范文一：2014版猪口蹄疫病毒

猪口蹄疫是猪、牛、羊等偶蹄动物的一种急性、热性和接触性传染的疾病，人也可感染，所以又是一种人畜共患病。它在临床上以VI腔黏膜、蹄部及乳房皮肤发生水疱和烂斑为特征。本病在世界各地均有发生，且目前仍在非洲、亚洲和南美洲很多国家流行。由于本病有强烈的传染性，一旦发生，其传播的速度很快，常常形成大流行，不易控制和消灭，造成巨大的经济损失，所以世界动物卫生组织一直将本病列为发病必须报告的A类动物疫病名单之首。

猪口蹄疫病原特性

猪口蹄疫的病原体是小核糖核酸病毒科的猪口蹄疫病毒(Food—and—mouth diseasevirus，FMDV)。该病毒的粒子呈圆形或六角形，由60个结构单位构成20面体，直径为23～25纳米，病毒由中央的RNA核心和周围的蛋白壳体所组成，无囊膜。成熟的病毒粒子约含30%RNA，其余70%为蛋白质。据认为，病毒的RNA决定其感染和遗传性;而蛋白质则主导其抗原性、免疫性和血清学反应的特点。

猪口蹄疫流行特点

猪口蹄疫病毒可侵害多种动物，但主要是偶蹄兽。家畜中以牛最易感，其次是猪和羊。各种年龄的猪均有易感性，但对仔猪的危害最大，常常引起死亡。病畜是最危险的传染源。由于本病对牛的敏感性最高，可在绵羊群中长期存在，而猪的排毒量远远大于牛和绵羊，故有牛是本病的“指示器”，绵羊为“贮存器”，猪为 “放大器”之说。病猪在发热期，其粪尿、奶、眼泪、唾液和呼出气体均含病毒，以后病毒主要存在于水疱皮和水疱液中，通过直接接触和间接接触，病毒进入易感猪的呼吸道、消化道和损伤的皮肤黏膜，均可感染发病。最危险的传播媒介是病猪肉及其制品，还有泔水，其次是被病毒污染的饲养管理用具和运输工具。近年来证明，空气也是猪口蹄疫的重要的传播媒介。病毒能随风传播到10～60公里以外的地方，如大气稳定，气温低，湿度高，病毒毒力强时，本病常可发生远距离气源性传播。

猪口蹄疫临床症状

猪口蹄疫的潜伏期为1～2天。病猪以蹄部水疱为主要特征。病初体温升高至40～

41℃，精神不振，食欲减退或不食，蹄冠(图1-3-1)、趾间、蹄踵出现发红、微热、敏感等症状，不久蹄冠部出现小水疱、出血和龟裂(图 1-3-2)或形成黄豆大、蚕豆大的水疱，水疱破裂后形成出血性糜烂和溃疡(图1-3-3)，1周左右恢复。蹄部发生水疱时，病猪常因疼痛而运动困难或卧地不起，站立时病肢屈曲减负体重(图1-3-4)。若有细菌感染，则局部化脓坏死，可引起蹄壳脱落(图1-3-5)，患肢不能着地，常卧地不起。部分病猪的口腔黏膜(包括舌、唇、齿龈、咽、腭)、鼻盘(图1-3-6)和哺乳母猪的乳头，也可见到水疱和烂斑。病程长时，蹄冠部病变逐渐恢复，该部缺少被毛和色素(图1-3-7)

吃奶仔猪患猪口蹄疫时，一般很少见到水疱和烂斑，通常由急性胃肠炎和心肌炎而导致突然死亡，病死率可高达60%～80%。病程较长者，亦可在口腔及鼻面上见到小水疱和糜烂。

猪口蹄疫病理特征

猪的猪口蹄疫根据病变的特点不同而有良性与恶性之分。

1.良性12蹄疫 本型的特点是病猪的死亡率低，在皮肤型黏膜和皮肤上发生水疱、烂斑等口蹄疮病变，败血病变化不明显。猪的口蹄疮多见于蹄部，如蹄冠、蹄踵和蹄叉等处;其次是口鼻端，如唇内面、齿龈、颊部、舌面(图1-3-8)、硬腭、鼻腔外口和鼻镜(图1-3-9)等部。无毛部的皮肤以乳腺部多见。

猪的口蹄疮通常较小，一般为米粒大到蚕豆大。水疱内的液体开始时呈淡黄色透明;如混有红细胞则呈红色;若水疱液内含有白细胞则变为浑浊而呈灰白色。水疱破裂后，通常形成鲜红色或暗红色烂斑;有的烂斑被覆一层淡黄色渗出物，渗出物干燥后形成黄褐色痂皮;当水疱破溃后如果继发细菌感染，则病变向深层组织发展，便形成溃疡;特别是蹄部发生细菌感染后，可使邻近组织发生化脓性炎或腐败性炎，严重者导致蹄壳脱落(图1-3-10)。

2.恶性猪口蹄疫本型的特点是主要发生于乳猪，死亡率高，可达75%～100%;在败血症的基础上，心肌呈现中毒性营养不良和坏死。剖检见心包内含有较多透明或稍浑浊的心包液。心脏外形正常，但质地柔软，色彩变淡，心内、外膜上有出血点。心肌纤维在病毒作用下发生局灶性脂肪变性、蜡样坏死和问质的炎性反应，所以在心室中隔及心壁上散在有灰白色和灰黄色的斑点或条纹病灶，因其色彩似虎皮样斑纹，故有“虎斑心”之称。病程较长的病例，上述变性和坏死的肌纤维被增生的结缔组织取代而形成硬结。 猪口蹄疫治疗方法

轻症病猪，经过10天左右多能自愈。重症病猪，为了缩短病期，特别是预防继发性感染的发生与死亡，应在严格隔离的条件下，及时对其进行治疗。可先用食醋水或0.2%高锰酸钾液洗净局部，再涂布龙胆紫溶液或碘甘油，经过数It治疗，绝大多数猪均可以治愈。对恶性猪口蹄疫病畜，除局部治疗外，常须辅以强心剂和补剂，如安钠咖、葡萄糖盐水等全身陛疗法进行治疗。用结晶樟脑口服，每天2次，每次5～8克，可收到良效。

中草药和一些民间验方对本病也有独到的疗效，兹简介几种如下：

1血清治疗

(1)对发病猪首先要加强饲养和护理,并保持猪舍清洁、通风、干燥、暖和,多饮水,加强营养,不食者可进行人工喂饲。

(2)对水疱破溃之后的猪,要对破溃面用0.1%高锰酸钾、2%硼酸或2%的明矾水清洗干净,再涂布1%的紫药水或5%碘甘油(5%碘配和甘油等量制成)。蹄部破溃的用0.l%高锰酸钾、2%硼酸或3%煤酚皂溶液清洗干净,并涂青霉素软膏或1%紫药水溶液。

(3)使用口蹄一针灵,口蹄一针灵对猪口蹄疫病毒引起的口炎、心肌炎、心脏功能衰退、口疮、水泡及腐蹄病等,有很好的治疗效果。

(4)在猪舍内外洒上石灰粉,能有效控制本病的蔓延。用消毒药每天消毒猪舍是控制本病流行最根本的办法,要注意选择有效的消毒药。

2.中草药疗法兹介绍3种有较好疗效并便于应用的处方。

处方一硼砂25克、冰片15克、枯矾15克、雄黄10克、青黛5克，共研细末，用管装药，吹入病猪口内，每天2～3次。

处方二金银花、连翘、大黄、生地、甘草各20克，花粉、山豆根、牛蒡子各15克，蝉蜕10克、黄连25克，水煎2次，分2～3次内服。此药量为100头猪的用量，用时可根据猪的头数，适量增减。

处方三煅石膏和百草霜各一半，研末，加少量食盐，涂布于病猪的蹄部烂斑或溃疡面上，能促进病损

的痊愈，明显缩短病程。

范文二：分子病毒学 口蹄疫病毒

口蹄疫的危害与防治

口蹄疫简介:

中文名称:口蹄疫

英文名称:foot and mouth disease;FMD

定 义:由口蹄疫病毒 (FMDV)所致急性、热性、高度接触性传染病。主要侵害偶蹄兽, 以发热、口腔黏膜及蹄部和乳房皮肤发生水泡和溃烂为特征,是国际兽疫局规定的 A 类传 染病,易通过空气传播,传染性强,流行迅速,偶尔感染人,主要发生在与患畜密切接触的 人员,多为亚临床感染。

应用学科:免疫学(一级学科) ;畜牧免疫(二级学科)

口蹄疫 Aftosa (属一类传染病)俗名“口疮” 、 “辟癀” ,是由口蹄疫病毒所引起的偶蹄动 物的一种急性、热性、高度接触性传染病。主要侵害偶蹄兽,偶见于人和其他动物。其临诊 特征为口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱。

概 述:

口蹄疫是猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度 接触性传染病,易感动物达 70多种。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性 疹。该病传播途径多、速度快,曾多次在世界范围内暴发流行,造成巨大政治、经济损失。 鉴于此,世界动物卫生组织(OIE )将其列为 A 类传染病之首。目前,有三分之二的 OIE 成 员国流行 FMD ,时刻威胁着无 FMD 国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。口蹄疫病毒属 于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。 其最大颗粒直径为 23纳米, 最小颗粒直径为 7— 8纳米。 目前已知口蹄疫病毒在全世界有七个主型 c A、 O 、 C 、南非 1、南非 2、南非 3和亚洲 1型, 以及 65个以上亚型。 O 型口蹄疫为全世界流行最广的一个血清型,我国流行的口蹄疫主要 为 O 、 A 、 C 三型及 ZB 型 (云南保山型 ) 。据观察,一个地区的牛群经过有效的口蹄疫疫苗注 射之后, 1— 2月内又会流行,这往往怀疑是另一型或亚型病毒所致。这是因为该病毒易发 生变异。该病毒对外界环境的抵抗力很强,在冰冻情况下,血液及粪便中的病毒可存活 120— 170天。阳光直射下 60分钟即可杀死;加温 85℃ 15分钟、煮沸 3分钟即可死亡。对酸碱 之作用敏感,故 1%一 2%氢氧化钠、 30%热草木灰、 1%一 2%甲醛等都是良好的消毒液。 特点 牛尤其是犊牛对口蹄疫病毒最易感,骆驼、绵羊、山羊次之,猪也可感染发病。本 病具有流行快、传播广、发病急、危害大等流行病学特点,疫区发病率可达 50%一 100%, 犊牛死亡率较高, 其他则较低。 病畜和潜伏期动物是最危险的传染源。 病畜的水疱液、 乳汁、 尿液、口涎、泪液和粪便中均含有病毒。该病入侵途径主要是消化道,也可经呼吸道传染。 本病传播虽无明显的季节性, 且春秋两季较多, 尤其是春季。 风和鸟类也是远距离传播的因 素之一。

症状 该病潜伏期 1— 7天, 平均 2— 4天病牛精神沉郁, 闭口, 流涎, 开口时有吸吮声, 体温可升高到 40一 41℃。发病 1— 2天后,病牛齿龈、舌面、唇内面可见到蚕豆到核桃大 的水疱, 涎液增多并呈白色泡沫状挂于嘴边。 采食及反刍停止。 水疱约经一昼夜破裂, 形成 溃疡, 这时体温会逐渐降至正常。 在口腔发生水疱的同时或稍后, 趾间及蹄冠的柔软皮肤上 也发生水疱, 也会很快破溃, 然后逐渐愈合。 有时在乳头皮肤上也可见到水疱。 本病一般呈 良性经过,经一周左右即可自愈;若蹄部有病变则可延至 2— 3周或更久;死亡率 1%--2%, 该病型叫良性口蹄疫。有些病牛在水疱愈合过程中,病情突然恶化,全身衰弱、肌肉发抖, 心跳加快、节律不齐,食欲废绝、反刍停止,行走摇摆、站立不稳,往往因心脏麻痹而突然 死亡,这种病型叫恶性口蹄疫,死亡率高达 25%~50%。犊牛发病时往往看不到特征性水疱, 主要表现为出血性胃肠炎和心肌炎,死亡率极高。

病理 除口腔和蹄部病变外, 还可见到食道和瘤胃粘膜有水疱和烂斑; 胃肠有出血性炎

症; 肺呈浆液性浸润; 心包内有大量混浊而粘稠的液体。 恶性口蹄疫可在心肌切面上见到灰 白色或淡黄色条纹与正常心肌相伴而行,如同虎皮状斑纹,俗称“虎斑心” 。

口蹄疫是由口蹄疫病毒感染偶蹄动物引起的一类动物的急性热性接触性传染病。 患口蹄疫的 动物出现高热、 跛行, 并在皮肤与皮肤粘膜上出现疱状斑疹等症状, 恶性口蹄疫会导致病畜 心脏麻痹并迅速死亡。

危 害

典型的口蹄疫的症状是发热,并在患病牲畜的口腔粘膜和乳房以及蹄部皮肤上出现水疱, 经过 12-36小时水疱破溃,局部呈鲜红色的糜烂面,患病动物此时体温升高、步态紧凑或者 跛行, 脉搏和呼吸增速, 奶量下降, 体质下降, 严重患畜的心脏遭受损害, 心脏衰竭而死亡。 此病潜伏期短,通常为 2-3日,也有长达 7天甚至两周。由于此病毒生命力较强,可通过接 触、空气、进食等途径导致病毒传播,因而传染范围大,传播速度快,引起暴发流行,因此 引起有关部门的高度重视。

最易患口蹄疫的动物是黄牛、水牛、猪、羊、骆驼、鹿等;黄羊、野牛、野猪等野生动物也 易感染此病毒而发病;老鼠、家兔虽不是偶蹄动物,但也是此病的高发种群,可见,多种偶 动物特别是饲养的家畜易得病

防治基本方法

常规防治方法

(1)预防病畜疑似口蹄疫时,应立即报告兽医机关,病畜就地封锁,所用器具及污染地面 用 2%苛性钠消毒。确认后,立即进行严格封锁、隔离、消毒及防治等一系列工作。发病畜 群扑杀后要无害化处理, 工作人员外出要全面消毒, 病畜吃剩的草料或饮水, 要烧毁或深埋, 畜舍及附近,用 2%苛性钠、二氯异氰豚酸钠 (含有效氯≥ 20%)、 1%~2%福尔马林喷洒消毒, 以免散毒。 接种。 对疫区周围牛羊, 选用与当地流行的口蹄疫毒型相同的疫苗, 进行紧急接 种,用量、注射方法、及注意事项须严格按疫苗说明书执行。

(2)治疗病初,即口腔出现水泡前,用血清或耐过的病畜血液治疗。对病畜要加强饲养管 理及护理工作, 每天要用盐水、 硼酸溶液等洗涤口腔及蹄部。 要喂以软草、 软料或麸皮粥等。 口腔有溃疡时,用碘甘油合剂 (1:1) 每天涂搽 3~4天,用大酱或 10%食盐水也可。蹄部病 变,可用消毒液洗净,涂甲紫溶液 (紫药水 ) 或碘甘油,并用绷带包裹,不可接触湿地。 空间电场自动防疫方法

对于设施以及牧场养殖动物的疫病, 可利用空间电场生物效应进行实时预防。 设置于环境 安全型畜禽舍和牧场饲养空间的空间电场能够从三个方面满足动物疫病的实时预防,

空间电场自动防疫原理

(1) 空间电场电极系统电离空气产生微量的臭氧和硝酸气 (二氧化氮) , 而臭氧可杀死空 气中的微生物,硝酸气又对口蹄疫病毒具有专杀性,口蹄疫病毒耐火碱、生石灰但对 pH 值 2~5的酸性物质抵抗力极弱,硝酸气可轻易使其失活。

(2)空间电场可以实时降低空气病原菌浓度。空间电场实际上是与静电场相似,只是适 用于防疫的空间电场发生设备的输出电压、 电流设置在对人畜安全的范围内, 因此, 它具有 静电场的空气净化能力, 可以将畜禽舍内的空气微生物浓度至少降低原始的一半之多, 进而 降低传播风险。

(3)空间电场可实时进行空气净化和臭气消解。偶蹄类动物生活环境中会有大量的粉尘 或可吸入颗粒物以及氨气等恶臭气体, 这些污染物会引起肺部感染、 结膜发炎, 进而继发多 种疾病, 而在空间电场却能够依据静电力去除空气颗粒物, 并通过电离空气又能将恶臭气体 分解为无害的小分子。 空间电场自动防疫方法主要用于集约化畜牧养殖领域的环境安 全建设, 确保动物免遭突发性烈性疫病的传播, 最大限度降低兽药的使用, 确保养殖环境的 生物安全。

范文三：猪口蹄疫病毒怎么治疗

猪口蹄疫病毒怎么治疗

猪口蹄疫病毒怎么治疗？猪口蹄疫病毒属于小RNA病毒科(picornaviridae)口疮病毒属(aphthovirus)，有7个血清型（O、A、C、 Asia1(亚洲1)、SAT1(南非1)、SAT2(南非2)和SAT3(南非3)），型间无交叉保护。每个血清型内有许多抗原性有差别的病毒株，相互间交叉免疫反应程度不等。口蹄疫病毒呈球形，无囊膜，粒子直径28～30nm，放大150万倍似小米粒大小。完整的病毒由衣壳包裹一个分子的RNA组成，分子量为6.9×106。电镜下可见病毒中心是紧密团集的RNA，外裹一层约5nm薄的衣壳。衣壳呈二十面体结构，由4种结构蛋白各60个分子组成。猪口蹄疫病毒怎么治疗？其实这种病毒并不可怕，现在已经有治疗好此病的药物出现了。使用5号血抗是可以杀灭这种病毒的。具体用法如下： 猪口蹄疫病毒怎么治疗？用5号血抗（香港奥邦）200斤/瓶配合头孢使用。，如果温度40度以上，用纯中药（柴胡）分点注射退烧。为避免应激需添加地米一同注射，添加量：4--5mg/200斤。这种治疗方案经过了大量的临床实验，疗效显著，凡是用过的养殖户都交手称赞，请放心使用。

范文四：检测口蹄疫病毒抗原的方法

检测口蹄疫病毒抗原的方法

(一)口蹄疫反向被动红细胞凝集试验(反向被动血凝)

红细胞膜具有吸附抗原或抗体的特性, 将提纯的口蹄疫抗体 (IgG ) 在 pH4.0醋酸缓冲液中致敏绵羊红细胞, 当这种被致敏的红细胞 (即红细胞表面均带有口 蹄疫抗体) ,遇到相应的口蹄疫病毒抗原时,便产生抗原抗体的特异性反应,从 而使红细胞发生肉眼可见的凝集现象。该法快速、简便、准确、可同步鉴定出口 蹄疫毒型和鉴别口蹄疫、猪水泡病病原。

1.试验材料

V 型 96孔 130o 血凝滴定板、玻璃吸管(1毫升、 5毫升规格) 、玻璃中试管 (内径 15毫米,长度 100毫米) 、试管架、微量振荡器、微量移液器、塑料咀、 玻璃板(与血凝板大小一致) 、口蹄疫 O 、 A 、 C 、 Asia-I 型、 SVD (猪水泡病) 反向被动血凝诊断试剂及其配套用的口蹄疫各型、 猪水泡病阳性抗原、 阴性抗原、 稀释液、待检抗原。

2.试验方法

(1)稀释待检抗原 取中试管 8支,横列于试管架上,每管各加入稀释液 1 毫升, 取待检抗原 1毫升加入第 1管混匀后从中取出 1毫升加入第 2管, 混匀后 取 1毫升加入第 3管??直至第 8管,此时待检抗原的稀释度依次为 1:6、 1: 12、 1:24、 1:48、 1:96、 1:192、 1:384、 1:768。

(2)稀释阴性抗原 取中试管 1支用记号笔标明“阴抗”字样,加入稀释液 390微升,加入阴性抗原 10微升,充分混匀,此时阴性抗原的稀释度为 1:40。 (3)稀释阳性抗原 取中试管 20支,横列于管架标明“阳抗”字样,每排 4支, (O 型 4支、 A 型 4支、 C 型 4支、 Asia-1型 4支、 SVD4支) 。每种阳抗第 1管,加稀释液 4.7毫升,第 2~4管各加稀释液 0.5毫升。取 O 型阳性抗原 0.1毫升 (100微升 ) 加入第 1排的第 1管中混匀后取出 0.5毫升,加入第 1排的第 2管并充分混匀, 取出 0.5毫升加入第 1排的第 3管混匀后取出 0.5毫升加入第 1排的第 4管并混匀。

其他阳性抗原均按上法稀释, 注意每稀释一种阳抗必须更换 1支吸管, 切勿 混杂以免影响反应的特异性。 经过上述稀释, 各阳性抗原的稀释度依次为 1:48、 1:96、 1:192和 1:384。用于阳抗对照孔的只加第 4管(1:384)的阳抗。 (4)滴加待检抗原和对照抗原 取第 8管稀释的待检抗原(1:768)加入血 凝滴定板上的 1~5排的第 8孔,每孔 50微升,取第 7管待检抗原(1:384)加 入 1~5排的第 7孔, 取第 6管待检抗原 (1:192)加入 1~5排的第 6孔??直至 第 1孔,每孔均为 50微升。 1~5排的第 10孔加入 1:40的阴性抗原,每孔 50微升。 1-5排的第 11孔依次加入 O 、 A 、 C 、 Asia-1型和 SVD1:384稀释度的阳 性抗原,每孔 50微升(即第 1排的第 11孔加 O 型抗原;第 2排的 11孔加 A 型 抗原;第 3排的 11孔加 C 型抗原;第 4排的 11孔加 Asia – 1型抗原;第 5排的 11孔加 SVD 抗原) 。 1-5排的第 12孔各加稀释液 50微升作为稀释 液对照。 (5)滴加反向被动血凝诊断液 血凝板上的第 1排 1~8孔和 10~12孔加 O 型诊断液,每孔 25微升。第 2排 1~8孔和 10~12孔加入 A 型诊断液,每孔 25微升。第 3排 1~8孔和 10~12孔加入 C 型诊断液,每孔 25微升。第 4排 1~8孔

和 10~12孔加入 Asia-1型诊断液,每孔 25微升。第 5排 1~8孔和 10~12孔加 入 SVD 诊断液,每孔 25微升。

(6)振荡血凝板 加毕诊断液后,立即将血凝板置于微量振荡器上,中速振 荡 30秒,取下血凝板放在白纸上观察各孔的红细胞是否均匀悬浮,孔底应无红 细胞沉淀, 若全部或部分孔底尚有红细胞沉积, 应继续在振荡器上振荡, 直至充 分混匀为止。

(7)室温下静置 将混匀的血凝板,盖上玻璃板后静置 2小时,判定检测结 果,若对照孔红细胞沉降不清晰或因故来不及判定,也可静置第 2天判定。 3. 判定标准

先观察血凝板上 1~5排的 10~12孔,每排的第 10孔为阴性抗原对照孔,应 无凝集现象,红细胞应全部沉入孔底,形成边缘整齐的小圆点;每排的 11孔为 阳性抗原对照孔,应出现“ ++” ~“ #”的凝集现象(即有 50~100%红细胞发生 凝集,红细胞悬于孔中,不沉入孔底) ,证明所加的反向诊断液效价不低于 1: 384,用于检测抗原合格;每排的第 12孔为稀释液对照孔,也应无凝集现象,红 细胞应全部沉入孔底,形成小圆点。

在上述对照孔判定合格的前提下,仔细观察血凝板上的 1~5排的 1~8孔,某 排 1~8孔或 1~6孔均有 “ ++” ~“ #” 凝集现象, 而其余 4排仅在 1~2孔出现 “ +” ~“ ++”的凝集,即可判定该份待检抗原为阳性。其型别与所加的反向诊断液的 型别相同。 比如第 1排 1~8孔出现 “ ++” 以上的红细胞凝集, 第 2~5排无此现象, 便可判定该待检抗原为 O 型口蹄疫。

以出现“ ++”以上凝集的待检抗原最大稀释度为其抗原滴度。例如第 1排的 1~4孔出现“ #”凝集,第 5孔出现“ +++”凝集第 6孔出现“ ++”凝集,第 7孔 出现“ +”凝集,第 8孔无凝集现象,即判定该待检抗原为 O 型,滴度为 1:192 (以第 6孔出现“ ++”凝集为滴度的终点) 。

4.注意事项

(1)勿用 90o 和 110 o血凝板,防止误判。

(2) 阴性抗原、 阳性抗原和稀释液 3孔对照全部或部分出现不合格时, 检测 结果不能判定,应更换试剂重新检测,以免错判。

(3)严重腐败变质的病料不宜检测,以防非特异反应。

(4)病料太少,无法检测时,可制成 1:10或 1:20悬液,先接种 3~5日龄 小白鼠,连传 3代后,用鼠组织制成待检抗原,再进行检测。

(5)检测过程中,有时出现前带现象,即第 1孔或第 2孔的红细胞沉淀形成 小园点, 第 3孔以后又出现 “ ++” 以上的凝集, 这是因为抗原抗体比例失调所致, 不影响结果判定。

反向被动红细胞凝集试验的诊断液及其配套试剂由中国农科院兰州兽医研 究所供应。

(二)口蹄疫微量补体结合试验

补体的作用是无特异性的,它能与任何一组抗原抗体复合物结合并不再游 离。但不能单独与抗原或抗体结合。当抗原与其相应的抗体结合成复合物之后, 可与补体结合, 但这种反应不能用肉眼观察。 如果抗原是红细胞与其相应抗体 (溶 血素)形成复合物后,当有补体存在时,红细胞就发生溶血;如补体已被其他抗

原抗体复合物结合, 则不溶血。 这种现象用肉眼是可以观察到的。 因此利用溶血 反应作为指示剂, 以检验补体是否已被前一种抗原抗体系统所结合, 这种试验叫 做补体结合试验。 前者称为溶菌系统或试验系统, 后者称为溶血系统。 如果溶菌 系统的抗原抗体是相应的,则补体被结合,加入溶血系统后不发生溶血。反之, 二者不对应,则补体游离,加入溶血系统后发生溶血。所以在补体结合试验中, 溶血判为阴性;不溶血则判为阳性。

操作步骤如下:

1.测定溶血素效价

(1)取试管 10支列于管架上, 1~10管内各加生理盐水 0.5毫升

(2)取溶血素 0.2毫升加生理盐水 9.8毫升 =1:100 的溶血素。

(3)取 1:100的溶血素 1毫升加生理盐水 4毫升 =1:500溶血素。

(4)取 1:500的溶血素 0.5毫升 加入第 1管混匀并取出 0.5毫升加入第 2管混匀,并取出 0.5毫升加入第 3管??以此类推,直至第 8管。并取出 0.5毫升弃去, 1~8管的溶血素稀释度依次为 1:1 000~1:8 000,第 9、 10管为对 照管。

(5)将补体(豚鼠血清)用生理盐水稀释成 1:10, 1~9管各加 0.5毫升, 第 10管不加补体而加 1:500的溶血素 0.5毫升。

(6)将洗净的红细胞沉淀用生理盐水配成 2%浓度, 1~10管各加 0.5毫升。

(7)每管充分混匀置 37℃水浴中作用 20分钟后判定效价。

(8)以出现完全溶血的溶血素最大稀释度为其效价。

溶血素效价滴定表(剂量毫升)

试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

生理盐水 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

1:500溶血素 0.5

补体 (1:10) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5(1:500

溶血素 )

红细胞(2%) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

37℃ 20分钟

判定效价 — — — — + ++ +++ ###

按此表滴度结果,该溶血素效价=1:4 000,工作浓度为效价的 4倍即 1:1 000。 1. 测定补体效价

溶血素效价被测出后,即可滴定补体效价。新鲜补体或冻干补体被稀释后, 容易失效,宜用 10% NaCl保存,即补体 1份十 10%Nacl 1份,混合后置 4℃或 -20℃贮存有效期 2~3个月。

取保存补体 2毫升加生理盐水 8毫升 =1:10的补体。

按下表程序及剂量进行滴定。

补体效价滴定表 (剂量 :毫升)

试管号 1 2 3 4 5 6 7

8

生理盐水 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4

补体 (1:10) 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 溶血素(工 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

作浓度)

红细胞 (2%) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 37℃ 30分钟

判 定 — — — + ++ +++ # #

以出现完全溶血的补体最大稀释度为其效价。

按此表测出的该补体效价为 0.35,工作浓度为 0.45。

以上 A 和 B 两步骤称为预备试验,溶血素一般半年滴定一次。而补体则必须 在每次试验前滴定,如果补体效价不准确,将会影响试验的结果。

3.将标准血清(已知阳性血清)用生理盐水稀释成 1:4(阴性血清 1毫升 加生理盐水 3毫升) 。标准血清的补反效价必须达到 1:80以上) 。

4.在 96孔或 24孔 U 型微量滴定板上, 1~5排的 1~7孔,各滴 2滴(约 50微升)生理盐水,半小时后弃去,以防板孔对反应成分的非特异吸附。

① 将待检抗原稀释成 1:3、 1:6、 1:12和 1:24,分别滴入 1~5排的 1~4孔,每孔 1滴(约 25微升) 。

② 第 1-5排的第 5孔滴入阴性抗原各 1滴; 1~5排的第 6孔依次分别滴入 O 、 A 、 C 、 Asia-I 型和 SVD 阳性抗原 1滴, 1~5排的第 7孔各滴入盐水 1滴 , 作为阴 性、阳性和盐水对照。

③ 1~5排的 1~4孔依次分别加入 O 、 A 、 C 、 Asia-I 型和 SVD 标准清 1滴 (25微升) 。

④ 1~5排的 1~7孔各加补体工作浓度 2滴(50微升) 。

⑤ 微量振荡器上振荡 1分钟, 37℃温箱保温 40分钟。

⑥ 每孔各加溶血素工作浓度 1滴。

⑦ 每孔各加 2%红细胞 1滴。

⑧ 振荡器上振荡一分钟, 37℃温箱 30分钟后判定结果。

5.判定标准:先检查对照孔,第 5和第 7孔应完全溶血为合格;第 1~5排 的第 1~4孔中任一孔呈现不溶血则判该份待检抗原为阳性, 其型别与所加标准血 清的型别相同。

该法操作较繁琐,敏感性低,但特异强。

(三)口蹄疫酶联免疫吸附试验(ELISA )

八十年代以来,国外常采用 ELISA 鉴定口蹄疫和猪水泡病病毒。国内也有人 试用该法对 FMDV 和 SDV 进行检测,由于 IgG 的纯度不高,经常出现非特异性反 应。影响检测的准确性,使推广应用受到限制。

ELISA 技术虽然多种多样,但一般以双抗体夹心法居多。用最适浓度抗口蹄

疫血清的 IgG 包被酶标板孔 4℃过夜,经洗涤后加入待检抗原 37℃保温 1小时, 洗涤后再加辣根过氧化物酶标记的兔抗豚鼠血清的 IgG 37℃保温 1小时,洗涤

后加底物溶液(邻苯二胺和 H 2 O

2

) , 30分钟后用 2M H

2

SO

4

中止反应, 751型分光

光度计 492nm 测定光密值或在酶标检测仪上直接测定。阳性 OD 值为 0.7~0.9; 阴性 OD 值为 0.1~0.3。

(四)免疫荧光直接检检测口蹄疫带毒肉品的操作方法

1.试验材料

(1)荧光显微镜及自动照相装置 1台

(2)冰冻组织切片机 1台

(3)电热恒温箱 1台

(4)玻璃染色缸 2具

(5)玻璃片 5盒

(6)组织切片盒 2个

(7)抗体(O 型、 A 型、 Asia-I 型、 SVD 等 4种)

(8) 0.01MpH7.2~7.4的 PBS

(9) 丙酮

(10) 伊文斯兰(万分之二浓度)

2.操作方法

(1)剥离淋巴结周围的脂肪及被膜,将淋巴结剪成长 1.5~2cm , 宽 0.8~1cm 厚 0.3~0.5cm 的组织块。

(2)在冷冻组织切片机上,低温切成 5~6微米的薄片,每份淋巴结切片 8张,迅速粘贴在洁净的载玻片上,并用记号笔编号。

(3) 冷丙酮固定(室温下 20分钟或在 4℃下 30分钟) 。

(4) 0.01MpH7.2~7.4 PBS 漂洗 3次,每次 1分钟,用滤纸吸去样品周围水 份,切勿碰损样品,再用吹风机吹干样品。

(5)滴加荧光抗体工作液,以复盖样品为度,置温盒 37℃温箱保温 30分 钟。

(6) PBS 洗 3次,滤纸吸水并吹干。

(7)荧光显微镜下观察。

3.判定标准

(1) 先判定已知阴性淋巴结切片染色结果, 仅见组织细胞的轮廓, 应无翠 绿色光点出现,或见少数(视野内少于 5个)橙黄色小点,视为合格。

(2)细胞质内出现成堆的有时呈放射状翠绿色亮点,判为“ #” ;胞质内出 现 5个以上翠绿色荧光点为“ +++”胞质内出现 2~3个绿色荧光点为“ ++” ;视野 中仅见 1~2个绿色荧光点为“ +” ,未见任何荧光点则为“—” 。

(3)出现“ ++”以上(含“ ++” )的荧光判为阳性, “ +”判为可疑, “—” 为阴性。

4. 注意事项

(1)根据本地及邻近地区的疫情,认为有必要时,每份样品应切片 8张, 每种荧光抗体染色 2张切片进行观察。 无必要时, 每份样品只切 2张, 用 O 型荧 光抗体染色亦可。

(2)每次检测应选 1~2份阴性淋巴结在相同条件下切片染色和观察,以作 阴性对照。

(3)每次均应照相保存,以备查考。

(4)为慎重判定起见,检出的阳性样品应冻结保存,并应接种 3~5日小白 鼠盲传 2~3代,每代 72小时扑杀,注意观察症状,最后反向间接血凝诊断液复 检判定。

(5)采集的淋巴结应新鲜(冻肉内的淋巴结亦可) ,避免反复冻融,尽量保 持样品细胞的完整性。腐败变质的淋巴结不宜检测。

(6) 荧光染色前, 可用万分之二的伊文斯兰染液, 浸染 1分钟, 立即以 PBS 洗 3次,可降低样品自发荧光的强度。

范文五：口蹄疫病毒基因组结构及功能

沧州师范专科学校学报23 卷第4期 No.4 Vol.23 第

2007年 12 月Dec.2007Journal of Cangzhou Teachers’College

口蹄疫病毒基因组结构及功能

孙 靖,于海峰

,吉林大学农学部 畜牧兽医学院,吉林 长春 130062,

摘 要,口蹄疫病毒的基因组结构和功能是开展口蹄疫研究工作的基础。口蹄疫病毒的基因组 5’U由TR、

ORF 和 3’UTR 及 Poly(A)组成,全长约 8500nt。本篇对基因组结构和功能作详细叙述。

关键词:口蹄疫病毒;结构;功能;基因组

中图分类号,S852.65文献标识码:A 文章编号:1008-4762(2007)04-0116-03

[2]才最适于生存。一般认为 VPg 在病毒 RNA 开始复制时起重 口蹄疫,Foot-and-mouthdis ease,FMD,是由口蹄疫病毒

引起偶蹄动物的最烈性传染病之一,可引起世界性的大流行并 要作用,同时参与病毒装配,只有在病毒RNA 与 VPg 结合后, 造成巨大的经济损失,严重影响人民的生活与畜牧业发展,同 才能够被装入病毒[1]。因此,只要 VPg 保 持完整,就会形成

具有感染性的病毒粒子。3B 基因由 3 个重复的紧密相关的基 时对国际贸易也造成重大影响,在国际上被称为政治经济病。

口蹄疫病毒,Foot-andmouth diseasev iruse,FMDV,属小R NA 因组成,编码 VPg1(3B1)、VPg2(3B2)V和P g3(3B3),分别由 -

病毒科、口蹄疫病毒属,该基因为单股正链无囊膜RNA 病毒, 23,24,24个 氨基酸组成。以酯键共价结合到正链和负链RNA 其宿主范围广,遗传变异率高,抗原差异大,现已有7 种血清 的 5，端 pUpU上形成 VPg-pUpU 结构,结合在新合成的正链

型,A、O、C、AsiaI、SAT1、SAT2、SAT3,和百余种血清RNA5，端的 VPg可能是 一个包装信号。 FalkMM等 (1992)通亚型并且每年还有为数众多的新变异株出现,血清型间无交叉 过对 VPg编 码区基因的一系列突变研究证实,这些突变会干扰 免疫现象。即使是免疫动物在接触新病毒后,也可形成隐性感 VPg与病毒 RNA 结合和水解过程。

2.2 非翻译区染而持续带毒,在免疫和非免疫条件下病毒均可适应机体而长

5，-UTR 约含 1300个碱基。 S 片段由 360个 碱基组成, 期存在。FMDV的这 些特性给 FMD 的防治带来了很大困难。[3]可形成一个长茎环结构(setm-loop) 。 BunchT 等(1994)认为S 1 形态特征和理化特性

片段对维持基因组的功能不是十分重要,但其具体功能未知。 口蹄疫病毒是已知最小的动物病毒之一,病毒的直径为

由其它小 RNA 病毒基因组的研究推测,在病毒感染宿主细胞 20,25 nm,呈大致的圆形或六角形。在负染标本中,可见衣

后,S 片段可能维持病毒 RNA 基因组结构的稳定,并有利于 壳由 32 个壳粒组成。成熟的病毒粒子约含 30,RNA,其70余 [1][4],为蛋白质,分子量约为 2.6×106,2.8×106。FMDV的 完整 基因组的复制。有报道认为,S片段可以 影响病毒的致病性, 粒子的衣壳由 1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)和1D (VP1)四种结 但目前还没有直接的证据证明该观点。 构蛋白各 60 个分子组成。装配过程中的前衣壳(75S)和14S 颗 S 片断下游是约 400bp的 Poly(C)序列。Poly(C)片段几乎 粒均由 1AB(VP0)、1C和 1D3 三种蛋白质构成。口蹄疫病毒裂 全部由胞嘧啶组成,约占 90%,仅有少量的U 与 A,大部分形 解时产生的 12S 的蛋白亚单位由 1A、1C 和 1D 三种蛋白质各 成二、三级结构,Poly(C)的长短因毒株不同而有很大的差异。 [5]5 个分子组成。1 个蛋白亚单位构成病毒粒子二十面体的一个 Harris 和 Brown对病毒株 Poly(C)区研究发现 Poly(C)的长短与 面。 病毒的毒力有关,缺失 Poly(C)的 cDNA 不具有感染性。也有

2 基因组结构特点研究表明, Poly(C)长度达到 60个 C 残基时(与自然分离株的 FMDV 基因组是单股正链 RNA,呈线状,全长约 8.5kb, 长度相当)才能产生感染性病毒粒子。EscarmisC(1992F)将MD V由 5，端非编码区、开放阅读框(ORF)、3，端非编码区和Poly (A) 在 BHK21 细胞上连续传 100代后 ,发现 Poly(C)增加了 145bp ,组成。5，端非编码区含有S 片段、poyl(C)、功能未知区和内 并对小鼠和牛的致病力大大降低。由此可见,FMD的V Poly(C) 部核糖体进入位点等。ORF 由 L 基因、P1 结构蛋白基因、及其长度可能与病毒 RNA 毒力有关。 Poly(C)结构下游存在一P2、 P3 非结构蛋白基因组成,共同编码一聚合蛋白。 系列假节结构,其功能目前还不

清楚。假结结构的下游有一个发夹结构,该结构是一个顺式复2.1 VPg[6] 制元件(cis-actingreplicativeelement,cre)。cre 是在研究人的 鼻不同的口蹄疫病毒株具有三种不同的VPg 。资料表明,VPg

病毒和脊髓灰质炎病毒的基因组中发现的,该结构为一茎环 基因相当稳定,只有在3 个 VPg 基因都编码的情况下 FMDV

* 收稿日期,2006-05-08

sequence of foot-and-mouth diseasevirus RNA to the 5，必然联系。O/TAW/97基因工程缺失3A病毒在BHK和猪细胞中

也有RNA合成的部分降低,经过改造后的毒株在所有类型细胞 side of the poly (C) tract. Gene,1985,40,331-336.

[4]Barton D J,O.Donnell B J,Flanegan J B.clover leafinpolio 中病毒RNA复制机制可能受损。3A、3AB是重要的RNA复制因

子,与细胞内膜密切相关。3C蛋白是病毒的一种蛋白酶,能单virus RNAi sacis-acting replication element required for 独发挥作用,具有催化病毒聚合蛋白裂解和宿主蛋白裂解的作 negativeste rand synthesis [J].E MBOJ,2001,20:1439-用。3C可以催化聚蛋白的次级裂解在,P1、P2和P3内发挥裂解 1448. 作用。同时,3C也可能抑制宿主细胞基因正常转录。3D为RNA [5] Harris,T.J,Brown,F. Biochemical analysis of a virulent 依赖的RNA聚合酶,催化病毒RNA的合成。3D编码区相对保

and anavirulent strain of foot-and-mouth disease virus. 守。病毒以VPg为引物,以3D为RNA聚合酶,以3A、2B、2及C

一些宿主蛋白形成复制复合体,附着在胞质内膜结构上合成负 [J]. Gen. Virol. 1977,(34):87-105.

NucleicAcidsRes.链RNA,再以负链RNA为模板合成正链RNA。VP0、VP1和VP3 picornavirus[J].[6] Forss,S.,Schaller,H.,A tandem repeat gene in a 各一分子组装成一个非对称的原体,5个原体形成一个五聚体, 1982,(10):6441-6450.

12个五聚体包裹新合成的正链RNA形成一个病毒粒子,VP0自 [7] Mc Knight,K.L.,Lemon,S.MC. apsid coding sequence is

required for efficient replication of human rhinovirus 我裂解为VP2和VP4 ,从而完成病毒粒子的包装成熟过程。

2.4 非结构区14 RNA. J.Virol.1996,(70): 1941-1952. ORF 下游 3，-UTR 序列可自身折叠成茎环结构。3，-UTR [8] Mc Knight,K.L,Lemon,S.M. The rhinovirus type 14 中存在病毒复制所需的基序,对病毒基因组的复制有重要作 genome contains an internally located RNA structure that 用,复制过程中 3，-UTR 可以结合很多病毒复制相关蛋白。

is required for viral replication. RNA .1998, (4):1569-Gutierrez等利用 3，-UTR 的反义 RNA 干扰 FMDV 的实验证

1584. 明,感染 FMDV 的细胞中病毒的翻译没有受到影响,但FM DV

基因组的复制却明显受到抑制。如果缺失了3， -UTR,FMDV [9] Falk,M.M.,Sobrino,F. VPg gene amplification correlates 的翻译效率会明显下降,在转染细胞中也不能获得活的病毒。 with infective particle formation in foot-and-mouth 用 SVDV 相应区段替代 3，-UTR,病毒也不能获得活病毒。 disease virus. J. Virol. 1992,(66): 由此证明,3，-UTR 对 FMDV 具有特异性,3，-UTR 的删除 2251-2260. [10]张显升,赵启祖,刘在新,等.口蹄疫病或替换会降低或消除病毒的感染性和复制能力。

毒基因组内部核 2.5 Poly(A)尾巴

E,FullkrugR,etal.Function3，-UTR 下游是长度不一的 poy(lA)结构。Poly(A)尾与病 [11]C糖aoX体进入位点一级和,Bergmann二级结构分析[J].病毒学报,2002, I alanalysis of the two alter native translation in毒的感染性有关,Poly(A)越长感染性越强。Potor等 分析了 5 18(2):14-22.

itiation sites of foot-and-mouth disease virus[J].J 种血清型 FMDV Poly(A)的侧翼序列发现 Poly(A)上游的 20bp

具有 75%的同源性。Poly(A)共价连接于细胞的 mRNA和异质 Virol,1995,69:560-563.

核 RNA 的 3，末端,小 RNA 病毒在复制期间以它们的负链 [12] Piccone M. E,Rieder E,MasonP W,et al.The foot-Poly(U)为模板合成正链的 Poly(A)尾巴。GrubmaMnJ(1979)认 and-mouth disease virus leader protein ase gene is not 为 Poly(A)尾巴具有起始R NA 的合成和保护 mRNA 免受细胞 required for viral replication[J].J Virol,1995,69:5376-核酶降解的作用。

5382. 3展望

FMDV 基因组是开展其结构与功能研究的前提条件,只有[13]Guarne A.HampoelBz .G laser W.,et al. Structural and 了解基因组的组成,才能更深入地进行序列比较、基因功能、 biochemical features distinguisht he foot-and-mouth diseas毒力演变、基因组调控元件、高级结构与表型关系以及复制和 virus leader proteinase from other 翻译机制的研究。在充分认识 FMDV 基因组的基础上,可以 papain-likeenzymes[J].JMoliol,2000,302:1227-1240. 通过敲除致病基因构建 FMDV 载体;FMDV 核苷酸特别是 1D

[14]Kitson J D A,Mc Cahon D,Belsham G J. Sequence analysis of 基因的序列比较,可作为 FMD 流行病学分析,疫情监测及预

monoclonal antibody resistant mutants of type O 报的有效手段,同时,FMDV 基因组的研究可为基因工程新型

疫苗研制奠定坚实的基础。 foot-and-mouth disease virus: evidencefor the in

volvement of the three surface exposed capsid proteins 参考文献:in four antigenic sites[J].Virology,1990, [1] 殷震,刘景华.动物病毒学,第二版,[M].北京,科学出 版179:26-34. [15]雷连成,陈伟,韩文瑜,等.家畜口蹄疫社,1997,645-652. 研究进展[J].中 [2] 刘庆军.口蹄疫病毒基因组的结构及其功能[J].动物医学 进[责任编辑,尤书才] 国预防兽医学报,2001,23(4):316-319. [16]徐为燕.兽展,2005,26,1,,1-5. 医病毒学[M].北京:农业出版社,1993:56-59. [3] Newton,S.E,Carroll,A.R.Campbell,R.O et al.The

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