 通过放射性同位素法也能评价p62蛋白的降解。然而, 当自噬流活化时也有可能观察到p62含量增加的现象, 这是由于自噬体和自噬溶酶体数量代偿性增加的原 因[25], 因此不能单独通过p62的表达来确定自噬活性。
在操作过程中, 通常可同时观察可溶性p62蛋白、不可溶性p62蛋白和LC3B-I/II转化综合判断自噬流状态。若是可溶性p62蛋白减少, 不可溶性p62无明显改变, 同时LC3B-I向LC3B-II转化增加则表明自噬流活化; 若观察到可溶性p62蛋白减少, 但不可溶性p62明显增加, 则无论LC3B是否发生I型向II型的转化均代表了自噬流阻断; 即使可溶性p62蛋白水平降低, 不可溶性p62无明显改变, 但LC3B没有发生I型向II型的转化, 也不能说明自噬流一定活化。获取不可溶性p62的方法主要是在常规细胞裂解离心后, 向离心沉淀中加入高浓度尿素或盐酸胍, 使形成包涵体的不可溶性p62溶解, 随后便可使用常规
检测到游离GFP标签蛋白条带。同理在进行mRFP/ 调节作用并观察这一作用的组织特异性。 喹或Baf A1部分抑制自噬后溶酶体内pH值升高, 流
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蛋白质电泳进行检测。
需要注意的是, 当自噬流出现波动时可溶性及p62测造成了一定困难。LC3B在自噬流出现活化或抑制时, 其蛋白水平改变较为迅速, 而作为自噬底物, p62间点可以动态分析p62的变化。假定经过药物处理后6 h或24 h能够观察到LC3B蛋白水平变化, 则p62的蛋白水平改变可能需要等到24 h或48 h才会出现, 但也有可能与LC3B同时出现改变。
另一种检测p62的方法是在使用或不使用自噬抑制剂的情况下通过免疫染色进行分析, 这样做可以观察到弥散型p62和聚集型p62的分布。目前通过检测p62判断自噬流最为准确的方法是联合Western blot和免疫染色技术, 包括免疫组化和免疫荧光。一方面可以检测到细胞内p62不同形态的含量变化, 另一方面可以观察不同形式p62在细胞内的定位。总体来说, LC3B-II的增加与p62的降低并不具有一致性, 要想正确评价自噬流受阻或自噬系统受损应当检测LC3B的转化, 也要检测可溶性和不可溶性p62的变化。
3 长寿命蛋白的自噬性降解
细胞内蛋白质主要通过两条途径来降解, 即蛋白酶体途径和自噬途径, 其中蛋白酶体途径主要负责短寿命蛋白的降解, 而长寿命蛋白和部分细胞器则主要通过自噬途径降解
[26]
未进入细胞的放射性物质, 再使用无同位素标记的氨基酸与细胞共孵育较短时间 (通常为1 h, 某些细胞此步骤可能延长至24 h), 待蛋白酶体将短寿命蛋白迅速降解后, 更换饥饿培基HBSS或EBSS诱导自噬 活化继续培养4 h, 期间也可以加入3-methyladenine 的抑制。最终在细胞中加入三氯乙酸后检测培养上清中的同位素及细胞中的同位素, 上清中同位素与沉淀细胞中同位素的比值即长寿命蛋白的降解率[27, 28]。
此方法具有较高的敏感性但特异性较低, 无法区分自噬依赖性降解和非依赖性降解, 因此通常需要加入溶酶体拮抗剂, 如氯喹、氯化铵和Baf A1, 通过分析添加拮抗剂前后同位素标记氨基酸的释放情况来考察此方法的特异性。除此之外, 若细胞在自噬流活化后, 长寿命蛋白降解产生的氨基酸不排出到细胞外, 而在细胞内重新合成或产能则会导致最终的实验结果出现偏差。 4 小结
自噬流检测是评价细胞自噬是否行使正常功能的重要途径, 但在自噬流的检测过程中往往由于存在技术稳定性差、检测手段单一、缺乏良好对照等情况, 使得实验人员难以获得真实可靠的结果。在本文中作者主要介绍了通过Western blot、流式细胞术和免疫荧光等方式检测LC3B-I/II的转化以及细胞定位; 自噬货车蛋白p62的检测方法; 长寿命蛋白自噬性降解的检测。这些方法均可用于观察细胞内自噬流的 变化, 但任何一种手段都有其局限性, 若要客观评价细胞自噬流状态最好选择多种方法综合评定, 例如联合使用Baf A1参与的LC3-I/II转化实验和mRFP- GFP-LC3串联荧光法判断自噬流就是较为恰当的方式。此外足够的实验重复次数、适当的实验对照也是正确检测自噬流的关键。
降解所需时间则较长。在检测过程中设定不同的时 (3-MA) 抑制自噬小泡的形成, 从而实现对细胞自噬
。近年来, 越来越多的研
究者意识到单纯观察自噬溶酶体的数量不足以判断自噬流的变化, 而检测长寿命蛋白的降解则可以很好地评价自噬流的改变。细胞自噬作为广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的降解途径, 其活化涉及到自噬体的形成、自噬底物的转运及其在自噬溶酶体中的降解等多个过程。在饥饿或应激条件下, 自噬可以有效调节胞内长寿命蛋白以及关键细胞器的降解, 为细胞对抗应激、细胞免疫和发育以及组织重塑提供物质基础; 在病理状态下, 自噬流受阻或过度活化则会导致长寿命蛋白的异常降解, 从而导致细胞正常功能和形态无法维持, 细胞稳态被打破, 促使组织器官的功能进一步恶化。
观察自噬蛋白降解是较早建立的一种自噬动态定量分析方法, 测定一般是利用放射性氨基酸掺入细胞蛋白并通过检测放射性标记氨基酸来定量蛋白降解。首先需要将同位素标记的氨基酸 (通常是C或
3
14
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范文二：自噬流的检测方法_吕晓希
药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (1): 45? 51 ? 45? 自噬流的检测方法
吕晓希 , 胡卓伟 *
(中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所 , 天然药物活性物质与功能国家重点实验室 ,
新药作用机制研究与药效评价北京市重点实验室 , 北京 100050)
摘要 : 自噬是调节真核细胞生长、死亡和能量代谢的重要生物学机制。细胞自噬行使其生物学功能的前提
是自噬流的活化。大量证据表明自噬流受损与多种慢性炎性疾病 , 特别是肿瘤、神经退行性疾病及组织纤维化
的发病密切相关 , 目前对于自噬流的检测是自噬与其相关疾病研究领域的热点。由于自噬流是一个由多个步骤
组成的动态过程 , 因此往往需要精细的实验才能准确判断自噬流状态。本文将介绍自噬流的基本概念并总结目
前常规使用的自噬流检测方法。这些方法将有助于自噬生物学机制的研究 , 并为自噬相关药物筛选提供有效的
解决方案。
关键词 : 自噬流 ; 流式细胞术 ; 串联荧光 ; 长寿命蛋白 ; 微管结合蛋白 1A/1B-轻链 3
中图分类号 : R965.2 文献标识码 :A 文章编号 : 0513-4870 (2016) 01-0045-07
New methods to detect autophagic flux
Lü Xiao-xi, HU Zhuo-wei*
(State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Beijing Key Laboratory of
New Drug Mechanisms and Pharmacological Evaluation Study, Institute of Meteria Medica, Chinese Academy
of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China)
Abstract : Autophagy is a crucial biological process of eukaryotes, which is involved in cell growth, survival and energy metabolism, while the premise of the autophagy function is activated autophagic flux. It
has been confirmed that impaired autophagic flux promotes pathogenesis of many chronic inflammatory diseases, especially cancer, neurodegenerative disease and tissue fibrosis, therefore the analysis of autophagic flux state is important for revealing autophagy function and the mechanism of autophagy related diseases. Given that autophagy is a dynamic process with multiple steps, it is very hard to observe the real state of autophagic flux. Summarized here is the novel concept and current approach to detect autophagic flux. This knowledge is crucial for the researching of the biological function of autophagy, and may provide some strategies for developing autophagy-related drug.
Key words: autophagic flux; flow cytometry; tandem fluorescent; long lived protein; microtubule-associated
protein 1A/1B-light chain 3
自噬是真核细胞降解长寿蛋白、错误折叠蛋白
收稿日期 : 2015-10-09; 修回日期 : 2015-11-10.
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (81503128); 中央级公益性科 研院所基本科研业务费 -创新药物与新技术专项资助项目 (2014CX09).
*通讯作者 Tel / Fax: 86-10-83165034, E-mail: huzhuowei@imm.ac.cn DOI: 10.16438/j.0513-4870.2015-0877 和受损细胞器的重要生物学过程 [1]。 细胞自噬由多个 步骤组成 , 其中包括 : ① 吞噬泡的形成 ; ② 自噬体 的形成 ; ③ 自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体 ; ④ 自噬溶酶体的降解。自噬流是这些步骤在细胞内 连续出现的动态过程 , 自噬流中的任一环节出现障 碍自噬将无法完成其生物学功能 [2]。 自噬流的活化或 受阻往往可以造成截然不同的生物学效应。 在不同组
? 46? 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (1): 45? 51
织器官中自噬流的阻断往往导致致病蛋白、 错误折叠 蛋白及受损细胞器清除障碍 , 进而通过诱导炎症等 生物学效应引发多种疾病发病 , 其中包括神经退行 性疾病、肿瘤、肌肉病、心血管疾病、自身免疫病和 组织纤维化等 [1,3? 6]。 由于自噬流是细胞内不断变化的 一种动态过程 , 因此通常在自噬流检测时存在诸多 难点。 可见熟悉自噬流快速、 准确的检测方法是真正 认识自噬生物学功能的关键。
1 微管结合蛋白 1A/1B-轻链 3的检测
目前使用最为广泛的自噬流检测方法是通过 Western blot检测 microtubule-associated protein 1A/ 1B-light chain 3B (LC3B) 蛋白表达水平 , 但是如果 没有自噬工具药作为对照 , 则观察到的 LC3B 改变无 法真实反映细胞内自噬流状态。 例如 LC3B-II 增加既 可能是自噬活化后自噬小体增多而成 , 也可能是自 噬溶酶体清除失败所致。 自噬流的检测方法较为复杂 , 单独使用现有的某一种技术方法往往不能达到系统 性检测自噬流 , 因此需要选择多种不同实验方法 , 综 合评价其检测结果才能较为客观地反映细胞自噬流 状态。
哺乳动物 LC3B 基因的同源性可高达 94%, 这体 现了自噬体在生物进化当中的保守性和重要性。在 哺乳动物细胞内 LC3B 的总量通常不会有巨大波动 , 一般只会出现 LC3B-I 和 LC3B-II 间的相互转换 , 或 是由于自噬溶酶体降解而导致的 LC3B-II 清除 , 这 些现象都间接反映了细胞自噬流的状态 [7]。通常认 为在 Western blot实验中观察到 LC3B-I 向 LC3B-II 转化 , 或是 LC3B-II 含量增多代表了自噬流的活化 ; LC3B-II 含量降低代表了自噬抑制。然而 LC3B-II 的 减少存在两种原因 , 一为自噬流的阻断 , 即 LC3B-I 无法向 LC3B-II 转化 ; 二是自噬流过度活化 , LC3B-II在自噬溶酶体降解消耗增多所致。这两种情况在 Western blot的检测中会得到类似的结果 , 但却代表 了截然不同的生物学终点。 因此如何精确把握自噬流 不同状态与 LC3B 蛋白含量的关系是正确判断自噬 流活化的关键。
1.1 使用自噬相关工具药物检测 LC3B-I/II转化 到目前为止伴随使用自噬晚期抑制剂 , 通过检测 LC3B-I/II转化是自噬流检测的金指标 [8]。 当使用自噬 晚期抑制剂巴弗洛霉素 A1 (bafilomycin A1, Baf A1) 刺激细胞时 , 细胞内自噬溶酶体降解被抑制 , 此时观 察到的 LC3B-II 的变化仅代表自噬小体数量的改变。 当细胞自噬流活化后 , LC3B-II的含量会在使用 Baf A1的 基 础 上 进 一 步 增 加 , 而 当 细 胞 自 噬 流 阻 断 后 , LC3B-II 的含量则不会在使用 Baf A1的基础上发生 改变。除 Baf A1外 , 其他一些能提高溶酶体 pH 值
的自噬晚期抑制剂也可以用于自噬流的检测 [9]。 若待
检测药物 +Baf A1组 LC3B-II 与仅 Baf A1处理组相
比显著增加则代表所检测药物可以增加自噬小体或
自噬溶酶体的合成。相反 , 若处理组与对照组相比 , LC3B-II 降低则代表处理药物减少自噬小体的合成 [10]。 通常在使用 Baf A1判断药物对自噬流影响时会
设定 4个组别 , A: 空白组 (未处理组 ) 、 B: Baf A1处
理组、 C: 待测药物处理组、 D: 待测药物与 Baf A1
联合处理组。 A 、 C 组 LC3B-I 向 LC3B-II 转化代表
了自噬小体的形成和自噬溶酶体降解的综合效应。 而
B 组和 D 组则仅代表细胞自噬小体的合成水平。因 此通过 C 组与 D 组比较可以部分判断待测药物对于
自噬小体或自噬溶酶体降解的影响。
若结果显示 LC3B-II 含量 A 组
在待测药物仅影响自噬体降解时 , LC3B-II C组与 D
组并无差异 (图 1A) 。
若结果显示 LC3B-II 含量 C 组
LC3B-II B组
进程 (图 1B) 。
若结果显示 LC3B-II 含量 A 组
含量
含量 A 组
解。 此时需要比较 C 组与 D 组间及 B 组与 D 组间的
LC3B-II 含量差别。若待测药物抑制自噬体降解则 D 组与 C 组 LC3B-II 含量之差应小于 D 组与 B 组之差 ; 若待测化合物仅增加自噬体合成则 LC3B-II 含量 D
组 ? C 组应等于 D 组 ? B 组 (图 1C) 。
通常图 1A 及 1B 中的状况较好判断 , 然而图 1C
情况则较为复杂。 由于受 Western blot实验精度影响 , 很难准确计算两组间 LC3B-II 含量的差值 , 难免最终
做出错误判断。 因此仅判断待测药物是否促进自噬体
合成较为容易 , 若要同时检测其是否影响自噬溶酶
吕晓希等 : 自噬流的检测方法
? 47 ?
Figure 1 Analysis of the regulatory effects of samples on
autophagic flux using bafilomycin A1. Cells were treated with
compounds with or without late phase autophagy inhibitor
bafilomycin A1, and the LC3 turnover was detected with Western blot. A: The compound inhibits autophagic flux; B: The com-pound increases the synthesis and clearance of autophagosome;
C: The compound increases the synthesis of autophagosome
体降解则需要更加谨慎的实验进行判断。
由于 Baf A1对于 LC3B-II 的清除抑制极为显著 , 若待检测药物仅微弱调节自噬反应 , 则在 Western blot 检测时 , LC3B-II的改变可能会由于 Baf A1的效 应无法判断。通常 Baf A1处理细胞 4 h已经能够完全 阻断自噬 , 而长时间 (>8~12 h) 饱和浓度的 Baf A1刺激很有可能会影响泛素蛋白酶体降解功能。
除 Western blot外 , LC3B蛋白还可以 GFP-LC3B 等融合蛋白形式通过免疫荧光和流式细胞术等方法 进行检测。这两种检测均需要使用荧光染料或荧光 蛋白进行标记。免疫荧光的优势是可以观察到 LC3B 的点状聚集 , 而流式细胞术则可以分析大量单细胞 内 LC3B 的表达水平。然而这两种方法均不能区分 LC3B-I 和 LC3B-II, 只能观察到 LC3B 的总量。 1.2 应用 GFP-LC3B 剪切实验评价自噬流 GFP- LC3B 融合蛋白不仅能够利用其荧光标签进行检测 ,
还可利用溶酶体对标签蛋白的切割通过 Western blot
进行检测 [11]
。 GFP-LC3B 蛋白进入到自噬溶酶体内 后 LC3B 部分对溶酶体中的蛋白水解酶较为敏感 , 较 容易被降解。而融合蛋白中的 GFP 部分则对于溶酶 体中的蛋白水解酶敏感性较低 , 不容易被降解。 使用 GFP 抗体进行 Western blot检测可能会检测到 GFP- LC3B-I 、 GFP-LC3B-II 和游离 GFP 标签三个条带 , 若 出现游离 GFP 标签条带则代表细胞自噬流活化 [12]。 此外 , 在检测同一细胞样品时还可以使用 LC3B 抗体 检测内源性 LC3B-I 向 LC3B-II 转化。值得注意的是 游离 GFP 标签的出现仅代表自噬流适度活化 , 当自 噬流过度活化时细胞内自噬溶酶体中的 pH 值进一步
降低 , 其降解蛋白的能力进一步增强 , 因此 GFP 标签 蛋白也被逐渐降解消失。 由此可见 , 若观察不到游离 GFP 标签 , 则有可能是由于自噬流阻断 , 也有可能是 由于自噬流过度活化所致。 当自噬流过度活化时 , 若 想要观察到 GFP 标签条带则需要配合使用低浓度自 噬抑制剂 , 如氯化铵或氯喹。 这些药物能中和溶酶体 中的酸性环境 , 又不完全抑制细胞自噬功能 , 但当自 噬流阻断时即使使用低浓度自噬抑制剂也无法观察 到游离 GFP 标签 [12]。
氯喹是一种常用的自噬抑制剂 , 其可以通过提
升细胞溶酶体内 pH 值进而剂量依赖性阻断细胞自噬
活性。使用低浓度氯喹处理 GFP-LC3B 过表达细胞 时仍可以观察到单独的 GFP 标签条带。此现象并不 是因为低浓度氯喹可以诱导自噬活性 , 而是由于使
用低浓度氯喹 (约 10 μmol·L? 1) 能够升高溶酶体中 pH 值 , 同时又可保留部分自噬活性 , 进而使得 LC3B 降解所致。 当氯喹浓度超过 50 μmol·L? 1时 , 自噬活性 被完全抑制 , 此时无法观察到 GFP 标签条带。同理 , 低浓度 Baf A1 (2.5 nmol·L? 1) 处理细胞也可以观察到 游离 GFP 标签条带 (图 2) 。
Figure 2 Analysis of autopahgic flux with Western blot using GFP-LC3 fusion protein. Cells were transfected with GFP-LC3
expressing plasmid, and the GFP-LC3 fusion protein or free GFP protein was detected with anti-GFP antibody
雷帕霉素刺激和饥饿培养是最为常规的自噬流 活化方法 , 但两者在 GFP-LC3B 的 Western blot检测 中却可以观察到截然不同的结果。
当使用雷帕霉素处 理细胞或饥饿诱导自噬活化后 LC3B-II 蛋白均发生 降解。 与饥饿不同 , 雷帕霉素属于温和的自噬活化方 式 , 使用 Western blot检测可以观察到游离 GFP 标签 条带 , 且雷帕霉素的这一现象具有一定的时间依赖 性和浓度依赖性。 而在使用 EBSS 进行细胞饥饿培养 后 , 细胞需要大量内源性蛋白提供生存所需养分 , 因
? 48? 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (1): 45? 51
此溶酶体中 pH 值急剧下降 , GFP蛋白随即被降解 , 因此无法观察到游离 GFP 标签条带 [13]。但无论使用 雷帕霉素还是饥饿处理细胞 , 使用 LC3B 抗体均能够 观察到内源性 LC3B-II 的表达增加。
1.3 应用流式细胞术检测细胞内 LC3含量 使用流 式细胞术观察 GFP-LC3过表达细胞内 LC3B 含量变 化时通常观察 LC3B 荧光强度的改变 [14]。 当自噬流活 化时 , 细胞内 LC3B-I 会向 LC3B-II 进行转化 , 定位于 自噬体或自噬溶酶体膜表面的 LC3B-II 将随着自噬 的活化而逐渐降解 , 因此在流式细胞仪上会观察到 LC3B 荧光强度降低 [15]。 但由于细胞本身自噬活化后 LC3B-I 的产生也会增加 , 因此 LC3B 荧光强度降低 并不十分明显。 若要在流式细胞仪上观察到明显的荧 光变化需要将待检测细胞进行破膜处理。 流式细胞术 可以将破膜后的细胞内游离型 LC3B (LC3B-I) 与结 合型 LC3B (LC3B-II) 相区分 , 这一点有助于判断细 胞自噬流的状态 [14]。由于 LC3B-I 是以游离形式弥散 于细胞浆中 , 细胞在经过皂素破膜后 LC3B-I 会漏出 到细胞外。 而 LC3B-II 主要结合在自噬体和自噬溶酶 体膜表面 , 即使破膜也不会漏出。 自噬流活化时自噬 体数量增加 , 且自噬体和自噬溶酶体由于体积的关 系 , 无法通过皂素在细胞膜表面所制造的微孔。 因此 当细胞自噬流活化时 , 经过皂素处理的细胞内荧光 强度会增加 (图 3) 。但当使用自噬抑制剂 Baf A1处 理细胞后 , 由于大量自噬溶酶体无法得到清除 , 在经 过皂素处理后细胞荧光强度同样会增强。
1.4 串联荧光标签检测细胞内自噬流 除 GFP 外 , 可以用于检测自噬流的荧光蛋白还包括 mRFP 及 mCherry 等 [16]。 GFP 或 EGFP 虽然对于溶酶体中蛋 白酶的降解较为不敏感 , 但其荧光在自噬溶酶体中 容易由于 pH 的降低发生淬灭。 与绿色荧光蛋白不同 , mRFP 或 mCherry 对于溶酶体中的酸性条件并不敏感 , 当荧光蛋白本身没有被降解时 , mRFP或 mCherry
Figure 3 Analysis of autophagic flux with flow cytometry. Cells were transfected with GFP-LC3 plasmid, and the fluores- cence intensity was detected with flow cytometry after treatment with or without saponin 可以持续发出红色荧光。 另一方面 , mRFP和 mCherry 的荧光强度和荧光稳定性也远高于 GFP, 更易于进 行免疫荧光检查。 由此可见 , 将绿色荧光蛋白及红色 荧光蛋白串联在一起可利用两者在溶酶体中敏感性 的不同 , 观察并判断细胞自噬流状态 [17, 18]。
mRFP/mCherry-GFP-LC3B串联荧光蛋白是专门 用于检测自噬流水平的融合蛋白 , 自噬活化时 GFP 荧光信号在进入溶酶体后由于 pH 值的下降会出现淬 灭 , 但是 mRFP 或 mCherry 荧光基团的 pH 值稳定性 比 GFP 高 , 在进入自噬溶酶体后仍能发出荧光。 因此 在使用 mRFP/mCherry-GFP-LC3B融合蛋白进行细胞 实验时 , 同时观察红色荧光和绿色荧光的强度变化 可以准确判断细胞自噬活性。 若细胞内出现绿色荧光 和红色荧光共定位 , 即出现黄色荧光时表明 mRFP/ mCherry-GFP-LC3B 融合蛋白并未与溶酶体发生融 合或自噬溶酶体中的 pH 值较高 , 进而代表了自噬流 的阻断。当细胞内仅出现红色荧光而无绿色荧光时 , 代表 mRFP/mCherry-GFP-LC3B融合蛋白定位于溶酶 体或自噬溶酶体内 , 即自噬流活化 [19]。 免疫荧光显微 镜或活细胞工作站是观察 mRFP/mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的最佳仪器 , 特别是活细胞工作站可以动 态观察细胞内荧光颜色的变化 , 更加确凿地证实细 胞自噬过程。 使用 mRFP/mCherry-GFP-LC3B串联荧 光蛋白的最大优势在于 , 仅通过荧光强度的改变就 可以判断自噬流状态 , 而不需要其他任何自噬工具 药物参与。转染 mRFP-GFP-LC3B 质粒后的细胞经 饥饿处理 , 会出现黄色荧光和红色荧光均出现点状 聚集的现象 , 其中黄色荧光的增加是由于自噬小体 数量增多导致的 , 这一点与 GFP-LC3B 过表达细胞 内的绿色荧光点状聚集相类似。 目前串联荧光这一技 术也被用于进行自噬调节剂的药物筛选 , 通过细胞 组学显微镜可以同时观察至少 1000个细胞的荧光强 度 , 进而达成高通量筛选的目的 [20](图 4) 。
前文所述 , 在使用 Western blot进行 GFP-LC3B
Figure 4 Analysis of autophagic flux with mRFP/mCherry- GFP-LC3 fusion protein. Cells were transfected with mRFP/ mCherry-GFP-LC3 expression plasmid, and the fluorescence intensity was detected with confocal or flow cytometry
吕晓希等 : 自噬流的检测方法 ? 49?
细胞自噬活性检测时 , 使用低剂量氯喹刺激细胞可以 检测到游离 GFP 标签蛋白条带。同理在进行 mRFP/ mCherry-GFP-LC3B 融合蛋白检测实验时 , 低剂量氯 喹或 Baf A1部分抑制自噬后溶酶体内 pH 值升高 , 因此在抑制溶酶体活性的同时还可以造成细胞绿色 荧光淬灭及红色荧光聚集现象。 若使用高剂量或饱和 剂量氯喹或 Baf A1刺激细胞时细胞内黄色荧光明显 增加 , 但绿色荧光淬灭并不明显 , 因此当绿色、红色 荧光合并后细胞内的红色荧光强度很低。 这种现象代 表高剂量自噬抑制剂造成的自噬流阻断完全抑制了 GFP 荧光的淬灭和其蛋白的降解 , 可见自噬流活化 和部分自噬阻断都可以检测到红色荧光强度增加的 现象。 两者之间的区别在于自噬流活化引发的红色荧 光强度要高于部分自噬阻断时细胞内的荧光强度。 鉴 于以上两种情况时黄色荧光点状聚集均增强 , 可以 通过计算每个细胞内红色荧光点的百分比来确定自 噬流状态。 若红色荧光点百分比与对照相比增加 , 则 代表自噬流活化 ; 若红色荧光点数量增加 , 而百分比 没有明显变化 , 且黄色荧光点数量同样增加 , 则代表 自噬流受到部分抑制 ; 若红色荧光点百分比下降则 代表自噬流阻断。 上述荧光点百分比可通过专业影像 学软件进行分析并计算 , 首先统计细胞内平均荧光 点总数 (X ), 随后统计细胞内平均红色荧光点总数 (Y ), 则 Y /X 值显示了细胞自噬流状态。 Y /X 值越高表 明自噬流活性越强 , Y /X 值越低则表明自噬流阻塞越 严重。
转染 mRFP/mCherry-GFP-LC3B的细胞除利用免 疫荧光显微镜观察细胞内荧光分布外 , 还可以通过 流式细胞术对其进行分选。 利用分选软件将每个细胞 内 mRFP 或 mCherry 的发射光强度与 GFP 发射光强 度进行比值处理 , 比值高的细胞代表高自噬流活性 ; 比值低的细胞代表低自噬流活性。 通过分选可以获得 一个细胞群中高自噬流活性的细胞亚群和低自噬流 活性的细胞亚群。 然而某一细胞内的自噬流活性并不 是固定不变的 , 分选所得高自噬流活性细胞群和低 自噬流活性细胞群在静息一段时间后 , 其细胞内荧 光比值会向中值偏移 , 这种现象充分代表了自噬流 是一种动态的过程 [21]。通常的实验手段仅能够检测 到自噬流的某一状态 , 要想充分评价自噬流变化需 要动态观察细胞内的自噬活性。 可见在活细胞工作站 下长时间观测 mRFP/mCherry-GFP-LC3B融合蛋白细 胞内荧光强度变化是评价自噬流的良好选择 [6]。 目前 mRFP/mCherry-GFP-LC3B转基因小鼠也可用于体内 自噬流检测 , 将转基因小鼠的组织进行冰冻切片染 色能够很好地评价待检测药物在体内对于自噬流的 调节作用并观察这一作用的组织特异性。
2 SQSTM1/p62结合 LC3B 蛋白翻转实验评价自噬 流
自噬底物的清除必须要经过两个步骤 , 一是自 噬对于待降解底物的识别 , 二是将待降解底物转运 至自噬溶酶体。 这两个步骤是自噬流活化与否的关键 , 而自噬货车蛋白恰恰是操控这些步骤的关键因素。 p62是选择性自噬最重要的货车蛋白 , 其也被称之为 选择性自噬受体 , 它是连接 LC3B 与待降解泛素化底 物的桥梁 [22]。 p62结合泛素化蛋白进入到自噬体后最 终与溶酶体融合形成自噬溶酶体从而得到清除。 自噬 流抑制时 p62含量增加 , 相反自噬流活化时 p62水平 下降。 p62 Ser403位磷酸化可调控自噬对泛素化蛋白 的清除 , 此现象可通过抗磷酸化 p62抗体检测 [23]。 当 某些 Atg 基因缺失或自噬体与溶酶体融合受阻时 , p62会显著性堆积 [24]。 此外 p62还可以作为载体将待 降解蛋白带入蛋白酶体内进行降解 , 但总体来说其 自噬调节作用更为重要。
通常检测 p62蛋白时应当选择观察内源性蛋白 , 因为在细胞内过表达 p62会造成 p62蛋白包涵体样堆 积 [6]。当自噬流受阻时 , 内源性的 p62也会出现不可 溶性堆积 , 且这种聚集体是 Triton X-100不可溶的。 此 外 p62还参与了蛋白酶体降解过程 , 当蛋白酶体降解 系统受阻时 p62含量同样增加。 在研究 p62蛋白降解 速率时 , 应当适当使用蛋白酶体降解系统抑制剂来 观察自噬对于 p62蛋白的降解 ; 构建带有诱导型启动 子的 EGFP-p62也可以用来单独评价其蛋白的降解 ; 通过放射性同位素法也能评价 p62蛋白的降解。 然而 , 当自噬流活化时也有可能观察到 p62含量增加的现象 , 这是由于自噬体和自噬溶酶体数量代偿性增加的原 因 [25], 因此不能单独通过 p62的表达来确定自噬活性。 在操作过程中 , 通常可同时观察可溶性 p62蛋 白、不可溶性 p62蛋白和 LC3B-I/II转化综合判断自 噬流状态。若是可溶性 p62蛋白减少 , 不可溶性 p62无明显改变 , 同时 LC3B-I 向 LC3B-II 转化增加则表 明自噬流活化 ; 若观察到可溶性 p62蛋白减少 , 但不 可溶性 p62明显增加 , 则无论 LC3B 是否发生 I 型向 II 型的转化均代表了自噬流阻断 ; 即使可溶性 p62蛋 白水平降低 , 不可溶性 p62无明显改变 , 但 LC3B 没 有发生 I 型向 II 型的转化 , 也不能说明自噬流一定活 化。 获取不可溶性 p62的方法主要是在常规细胞裂解 离心后 , 向离心沉淀中加入高浓度尿素或盐酸胍 , 使 形成包涵体的不可溶性 p62溶解 , 随后便可使用常规
? 50? 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (1): 45? 51
蛋白质电泳进行检测。
需要注意的是 , 当自噬流出现波动时可溶性及 不可溶性 p62的变化具有一定的滞后性 , 这也为其检 测造成了一定困难。 LC3B 在自噬流出现活化或抑制 时 , 其蛋白水平改变较为迅速 , 而作为自噬底物 , p62降解所需时间则较长。在检测过程中设定不同的时 间点可以动态分析 p62的变化。 假定经过药物处理后 6 h或 24 h能够观察到 LC3B 蛋白水平变化 , 则 p62的蛋白水平改变可能需要等到 24 h或 48 h才会出现 , 但也有可能与 LC3B 同时出现改变。
另一种检测 p62的方法是在使用或不使用自噬 抑制剂的情况下通过免疫染色进行分析 , 这样做可 以观察到弥散型 p62和聚集型 p62的分布。 目前通过 检测 p62判断自噬流最为准确的方法是联合 Western blot 和免疫染色技术 , 包括免疫组化和免疫荧光。一 方面可以检测到细胞内 p62不同形态的含量变化 , 另 一方面可以观察不同形式 p62在细胞内的定位。 总体 来说 , LC3B-II的增加与 p62的降低并不具有一致性 , 要想正确评价自噬流受阻或自噬系统受损应当检测 LC3B 的转化 , 也要检测可溶性和不可溶性 p62的变 化。
3 长寿命蛋白的自噬性降解
细胞内蛋白质主要通过两条途径来降解 , 即蛋 白酶体途径和自噬途径 , 其中蛋白酶体途径主要负 责短寿命蛋白的降解 , 而长寿命蛋白和部分细胞器 则主要通过自噬途径降解 [26]。 近年来 , 越来越多的研 究者意识到单纯观察自噬溶酶体的数量不足以判断 自噬流的变化 , 而检测长寿命蛋白的降解则可以很 好地评价自噬流的改变。 细胞自噬作为广泛存在于真 核细胞内的一种溶酶体依赖性的降解途径 , 其活化 涉及到自噬体的形成、 自噬底物的转运及其在自噬溶 酶体中的降解等多个过程。 在饥饿或应激条件下 , 自 噬可以有效调节胞内长寿命蛋白以及关键细胞器的 降解 , 为细胞对抗应激、 细胞免疫和发育以及组织重 塑提供物质基础 ; 在病理状态下 , 自噬流受阻或过度 活化则会导致长寿命蛋白的异常降解 , 从而导致细 胞正常功能和形态无法维持 , 细胞稳态被打破 , 促使 组织器官的功能进一步恶化。
观察自噬蛋白降解是较早建立的一种自噬动态 定量分析方法 , 测定一般是利用放射性氨基酸掺入 细胞蛋白并通过检测放射性标记氨基酸来定量蛋白 降解。 首先需要将同位素标记的氨基酸 (通常是 14C 或 3H 标记的亮氨酸或缬氨酸或 35S 标记的甲硫氨酸 ) 与 培养细胞共孵育数小时乃至数天 , 通过洗涤细胞清除 未进入细胞的放射性物质 , 再使用无同位素标记的 氨基酸与细胞共孵育较短时间 (通常为 1 h, 某些细胞 此步骤可能延长至 24 h), 待蛋白酶体将短寿命蛋白迅 速降解后 , 更换饥饿培基 HBSS 或 EBSS 诱导自噬 活化继续培养 4 h, 期间也可以加入 3-methyladenine (3-MA) 抑制自噬小泡的形成 , 从而实现对细胞自噬 的抑制。 最终在细胞中加入三氯乙酸后检测培养上清 中的同位素及细胞中的同位素 , 上清中同位素与沉 淀细胞中同位素的比值即长寿命蛋白的降解率 [27, 28]。 此方法具有较高的敏感性但特异性较低 , 无法 区分自噬依赖性降解和非依赖性降解 , 因此通常需 要加入溶酶体拮抗剂 , 如氯喹、氯化铵和 Baf A1, 通 过分析添加拮抗剂前后同位素标记氨基酸的释放情 况来考察此方法的特异性。 除此之外 , 若细胞在自噬 流活化后 , 长寿命蛋白降解产生的氨基酸不排出到 细胞外 , 而在细胞内重新合成或产能则会导致最终 的实验结果出现偏差。
4 小结
自噬流检测是评价细胞自噬是否行使正常功能 的重要途径 , 但在自噬流的检测过程中往往由于存 在技术稳定性差、 检测手段单一、 缺乏良好对照等情 况 , 使得实验人员难以获得真实可靠的结果。 在本文 中作者主要介绍了通过 Western blot、流式细胞术和 免疫荧光等方式检测 LC3B-I/II的转化以及细胞定位 ; 自噬货车蛋白 p62的检测方法 ; 长寿命蛋白自噬性降 解的检测。这些方法均可用于观察细胞内自噬流的 变化 , 但任何一种手段都有其局限性 , 若要客观评价 细胞自噬流状态最好选择多种方法综合评定 , 例如 联合使用 Baf A1参与的 LC3-I/II转化实验和 mRFP- GFP-LC3串联荧光法判断自噬流就是较为恰当的方 式。 此外足够的实验重复次数、 适当的实验对照也是 正确检测自噬流的关键。
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范文三：自噬在心力衰竭中的利弊评价_从自噬体到自噬流_王鹏博
作者简介 :王鹏博 (1986— ) , 在读博士 , 主要从事心力衰竭研究 。 Email :1204498217@qq．com 通信作者 :王国干 , 主任医师 , 博士 , 主要从事心力衰竭研究 。 Email :wangguog@hotmail．com
自噬在心力衰竭中的利弊评价 —
— — 从自噬体到自噬流 王鹏博 综述 王国干 审校
(中国医学科学院 , 北京协和医学院 , 国家心血管病中心 , 阜外心血管病医院 , 心血管疾病国家重点实验室 , 北京 100037)
The Ｒoleof Autophagy in Heart Failure — from Autophagosome to Autophagy Flux
WANG Pengbo , WANG Guogan
(State Key Laboratory of Cardiovascular Disease , Fuwai Hospital , National Center for Cardiovascular Diseases , Chinese A-cademy of Medical Sciences and Peking Union Medical College , Beijing 10037, China )
文章编号 :1004-3934(2014) 04-0419-04中图分类号 :Ｒ541.6
文献标志码 :A
DOI :10．3969/j．issn．1004-3934．2014．04．007
摘要 :
自噬在心力衰竭中的利弊存在争议 , 关键原因之一是自噬水平的评价方法不当 。 既往研究多以自噬体评价细胞自噬
水平的高低 。 然而自噬体数量的变化并不能反映自噬水平高低 。 因为从自噬流的角度来看 , 自噬体的数量受生成和消除两方面影 响 。 既往研究多认为自噬体增加是自噬过度导致生成过多所造成 ,
而新近研究表明自噬体的蓄积多是自噬清除功能障碍所致 。 如 何提高心力衰竭中自噬的清除功能可能是以后的研究热点和新药开发方向 。
关键词 :自噬 ; 心力衰竭 ; 发病机制
Abstract :
In comparisons of similar studies on autophagy ’ s role in heart failure (HF ) , results of these studies show that it has not
been possible for researchers to reach any one conclusion about the exact role of autophagy in HF．One reason for the lack of consensus a-mong researchers is the inappropriate methods used for the evaluation of autophagy．In many older studies the number of autophagasomes present during HF was examined．However , recent studies show that autophagosomes are an intermediate step in a dynamic process , thereby frequently fluctuating in number．These studies have shown that the accumulation of autophagosomes was due to a dysfunction in autophagic flux．Additionally , the mass of autophagosomes can result in pathologic changes such as inflammation and cell death , which are closely in-volved in the pathogenesis of HF．Therefore , improving the clearance of autophagosomes may benefit HF．This review indicates that it may contribute to the development of new drug for HF to explore the methods of improving the clearance of autophagosomes．
Key words :
autophagy ; heart failure ; pathogenesis
心力衰竭是各种心脏病发展的终末期阶段 。 虽 然血管紧张素转换酶抑制剂 、 β受体阻滞剂和醛固酮 受体拮抗剂等药物以及心脏再同步化治疗 、 植入型体 内自动除颤器等器械治疗可在一定程度上改善心力 衰竭 患 者 的 预 后 , 但 其 5年 生 存 率 仍 只 有 50%左 右
[1-2]
。 因此新的药物和治疗手段亟待出现 , 而这需
要进一步阐明心力衰竭的发病机制 。 近年来多项研
究表明自噬参与心力衰竭的发病过程
[3-5]
。 然而自噬 在其中的利弊仍存在争议 , 甚至相似的研究得出完全
相反的结论
[6-11]
。 产生这种争议的关键原因之一是自 噬水平的评价方法不当 。
1
自噬和自噬流的概念
自噬 (autophagy ) , 顾名思义即 “ 自己吃自己 ” , 是
细胞消化自身细胞器和内容物的一种生命现象 。 细
胞可通过自噬 , 对受损的细胞器和异常的蛋白质等细 胞内容物进行分解 , 并循环利用
[12-13]
。 因此自噬系统
相当于可将垃圾回收再利用的清洁系统 。
自噬流 (autophagy flux ) 即自噬的流程 。 由于自噬 现象中 最 常 见 、 研 究 最 多 的 是 巨 自 噬 (macroautoph-agy ) 。 因此目前研究中所提到的自噬流多指巨自噬的 流程 , 即由内质网来源的膜包绕待降解物形成具有双 层膜结构的自噬体 (autophagosome ) , 继而与溶酶体融
·
914·心血管病学进展 2014年 7月第 35卷第 4期 Adv Cardiovasc Dis , July 2014, Vol．35, No．4
合 , 形 成 自 噬 溶 酶 体 (autolysosome ) 并 降 解 其 内 容 物 [14]。 其中 , 自噬体的形成和清除是自噬流的两个密 不可分的过程 。
2以自噬体为评价标准
由于自噬体是较具特征意义的自噬标志 , 因此既 往研究多以自噬体有无或者多寡评价细胞自噬水平 的高低 。 自噬体有无或者多寡的情况可以通过电镜 下观察直接得到 , 也可以通过 western-blot 等方法检测 自噬体膜上的标记物蛋白 LC3-Ⅱ 或以绿色荧光蛋白 标记 LC3等方法间接反映 [15]。 Shimomura 等 [6]取 27个扩张型心肌病的患者行部分左室切除术后的心肌 , 通过电镜发现变性的心肌细胞中存在包含线粒体等 细胞器的自噬体 , 因此认为自噬是心肌细胞死亡的机 制之一 。 而 Kassiotis 等 [7]通过对比 9个扩张型心肌病 患者行左室辅助装置术前后心肌细胞内自噬和凋亡 指标的变化 , 发现术后 LC3-Ⅱ 等自噬标记物明显下 降 , 而凋亡指标变化不大 , 因而得出结论 , 自噬在心力 衰竭中是一种适应 (adaptive ) 机制 。 这两项研究均采 用了人体心脏组织标本 , 只进行了观察 , 而没有直接 干预自噬过程 。 从统计学中相关性和因果关系的角 度来看 , Shimomura 等 [6]的研究结论是明显偏颇的 , 因 为静态观察到变性心肌细胞中包含自噬体 , 只能说明 自噬和心肌细胞死亡相关 , 却不能说明自噬是心肌细 胞死亡 的 原 因 。 譬 如 心 力 衰 竭 患 者 血 液 中 脑 钠 肽 (BNP ) 升高 , 只能说明 BNP 和心力衰竭相关 [16], 如果 就此推论 BNP 是心力衰竭原因 , 则在目前看来是显而 易见的错误 , 因为 BNP 具有抗心力衰竭作用 [17]。 而 Kassiotis 等对心肌中的自噬进行了动态的观察 , 其研 究结果具有重要意义 , 但结论似乎不妥 , 因为观察到 心脏负荷减小后 , 心肌自噬标记物的降低 , 只能说明 自噬标记物随心脏负荷的减小而降低 , 却不能说明自 噬是心力衰竭的适应机制 。 这类似于动态观察心力 衰竭患者血液中血管紧张素 , 心力衰竭改善后血管紧 张素下降 , 只能说明血管紧张素随心力衰竭改善而降 低 , 若认为血管紧张素升高是心力衰竭的适应机制 , 则是众所周知的谬误 , 因为目前公认心力衰竭中血管 紧张素升高是机体适应不良 (maladaptive ) 的表现 , 降 低血管紧张素可治疗心力衰竭 [18]。
由此可见 , 单纯通过直接或者间接观察心肌细胞 中自噬体有无或者多寡来推论自噬和心力衰竭的因 果关系 , 探讨自噬在心力衰竭中的利弊 , 是有失偏颇 的 。
由于人体试验的局限性 , 难以对自噬本身进行干 预 , 因此有基础研究通过药物或者基因敲除的方法来 调控自噬 , 以判断自噬在心力衰竭中的利弊 。 Atg5是 自噬体形成阶段中的重要因子 。 Nakai 等 [8]通过抑制 Atg5调控自噬水平 , 观察小鼠心脏结构和功能的变 化 。 当短时间抑制成年小鼠心脏中的 Atg5时 , 小鼠心 肌细胞中代表自噬体数量的 LC3-Ⅱ 减少 , 心脏发生肥 厚 、 左室扩大 、 收缩功能减低 ; 而 Atg5基因敲除的小 鼠 , 尽管心脏发育正常 , 但增加压力负荷一周后即出 现 LC3-Ⅱ 减少 、 左室扩大和心功能不全 。 因此 Nakai 等 [8]认为 , 基础水平的自噬对维护心脏结构和功能意 义重大 , 心力衰竭时上调自噬水平可以保护心脏细胞 免受血流动力学变化的损伤 。 但是当时多数研究认 为自噬在压力负荷所致的心力衰竭中是适应不良的 表现 , 自噬水平上调会加速病情进展 , 对机体是不利 的 [19]。 Nakai 等的研究当时被认为是偏颇的 。 因为抑 制 Atg5或者基因敲除 Atg5后 , 自噬被过度抑制 , 因此 心力衰竭进展快 , 但这并不能说明上调自噬可以起保 护作用 ; 何况在心力衰竭患者中的自噬并没有受过度 抑制 [6]。 那么 , 在保证基础水平自噬的前提下 , 上调 自噬对心力衰竭是利还是弊 ?
Beclin1是自噬启动阶段的一个关键因子 。 Zhu 等 [9]制作了 beclin 1+/-的小鼠 , 这种小鼠心脏细胞具 有基础水平的自噬 , 而不会像 Nakai 等的研究中自噬 被过度抑制 。 当压力负荷增加时 , 相对于野生型小 鼠 , beclin 1+/-小鼠心肌中绿色荧光蛋白标记的 LC3减 少 , 左室扩大和收缩功能降低的幅度均减小 。 而当上 调 beclin-1表达时 , 绿色荧光蛋白标记的 LC3增加 , 心 脏结构和功能病理性恶化的程度加重 。 因此 , 作者得 出结论 , 压力负荷增加会上调自噬 , 从而造成心力衰 竭 。
以上结论相反的两个研究 , 被一些研究者推论 为 :自噬是双刃剑 , 即基础水平的自噬对心力衰竭是 有利的 , 但过度自噬则会造成病理性改变 , 使心力衰 竭恶化 [20]。 然而这种推论是不妥的 , 因为 Zhu 等 [9]的 研究结论并不十分可靠 , 其以绿色荧光蛋白标记的 LC3反映自噬体数量 , 并以此评价自噬水平是很可能 导致谬误的 。 原因在于 , 自噬体数量的变化并不能反 映自噬水平 。 自噬体数量增加并不能代表自噬水平 上调 。
3以自噬流为评价标准
新近研究多以自噬流评价自噬水平 [21-23]。 自噬 体的形成和清除是自噬流的两个密不可分的过程 。 从自噬流的角度来看 , 自噬体增多的原因既可能是自 噬体的形成增加 , 也可能是其清除受阻 。 而这两种情 况可代表自噬水平完全相反的状态 :若只是自噬体的 形成增加 , 则代表自噬流上调 , 自噬水平上调 ; 若只是
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·心血管病学进展 2014年 7月第 35卷第 4期 Adv Cardiovasc Dis , July 2014, Vol．35, No．4
其清除受阻 , 则代表自噬流下调 , 自噬水平下调 [24]。 因此 , 不难理解 , 以自噬体有无或者数量多寡评价自 噬利弊的研究会得出完全相反的结论 。 而以自噬流 评价自噬水平则科学全面 。
自噬流概念的引入 , 使众多研究从干预自噬体的 形成过程转而关注自噬流的清除阶段 。 与上文 Zhu 等 [9]研究类似的是 , Ma 等 [25]也观察到 , 当 beclin-1上 调时 , 绿色荧光蛋白标记的 LC3增加 , 自噬体蓄积 , 心 脏损伤加重 。 但与 Zhu 等不同的是 , Ma 等除了观察 到自噬流上流的自噬体蓄积 , 还注意到其下流的自噬 溶酶体并没有增加 , 因此认为心脏损伤的减轻并非自 噬水平上调造成的 , 相反 , 是自噬清除功能障碍所致 。 而部分敲除 beclin-1时 , 自噬清除功能增强 , 心脏损伤 减轻 。 另外 , 作者提出 , 蓄积的自噬体会增加活性氧 , 致使线粒体膜通透性增加 , 从而导致细胞死亡 。 由此 可见 , 自噬体蓄积是导致病理性改变和细胞死亡的真 正原因 。 之前认为自噬体蓄积是自噬过度表现的观 点是错的 。 自噬体蓄积的原因很可能是自噬流在清 除阶段出现功能障碍 , 这是自噬不足的一种表现 。 这 一观点被其他的试验从另外的角度佐证 。 DNase Ⅱ 是 溶酶体中的 DNA 水解酶 , 在清除自噬体内的线粒体 DNA 中起重要作用 。 Oka 等 [26]发现 DNase Ⅱ 对应基 因敲除后的小鼠在基础水平并无异常 , 但当压力负荷 增加时 , 其自噬体内的线粒体 DNA 蓄积 , 从而引发心 肌炎症和心力衰竭 。 新近 Dutta 等 [13]研究表明 , 上调 自噬可以减少氧化应激反应对心肌细胞的损伤 , 而氧 化应激反应参与心力衰竭的发生发展 。 可见自噬在 心力衰竭的发生发展过程中起正面抗衡的作用 , 但当 自噬功能在清除阶段受阻时 , 则蓄积的自噬体会导致 病理改变 。
如果将自噬系统比作可将垃圾回收再利用的清 洁系统 , 那么线粒体 DNA 等受损的细胞内容物好比垃 圾 , 而自噬体是垃圾堆 , 清除过程相当于焚化 。 可见 最终导致污染和破坏的是垃圾堆中的垃圾 , 而非清洁 系统本身 。 根据垃圾堆的数量判断清洁系统的效率 是不当的 。 因为垃圾堆的增多 , 既可能是清洁系统在 前一阶段高运转 , 扫出了很多垃圾堆 , 也可能是清洁 系统在清除阶段效率低下 , 扫出的垃圾堆焚化不良 。 因此 , 在评价自噬在心力衰竭中的利弊时 , 综合考虑 其形成能力和清除能力是必要的 。 在尽量减少受损 细胞器和异常蛋白的前提下 , 增强自噬的清除功能应 是以后的研究热点和新药开发方向 [11, 27]。
综上所述 , 自噬在功能正常时可正面抗衡心力衰 竭的进展 , 但当自噬清除功能障碍时 , 则会造成负面 影响 。 如何提高心力衰竭中自噬的清除功能是以后 的研究热点和新药开发方向 。
[参 考 文 献 ]
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2013, 9(7) :1094-1096．收稿日期 :2014-01-27修回日期 :2014-
04-17作者简介 :张昌琳 (1982— ) , 主治医师 , 在读博士 , 主要从事冠心病研究 。 Email :frybe @163．com 通信作者 :乔树宾 , 主任医师 , 博士 , 主要从事冠心病及肥厚型心肌病研究 。 Email :qsbfw@sina．com
环孢素 A 在心肌缺血再灌注损伤中的心脏保护作用研究进展
张昌琳 综述 乔树宾 审校
(中国医学科学院 北京协和医学院 国家心血管病中心 阜外心血管病医院 冠心病诊治中心 , 北京 100037)
Cardioprotective Effects of Cyclopsporine A
in Treatment of Myocardial ＲeperfusionInjury
ZHANG Changlin , QIAO Shubin
(Coronary Heart Disease Center , Fu Wai Hospital , Nationanl Center for Cardiovascular Diseases , CAMS ＆PUMC , Bei-jing 100037, China )
文章编号 :1004-3934(2014) 04-0422-05中图分类号 :Ｒ542.2
文献标志码 :A
DOI :10．3969/j．issn．1004-3934．2014．04．008
摘要 :
越来越多的证据显示线粒体通透性转换孔 (mPTP ) 的开放在心肌缺血再灌注损伤中发挥着关键作用 。 尽管其结构仍
不明确 , 但亲环素 D 却是其主要的组成成分之一 。 环孢素 A 是一种有效的免疫抑制剂 , 可结合于线粒体亲环素 D , 从而抑制 mPTP 的开放 。 许多动物实验及部分小规模临床研究表明 , 其可以通过抑制 mPTP 而减少心肌梗死面积 。 然而 , 也有研究提示环孢素 A 并没有心脏保护作用 。 现就环孢素 A 在心肌缺血再灌注损伤中可能的心脏保护作用机制 、 相关的动物实验模型及临床研究 、 可能 的影响因素及进一步研究方向进行综述 。
关键词 :环孢素 A ; 心肌缺血再灌注损伤 ; 心脏保护
Abstract :
Accumulating evidence suggests that the opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP ) plays a key role
in myocardial reperfusion injury．Its structure is still not clearly defined but one of its key components is the protein cyclophilin D．Cyclospo-rine A , which has potent immunosuppressor activity , can bind to the mitochondrial cyclophilin D and thereby inhibit the mPTP from open-ing．Cyclosporine A has been shown to reduce infarct size in various experimental conditions and some clinical studies by inhibiting the open-ing of mPTP , although similar studies have been done with negative results．In this article , the potential mechanisms , experimental and clin-ical studies , probable influential factors , and future research of the cardioprotective effects of cyclosporine A in myocardial reperfusion injury have been reviewed．
Key words :
cyclosporine A ; myocardial reperfusion injury ; cardioprotection
急性心肌梗死后 , 早期恢复心肌血液灌注可以限
制梗死面积并改善临床预后 。 然而 , 再灌注本身可以 造成心肌损伤 ,
从而抵消急性心肌梗死后早期再灌注 (通过溶栓或直接经皮冠状动脉介入治疗 ) 的获益 。
·
224·心血管病学进展 2014年 7月第 35卷第 4期 Adv Cardiovasc Dis , July 2014, Vol．35, No．4
范文四：UV254的检测方法
UV254的检测方法 水质检测 2007-06-12 16:58:07 阅读393 评论0 字号：大中小
UV254 作为水处理中有机物控制指标的意义
出 自：中国土木工程学会水工业分会给水委员会第八次年会
发表时间：2001-10-9
蒋绍阶， 刘宗源
（重庆大学 城市建设与环境工程学院，重庆 400045）
摘 要：本文对UV254进行了不同于传统认识的探讨，揭示了其在水处理中与TOC 、DOC ，以及THMs 前驱物等常用有机物控制指标之间的相关关系，并通过可行性探讨说明UV254可以作为它们的替代参数。UV254的测定具有仪器便宜、操作方便、使用成本低、与原指标相关度高、精度高和重复测定重现性好等优势。在目前国内水处理厂运行监控以及实验室研究条件下，UV254作为有机物控制的间接参数，具有重要的应用价值。 关键词：UV254； 有机物测定； 替代参数
UV254是衡量水中有机物指标的一项重要控制参数，在国外经过近二十年的不断研究，已被水处理研究和管理人员普遍接受和使用。[1] 但是，国内通常认为紫外吸收（UVA ）主要是对某种有机物进行定性、定量研究的一种测定方法，通过波长扫描将所得光谱与标准谱图对照来确定官能团并在此基础上定量计算有机物含量。而本文试图探讨的是：非特异性UV254。
针对目前国内对于有机物的测定方法上还存在的不足，本文通过对UV254含义进行阐述，详细介绍了它对于有机物测定的实际意义，并通过它与NPTOC 、DOC 、THMFP 的相关分析，证实了UV254是TOC 、DOC ，以及THMs 前驱物的替代参数，可以作为有机物的控制参数。鉴于目前国内TOC 测定仪等仪器，普遍由于设备昂贵、使用成本高、药品消耗量较大且价格不菲等原因而一直难以大规模推广，UV254作为有机物控制的间接参数的测定具有操作简单、仪器低廉、实验操作成本低、精度较高、数据重现性好等优点。作为反映一类有机物的替代参数，即间接指标，UV254可以在水和废水处理实验室研究以及水厂实际运行中广泛推广。
1 UV254的含义
1.1 UV254的定义
UV254是指在波长为254nm 处的单位比色皿光程下的紫外吸光度。计算公式如下： UV254 = [A/b]×D
式中，UV254--UV 值，cm -1；
b--比色皿光程，cm ；
A--实测的吸光度；
D--稀释因子，由不含有机物清洗水的稀释引起（= 最终水样量/初始水样量）。
1.2 非特异性UV254的含义
由以上定义可见，UV254并非针对某一种有机物来进行测定，即UV254反映的并不是某一种有机物的存在和含量，这也就是“非特异性”的含义。与传统观念不同之处就在于： i) UV254的测定不需要进行波长扫描，而只反映在254nm 处的紫外吸收；
ii) 正是由于UV254只是254nm 一个波长处的紫外吸收，故其所反映的并不是某一种有机物的浓度，而是多种（甚至达几百种）有机物的浓度之和，是一类有机物的共同含量。 所以本文所述的UV254并不适宜去一种一种的检测化合物的微量浓度，而是用于所有具有紫外吸收性能的有机物成分总浓度的指示。
2 UV254用于水处理中的意义
水中有机物的成分很复杂，其中一些有机物，如腐殖质类的分子量从500～105变化，它们的化学式至今都尚无定论。我们不可能（其实也没有必要）逐一测出这些物质的浓度。UV254正是反映某一类有机物，它们具有相近的性质，所以可以采用UV254来代表。其在水处理中的最显著的意义为：UV254可以作为总有机碳（TOC ）、溶解性有机碳（DOC ），以及三卤甲烷（THMs ）的前驱物（THMFP ）等指标的替代参数。为监控水厂运行效果和测定水质而采用替代参数对于水工业来说已不罕见，例如，浊度就是一种广泛用于控制和监测水处理厂运行中颗粒物去处率的替代参数，而TOC 本身就是作为总有机物含量的替代参数。现在使用的其他替代参数如色度、大肠菌群数等。具体说来，UV254作为替代参数的意义分述如下。
2.1 UV254作为TOC 和DOC 替代参数的意义
TOC 是常见的控制指标，它几乎代表了水中所有有机物的含量，且操作方便，在国外得到了较广泛的应用。而DOC 则反映水中溶解性有机物，是TOC 的一个组成部分，也是一项重要的水质指标。一般TOC 的测定采用非分散红外吸收TOC 分析仪，目前这种仪器主要有两类：一类为高温催化燃烧法（所得结果为TOC ），另一类为催化氧化法（所得结果为DOC ）。但是，不论哪种方法，都由于TOC 分析仪设备昂贵、使用成本高、仪器易损坏、测定精度通常较低且重现性差等特点，从而限制了其在国内的应用，很多科研单位无力购买，或常常形成即使买得起也用不起的局面。例如，整个重庆市也只有为数不多的几台TOC 测定仪。
而UV254可以作为TOC 和DOC 的替代参数，从而使用更便宜的测定方法，即以UV254测定值来间接表示TOC 或DOC 。
常见紫外光谱波长范围为200～400nm ，即近紫外区，也称石英紫外区。根据光谱分析的结果，一般的饱和有机物在近紫外区无吸收，含共轭双键或苯环的有机物在紫外区有明显的吸收或特征峰，含苯环的简单芳香族化合物的主要吸收波长在250～260nm ，多环芳烃吸收波长向紫外区长波方向偏移。紫外谱图提供的主要信息是有关该化合物的共轭体系或某些羰基的存在。常见官能团的紫外吸收特点如下：
i) 化合物在220～400nm 无紫外吸收，说明化合物是饱和脂肪烃、脂环烃或其衍生物（氯化物、醇、醚、羧酸等）；
ii) 化合物在220～250nm 显示强烈吸收，说明该化合物存在共轭双键（共轭二烯烃、不饱和醛、不饱和酮）；
iii) 化合物在250～290nm 显示中等强度吸收，说明化合物中有苯环存在；
iv) 化合物在250～350nm 显示中低强度吸收，说明化合物中有羰基或共轭羰基存在； v) 在300nm 以上有高强度吸收，说明该化合物有较大的共轭体系。
水和废水中的一些有机物，如木质素、丹宁、腐殖质和各种芳香族有机化合物都是苯的衍生物，而且是天然水体和污水二级处理出水中的主体有机物（占DOC 的40～60%），可以采用UV254作为它们在水中含量的替代参数。UV254/DOC即单位溶解性有机碳的紫外吸收值，可以反映水中有机物的芳香构造化程度，简称芳香度。对水源水的分析表明：分子量越大其UV254越高，特别是分子量大于3000以上的有机物是水中紫外吸收的主体，而小于500的有机物紫外吸收很弱。[2]
2.2 UV254作为THMFP 替代参数的意义
随着对饮用水氯消毒副产物（DBPs ）研究的深入，THMs 已经成为最重要的一个检测项目。国内外大量研究表明，[3] THMs的各组份（包括三氯甲烷、二氯一溴甲烷、一氯二溴甲烷和三溴甲烷）具有明显的致畸变、致突变作用，且存在显著的剂量反映关系。大量流行病学调查表明，长期饮用氯消毒的饮用水，死于消化和泌尿系统癌症的危险性增加，并和
其它癌症的死亡率存在着统计学上的关系。目前THMs 类的DBPs 已成为多数国家和组织的饮用水水质标准中的控制目标。
而THMFP 与UV254之间存在着密切关系，以UV254作为其替代参数是简便、便宜、可行的。
总之，UV254不但与水中有机物总量（TOC 或DOC ）有关，而且与THMFP 有较好的相关性，此外还与色度等有关，因此UV254可成为了解水质特性的“窗口”，高的UV254意味着水质有问题。
当然，任何替代参数因其都只是替代的测定方法且经常是非确定的，故其总有其局限性。但我们使用替代参数是因其与原始参数相比，测定更简单、快捷、便宜，而这对于水处理厂运行效果的监控、来说，通常是能够允许的。在饮用水处理的有机物控制科学研究中也可作为一种有机物测定的替代参数。
更重要的是UV254与TOC 、DOC 和THMFP 的直接测定方法比较而言（特别是和TOC 分析仪相比），有着更好的可重复测定性，即更高的精密度，使得多组数据之间具有可比性，以及能够进行实验室间的质量控制。
3 UV254作为控制指标替代参数的可行性
早在1985年，J. K. Edzwald等人就在这方面做了研究，证实了UV254是TOC （以NPTOC-不可提纯的总有机碳计）和THMFP 浓度的一种很好的替代参数。UV254可以用于原水NPTOC 和THMFP 浓度的预测、水厂试验效果的监控、以及全面水厂生产效果的监控。UV254测定具有快速、简便、便宜的特点。
他们还建立了NPTOC-UV254回归方程、THMFP-NPTOC 回归方程, 并基于这两个方程，研究了季节性THMs 变化和UV254/TOC值，高色度、含腐殖质的水体（Grasse 河）与受保护的上游水体（Glenmore 水库）相比，其有机物的特性是不同的。即使如此，这两种水源的THMs 前驱物的浓度与UV254的关系是类似的，即从两水源所得的THMFP-UV254回归方程是相似的。
经试验证明，由Grasse 河所导出的NPTOC-UV254方程和THMFP-UV254方程能够成功地应用于其它类似水体。Grasse 河以及其它也含有腐殖质的水源的UV254/TOC都明显在4～5的范围。测定UV254/TOC是一种简便的方法，它能用于判断有某一水体（如Grasse 河）的数据所得方程是否可以推广至其它水体，因其反映的是天然有机物(NOM)的特征。[4]
随后有更多学者研究此相关关系，都进一步证实了UV254是NPTOC 和THMFP 的良好替代参数，并将此相关关系所使用的水体水质、水厂进出水水质的范围加以推广，得出了较为普遍的公式。目前的研究主要集中在如何建立NPTOC-UV254和THMFP-NPTOC 的全面替代回归方程公式。
按有机物形态大小，TOC 大致可以分成颗粒态有机碳（POC ）、胶体态有机碳（COC ）和溶解性有机碳（DOC ）。由于DOC 与TOC 之间存在着一定的相关关系，在一般水源水质情况下，可以得到DOC-UV254的相关方程。Robert L. Sinsabough III等人的研究也证实了这一点。当然，目前UV254作为DOC 替代参数所得结果仍不具有普遍性。 4 UV254的测定方法
4.1 实验器材
i) 分光光度计
ii) 滤膜：滤膜采用预先洗净的孔径为0.45μm 的滤膜，或不含有机粘合剂的名义孔径为1～1.5μm 的玻璃纤维滤膜。实际中一般采用直径为2.2～4.7cm 大小的滤膜。滤膜不应吸附试验所关注的具有UV254吸收能力的有机物，也不应透过水中必须被去除的胶体状态的干扰物（例如硝酸盐、亚硝酸盐等）。还应用不含有机物的清洗水对滤膜进行预冲洗，以去
处其中的溶解性杂质。安装所选滤膜的过滤或喷淋装置应使用玻璃或不锈钢等材料。 iii) 清洗试剂：采用不含有机物的清洗水，即指DOC 含量低于0.3mg/L 的双蒸馏水、纯水或超纯水。[5]
4.2 操作过程
i) 水样稀释：水样应以比色皿光程为基础，一般保证吸光度在0.005～0.900之间，若超出该范围，则应将水样用不含有机物的清洁水稀释，使稀释后水样的吸光度在此范围内。 ii) 水样的制备：清洗滤膜和过滤装置时应保证至少50mL 不含有机物的清洗水通过滤膜。当为建立特定相关关系而进行的试验，应调节pH 值，如在用于监控时，须按环境pH 值进行调节。富里酸溶液的UV254在pH = 4～10时能保持明显的稳定。此外，还应制备不含有机物的清洗水作为空白样与水样共同进行对照分析。[6]
iii) 使用分光光度法测定：设置波长为254nm ，并在测定空白样时调零。然后，测定已知吸光度的苯二酸氢钾(KHP)标准样品以验证分光光度计是否已校准好。最后，在室温下开始测定，至少测定两组滤后水样。
4.3 计算
计算公式见1.1“UV254的定义”中所示。
如果由干扰物引起的那部分UV254超过总的UV254的10% 以上，则不应再使用UV254作为有机物的指示参数。
4.4 质量控制
i) 重复测定：至少测定两组滤后水样。
ii) 两次分析：每次测到第十个水样时，将这个水样再测一次（重复整个操作过程再测一次）以检验该方法的精密度。
iii) 检测基准吸光度：至少在每测十次水样后，应用不含有机物的清洗水空白样对系统基准吸光度进行检测。
5 结论与建议
国外对UV254应用的成功经验表明，UV254是一种有效、简便、可行的替代参数。它除了与NPTOC 、DOC 、THMFP 有着相关关系之外，对于其它控制指标，如色度、NOM 、以及DBPs （如TOX--总有机卤， HAAs--卤乙酸等）的前驱物质等，也可以建立起相关关系。
总之，非特异性UV254可以作为水处理中多种有机物控制指标的替代参数，这大大地方便了我们对这些控制指标进行测定。在目前国内研究条件下，UV254的测定具有直接测定原控制指标明显的优势，即仪器便宜、操作简便、药品及使用成本低廉、与原指标相关关系高、准确度较高、精密度好，以及实验室内和实验室间多次测定的重现性好等优点。另外，该方法测定快速，便于水厂运行处理效果的实时在线监测。建议国内研究机构和供水企业对于主要水源、流域开展研究，建立适合我国不同地区水源水质特征的UV254与TOC 、DOC 、THMFP 等参数的相关关系，促进国内的饮用水处理中有机物控制技术的发展，强化水处理厂对有机物含量进行的监控，提高出水水质和运行效果。
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作者简介：蒋绍阶（1956- ），男，汉族，湖南祁阳人，博士，研究方向为水处理。 电话：（023）65121468
范文五：梅毒的检测方法
梅毒的检测方法
1、暗视野显微镜检 暗视野显微镜检查是一种检查 梅 毒螺旋体 的方法。暗视野,顾名思义即是显微镜下没有明亮 的光线,它便于检查苍白的螺旋体。这是一种病原体检查, 对早期梅毒的诊断有十分重要的意义。 早期皮肤粘膜损 害(一期、二期霉疮)可查到苍白螺旋体。一期梅毒苍白螺 旋体多在硬下疳的硬结、溃疡的分泌物和渗出液中存在,肿 大的淋巴结穿刺也可检出。二期梅毒苍白螺旋体可在全身血 液和组织中检出,但以皮肤检出率最高。早期先天性梅毒, 可以通过皮肤或粘膜损害处刮片发现梅毒苍白螺旋体。最 近,通过羊膜穿刺术获得孕妇的羊水,以其作暗视野显微镜 观察,对先天性梅毒有诊断价值。
2、梅毒血清学检测 梅毒血清学检查对于诊断二期、 三期梅毒,以及判定梅毒的发展和痊愈,判断药物的疗效都 有十分重要的意义。梅毒血清学检查包括非梅毒螺旋体血清 学试验和梅毒螺旋体血清学试验。前者常用于临床筛选及判 定治疗的效果,抽血后 1小时即可出结果,费用也低廉。后 者主要是用于判定试验,但是它不能判定治疗效果,一旦患 有梅毒,这一试验将终身阳性。 (1)非梅毒螺旋体血清试验 这类试验的抗原分为心磷脂、卵磷脂和胆固醇的混悬液,用 来检测抗心磷脂抗体。由于这些试验具有相同的标准化抗 原,所以敏感性相似。常用的有三种:① 性病 研究实验室
玻片试验 (VDRL ) ; ②血清不加热的反应素玻片试验 (USR ) ; ③血浆反应素 target=_blank>快速血浆反应素环状卡片试 验(RPR ) 。 可用作临床筛选, 并可作定量, 用于疗效观察。 (2)梅毒螺旋体血清试验 包括有:①荧光螺旋体抗体吸收试 验(FTA-ABS );②梅毒螺旋体血凝试验(TPHA );③梅 毒螺旋体制动试验(TPI )等。这类试验特异性高,主要用 于诊断试验。 3、梅毒螺旋体 IgM 抗体检测 梅毒螺旋体 IgM 抗体检测是近年来才有的新的诊断梅毒的方法。 IgM 抗 体是一种免疫球蛋白,用它来诊断梅毒具有敏感性高,能早 期诊断, 能判定胎儿是否感染梅毒螺旋体等优点。 特异性 IgM 类抗体的产生是感染梅毒和其他细菌或病毒后机体首先出 现的体液免疫应答,一般在感染的早期呈阳性,随着疾病发 展而增加, IgG 抗体随后才慢慢上升。经有效治疗后 IgM 抗 体消失, IgG 抗体则持续存在, TP-IgM 阳性的一期梅毒病人 经过青霉素治疗后,约 2~4周 TP-IgM 消失。二期梅毒 TP-IgM 阳性病人经过青霉素治疗后, 2~8个月之内 IgM 消 失。此外, TP-IgM 的检测对诊断新生儿的先天性梅毒意义 很大, 因为 IgM 抗体分子较大, 其母体 IgM 抗体不能通过胎 盘,如果 TP-IgM 阳性则表示婴儿已被感染。 4、分子生 物学检测 近年来分子生物学发展迅速, PCR 技术广泛用 于临床,所谓 PCR 即多聚酶链式反应,即从选择的材料扩 增选择的螺旋体 DNA 序列, 从而使经选择的螺旋体 DNA 拷
贝数量增加,能够便于用特异性探针来进行检测,以提高诊 断率。但是,这种实验方法,要求有条件绝对好的实验室和 技术一流的技师,而我国目前很少有这样高水平的实验室。 不然有了污染,你放入的是梅毒螺旋体,经过 DNA 扩增后 出现了大肠杆菌,让你哭笑不得。一些小诊所常常赶时髦, 挂个 PCR 实验室的牌子,吃喝拉撒在一起,只能是自欺欺 人。 其实诊断梅毒不一定要作 PCR , 作一般的抽血化验即可。 5、脑脊液检查 晚期梅毒患者,当出现神经症状,经过驱 梅治疗无效, 应作脑脊液检查。 这一检查对神经梅毒的诊断、 治疗及预后的判断均有帮助。检查项目应包括:细胞计数、 总蛋白测定、 VDRL 试验及胶体金试验。
