酱油爆鱼
范文一：配体—受体相互作用与识别的研究
配体—受体相互作用与识别的研究
北京工业大学
硕士学位论文
配体?受体相互作用与识别的研究
姓名:于永辉
申请学位级别:硕士
专业:流体力学
指导教师:王存新
2003.5.1摘要
摘 要
近年来,用计算机来模拟生物分子的相互作用与识别已经受到了相当大的
关注。在众多的模拟方法中,分子对接已成为其中非常重要而又受到广泛应用
的方法之一。所谓分子对接就是已知两个分子的三维结构,考察它们之间是否
可以结合,并预测复合物的结合模式。通常热力学上认为生物分子的稳定构象
是自由能最低的构象,因此,分子对接的目的就是找到能量最低的构象。分子
对接包含两个方面,一是快速有效的搜索算法,可以在可能的空间进行构象搜
索:另一个是好的打分函数,能够在合理的时间内正确有效地从搜索到的结
构
中区分出近天然构象。
本论文的主要研究内容如下:
.采用本组在和的刚性对接算法基础上改进的半柔性对接
算法,以种蛋白质一蛋白质复合物体系为例,我们研究了如何正确有效地从 对接采样中挑选出近天然构象的方法。比较了不同的能量打分函数、能量优
化
以及分子动力学模拟方法对区分近天然构象的作用。
在对接结构的过滤中,采用三重过滤技术,来筛选合理的结合模式, 用静电能蛆。、去水化自由能?。。以及范德华能丝。的不同组合对 这些结构打分以获得近天然结构,并进而评价这些能量项组合在区分近天然
构
象方面的能力。结果发现结合自由能函数?。?。口?。有比较强的 区分近天然构象的能力。
同时,对对接结构进行能量优化后再打分,发现
有助于打分函数挑选到距蛋白质晶体结构主链原予的均方根偏差较 小的近天然构象。
研究还发现模拟方法有助于进一步区分近天然构象。以两种蛋白 质复合物为例,对其候选结构进行模拟,根据轨迹中构象相对于初始摘要 北京工业大学工学硕士学位论文
构象的平方平均偏差随时间的变化来辅助打分函数排除错误构象,得
到了较好的结果。
.用软件模拟脑灌注显像剂”“.的不同的异构体与谷 胱甘肽的对接,拟获得二者的初步结合模式,从分子水平和理论计算
上对二者的识别机制以及‰.的立体构型差异对其滞留效应的影响
进行了讨论。
关键词: 分子对接;能量优化:打分函数:分子动力学模拟;近天然构象
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?第章绪论
第章绪论
.研究配体.受体相互作用的背景和意义
美国人类基因组计划实施五年后的总结报告中,对生物信息学
硼作了以下定义:生物信息学是一门交叉科学,它包含了生物
信息的获取、处理、存储、分发、分析和解释等在内的所有方面,它综合运用
数学、计算机科学和生物学的各种工具,来阐明和理解大量数据所包含的生物
学意义。当前,基因组信息学、蛋白质的结构模拟以及药物设计有机地连接在
一起,它们是生物信息学的三个重要组成部分“。生物信息学目前已在理论生
物学领域占有了核心地位,它在生物、医药、农业、环境等学科的应用已无所
不在。随着快速序列测定、基因重组、多维核磁共振、同步辐射、机器人等
技
术的应用,生物学实验数据呈爆炸趋势增长,同时计算机和国际互联网络的发
展使对大规模数据的贮存、处理和传输成为可能。现在某一实验室的研究成果
一经进入生物信息网络便为全球科学共享。生物信息学作为一门新的学科领
域,它是把基因组序列信息分析作为源头,在获得了蛋白质编码区的信
息之后进行蛋白质空间结构模拟和预测,然后依据特定蛋白质的功能进行必要
的药物设计。
功能蛋白组学?作为生物信息学的一个分支,主要研究蛋白同源性分析、
功能类比、分类;蛋白组表达谱及分析;蛋白间相互作用:蛋白质功能;蛋白
组平台的药物筛选及相关研究。
配体一受体相互作用,在许多生理过程中起着重要的作用,如信号传递、
生理调节、基因转录和酶催化反应等”。配体一受体相互作用包括:生物大
分子.生物大分子相互作用,如蛋白质.蛋白质、蛋白质.、抗体.抗原等;
小分子.生物大分子相互作用,如药物.蛋白质、药物.、神经递质一受体蛋北京工业大学工学硕士学位论文
白等。
关于受体学说,可以追溯到、和等人的工作。’“。
早期受体概念为药物在体内作用的位点,即药物作用“靶标”,现在受体概念
已推广到生物大分子上特定的结合部位拍,酶、离子通道和核酸等生物大分
子
均可作为药物的受体。
蛋白质问相互作用存在于机体中每个细胞的生命活动过程中,生物学中的
许多现象,如基因的复制、转录、翻译和遗传密码的分析与破译以及细胞周期
调控、信号转导和中间代谢等,均受蛋白质间相互作用的调控。某些蛋白质由
多个亚单位组成,它们之间的相互作用就显得更为普遍。有些蛋白质结合紧密,
而有些蛋白质只有短暂的相互作用。然而不论哪种情况,它们均控制着大量的
细胞活动事件,如:细胞的增殖、分化和死亡。在细胞衰老过程中蛋白质合成
会有一系列变化:大多数蛋白质合成速度降低;出现一些特异蛋白或原有蛋白
发生了与衰老有关的结构上的改变。细胞的各种重要的生理过程,如信号转导、
细胞对外界环境及内部环境变化的反应等,都是以蛋白质间的相互作用为纽带
而进行的。总之,虽然是所有生物除少数病毒外遗传信息的携带
者,但最终机体的生命活动规律还是由蛋白质的功能来体现的,因而,研究配
体一受体的相互作用,有着很重要的生命意义。
许多蛋白质重要的生理和药理功能,是通过与小分子相互作用体现出来的
如酶与底物的相互作用,体现酶的催化功能,因此对小分子配体与生物大分
子相互作用有全面、准确的了解,是基于结构的合理药物设计
的基础,而对配体一受体相互作用进行计算机模拟和理论计
算研究,对配体.受体相互作用的研究起十分重要的作用,并且理论计算可以解
决某些实验不能解决的问题,如酶催化反应过渡态结构问题【】。第章绪论
.国内外的研究现状及分析
在过去的十几年中,分子生物学和一射线衍射晶体学、多维核磁共振
.等结构测定技术不断的发展,许多受体生物大分子的三维结构已
被测定峨”。对于那些仅知一级序列,不知其三级结构的生物大分子,可以用理
论方法或分子模拟方法如同源蛋白模建方法预测其三维结构呻。”。这可以
为受体.配体相互作用的理论计算以及在此基础上的合理药物设计提供受体三维
结构的知识。与此同时,计算机科学的发展,也为对配体一受体相互作用进行高
精度的理论计算如自由能微扰计算等提供了良好的硬件平台【。“。
目前,用计算机模拟来研究生物分子的相互作用与识别已经受到了相当大
的关注。在众多的模拟方法中,分子对接已成为其中非常重要而又受到广泛应
用的方法之一。计算框图在尝试找到两个分子配体与受体间的最好的匹配
模式时,引入了
这个术语,也就是分子对接。所谓分子对
接就是已知两个或多个分子药物与酶或受体蛋白的三维结构,考察它们之
间是否可以结合,并预测复合物的结合模式。例如,找到一种可以与某种特定
的蛋白质结合的抑制剂,就可以阻止该蛋白质在人体内的毒害作用。
..分子对接的步骤
一般情况下,分子对接方法可以分为三个阶段,见图.。首先,将受体
和配体分子处理为刚体有些算法可能对分子表面进行了软化处理,搜索平
动和转动六维空间,同时利用简单的分子表面几何互补性打分,初步排除一些
不合理结构;然后,用精细的能量打分对结构作进一步的评价并排序;最后,
对排序较靠前的结构进行能量优化,允许氨基酸侧链和骨架的运动。另外,如
果在分子对接前能够获得任何关于结合位点的信息,那么可以在尽可能早的阶
段利用它来缩小构象搜索的范围,提高结构的成功预测率。下面分别就这三个
阶段作简要说明:北京工业大学工学硕士学位论文
图传统的分子对接方法的三个阶段
?
全空间搜索在不知道受体和配体分子任何结合位点信息的情况下模拟
分子间的识别,首先就是要进行全空间的搜索。考虑到搜索的时间问题,目前
【“、几个
仅有少数一些程序能够作到这一点,如对接程序【,”、
基于遗传算法的程序叭冽和在快速傅立叶变换 ,
算法基础上建立起来的一些对接程序【,”。
在等提出完成全局搜索的对接程序中,受体和配体分子
被投影到三维空间网格中,根据格子所处的位置表面还是内部赋以整数值 或,然后利用快速点乘的规则加速采样。
另外,采用遗传算法进行构象搜索的方法也很多。和所发
展的对接方法就属于这一类。一”采用溶剂可接近表面来描述蛋白质分 子,其上标有法线矢量、曲率和氢键特性,以表面几何匹配性为构象选择压力
第章绪论
来挑选近天然构象。一则采用分子势能作为适应性函数淘汰或保留对接 构象。
打分排序经过第一阶段的构象搜索和初步打分后,一般会得到几百或 几千个对接结构。为了进一步缩小预测结构的范围,必须用更加精细、可靠
的
打分函数重新评价这些结构,尽可能地使近天然构象排在较靠前的位置。 目前存在的打分方法大致可以分为两类。一类是基于知识的打分函数,如 残基?残基接触能模型呻和原子一原子接触能模型【”,这些模型都是从大量
非
同源蛋白质复合物中获得的统计性结果。其中,文献中报道的残基.残基 接触势模型是等人对抗原一抗体类复合物界面深入研究的结果,专门用 于抗原与抗体相互作用与识别的研究。另一类是基于分子势能的打分函数,
如
分子间的静电相互作用能、氢键相互作用能、去水化自由能和范德华相互作用
能,四、【和锄九均采用了这类方法。
结构优化结构优化在蛋白质与小分子的对接模拟中尤为重要。在这一
阶段,至少要将氨基酸残基侧链的柔性,有可能连同主链的柔性一同考虑。选
择一个恰当的分子力场是必要的,溶剂分子不必明确考虑,可将其产生的效果
以能量项的形式在结构优化中予以考虑,如程序中则考虑了溶剂化
效应。
到目前为止,分子对接方法还不能成功地处理复合物形成中较大的构象变
化,如蛋白质分子域间类似于铰链的运动,只能在一定程度上考虑蛋白质分子
的柔性。
..分子表面的描述模型
分子对接基本上模拟的是蛋白质表面的相互作用,因此在进行全空间构象
搜索之前的首要的问题就是如何描述蛋白质的表面刖。对于蛋白质表面的描述
有很多分子模型,目前的方法主要有:北京工业大学工学硕士学位论文
“表面点模型”在蛋白质的表面以一定的密度根据计算量而定撒
点,这些点带有表面法线矢量,用来定义表面的互补性,如图一所示:
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图.表面点模型图 矗
图?展示了复合物表面的一部分,可以用来计算表面匹配互补的程度, 球心是靶分子上的一个点,匹配互补测试仅对球内的探针点进行。代表探针 分子,代表靶分子,是球的半径,的值通常取作探针原子半径与靶原子 半径之和的.~.倍。
图.是互补性的一个定义,。矢量是靶分子上表面点的法线矢量,矢 量是探针分子上表面点的法线矢量,矢量是’矢量的反响延长矢量。是 与’之间的夹角。如果小于一个给定的阈值,通常取。?。,那么就认 为它们是互补匹配的。第章绪论
图互补性定义疗
鲥
“立方格子模型”用立方体表达蛋白质分子的表面和内部?,这是对用
点来表达分子表面的进一步简化。在这个模型中,一个点的位置用包含它的立
方体中心的三个坐标来代替,这些等体积的立方体构成了一个格子空间,但是
这些点仍然具有其表面法线矢量。因此,在同一个立方体内的点具有相同的坐
标,但是仍可以被其上的表面法线所区分。在实际的操作过程中,选取的立方
体的大小以平均包含~个点为准。包含表面点的立方体被定义为表面立方
体;不包含任意一个表面点,并且存在于蛋白质分子表面内部的立方体被定义
为空间立方体。空间立方体用来计算两个分子间交叠的数量。如下图所示:
图探针和靶分子表面立方体的匹配 北京工业大学工学硕士学位论文
图.展示了探针和靶分子表面立方体的匹配示意图。为了表达的清晰,
将三维坐标系统中的立方体向平面映射成为平方形。探针表面立方体包含
两个表面点,靶分子表面立方体包含个表面点。箭头代表了表面点的法线。
如果探针表面立方体按照图中所示的矢量平移,那么它将与靶分子表面立方体
重合。这样,这两个立方体的匹配数就可以通过下面的方法来确定:如果所有
匹配的表面法线对满足图.的状态,那么匹配数是,这是可能的最大的匹
配数。
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第章绪论
物理模型过于简单大多数蛋白质.蛋白质对接算法中的打分函数都采用
经验势函数,即把体系的总相互作用看作是组成该体系两两相互作用的总和
原子与原子之间的相互作用又简化为各种简单相互作用,如键伸缩能、键角扭
曲能、二面角扭曲能、范德华相互作用、静电能等的累加。这种把一个多粒子
体系量子力学水平上的相互作用,以原子对之间相互作用的和来表示的方法显
然是过于粗略了。
同时,描述分子表面的各种模型,如残基一球模型【、立方格子模型【和表
面点模型口”等还不足以表达蛋白质分子内部和外部的真实情况,对分子柔性的
考虑都不够充分。
如何找到结合自由能曲面上的全局极小点通常认为生物分子的稳定构
象是自由能最低的构象。因此对接模拟的目的就是要找到与最低自由能相对应
的构象,但寻找具有大量自由度体系的全局极小问题,目前还无法解决。
科学家们正在努力解决这些问题。第一个问题关于物理模型改进,它的主
要制约因素是计算能力,因为严格地说从本世纪年代发展起来的量子物理
理论对描述多粒子体系是严格的,其后,年代发展的量子化学从头计算方法
以及密度泛函理论等,在处理分子体系时虽有一些近似,但物理模型还是合理
的。只是由于生物分子粒子数过多,计算能力不允许才不得不使用经验势函数。
随着计算机计算能力的快速提高,使用复杂力场的可能性越来越大,物理模型
也将会越来越真实。第二个关于极值搜索问题,它在目前仍是一个没有解决的
问题,但是对它的讨论与改进是很多的。要根本解决这一问题,了解真实的发
生在生物体中的事件也许是很重要的。尽管蛋白质自由度很大,但在生物体中
最终都形成了它的确定的天然态,可以说多极值问题在活体中是解决了的。所
以要确定蛋白质的构象,应该研究蛋白质的折叠过程,要把生物学的信息加到
理论模拟中去。基于知识的分子设计方法就是从这一点出发的。
在解决对接问题上涉及到两个方面】:有效的搜索程序,包含相关的构象北京工业大学工学硕士学位论文
空间;好的打分函数,可以有效的区分近天然构象与非近天然构象。目前各种
分子对接方法在研究配体一受体相互作用与识别时,要想得到一个好的对接
模
式,必须尽可能的包含这两个方面。
本论文主要内容分为三章。第章介绍了分子对接方法的理论机制以及
各种对接软件的应用;第章用本小组在和的刚性对接算法基
础上改进的半柔性对接算法,并在程序中加上了范德华作用能项,从打分函数
与分子动力学模拟两方面进行了研究,并讨论了如何有效地挑选对接采样中的
近天然构象。第章用等开发的软件进行谷胱甘肽
与脑灌注显像剂“.的不同的异构体,.型和一型的对接模
拟,以从分子水平和理论计算上探讨二者的识别机制以及”“.的立
体构型差异对其滞留效应的影响。第章分子对接方法及应用
第章分子对接方法及应用
.分子对接的理论基础与机制
分子对接的最初思想起源于年前.的“锁和钥匙模型”,即“~
把钥匙开一把锁”。.认为,“锁和钥匙”互补识别的首要条件是它们在
空间形状上要互相匹配。当然分子对接比“锁和钥匙”模型要复杂的多。配体
和受体的构象是变化的,而不是刚性的。受体和配体在对接过程中互相适应对
方,从而达到更完美的匹配。分子对接和“锁和钥匙”模型的另一个不同之处
是分子对接不仅要满足空间形状的匹配,还要满足能量的匹配。受体和配体能
否结合以及结合的强度最终是由形成此复合物过程的结合自由能的变化决定
的。
..配俸受体识别过程的相互作用力
配体.受体识别过程中的作用力可以分为两种:强相互作用共价键和弱
相互作用非共价键。共价键是指维持分子的基本结构,是分子中或分子间
的原子之间结合的主要相互作用,决定着生物大分子的一级结构。非共价键是
指分子间或基团间弱相互作用的总称,在维持生物大分子的二级、三级、四级
结构中以及在维持其功能活性中起着相当重要的作用,也是药物与受体识别的
重要识别方式。在通常情况下,非键相互作用包括【】:
盐键盐键或称离子键,它是正电荷与负电荷之间的一种静电相互作用。
吸引力与电荷电量的乘积。:成正比,与电荷质点间的距离平方成
反比,在溶液中此吸引力随周围介质的介电常数增大而降低。在生理下,
蛋白质中的酸性氨基酸和的侧链可解离成负离子,碱性氨基酸、
缸和的侧链可离解成正离子。在多数情况下这些基团都分布在球状蛋
白质分子表面,而与介质水分子发生电荷.偶极之间的相互作用,形成排列有序
的水化层,这对稳定蛋白质的构象有着一定的作用。盐键的形成不仅是静电吸北京工业大学工学硕士学位论文
引而且也是熵增的过程。升高温度时,由于对?一项有利,因而增加盐桥的
稳定性,此外,盐键因加入非极性溶剂而加强,加入盐类而减弱。
氢键由电负性原子与氢形成的基团如?和?具有很大的偶极
距,成键电子云分布偏向负电性大的重原子核,因此氢原子核周围的电子分布
就少,正电荷的氢核质子就在外侧裸露。这一正电荷氢核遇到另一个电负
性强的原子核时,就产生静电吸引,即所谓氢键。
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这里、是电负性强的原子、、等,?是共价键,一了是氢键。
是氢质子供体,是氢质子受体。判断形成氢键的准则:原子
与之间的距离小于.;与之间的角度大于。。
氢键在维持蛋白质的结构中起着极其重要的作用。可以在多肽主链上的羰
基氧和酰胺氢之间形成氢键,也可以在侧链与侧链、侧链与介质水、主链肽基
与侧链或主链肽基与水之间形成。大多数蛋白质所采取的折叠策略是使主链肽
基之间形成最大数目的分子内氢键如一螺旋,一折叠,与此同时保持大
部分能成氢键的侧链处于蛋白质分子的表面将与水相互作用。
范德华力范德华力包括三种较弱的作用力,即定向效应、诱导效应和
分散效应。定向效应发生在极性分子或极性基团之间。它是永久偶极间的静
电
相互作用,氢键可被认为属于这种范德华力。诱导效应发生在极性物质与非极
性物质之间,这是永久偶极与由它诱导而来的诱导偶极之间的相互作用。分散
效应是在多数情况下起主要作用的范德华力:它是非极性分子或基团间仅有的
一种范德华力,也称为分散力。这是瞬时偶极间的相互作用,偶极方
向是瞬时变化的。瞬时偶极是由于所在分子或基团中电子电荷密度的波动即电
子运动的不对称性造成的。瞬时偶极可以诱导周围的分子或基团产生诱导偶
极,诱导偶极反过来又稳定了原来的偶极,因此在它们之间产生了相互作用。
范德华力是很弱的作用力,而且随非共价键合原子或分子间距离的六次方第章分子对接方法及应用
倒数即/而变化。当非共价键合原子或分子相互挨得太近时,由于电子云重
叠,将产生范德华力。实际上范德华力包括吸引力和排斥力两种相互作用。因
此范德华力吸引力只有当两个非键合原子处于一定距离时才能达到最大,
这个距离称为接触距离或范德华距离,它等于两个原子的范德华半径之和。虽
然就其个别来说范德华力是很弱的,但是范德华相互作用数量大并且具有加和
性,因此就成为一种不可忽视的作用力。
疏水相互作用水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏
在分子的内部。这一现象被成为疏水相互作用或疏水效应。它在维持蛋白质的
三级结构方面占有突出的地位。疏水相互作用其实并不是疏水基团之间有什么
吸引力的缘故,而是疏水基团或疏水侧链出自于避开水的需要而被迫接近。当
然,当疏水基团接近到等于范德华距离时,相互间将有弱的范德华引力,但这
不是主要的。
蛋白质溶液系统的熵增是疏水相互作用的主要动力。疏水相互作用是熵驱
动的自发过程。就药物和受体而言,它们的非极性部分在体液中均为水合状态,
即被水分子所包围,当药物与受体接近到一定程度时,非极性部分周围的水分
子便被挤出去发生去水合现象,使置换出来的水分子成无序状态,因而体系的
熵增加,焓变值减少,使两个非极性区域间的接触稳定化,这种缔合就是疏水
相互作用的结果。
..配体.受体相互作用的热力学过程
配体包括药物与受体结合时,有共价相互作用如酶催化底物水解形成
过渡态复合物、烷基化剂抗癌药物.受体复合物等和非键相互作用两种情形,
其中药物和受体结合时,非键相互作用比共价相互作用更为常见,因为药物利
用非键相互作用与受体结合有利于药物的代谢和排泄】。此外,非键相互作用
可以用经验力场如、、和等方法计算,
而共价相互作用,牵涉到化学键的生成与断裂,必须用量子化学方法计算【】。北京工业大学工学硕士学位论文
本论文在此处着重讨论药物.受体非键相互作用,其它配体一受体相互作用以此
类推。
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图?药物受体相互作用的过程”“
。图.示意了药物.受体相互作用的热力学过程【”】。药物与受
体存在于体液环境中,与周围的水分子存在溶剂化作用,水合焓分别为??。,
和??。,。这时药物小分子还没有受到受体的束缚,药物有平动转动熵丛。和
单键旋转熵丛。。。当药物一受体形成复合物时,药物和受体要失去水合焓,同
时,药物还将失去平动、转动和单键旋转熵,释放出水分子,增加了水熵丛,
和药物?受体生成焓?。。
因此,药物.受体相互作用过程中,熵的变化如下:丛笛?丛,一丛。一埘
这里,?昂表示水熵的变化,?。表示振动熵,丛。表示药物的平动转动熵,
?。表示药物的单键旋转熵。
该过程中,焓的变化如下:
?日??珊一??‖一??‖ ?第章分子对接方法及应用
这里,?日表示药物.受体复合物的生成焓,??。,、??。‖分别表示药物与
受体的水合焓。
该过程中,自由能的变化如下式:
??一?
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由以上各式知,从热力学的观点来看,药物一受体相互作用是一个综合平衡
的过程,并且药物还必须取一定的构象,使其能“适应”受体结合部位的“空
腔”形状和构象变化。同时,为与药物分子相结合,受体的构象也会发生相应
的变化,这就是所谓的“诱导契合”。
..配体一受体识别作用中的立体化学因素
配体仍以药物为例一受体结合时,存在静电相互作用、氢键相互作用、
范德华相互作用和疏水相互作用,前三种作用控制药物.受体结合,疏水作用是
药物.受体结合的驱动力,如疏水作用强,药物和受体才能排除水分子,相互结
合在一起。尽管药物和受体均与体液形成氢键,两者结合时,要打破这些氢键,
但这部分氢键作用能被药物.受体间形成的氢键补偿?】。因此,药物分子与
受体
结合时,必须遵循以下互补匹配规则见图?:
几何形状互补匹配;
静电相互作用互补匹配正电荷对应负电荷;
氢键相互作用互补匹配氢键供体对应氢键受体;
疏水相互作用互补匹配疏水区对应疏水区。
这些互补性质往往可以用分子的表面性质来表示。生物大分子和药物小分 子的各种表面性质,可用分子模拟方法计算,如软件【”中的 模块可计算分子的静电、氢键和疏水性质,曲 软件”中的模块也 可计算分子的静电性质。另外,、以及等也可以
模拟配体.受体的相互作用。北京工业大学工学硕士学位论文 ?尊’
相互怍用
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图药物受体互补匹配不意图口?叩 ?
综上所述,配体.受体相互作用时须遵循以下互补匹配规则: 几何形状互补匹配,原子紧密结合,使其具有较大的接触面积; 静电相互作用互补匹配,正负电荷相对应;
复合物界面包含尽可能多的氢键,盐桥:
疏水相互作用互补匹配:
尽量避免在界面上出现没有成对的极性基团。
.
.分子对接与药物设计
分子对接在药物设计中具有十分重要的意义。在药物分子产生药效的过程 中,药物分子需要与靶酶相结合,首先就要求两个分子能充分接近,并采取合 适的取向,使两者在必要的部位相互契合,发生相互作用,继而通过适当的构 象调整,得到一个稳定的复合物构象。分子对接方法应用于药物分子设计,
主
要是用来进行数据库搜寻【。数据库搜寻主要分为两类:一类是基于药效基
团
的数据库搜寻,另一类是基于配体一受体分子对接的数据库搜寻”。 程序首先被用来在数据库中搜寻出分子形状与受体结合部位相匹 配的化合物,作为先导化合物,进行新配体如酶抑制剂的设计工作。应用 分子对接方法进行数据库搜寻的关键在于对所选出的化合物进行评价,即打
分第章分子对接方法及应用
。打分较高的化合物可作为先导化合物的候选物。程序最初用的 打分规则较为简单,用配体和受体的表面重叠程度。帅来判别分子对接 的好坏,即
?
嘶?‘气一
其中‘和气分别为配体和受体原子的范德华半径,。是原子间距离,求和遍及 所有的受体和配体原子,上式仅考虑了分子的形状匹配,没有考虑分子的化
学
性质匹配。【发展的程序在进行分子基团与受体活性部位对接时,
考虑了氢键相互作用和疏水相互作用,用经验规则决定相互作用的大
小,氢键相互作用能为. /,疏水作用能为 /,其打分标
准为:
?
?/?一厂?口导。
其中,醵口,是经验函数,用于表征配体一受体对接时的氢键键长和键角偏
离理想键长和键角的程度,。为配体与受体活性部位作用的疏水接触表面积。
绪论中所述的药物.受体相互作用互补匹配规则,是药物研究中经常提及的
锁匙机理
】,也是各种药物设计方法的基础。当前
分子设计的热点主要集中在两个方面,一方面是对具有明显药物功能的天然蛋
白质分子如胰岛素、天花粉等加以改性,这与蛋白质工程紧密相连;另一
方面,主要是基于生物大分子结构知识的药物设计。
药物的治疗作用主要是通过药物与受体的相互作用。在生物体中受体大多
是生物大分子,象蛋白质和核酸,而以蛋白质居多。如果人们了解了受体蛋白
的结构,就可以根据其结构来研究药物是怎样改变它的构象,进而产生治疗作
用。设想受体各种可能的药物结构来模拟这种相互作用就有助于找到较好的药北京工业大学工学硕士学位论文
物。这是当前药物筛选中的一个合理的和有效的途径。这种基于大分子结构的
药物设计,使得常规的药物开发从较随机的筛选,逐渐过渡到理性化,避免了
过多的财力和时间的浪费和盲目性。目前已有很多生物大分子作为药物设计的
受体模型,并正在不断的发展,大体情况如下:
基于酶结构的药物设计主要是设计特定酶的抑制剂或激动剂。这里酶
就是受体,而它的抑制剂或激动剂就是要筛选的药物。这方面的例子很多,如
胸腺嘧啶核苷酸合成酶抑制剂、二氢叶酸还原酶抑制剂、羧肽酶抑制剂、胰
蛋白酶抑制剂、凝血酶抑制剂等。蛋白酶类抑制剂的设计是当前的热门,比如
酪氨酸蛋白激酶,它在细胞增值、细胞转化、代谢调控以及细胞通讯的许多方
面都起着十分重要的作用,细胞表面酪氨酸激酶受体的失控信号与细胞内的酪
氨酸激酶能导致炎症和癌症、粥样硬化、银屑病等多种疾病。它的抑制剂的设
计可以发展一类有效药物用于治疗上述疾病。
基于抗体结构的药物设计与抗体相关的设计除人源化抗体外,新近还
发展了抗体衍生的小分子药物。经仔细研究过的抗原一抗体相互作用表面,抗体
分子与抗原分子互补决定区只涉及若干个残基。这就意味着可以模拟互补决定
区的残基结构设计小的抗体结合肽。这种小肽应当具备抗体的活性。国际上一
些科学家设计的具有十几个残基的这类肽都有抗原能力。
基于致癌、抑癌基因表达产物的药物设计细胞表面受体在生命中具有
重要作用。近年来已经了解了几个这样的受体空间结构,如和生长因子?
受体,根据这些受体设计调节剂抑制剂,就可调节细胞功能,从而影响整
个生物体。
基于转录因子结构的药物设计随着对真核生物基因表达调控研究的深
入和对空间结构测定数目的增加,很多转录因子的结构功能已经了解,
如锌指、亮氨酸拉链、螺旋.环.螺旋等。根据这些高分辨率的空间结构信息来
设计药物也提上了日程,国外一些科学家已经设计与合成了一些小分子,使它第章分子对接方法及应用
们与转录因子的重要表面区域互补。研究表明,这样的分子可以专一地结合到
转录因子表面,从而干扰该基因的活性,调节该基因的表达。
基于大分子结构的药物设计种类是很多的。原则上,只要是具有生物功能
又已知结构的生物大分子,都可设计与之互补的小分子来调节它们的生物功
能。
.分子对接方法的分类
根据不同的简化程度,分子对接方法大致可以分为三类:
刚性对接刚性对接指在对接过程中,研究体系的构象不发生变化,其 中比较有代表性的是和【”发展的分子对接算法。刚性对接适合考 察比较大的体系,比如蛋白质.蛋白质以及蛋白质一核酸之间的对接,它的计
算
较为粗略,原理也相对简单。
半柔性对接半柔性对接指在对接过程中,研究体系尤其是配体的构象 允许在一定范围内变化,其中比较有代表性的对接方法有等发展的 软件五以及等开发的软件,”。半柔性对接方法适合于处理
小分子和大分子之间的对接。在对接的过程中,小分子的构象一般是可以变
化
的,但大分子比如靶酶则是刚性的。由于小分子相对较小,因此在一定程度考 察柔性的基础上,还可以保持较高的计算效率。在药物设计中,尤其在基于分 子对接的数据库搜索中,一般采用半柔性的分子对接方法。 柔性对接柔性对接指在对接过程中,研究体系的构象基本是可以自由 变化的,其中比较有代表性的方法有公司发展的基于分子力学和分子 动力学的分子对接方法【】。柔性对接方法一般用于精确考察分子之间的识
别情
况。由于在计算过程中体系的构象是可以变化的,因此柔性对接耗时较长。 当然这只是一种简单的分类方法,在很多分子对接程序方法中,实际上采 用了多种处理方法。比如在发展的程序中,作者实际上把半 柔性和柔性的分子对接方法进行了结合。北京工业大学工学硕士学位论文
.分子对接中常用的模拟方法
..分子动力学模拟方法
分子动力学的基本思想是将微观粒子视为服从牛顿第二定律的经典粒子,
使用的基本假说是各态历经假说,即无限时间平均等于系综平均或整个构型空
间的积分。通过数值积分方法由各个粒子的瞬时受力情况求出它们的运动经典
轨迹。因而可用这种方法模拟生物大分子的构象和计算体系的热力学性质。
对于对接问题,分子动力学方法同样可以有效地预测分子可能的结合模
式。将复合物系统作为一个整体,但是把探针的平动、内部运动,以及受体的
运动看成不动的动力学子系统,并使它们与不同温度的热浴耦合,赋予它们不
同的时间常数。这样做的目的是可以通过温度控制在高温的条件下快速搜索某
些自由度,同时,采用低温热浴来冻结那些我们不希望改变的自由度。在实验
室坐标下,系统的动能为:
去?%
‘
,是相对于实验室坐标的速度。在质心坐标系下,速度为:
%.,,一矿?
其中,
矿?.。/
是质心的运动速度。在实验室坐标系下,系统的动能可以表示为:
,
%圭莩一圭军‖丢彬
式?中的两项分别为内部动能和质心动能。
为了允许大范围的探索受体的表面,底物的平移温度设置在较高的温度范第章分子对接方法及应用
围内肛,从而增加底物的动能,使它跨越高的势垒,以找到能量更
低的构象。底物内部运动的温度设为,以避免不合理的内部结构的改变。
分子动力学模拟一般分两步进行,先进行能量优化,然后紧跟着进行模拟
退火。该方法可以为分子模拟提供许多帮助,如模拟新的同类化合物的能量最
低的结构及其动力学轨迹。
..蒙特卡洛方法
在分子模拟的发展过程中,蒙特卡洛模拟方法起了很重要的作用,它最先
被用于分子体系的计算机模拟。蒙特卡洛方法的基本思想很简单,是使用经验
势函数的随机模拟方法,通过按照~定的采样方法不断抽取体系构象,使其逐
渐趋于热力学平衡系综。因为蒙特卡洛模拟是一个随机或随机采样的过程,
可以有多种表达法,习惯上,在分子对接中,蒙特卡洛模拟通常表达为重要性
采样或采样法。该采样法实际上是一种马尔可夫链蒙特卡洛方法,
它先给体系产生一个随机的运动,紧接着依据玻尔兹曼概率来判断是接受还是
抛弃该运动。
重要性采样即昀方法】的描述如下:
先随机地选取一个初始状态盯。由盯出发,产生一个新的状态盯’。计算能 量’和仃。如果’仃,新状态的能量较低,因而作为“重要” 状态,保留这个解。如果占’叮,不能简单抛弃口’,否则,就是忽略了 热运动的影响。这时两个系统的玻尔兹曼因子的比值
.
,:“丝掣
总是一个小于的数,其中,七是】糊常数,丁是绝对温度。产生一个 到之间的随机数,如果,保留盯’:如果,,就抛弃盯’,仍用原 来的盯。
蒙特卡洛方法在分子对接中起着很重要的作用,很多常用的软件程序采用北
京工业大学工学硕士学位论文
了蒙特卡洛方法,如,“、及【】。
..模拟退火技术
无论是使用分子动力学模拟方法还是蒙特卡洛方法进行生物大分子结构模 拟,都会遇到多重极值问题,即:如何在众多的局域极小中寻找相应于整体能 量极小的构象。要实现这一点,首先体系要能够克服局域高能势垒,这样就可 以在更广泛的构象空间进行,然后再引导搜寻向总体极小演化。 模拟退火技术可以有效地寻找分子的优势构象。其过程为:先使体系 升温,在高温下进行分子动力学模拟,使分子体系有足够的能量,克服柔性分 子中存在的各种旋转能垒和顺反异构能垒,搜寻全部构象空间,在构象空间
中
选出一些能量相对极小的构象;然后逐渐降温,再进行分子动力学模拟,此时
较高的能垒已无法越过,在极小化后去除能量较高的构象,最后可以得到相应
的能量最小的优势构象。此法优点是它取舍构象使既考虑能量下降的变化,也
考虑能量上升的构象,因此就有可能跳出局部势阱,达到全局优化。
目前,用模拟退火算法得到高质量近似解耗时较长,特别是当问题尺度增
大时更为明显。当前模拟退火技术已广泛应用于生物大分子的模拟和分子
对接中,对.射线晶体衍射、等实验方法得到的生物大分子结构进行修
正。
..遗传算法
遗传算法的基本思想源自于达尔文的自然选择和生物进化学说,
是模拟了达尔文进化的大多数特性并应用了孟德尔遗传规律。遗传选择和自然
淘汰的生物进化过程,符合适者生存的自然规律,具有“生存检测”的迭代
过程的优化算法。
习惯上把
年提出的称为传统的“。传统的常常
用一个二进制的线性数字串表示个体,若干个体构成一个种群第章分子对接方法及应用
。先随机产生初始种群,然后用“适应性函数‰”
选择优良的个体,通过杂交和变异来繁衍它们的后代。得分高的个体被选中的
可能性大一些,那些未选中的个体就自然消亡,留下来的个体和它们新产生的
子代就形成了新的种群。经过如此的迭代,直到满足了预设的终止标准,即最
大迭代数或者能量评估最大值,迭代过程收敛,算法结束,得到总体得分较高
的种群。
在 .版本中,应用了改进的遗传算法,使配体在空间中的状态
对应于基因型,与该状态相应的原子坐标对应于表现型。其主要操作步骤九如
下:
矗
“先将每个个体的基因
图形匹配评估
型转译成其相应的表现型,紧接着对每个个体进行适应性编码。遗传算法在进
行搜索之前,先将解空间的数据表示成基因型串结构数据。
选择其目的是为了从当前群体中选出优良的个体,使它们有机会作为
父代繁衍子孙,原则是适应性越强的个体繁衍子孙的概率越大。
杂交通过杂交操作可以得到新一代个体,它们组合了父辈个体的特性。
杂交体现了信息交换的思想。
变异首先在群体中随机选择一个个体,对于选中的个体以一定的概率
随机地改变串结构数据中的某个值。变异为新个体的产生提供了机会。
定义一个精英参数来决定自动存活进入下
精英选择
一代的优秀个体数。
遗传算法的主要特点是直接对结构对象进行操作,不存在求导和函数连续
性的限定;具有较好的全局寻优能力;采用概率化的寻优方法,能自动获取和
指导优化的搜索空间,自适应地调整搜索方向,不需要确定的规则。作为一种
全局优化搜索算法,遗传算法以其简单通用、适于并行处理及高效、实用等显
著特点,在各个领域得到了广泛应用,取得了良好的效果,并逐渐成为重要的北京工业大学工学硕士学位论文
智能算法之一。
目前,以上提及的分子模拟方法已被广泛应用于研究配体一受体相互作用及
识别的机制的对接模拟中。随着计算机科学与生物科学的发展,新的算法也会
随之产生。
.几种有代表性的分子对接软件及方法
分子对接的方法有很多,这里不可能一一介绍。下面主要介绍几种应用较
为广泛的分子对接方法。
实时图形处理途径不管是对配体.受体相互作用进行理论计算,还是根据生物大分子的结构进
行新配体的设计,第一步总是将配体对接到受体的结合部位去,形成配体一
受体
复合物,这一过程称为分子对接。在进行分子对接时,往往以已知配
体一受体复合物的晶体结构为基础,计算受体结合部位的各种表面性质静电、
氢键和疏水势等的分布,删去原有的配体,计算用于分子对接配体的表面性质,
然后根据上面所讲的互补匹配规则,将配体对接到受体的结合部位上去。现有
的图形工作站如和分子模拟软件如使得这一过程能够进行。
分子对接的目的有两个:一是为进一步精确的理论计算如、/
等计算提供了配体.受体复合物的初始构型;二是可以根据匹配情况,对配体
进行结构修饰,提高配体与受体的亲和性,如配体是多肽,可以改变肽链骨架,
设计出非肽和类肽配体,以提高生物利用度,或将柔性配体环化,以降低配体.
受体结合时的熵损失见式.。实时图形处理途径在以结构为基础的药物
设计中得到了广泛的应用,并取得了成功,但现已被自动分子对接方法所替代。
实时图像处理途径的优点是能在计算机屏幕上形象直观地显示、操作分子间的
相互作用过程。
和扩”提出的蛋白质~蛋白质刚性对接算法用简化
“
蛋白模型一个氨基酸残基用一个球来表示来模拟分子的表面,采用系统格第章分子对接方法及应用
点搜索法采样构象空间,以几何互补性为标准过滤掉不合理的构象。在打分函
数中考虑了蛋白质分子间的静电和范德华相互作用。算法的最大优点在于球极
坐标系统的使用。在这种坐标系下,对已知受体或配体活性位点的识别预测,
限制一两个角度的搜索在一个较小的范围内,这样就在很大程度上减少了程序
的运行时间。该算法的缺点在于几何互补过滤标准并不足以在正确与错误的构
象间作出区分,有可能漏选大量的近天然结构。详细用法见第章。
等九为了进行全新药物设计研究,发展了自动分子对接
程序,这一方法被广泛地应用于基于受体结构的三维数据库搜寻,并取
得了成功”。其基本方法如下:
千
图受体分子表面球形表示的示意图 如
分子表面的“空腔”可用“填充”在分子表面的球形来表示。每一个球与
受体分子表面的一个点相切,即经该点并与分子表面垂直的直线经过球心,同
时球体表面与分子表面的另一点相触见图.,然后根据一定的规则,使得
覆盖受体表面的球形数最少,同时每一个受体表面的原子仅保留一个球形与
之
对应,亦即保留那些审。的球形,这样做的目的是摒弃那些受体表面浅的 “沟槽”。另外,半径大于.
的球也不计入,目的是防止受体结合部位延伸北京工业大学工学硕士学位论
文
到溶剂中去。按这样的方法,球形数聚集体最多的表面即为受体的结合部位 配体分子表面可用类似的方法进行球形表示,所不同的是球形与分予的内 表面相切受体球形与其外表面相切,对于小分子配体,也可用以原子中, 为球心,范德华半径为半径的球形代替上述球形表示。
”集团匹配 。得到上述受体结合部位和配体表面的球形表示 后,必须利用球形表示将配体和受体对接起来。分子对接时,将配体和受体的 球形一一配对,在配对时,必须调整配体的方向,找到最佳位置。用刚性分子 对接方法搜寻数据库有其局限性。近年来人们不断对分子对接方法进行了改 进,在分子对接时考虑或部分考虑分子的柔性,并且药物与受体结合的打分
函
数也考虑了静电、氢键和疏水等相互作用。
等人充分考虑了配体的柔性设计了将柔性配体对接到
受体上的程序?“。在最早的版本中,作者采用了模拟退
火来优化配体.受体之间的结合。在.版本中,埘等发展了一种改良的遗 传算法,即拉马克遗传算法。程序中主要采用包含两点杂交和随机突 变的遗传算法来完成全局搜索,用优化算法来完成局部搜索,并用基
于格点势如图。所示的快速能量评估法来评价受体和配体之间的能量匹 配。
在 .和.版本中,能量匹配打分采用简单的基于力 场和非键相互作用能。非键相互作用来自于三部分的贡献:范德华相互作用,
氢键相互作用,以及静电相互作用。第章分子对接方法及应用 图?对接中的格点计算图 印
范德华相互作用采用?函数形式
一
.耋
脚
?卟
鸣百~ 色~
氢键相互作用采用传统的一势函数形式
%。:?皂一%
‘‘?
占‖景,,
喘,‖ ?
静电相互作用则采用了常用的库仑相互作用
一
‘.‘“””
耻。.蠢,恭北京工业大学工学硕士学位论文
介电函数可以设为常数,也可以是与距离有关的函数,后者在
中采用函数的形式:
‘。
占彳寺
.水在?时的介电常数,彳墙.,世
式中占。.爿,
., .。
在.版中,提供了半经验的自由能计算方法来评价配体和受 体分子之间的能量匹配,计算采用下面的函数形式,结合自由能来自于五部
分
的贡献:
?“否?一争,??莓即,?一?,
亿,;、
枷一再击“批?“驴一柑胗卜咖矿’
其中,?、、?。。、?。,以及?。,都是半经验参数,通过拟合 得到:?。,指配体分子在对接时选择的可旋转键的数目。公式中的静 电相互作用、范德华相互作用和氢键相互作用的计算方法和.以及.版本 中的一样,只是每个计算出来的能量值需要乘上相应的权重系数。 在最早的版本中,作者采用了模拟退火来优化配体和受体之间 的结合。在.版本中,等发展了一种改良的遗传算法,即拉马克遗传 算法九”锄 ,。在方法中,作者把遗传
算法和局部搜索 结合在一起,用包含两点杂交和随机突变的遗 传算法来完成全局搜索,用 优化算法来完成局部搜
索。在中,局部搜索方法是自适应的,它可以根据当前的能量调节
.包含了两大优点:大的搜索空间和强有力的
步长大小。改进后的
能量评估。第章分子对接方法及应用
等最近提出了一个软对接算法口『来预测蛋白质与蛋白质的
相互作用和识别,并获得了较好的效果。由于在蛋白质一蛋白质结合时,构象的
变化主要发生在蛋白质表面的氨基酸残基的侧链上,尤其是表面的五中氨基酸
残基、~卧、和具有较强的柔性。基于这种现象,在处理分
子柔性时,算法不仅允许表面氨基酸残基的侧链有一定程度的交叠,而且特别
允许这五种残基的侧链除了。原子可以发生较大程度的交叠。经过这样
的柔性考虑,再加上几何互补和侧链接触性评价的双重过滤技术,算法在大量
的采样中,找到近天然构象的能力大大提高了。
下面将几种有代表性的分子对接算法总结如下:
表?几种分子对接算法
咖‘
虹第章一种新的挑圭对接采样中近天然构象的方法
第章一种新的挑选对接采样中近天然构象的方法
.打分函数的改进
..概述
分子对接是研究蛋白质一蛋白质相互作用与识别的重要方法之一,它包括
两方面:一个有效的搜索程序和一个好的打分函数。如何构造打分函数来有效
地区分正确与错误结合模式~直是人们研究的难点【】。对于如何从众多的对接
构象中筛选出近天然构象,~般采取两个步骤,初步过滤和细致打
分血。蛋白质一蛋白质受体与配体的识别与相互作用的过程,是很
难通过精确计算确定的。这其中的主要原因是,分子间相互作用表面的靠近会
使范德华相互作用和其它短程相互作用逐渐加强,构象空间中相距几个埃的状
态在能量空间中彼此间可能会存在相当大的势垒障碍,这是简单的局域能量优
化所不能跨越的。对这一问题的解决可能需要一种算法来对能量函数进行一定
程度的平滑处理‘”,”。目前大部分蛋白质一蛋白质对接算法在曲中,或
者是基于几何互补性【.”】,或者是基于简化的分子势能函数??”,或者是基于
这二者的组合?。然而在很多情况下,简单的分子势能函数不能对近天然和错
误结合模式作出
范文二：受体与配体结合试验的测定方法
中国和协医科学大理药实验学
放
射配受体结合体实验
aRido-lgaindRec petroB idinng Assya
国中和协科医学大理药学系 菜叶英
【
实验目】的
?习学放配体受体射合结RRA）的（本基方； 法? 观察解了体与配受的结合基用。
作
【验实原】理?
RL+≒RL*L+本为实的验基本应。其中R反代表受，体代L表配 ，RL*基代受表配基复体物合。 ? 药与物体受结合位间点的互作相用遵守质量作用定律。，利用不 浓度的放射同性配与一基量的受体结定合即可，以用数 学作推导出受图体含，量计并出算离常解数为受作体 与配基亲力和一个的指。本标验实用标记氚纳的洛 酮（anolxno eN，x）来究研片阿体及其配基受结合情的况， 计出算受体含量解及离数，常析分多种不有同亲和的受力体存 时在基与受体配作的规用律
。
【
实原理验
? 放射配基】与受体备物制（含受体的组或细胞制织备物） 作时，用其合结式有两形，一种种是配 与基受的特体异结性合，特其是亲和点高力；由且于受体有限 ，具故饱有和。性一另是种配基受与 制备体物的受非体子分的合，称为非特结异性结 。合其点特亲和是力低但结点多合不，饱和。易用 放射配基性究特异性受研体，必时须法减除设 非特异结性合。般采一的用法方制备是结总管 和非合异特结管，两合者数计差之为即特性异结合 量
。
【实验理原】?
总 结合：管将射放配基性受与制备体物反应，去游除离 的放射性基配测定，结合放的性射基配计的，（其中包数含 异特结合与非性异性特合结称为总，合结） 。? 非异性特合管结将大量：一（般5为00－100倍0非）标 记异性配基特标与记放射性配的相基，混然共同与受后体 备制反物。应于由标非记基配标记与基配者两比悬殊，例所 受体几乎以部全被非标记配基和，标记饱配基只与能组 制备物中织非特的异结位合结合点。这测时的标出配记的基 合结，量映的反非特异是合结。量用总结管合计的减数去 非特异结管的合计数即可，到特得结合异计。数
【
验实理原】
【
验实原】
理 ?组织制备物的受体含量中解离及数常的计算设 ：如想放射果性配基度足浓大，够受全部被体其 结，这合的放射性配时基结合的量即映反受出点 含，量们将我称其最为结大合，量以Bam表示。x 以B代表与若体结受的合配量基，代F配基浓度表 ，D代表解离常K，数根C据lak受r体论：理? ＝BBam?Fx(/＋KF)DB 与作用F一是条角直双曲 ?线将B＝ BmaxF?(/＋FKD)变得： 形BF/＝Bmx/aK D－B /K D
实验【原】理
图
2
个配基一一受种情况体下的Scrahardc图作
【验原实理】
以B/?FB与图作可得，到条直线一，即caSchrar作 d（
图如图2）若。射放性配基释成稀同不浓度( )F与受体制，备物作后用，分测得别应的结合相 配基，即可绘量上图，从出求而Bmax及 KD得 。图由可分析受2的属性体及以求得maBx。 ? 以上值一是配个基个受体一的况，若情受体具有 亲力和同不的两种上以结的点，则Sc合achart图d是曲 。线例当有高低如两亲和力种合结点时， caStcardh是双图线曲其。两渐近个线别分表高 代低亲和力两种结点的合图形，并可过计算通 出求，而从求相得应B的ma及xK。如图3所示D。
【实
验原】理
图3
有高
低种亲和两受体力合结点的时Satccahr图d
【实验材料
? 】纳洛酮：25μ水溶液M；? H 依3托 啡 ： 原 液 的 放 射 比 活性为 4 4i/mcol m ，m1ci/l配m4成.nM9按1：0.7的比例依次，释， 稀制6个配度的浓作液工，浓度依次为：4其.n9， M343nM，2.4.nM，.61nM，0.88n2M0.4，Mn；? 甲 苯 闪烁液 ：PPO1.g5，OPOP30Pm0加甲苯g至 300ml0? 50mMriT－HsCl buffrep H.7
5【实
方法验】
1.脑 2部P（分啡吗受体粗）制膜备（实验：老师 先事已成完 ）? 大鼠断处头死取，全脑出，去小弃脑清，除面 表的膜及脑血管称重后。10倍体积T加irsH-lC溶，液用 璃匀浆器玻碎研制，1成％匀浆0。℃，1400g0离 1心分0，弃钟去沉淀。上离心清6100g0，℃24 分0钟后留保淀沉。加0mM5T is-rCHl缓液冲混悬 匀均3，℃0温3保分0，以钟去除源性阿片内样物质 ，再次心16离00g，042℃分0。保钟留淀沉将 其并悬于50混mM rTs-Hil缓C液冲中使其蛋。白度浓 为6.1mg7/l，m后分装，置－2然℃0箱冰保备用存 此。制备物为阿即片体受粗膜P2（。
）
【实验法】方
. 2RAR实验样：加? R R实验A加，依表中样所列序加入顺试管。P2制备物 后加最，个每测点都定双复取平管行验。实 ?每个配浓基有度管，两个总4合管T结取（平均 ），两值个特非异结合性管N取平均（值；）6做 浓度个（表2）见，所共有2以管，4意加注样顺 ，见表1序
：
【验方法实】
1表R AR实加验表样
样加总结合 T 非特异结合N管
T
ris－HCl0. 1lm/
纳洛酮 /
0.1l
3H－m纳洛酮
2P0.3 l m0.3ml
0.m1 l.10m
l
实验【方法】
3 分．离液闪与定：测 ?样完加毕样，品管试混均合匀，置后于0℃3室 温保下30温分钟冰上，止终应反。 4到5号4房间抽滤（以G /B或国产滤F79膜1过0，滤滤膜 T用ri液s润浸，面向上，毛面光下，向5lm冷 buferf洗涤2次，）。下膜取，膜滤入放闪烁 杯，每加管 8m闪烁l，液行进闪测液定。
【
验结果与实析】分
表 2射放体受合实结原始验数表据（位单：cp）m
1TT2 Tave 1 N2 NN ae
v注：
T,1 2分T别总为结合的两量平行个定测，Tav值e为总结合的量均平值即，（T 1+T2 /）。类似2，N的, N1分别2非特异为结量合的个两平
行测定，N值ve a非特异结为量合的均平，值（即N +1 N）2/。2
实验【果与分结】
实析数验据处和理计 （1）算 各中自管标记由基的配浓F度 ?： 测由定到的高最算计以1：.70比例释后稀种浓各 标记配度基的放射计数，从中去总结减合数， 计即得中管离的标记游配体计数，并换算的成配 基的度。浓? 于C1V1=由2C2，可V得：=F相浓度应（×总计 数总－合量结）/计总数 2）（特异结合S性B算： ? 总结合管计减非异特性结管合的数计为即异特结性合 数计并，算成换基浓配度 。 ?=TS－；NB=相应浓度×特异性合结量/总数。计
【实
验果与分析】
结表
3总数 /计pmc 应相度 /nM 浓总合T结 c/pm
放受体结合射实数据验
非特异表结合N/c mp特异结合S /cp m离配游基浓 度/FM n特结异的合 配基度浓Bn/MB/ F
注T、N：由实值测验，得为两次量测值的平，均 S= －N；T 由于1C1=C2VV，可2得F：=相应浓×（度总计数总结－合量）总/ 计，B数=应浓相度×异性特结合/量计数总
实【结果与验析】分绘图
：（ 1）饱和曲：线见图 ?4B为 纵坐标F，横坐为，计标出算总合，非特 结结合，特异异结合性作，图即得到可点受合结 线曲 。2（）Scathacd作r：图图5见? B F/为纵坐，标B为坐横标绘制cStahcad图r形，所 图得为形曲线双，电子用算计机绘图，出 找渐近线，分别出高低算和亲结合的力最大结 数合KD量值。
实验结【果分析】
与图 4射放受体结合实验据饱数和曲线饱和曲
配基线合浓度/结pc
m3050 300 05200 020 1000 1500 500 0 00 123 54
N S
T 对数 (S 对数 ())T 性线(N)
/Fcm
p注：
T ,,S分N别总为合，结非特异合，特异结性结计合数横，坐F标游为 离基配浓度
。【实
验结果与析】分
图5 放受射体实数验据cSatchadr图
0.5 0.作40 .30. 2 .0 010.0
y5 = -11.68x 6 0+.4625 2 =R .044
6
/B
0.1
0F.15
.20
0
25
..03
.305
0.
4B/cm
p
【实验讨】
论? 验实法方论 ? 实验讨作操论讨 实验结果?讨
论
【
论结
】? 受体与结的最大合基量为X配XXXn M即， 脑2部分P样品受点含的量最－大结合量： XXX XM。 解n离数常D为KXXX。X
【参
考文献
?】 arM Jy. Mcyke, icRhra Ad.Harvey ,amPlaeC. Cahplm. eLippncoti tllIstrateu Rdeivwe Phsrmacaloog. yPilhaeldpiha Lip:pniott cWliamls & Wlkiin,s 0022.张德昌 主. 编医《学药学理. 北》：京京医科 北学大中协和国医科学联合出大版社1，99.8《 药理学验实讲》义 中.协和医科大学药国理 ,室20 5年00月 1左萍萍老的课件
师
?? ?
范文三：hGM_CSF受体_亚单位胞浆域在配体胞吞过程中的作用
3βh GM - CSF 受体亚单位胞浆域在配体胞吞过程中的作用
1 冯一中苏成海 张日朱子玲 1 ()苏州医学院附属第一医院 ,江苏省血液研究所 ,苏州 ,215006 ; 苏州医学院病理解剖学教研室
( )β摘要 目的 探索人粒 - 巨噬细胞集落刺激因子受体 h GM - R亚单位胞浆域在配体诱导的胞吞过程中的
(β) 作用 。方法 通过 PCR 扩增技术 ,构建亚单位胞浆域缺失突变子 1441 、1582 、1726 、2354 和 Sma,然后将野生型
βα或突变型亚单位和 GM - R亚单位 cDNA 共转染入 COS - 7 细胞 ,并对转染细胞的配体胞吞进行检测 。结果 以
α低亲和力方式与配体结合的 COS - GM - R胞吞水平仅为结合配体的 7 % ,而以高亲和力方式与配体结合的
αβCOS - GM - R/胞吞水平则达 37 % ,为前者的 5 倍 ,这种胞吞现象可被丝氨酸/ 苏氨酸激酶抑制剂 H - 7 和星形
β孢菌素抑制 ,但不被酪氨酸激酶抑制剂木黄酮和制表菌所抑制 ; 从亚单位胞浆域结构与胞吞关系可见 , C 末端
122 个氨基酸缺失可使胞吞受抑 ,而该 122 个氨基酸上游的 300 个氨基酸区域缺失则可使胞吞水平显著提高 。结
β论 有效的胞吞需要高亲和结合力的功能受体存在 ,且胞吞过程不涉及酪氨酸激酶磷酸化 ; 而亚单位胞浆域对 胞吞有正性或负性调节作用 ,提示这些区域含有调节胞吞过程的序列 。
β 关键词 人粒 - 巨噬细胞集落刺激因子受体 ; 亚单位胞浆域 ; 胞吞 ; 激酶抑制剂
中图法分类 R392 - 33
β Role of the Cytopla smic Doma in of Subun it of the Human Granul ocyte2 Macrophage Col ony - St imulat ing Factor Receptor in L igan d En docytosis
Zha n g R i , Zh u Zi l i n g , Fen g Y i z hon g , et al
()J iangsu Instit ute of Hematology , The First Ho spital Affiliated to Suzho u Medical College ,Suzho u ,215006
β t he cytoplasmic regio n of Abstract Object ive To explo re t he role of subunit of t he human
( ) granulocyte2macrop hage colo ny2stimulating f acto r recep to r h GM - Rin ligand2induced endocyto sis.
() β Methods Cytoplasmic deletio n mutant s 1441 ,1582 ,1726 ,2354 and Smaofsubunit were generat2
α ed by PCR amplificatio n technique . CO S - 7 cells were t ransiently cot ransfected wit h GM - Rsubunit
β and eit her wild2t ype o r mutant subunit cDNA and GM - R mediated2endocyto sis of t he t ransfected
α cells was t hen examined. Results The CO S - GM - Rbo und it s ligand wit h low affinit y and inter2
αβ nalized o nly 7 % of t he total bo und co unt s w hile CO S - GM - R/bo und it s ligand wit h high affinit y
αand inter nalized 37 % of t he bo und ligand w hich was 5 times of t hat of GM - R. Efficient endocyto sis was inhibited by serine o r t hreo nine kinase inhibito rs H - 7 and stauro spo rine , but not by t yro sine ki2
β nase inhibito rs genistein and erbstatin . Deletio n of C2ter minal 122 amino acids ofsubunit reduced lig2and2induced endocyto sis w hereas deletio n of 300 amino acids p ro ximal to t hese 122 amino acids co nsis2 tently increased ligand endocyto sis. Concl usion High affinit y binding is required fo r efficient endocy2
β to sis w hich is not affected by t he t yro sine kinase p ho sp ho rylatio n . The cytoplasmic regio n of subunit has a po sitive o r negative effect o n ligand endocyto sis. This suggest s t hat t hese regio ns co ntain se2 quences w hich regulate endocyto sis.
Key words human granulocyte2macrop hage colo ny2stimulating f acto r recep to r ; cytoplasmic re2
β gio n of subunit ; endocyto sis ; kinase inhibito rs
( ) () 3 国家自然科学基金 No . 39670277和国家教委留学回国队员科研启动基金 1997 - 932资助课题
( μ) 人粒 - 巨噬细胞集落刺激因子 human granulo2 10g,37 ?培养 18 ,24 h 后 ,洗涤细胞并加入新鲜 cyte2macrop hage colo ny2stimulating f acto r , h GM - 培养液继续培养 48 h ,然后收集细胞进行结合检测 。
) CSF是一种主要由巨噬细胞和 T 淋巴细胞产生的 1 . 4 同位素配体结合检测 : 同位素标记 GM - CSF分子量为 18,24 kd 的糖蛋白 ,它能刺激粒系造血祖 2 6 结合检测按 Di Persio 法进行 ,即取 2 ×10细胞悬 细胞的增殖与分化 ,并增强成熟粒细胞的功能 。目 μ( 浮于 50l 结合缓冲液 IMDM + 50 mmol/ L H EP ES 前已知 , h GM - CSF 的生物学作用是通过定位于细
) + 0 . 1 %B SA中 ,混匀后分 2 管 ,与含特异性放射性( ) 胞膜上的 特 异 性 受 体 h GM - R而 介 导 。完 整 的 18 125 ( ) 活性 为 1 , 5×10dp m/ mole 的I - GM - CSFαβαGM - R 由和两个亚单位组成 。亚单位能与配
β体以低亲和力方式特异性结合 , 亚单位尽管自身 室温下孵育 90 min 。为了获得特异性结合 , 其中一
α不能结合配体 ,但可与 GM - R共同组成能与配体 管加入比 标 记 配 体 浓 度 高 100 倍 的 未 标 记 GM - 高亲和结合的功能受体分子 ,同时担负信号传导功 CSF 。孵育结束加入含 20 %FCS 的结合缓冲液中止 β( ) 能 。此外 , 亚单位也是白细胞介素 - 3 IL - 3和 γ反应 ,离心后在计数仪上测定细胞放射性活性 。 (( ) β) 白细胞介素 - 5 IL - 5受体的共同成员 c,因而 3 1 . 5 受体胞吞检测 : 按 Perelaux 法进行 , 即取 51 ,3 GM - R 也可被 IL - 3 和 IL - 5 交叉竞争结合 。 6 125 ×10瞬时转染细胞与I - GM - CSF 在冰上孵育虽然 h GM - R 与信号传导之间关系的研究已有诸
90 min ,继用冰冷的结合缓冲液洗细胞 2 遍后 ,重新 β多报道 ,但对c 胞浆域结构在配体与受体结合后介
( ) 导的 胞 吞 endocyto sis过 程 中 的 作 用 至 今 仍 不 清 悬浮 细 胞 于 10 % FCS 的 IMDM 中 , 37 ?培 养 。在
6 β楚 。为此 ,我们构建了c 亚单位胞浆突变子 ,探讨 培养的 0 、5 、10 、30 和 60 min 时 ,各取 1 ×10细胞与 β了c 胞浆域在配体胞吞过程中的作用 。 ( 1 ml 酸性缓冲液 由 0 . 1 mol/ L 甘氨酸和 0 . 15 mol/ L
) NaCl p H = 3 . 0 组成在冰上处理 5 min , 然后将细
胞通过由 dibut yl p ht halate 和色拉油按 20?3 比例组
γ 成的油层离心 ,在计数仪上分别测定细胞上清与
沉淀部分的放射性活性 。为了观察激酶抑制剂对胞 1 材料与方法 αβ吞的影响 ,实验前先将表达 GM - R/的细胞在冰
(上与激酶抑制物预培养 2 h 所用的激酶抑制物及浓 1 . 1 试剂和细胞培养 :表达载体 p M X 和 p R EP9 及
μμ度如 下 : 100mol/ L 木 黄 酮 , 10mol/ L 制 表 菌 素 , 激 酶 抑 制 剂 分 别 购 于 Invit rogen 和 Boehringer 公
125 μμ) 10mol/ L H - 7 和 1 . 0mol/ L 星 形 孢 菌 素, 然 后 司 ,I -GM - CSF 购于 N EN 公司 ; 非洲绿猴肾
进行上述实验 。 ( ) 细胞 CO S - 7 生长于含 10 %胎牛血清 FCSIMDM
培养基中 。
1 . 2 突变子构建 :利用 KH97 质粒 ,经 PCR 扩增构
2 结果 β( 建 了 c 胞 浆 缺 失 突 变 子 1441 , 1582 , 1726 和
β2 . 1 c 胞浆缺失突变子结构 : 按照核苷酸数目设 ( ) 2354。所用 PCR 引物如下 每一反义引物均含 3′
计构建胞浆突变子 。1441 突变子仅保留胞浆域近 ) 端终止码:
膜端的 6 个氨基酸 ; 1582 突变子含有包括 bo x1 在 有义链 :AA GC T T GA GC T GACCA GGGA GA T
内的近膜区域 ,但缺少 bo x2 序列及其余的胞浆域 ; 反义链 :1441 : TCA GC GCA GCC T GTACCC GT
1726 突变子含 bo x1 和 bo x2 结构 ,但缺少 bo x2 结构 1582 : TCA GAA GC GGC T GCCCCAC G 1726 : TCA GGGC T GC TC T GT GGGTA β下游的胞浆域 ; 2354 突变子含 对c 功 能 有 关 键 影
577 750 2354 : TCACC GGCCC TCAA T T GGA 响的 bo x1 、bo x2 、酪氨酸和酪氨酸结构 ,但缺少
Sma 突变子则通过常规分子克隆技术 ,在 Sma C 末端 122 个氨基酸 ; Sma 突变子除缺少 C 末端 55 I 位点进行消化切割产生 。所有构建的突变子核苷 β个氨基酸外 ,其余结构和野生型 c 相同 。酸序列均被检测以保证其正确 ,然后将其分别插入 β2 . 2 配体胞吞需要c 的存在 : 胞吞水平依据 37 ?
α- RDNA GM 则 被 插 入p M X 载 体 中 ; 野 生 型 时不同时间内沉淀细胞的总 cp m 百分比增加值来
p R EP9 载体中 。α 测算和定 量 。我 们 检 测 了 表 达 GM - R及 GM -
125 α1 . 3 转染 : 利用磷酸钙法将相应的质粒导入 CO Sβ R/的 CO S 细胞胞吞I - GM - CSF 的能力 , 发
6 细胞 ,即在直径 100 mm 培养皿中 ,每皿种入 1 ×10α 现呈低亲和结合的 CO S - GM - R细胞仅胞吞总
细胞 , 1 天 后 , 每 皿 加 入 1 ml 磷 酸 钙/ DNA 沉 淀 物 结合参数的 7 % ,而与配体有高亲和结合力的 CO S(α βαβ 内 含 GM - R和 野 生 型 或 突 变 型 cDNA 各- GM - R/细胞则可胞吞总结合参数的 37 % ,为
( () ) 前者的 5 倍 见图 1,这提示高亲和结合力为高效 H - 7 仅中等度 33 %抑制胞吞 ,星型孢菌素则可抑
胞吞所必需 。制配体胞吞的 65 % ,提示丝氨酸或苏氨酸磷酸化可
() 涉及 GM - CSF 诱导的胞吞 见图 3。
图 1 有效的配体胞吞需要高亲和力
的功能受体存在
β2 . 3 c 胞浆突变子对配体胞吞具有独特的影响 :
αβ共表达 GM - R和野生型或突变型c 的 CO S 细胞 图 3 激酶抑制剂对配体胞吞的影响 α胞吞结果见图 2 。当野生型 GM - R存在时 ,所有
βc 胞浆缺失突变子均能与之共同组成高亲和结合 3 讨论 力的受体分子 。缺失胞浆远膜区域的 2354 和 Sma 在 GM - CSF 刺激后 ,存在于靶细胞膜上的受 α 突变 子 , 其 胞 吞 水 平 与 仅 表 达 GM - R时 近 似 体 GM - R 可被活化 ,形成的配体 - 受体复合物一 () β9 %, c C 末端 122 个氨基酸上游的 300 个氨基酸 方面通过信号传导途径 ,将刺激信号下传细胞核 ,从 () 以 1582 和 1726 为代表,则反见胞吞水平升高至 而诱发各种细胞生物学行为 ;另一方面 ,完成受体后
48 % ,提示该 300 个氨基酸区域对胞吞有负调作用 ,信号传导的配体 - 受体复合物可被网格蛋白构成的
去除该区域可增强胞吞作用 ; 仅保留胞浆近膜端 6 陷窝内吞 ,并运送至溶酶体而降解 ,从而引起受体下
β个氨基酸的 1441 突变子 ,对胞吞的影响与野生型c 调 ,这一过程即称为配体介导的胞吞 ,这是细胞摄取 () β相同 36 %,提示有效胞吞不需c 胞浆域 。 与转运激素 、糖蛋白和脂类物质的重要方式 。通过
该机制 ,可使细胞对配体重复刺激产生耐受 ,直至细
胞重新合成新结合蛋白并在细胞表面表达为止 。尽
管目前对 GM - CSF 诱导的受体胞吞所知甚少 ,但
巨噬集落刺激因子受体的研究证明 ,受体的近膜胞 4 5 浆域对胞吞十分重要。Ro nco 等也报道 , GM - R
α亚单位胞浆域突变并不影响 GM - R 介导的胞
β吞 ;另一方面 ,一些研究发现 , c 胞浆域结构在 GM
- CSF 介导的信号传导过程中具有决定性作用 ,缺
( ) ( 失胞浆 域 bo x1 氨 基 酸 456 , 487 、bo x2 氨 基 酸
577 750 ) 517,542,酪氨酸和酪氨酸可分别阻断 GM -
() CSF 受体介导的增殖反应 、J ak 家族 J ak2、Shc 及
6 ββc 酪氨酸激酶磷酸化。我们推断c 胞浆域结构
中某些保守序列也许在胞吞过程中起关键作用 。 β图 2 c 胞浆域对配体胞吞有正性和负性调节作用
β 我们的结果证明 ,配体胞吞需要c 亚单位的存
2 . 4 酪氨酸磷酸化与配体胞 吞 无 关 : 实 验 结 果 表 α 在 。因为单独亚单位并不足以导致有效的胞吞 ,
明 ,酪氨酸激酶抑制剂木黄酮与制表菌素并不影响
GM - CSF 诱导的胞吞 , 提示酪氨酸磷酸化与配体
1988 ,263?1834 子则可使胞吞水平至少提高 5 倍 ,这与 IL - 2 受体
3 Perelaux A ,et al . Binding ,internalizatio n and degradatio n of ( ) βγ 复合物 IL - 2 R较类似 ,即仅在由和亚单位共 radiolidinated interleukin 3 and grnaulocyte2macrop hage 7 同组成的中和高亲和力受体分子才被有效胞吞。 colo ny stimulating factor by various hemopoietic cells. 如前所述 ,仅保留胞浆近膜端 6 个氨基酸的 1441 突 Biochim Biop hys Acta ,1990 ,1055?141 . β变子 ,能产生与野生型c 一样的胞吞水平 ,说明只 Myles GM ,et al . Tyrosine 569 in t he c2Fms juxtamembrane 4
β有高亲和结合力受体才能产生高水平的胞吞 ,而c do main is essential for kinase activity and macrop hage
colo ny2stimulating factor2dependent internalizatio n. Mol Cell 胞浆域并非为高效的胞吞所绝对必需 。Hatakeyama
8Biol ,1994 ,14?4843 β 等发现 , IL - 2 R胞浆域并非为胞吞所必需 , 这 5 Ro nco L V , et al . Identificatio n of co nserved amino acids in β也支持我们的结果 。纵然胞吞过程并非需要c 的 t he human granulocytemacrop hage colo ny2stimulating factor 胞浆域 ,但当其存在时 ,则对配体胞吞具有正性或负 recep tor alp ha subunit critical for f unctio n. evidence for for2 β性影响 ,缺失 C 末端 122 个氨基酸可阻断c 介导的 matio n of a heterodimeric recep tor co mples p rior to ligand
配体胞吞 ,而缺失邻近该 122 个氨基酸上游的 300binding. J Biol Chem ,1994 ,269?277 个氨基酸区域并包括该 122 个氨基酸则反可使胞吞 6 Bagley CJ , et al . The st ruct ural and f unctio nal basis of cy2
β水平增高 。对此似乎矛盾现象的解释是 ,可能c 胞 β to kine recep tor activatio n?lesso ns f ro m t he co mmo nsub2浆域某些结构特征如大小 、次级结构或三维折叠对 unit of t he granulocyte2macrop hage colo ny2stimulating fac2
β胞吞效率有一定影响 ; 然而 ,对受体代谢中c 亚单 ( ) tor ,interleukin23 IL - 3 , and IL - 5 recep tors. Blood ,
1997 ,89?1471位在胞吞中的确切作用 ,尚需进行更多的研究 。 我
7 Weissman AM ,et al . Only high affinit y recep tors for inter2 们的实验还显示 ,蛋白质酪氨酸磷酸化与配 leukin 2 mediate internalizatio n of ligand. Proc Natl Acad Sci 体胞吞无关 ,因为酪氨酸激酶抑制剂不能改变其胞U SA ,1986 ,83?1463 9 吞水平 ,与此相类似的是 , Okuda 等发现 ,酪氨酸 Hatakeyama M ,et a . A rest ricted cytoplasmic regio n of IL - 8
激酶的活化并不支持 GM - CSF 诱导的胞吞 ; 另一 β 2 recep torchain is essential for growt h signal t ransductio n 664 ( ) 方面 , 有人证明特异性丝氨酸残基 S磷酸化对 but not for ligand binding and internalizatio n. Cell ,1989 ,59
10 ?837于多聚免疫球蛋白受体胞吞是必需的。我们观
9 Okuda K , et al . Internalizatio n of t he granulocyte2 察到 ,丝氨酸/ 苏氨酸激酶抑制剂 H - 7 和星形孢菌 macrop hage colo ny2stimulating factor recep tor is not re2 素可抑制 GM - CSF 诱导的受体胞吞 ,因而推测丝 quired for inductio n of p rotein t yrosine p hosp horylatio n in
11human myeloid cells. Blood ,1991 ,78?1928 。氨酸或苏氨酸磷酸化可能影响配体胞吞过程 10 Hirt R P ,et al . Transcytosis of t he polymeric Ig recep tor re2
quires p hosp horylatio n of serine 664 in t he absence but not 参 考 文 献 t he p resence of dimeric IgA. Cell ,1993 ,74?245 α 1 Mire2Sluis A , et al . Evidence for a signalingrole for t he 2 Khwaja A , et al . Isoquinolinesulfo naide p rotein kinase in11 chains of grnaulocyte2macrop hage colo ny2stimulating factor hibitors H - 7 and H - 8 enhance t he effect s of grnaulocyte2 ( ) ( ) GM - CSF,interleukin - 3 IL - 3,and IL - 5 recep tor?( ) macrop hage colo ny2stimulating factor GM - CSFo n neu2 divergent signaling pat hways betewwn GM - CSF/ IL - 3 t rop hil f unctio n and inhibit GM - CSF recep tor internaliza2 and IL - 5 . Blood ,1995 ,86?2679 tio n. Blood ,1990 ,76?996 2 Di Persio J F , et al . Characterizatio n of human grnaulocyte2 () 1999 年 7 月 12 日收稿macrop hage colo n2stimulating factor recep tor . J Biol Chem ,
()rat s wit h radiatio n - induced hippocampal damage. Behav 上接第 1260 页
田 野 ,等 . 放射性脑损伤实验研究之近况 . 中华放射医2 Neurosci ,1989 ,103?722
学与防护杂志 ,1998 ,18?442Fi ke J R , Gobbel GT. Cent ral nervous system radiatio n in2 5
胡逸民 . 电离辐射的剂量测量 . 见 : 谷铣之 ,等主编 . 肿瘤 3 jury in large animal models. In : Gutin P H , et al . eds. Ra2 放射治疗学 . 第 2 版 . 北京?北京医科大学 、中国协和医 diatio n injury to t he nervous system. New Yor k : Raven 科大学联合出版社 , 1993?45 Press L t d , 1991?113
4 Mickley GA , et al . Spo ntaneous perseverative t urning in () 1999 年 8 月 23 日收稿
范文四：四种咪唑钌配体与DNA的作用方式
四种咪唑钌配体与 DNA 的作用方式
2016-06-28 13:40来源:内江洛伯尔材料科技有限公司作者:研发部
四种钌配体结 构图
近年来 , 设计、合成具有低污染、高灵敏、高选择的新型过渡金属配合物的 DNA 识别探针 , 并发展一些新的有价值的诊断试剂的研究 , 已经成为生物无机化学研究领 域的热点 . 与其它类型的金属配合物相比 , 多吡啶钌 (Ⅱ ) 金属配合物与 DNA 之间的 相互作用具有自己鲜明的独特之处 , 这类配合物带有手性的八面体构型 , 热力学稳定 性好 , 还有丰富的光化学、光物理、氧化还原等特性 , 而 B-DNA 同样具有手性 . 可通 过它们之间的立体性结合 , 来实现手性合成小分子对手性生物大分子的结构识别 . 自从 Barton 报道 [Ru(phen)3]3+具 DNA 识别能力后 , 多吡啶钌 (Ⅱ ) 配合物被广泛地用 于 DNA 二级结构探针 . 其中 , 最著名的是可以充当 DNA 分子光开关的
[Ru(phen)2dppz]2+. 在水中 , 该配合物中 dppz 的吡嗪环上的两个氮原子易与水分 子形成氢键而质子化 , 使配合物激发态能量容易散失 , 因而在水溶液中不发光 . 但在 DNA 存在时 ,dppz 插入 DNA 碱基对平面间 , 在疏水环境中大大降低了受到水分子猝灭 的可能性 , 从而观察到很强的荧光 .
对于钌八面体配合物 , 由于可以通过修饰配体的三维空间形状 , 增加一 些功能性基团来匹配 DNA 的螺旋双轴 , 所以配体的形状和极性 , 直接影响了钌配合物 与 DNA 的相互作用 .
中山大学光电材料与技术国家重点实验室计亮年等人合成了 4-氰基苯 基咪唑并 [5,6-f ]邻菲咯啉 (CYIP)和 2-羧基苯基咪唑并 [5,6-f ]邻菲咯啉 (COIP)两 种新配体及它们的钌混配配合物 [ Ru(bpy)2CYIP](ClO4)2·2H2O(Ru1)(bpy= 2 ,2′ 2联吡啶 ) , [ Ru(phen)2CYIP] (ClO4)2·H2O(Ru2) (phen = 1 ,10-邻菲咯 啉 ) ,[Ru(bpy)2COIP](ClO4)2·3H2O( Ru3) 和 [Ru(phen)2COIP](ClO4)2·H2O(Ru4),并用红外光谱、紫外光谱、核磁和质谱对它们进行了表征 . 通过循环伏安法研究了 这些配合物的电化学性质 . 采用电子吸收光谱、稳态荧光、圆二色谱和粘度测定研 究了配合物与小牛胸腺 DNA 的相互作用 . 结果表明配合物 Ru1和 Ru2通过 CYIP 配体 以插入的方式与 DNA 结合 , 而配合物 Ru3和 Ru4则通过 COIP 配体以部分插入的方式 与 DNA 结合 .
范文五：【word】 Eph受体和Ephrin配体的研究进展
Eph受体和Ephrin配体的研究进展
《中国癌症杂志》2003年第13卷第1期
CHINAONCOLOGY2003Vo1.13No.1
Eph受体和Ephrin配体的研究进展
[摘要]蛋白酪氨酸激酶基因家族是最大的癌基因家族,蛋白酪氨酸激
酶参与信号传导通路,控制细胞形态,
参与细胞增殖,分化和迁移.本文就Eph受体和Ephrin配体在正常发
育过程中的作用以及可能的促进肿瘤生成作
用的最新研究进展进行综述.
[关键词]受体酪氨酸激酶;轴突向导;血管生成
中图分类号:R730.23文献标识码:A文章编
号:1007—3639(2003)0l-0079-04
RecentadvancesinEphreceptorsandEphrinligandsLUOChao,TIANGang,X
UMin—hui
,DepartmentofNeurosurgery,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing
400042,China)
【Abstract】
Proteintyrosinekinasegenesarethelargestfamilyofoncogenes.Thisisnotsurp
risingsinceprotein
tvI_()sinekinasesareimportantcomponentsofsignaltransductionpathwaysthatcontrolcellshapes,proliferation,
differentiation.andmigration.ThisreviewwilladdresstherecentprogressinunderstandingthefunctionofEphreceptor
andephrinligandsinnormaldevelopmentandhowdisregulationofthesefunctionscouldpromotetumorigenesis.
【Keywords】receptortyrosinekinase;axonguidance;angiogenesis
目前已明确的Eph受体和Ephrin配体共有l4
个成员,Eph激酶组成了受体酪氨酸激酶的最大家
族.Eph受体是新发现的酪氨酸蛋白激酶受体
(RTK)家族中最大的分支,其分布广泛,结构上高
度保守,参与神经系统细胞间相互作用,并与轴突发
育路径有关;最近的研究资料显示Eph家族蛋白与
肿瘤发生相关.正是由于近来Eph受体和其配体
Ephrin成为研究的热点,并且出现命名混乱,于是在
1996年9月来自世界各地代表2O多个实验室的专
家一致通过了新的命名方案ll:配体名为Ephrin,起
源于古希腊字ephoros,其意为”监工”;根据配体结
构不同分为两种亚型:通过糖基磷酯酰肌醇(GPI)
固定于胞膜上的称为EphrinA亚型共5种;而3种B
亚型的Ephrin配体则属于跨膜蛋白.根据同源序
列将Eph受体也分为两组:EphA和EphB受体.虽
然Ephrin配体与Eph受体可以混杂结合,但仍具有
一
些优先选择性.通常Ephrin.A型配体优先与
EphA型受体结合,而Ephfin—B型配体则优先与
EphB型受体结合.以下就Eph受体和Ephfin配体
在生理和病理两方面的作用进行综述.
一
Eph受体和Ephrin配体的生理功能
(一)Eph受体和Ephnn配体参与双向信号
第一作者简介:罗超,男,主治医师,湘雅医学院在读博士生.
调节
Bruckner等研究发现Eph受体的下游基因
和Ephrin配体的下游基因均参与双向信号调节.
在细胞质结合域Eph受体特定的酪氨酸残基被磷
酸化后与相应的配体结合.磷酸化后的基序的作用
就是为细胞质信号蛋白提供相互作用的位点.这些
蛋白质包括以下几种类型:例如非受体酪氨酸激酶
Src与Abl两个家族和非受体磷酸化的蛋白酪氨酸
磷酸酶LMW—frrP(低分子量的磷酸化蛋白酪氨酸磷
酸酶);酶类如磷脂酶c,磷脂酰肌醇3激酶和Ras
GTPase激活蛋白;衔接子如SLAP,Grb2,Grb10和
Nck;以及SHEPI,一种R—Ras一和RAP一1A结合蛋白.
通过c末端Eph受体与PDZ(突触后密度蛋白,结
合面大,带状疱疹样结合)结合域相连,容纳像AF6,
一
种为RaplA的后选效应器蛋白质;Pickl,一种蛋
白激酶C一相互作用蛋白;Syntenin,一种syndecan一相
互蛋白;以及Gripl和Grip2,两种谷氨酸受体相互
作用蛋白[3j.上述蛋白质中有许多参与调节Eph
受体的活性,同时参与调节细胞形态,粘附和运动.
随着受体与配体相结合,跨膜Ephrn—B配体的
酪氨酸残基上发生磷酸化].虽然Ephfin—B磷酸
化位点的特性与其功能上的相关性目前不清楚,但
这足以提示Ephrin—B与酪氨酸激酶相关.这种结
合可以解释为什么当Ephrin—B配体无酶活性时仍
80罗超,等.Eph受体和Ephrin配体的研究进展
能传导信号.Ephrin—B配体通过其c一末端与多个
PDZ结合域相互作用并且容纳Syntenin.Grip,
Piekl,Phip和磷酸化的蛋白酪氨酸磷酸酶FAP一1;
这些蛋白也可能参与Ephrin—B的信号通路.Daniel
等的研究表明Ephrin—A配体在缺乏细胞质部分
也参与信号传导
(二)细胞归类
在许多组织发育中,凡是Eph受体表达的部位
均限制Ephrin配体的表达;Eph受体和Ephrin配体
系统限制临近细胞群的混杂.Xu等的研究表明
Eph家族蛋白质对后脑的部分形成模式发挥作用,
例如它们阻止临近部分像神经脊细胞的主干和菱脑
原节的细胞混杂.此外,Donoghue等的研究发
现EphA蛋白在灵长类胚胎脑皮层特定层面,特定
区域表达模式提示存在一个早期规范假定功能区的
作用.在神经系统外由Eph蛋白调节细胞隔离的
一
个显着例子,就是受体EphB4只表达于胚胎静脉
血管内皮细胞上,而其配体Ephrin—B2只表达于胚
胎动脉血管内皮细胞上.
(三)轴突向导
从视网膜到中脑顶盖之问神经纤维的排列方式
是Eph受体调节轴突介导的一个经典例子.
Drescher研究发现颞侧视网膜轴突纤维,含有较
高的EphA3表达,投射到表达其配体Ephrin.A2和
Ephfin—A5较低水平的顶盖前部;并在离体实验证实
这两种配体与其受体互为排斥分子.有人用逆转录
酶病毒表达的研究方法,改变活体鸡视区顶盖
Ephrin—A2的分布时,将会诱发颞侧轴突产生异常投
射轨迹并能避开异位区域高配体表达].Feldheim
等用基因敲除在体实验证实,为了形成正确的介
导和视网膜轴突纤维投射,在哺乳动物的中脑需要
Ephrin—A2和Ephfin—A5两种配体与其受体的相互
排斥活性.Eph受体调节轴突介导的例子并不局限
于视网膜到中脑顶盖或视丘的投射通路:例如
Vanderhaeghen等…研究发现,若破坏Ephrin—A5基
因,在新皮层躯体感觉区域产生混乱的投射并且投
射到前脑感觉纤维缺乏精确的解剖定位.此外,皮
质脊髓束可因EphA4基因失活而出现严重的探路
缺失;EphB3受体基因的失活会影响轴突纤维投射
到胼胝体;EphB2基因失活引起支配耳的中线连合
的轴突投射选择失误.在脊髓纵向投射的联合轴突
探路过程中,EphB受体起重要作用.
Birgbauer等”用基因敲除实验证实,Ephrin.B
配体在它们表达轴突中传导信号.例如,通过
Ephrin.B配体与EphB受体胞外结合域相互作用,
显示出介导轴突生长形成大脑前连合,或者形成视
网膜神经节细胞轴突.事实上,当在老鼠缺某一特
定EphB基因,就出现轴突投射异常,但这种介导错
误会被表达缺乏激酶结合域但含有胞外结合域的
EphB2的修整形式所纠正.EphB2的内在信号传导
功能作为介导轴突并非必须,而其胞外结合域却扮
演重要角色,并推测是通过激活Ephrin—B配体的信
号传导通路.
(四)在突触的作用
Eph家族蛋白的功能涉及介导轴突到达靶区,
也影响神经元初始接触突触和突触维持的发育过
程.Eph受体和Ephrin配体在神经元定位过程提示
出了这些蛋白质的以前意想不到的功能;它们激活
突触双向信号通路,破坏突触的稳定性而激发突触
的可塑性;通过EphB2与Ephrin—B1相互作用可产
生粘附作用,EphB2和Ephrin.B1在突触的定位很
有可能依靠PDZ结合域j.
(五)血管生成
Eph受体作为受体酪氨酸激酶一个家族之一,
一
旦与其配体结合,就能控制血管形成.Ephrin.A1
是Eph受体的第一个被明确的配体,作为一种被肿
瘤坏死因子仅(TNFe~)诱导的基因,已从人脐静脉内
皮细胞(HUVECs)克隆出.在非成人组织早期器官
形成的胚胎内皮细胞中已检测出Ephrin.A1转录,
这预示Ephrin—A1配体在血管形态发生中发挥生理
作用.Pandey等在小鼠在体血管生成实验中证
实了Ephrin—A1的血管生成活性.在这种实验中,
Ephrin—A1而非FGF,特定地调节TNFc~的血管生成
效果,提示Ephrin—A1的诱导以及随后其配体
EphA2的激活,可能调节TNFe~的血管生成效果.
Ephrin—A1并不引起内皮细胞增殖,而是为内皮细胞
扮演化学粘附作用.
Wang等分别发现其他3种Eph受体如
EphB2,EphB3和EphB4以及它们的配体Ephrin.B1
和Ephrin—B2,与小鼠胚胎循环系统的形成有关.
Ephnn—B2在动脉内皮细胞上表达,而EphB4补充
表达并局限于静脉内皮细胞.EphB4和Ephrin.B2
可以确定动静脉内皮细胞的边界.然而,Eph受体
与Ephrin配体的表达并不局限于动静脉的分界上:
Ephrin.B1可以广泛地表达于动静脉的内皮细胞:而
EphB3可以表达于静脉和一些动脉上.最后,
Ephrin’B2和EphB2在临近血管的间充质上表达提
示Eph家族蛋白也具有调节间充质与内皮细胞之
《中国癌症杂志》2003年第13卷第1期81
间的相互作用.实际上,如果小鼠缺乏Ephrin—B2
和一定比例的EphB2与EphB3,将在胚胎血管系统
塑性方面显示出严重缺陷.
二Eph受体和Ephrin配体的病理作用
(一)Eph受体和Ephrin配体在肿瘤中表达
EphA1作为这个基因家族第一个受体,最早是
从产生促红细胞生成素的肝细胞瘤细胞系中分离
出.已发现乳腺癌,肝癌,肺癌和结肠癌显示出这种
受体的高表达,但缺乏基因扩增和重排方面的证据.
另外,在NIH3T3细胞中EphA1的过度表达导致在
软琼脂中形成类似病灶,在裸鼠中形成肿瘤.
A和B型的其他受体的表达水平在各种肿瘤中
均见增高.在几乎所有黑色素瘤细胞系实验中均可
见EphA2过度表达,而在正常的黑色素细胞中不能
检测出.黑色素瘤EphA2的表达水平是远处转移
病灶明显高于原发病灶.虽然缺乏基因扩增和重排
证据,EphA3在前B细胞白血病细胞系表面作为抗
原被鉴定,并在一些造血系统肿瘤和淋巴细胞肿瘤
细胞系中存在过度表达.Kiyokawa等?研究发现
在3l例肿瘤细胞系的实验中约1/3的病例检测出
EphB2过度表达,在检测的胃部肿瘤和一些食管及
结肠肿瘤中约有75%存在EphB2过度表达.在一
些乳腺和皮肤起源的肿瘤细胞系中可检测出
EphB3.
Berclaz等用原位杂交的方法分析人乳腺癌
组织显示,伴随着原发性浸润性导管型乳腺癌恶性
程度的增高,EphB4的表达水平也增高.特别在?
级恶性乳腺癌中可发现EphB4强表达,并且这种类
型肿瘤的外层细胞极易脱落造成转移.在研究乳腺
癌起源的转基因模型中,在表达H.Ras致癌基因小
鼠的未分化,浸润性乳腺癌中能检测出EphB4和
EphA2,但表达c—Myc小鼠的分化良好,无转移的乳
腺肿瘤中却检测不出.Nikolova等?发现H—Ras
肿瘤恶性过程的进展与EphB4从肌上皮细胞转换
到上皮起源的退形性肿瘤细胞上表达相关.Berclaz
等’”发现在所有人乳腺癌被检测的细胞系中,包括
MCF7,MDAMB一231,SKBR,T47D,BT20和BT474,
均可检测出EphB4mRNA.
在肿瘤组织中Eph受体的表达水平与被观测
肿瘤的恶性程度之间似乎存在一种正相关.至于
Ephfin配体,目前未查到相关资料.实际上,Ephfin
在肿瘤中的表达模式的研究仅仅才开始,还需要做
大量的工作.Easty等研究发现在黑色素瘤中已
存在Ephfin—A1和Ephfin—B2表达上调,但在小鼠乳
腺肿瘤模型中,Ephrin—B2的表达被主要地限制在腔
上皮细胞,对肿瘤起源失去作用.Bruckner等研
究发现跨膜的EphrinB型配体显示出抑制转换致癌
基因酪氨酸激酶活性的作用.
(二)分子水平控制整合素活性——提高细
胞机动性,侵袭性和转移性
Eph受体通过调节整合素活性从而影响细胞基
质粘附作用.Miao等?研究发现在PC一3前列腺癌
细胞上,激活的内生型的EphA2与Ephrin—A1配体
结合显示出短暂的抑制整合素调节的细胞粘附作
用.蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2快速聚集到激活的
EphA2旁,导致局部粘附激酶(FAK)去磷酸化从而
失活.小分子的GTPaseR—Ras被EphB2酪氨酸磷
酸化后可以调节整合素粘附,这种磷酸化作用有可
能导致R.Ras不能与下游效应基因起作用,并最终
导致整合素活性及粘附能力下降.
Ephrin配体的密度决定Eph介导整合素调节粘
附的效果.低密度的配体以受体依赖的形式刺激整
合素介导的粘附作用;然而,尽管存在相同水平的激
活受体,高密度的配体却没有此作用,这可通过酪氨
酸的磷酸化水平证实.低聚状态的激活配体似乎有
决定信号联合体聚集受体的能力.通过调节整合素
功能增弱,并依靠受体与配体的比率,在体细胞接触
诱导Eph受体激活可以影响方向细胞的移动.随
着对配体刺激敏感性的增高,过度表达的Eph受体
可以诱导肿瘤,降低细胞粘连,提高细胞运动性,并
伴随高度的组织侵袭性.Zisch等?研究发现,也
许配体的存在与否无关重要,因为过度表达的Eph
受体自然地提高自身活性,并且足够提高这种效果.
事实上,抗肿瘤效果观察发现,配体表达低而受体表
达高的条件也许最适宜肿瘤生长和转移.
Eph受体通过与特定的细胞粘附分子作用从而
影响细胞与细胞之间的粘附.缺乏E—cadherin,胚
胎早期和成人上皮细胞的主要粘附分子,将影响几
种Eph受体和配体的表达和亚细胞定位.cadherin
的功能可以被Eph受体和配体调节,异位表达的
Ephfin—B1和早期爪蟾属胚胎中激活的EphA4能破
坏cadherin依赖的细胞粘附作用.涉及这些交叉调
节的分子机制尚不明确.
细胞粘附的调节只是细胞机动性很重要的一方
面.Eph受体参与的细胞介导的过程,就是在细胞
运动形态发生变化时允许细胞骨架成分得以重建.
Rac/Rho家族小分子GTPase是调节这些作用的主
要代表,Eph受体和这些GTPase之间的联系已建立
罗超,等.Eph受体和Ephrin配体的研究进展
起来.用Ephrin.A5刺激视网膜神经节细胞显示出
诱导以Rho依赖方式的生长锥的破溃,抑制Rho或
Rho效应基因的下游基因,Rho激酶(ROCK)明显地
减弱Ephrin.A5诱导的生长锥的破溃,甚至允许生
长锥在配体存在的情况下持续生长.在离体实
验发现,Rho蛋白是细胞骨架肌动蛋白的调节基因,
为细胞浸润所必须,经过Eph受体激活可能提高肿
瘤侵袭和转移能力.
(三)促进血管生成——促进肿瘤生长
虽然我们现在已经了解Eph受体和配体在胚
胎血管形成中所起的重要作用,但对于病理性血管
生成准确机制尚不清楚.然而,现有的资料允许我
们提出一些假设:既然离体实验显示配体促进组织
和内皮细胞形成毛细血管样排列并刺激现有的血管
芽生,那么这些分子在肿瘤生长中可以起类似作
用.肿瘤组织的增殖依赖相宜的血液供应,并且许
多肿瘤为新生血管生长而分泌血管生成因子.由肿
瘤细胞和内皮细胞表达的Eph受体和配体之间可
以产生相互作用,例如,分泌型的配体可以为内皮细
胞起到扩散的化学粘附作用;表达Eph受体的肿瘤
可以承担为接触依赖性组织分子提供适宜介导新生
血管的任务.尽管其他可能性依然存在,即使其功
能仍然不明确,但血管和肿瘤细胞表达Eph受体和
配体的事实,使这些分子作为预测的肿瘤标记物和
对肿瘤进行治疗干预的靶点而实现其价值.
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[参考文献]
EphNomenclatureCommittee.UnifiednomenclatureforEph
familyreceptorsandtheirligands,theephrins(1etter)[J].
ff’1997.90(3):403-404.
BrncknerK,PasqualeEB,KleinR.Tyrosinephosphorylationof
transmembraneligandsforEphreceptors[J].Science,1997,275
(5306):1640—1643.
BuchertM,SchneiderS,MeskenaiteV.
eta1.Theiunction.
associatedproteinAF-6interactsandclusterswithspecificEph
receptortyrosinekinasesatspecializedsitesofcel1.cellcontactin
thebrain.[J].JCellBiol,1999,144(2):361.371.
DanielTO,SteinE,CerrettiDP.eta1.ELKandLERK.2in
developingkidneyandmicrovascularendothelialassembly[J].
KidneyIra,1996,57(Supp1):$73-81.
XuQ,MellitzerG,RobinsonV,eta1.Invivocellsortingin
complementarysegmentaldomainsmediatedbyEphreceptors
andephrins[J].Nature,1999,399(6733):267-271.
DonoghHeMJ,RakicP.Molecularevidencefortheearlv
specificationofpresumptivefunctionaldomainsintheembryonic
primatecerebralcortex[J].JNeurosci,1999,19(14):5967.
5979.
DrescherU.TheEphfamilyinthepatterningofneural
development:review[J].CurtBiol,1997,7(12):R799-807.
NakamotoM,ChengH.I,FriedmanGC,eta1.Topographically
specificeffectsofELF一1onretinalaxonguidanceinvitroand
retinalaxonmappinginvivo[J].Cell,1996,86(5):755-766.
FeldheimDA,VanderhaeghenP,HansenMJ,eta1.
Topographicguidancelabelsinasensoryproj’ectiontothe
forebrain【J].Neuron,1998,21(6):1303—1313.
VanderhaeghenP,LuQ,PrakashN,eta1.Amappinglabel
requiredfornormalscaleofbodyrepresentationinthecortex
[J].NatNeurosci,2000,3(4):358—365.
BirgbauerE,CowanCA,SretavanDW,eta1.Kinase
independentfunctionofEphBreceptorsinretinalaxon
pathfindingtotheopticdiscfromdorsalbutnotventralretina
1241. [J].Development,2000,127(6):1231—
PandeyA,ShaoH,MarksRM,eta1.RoleofB61,theligand
fortheEckreceptortyrosinekinase,inTNF—alpha—induced
angiogenesis[J].Science,1995,268(5210):567—569.
WangHU,ChenZF,AndersonDJ.Moleculardistinctionand
an~ogenicinteractionbetweenembryonicarteriesandveins
B4[J].Cell,1998, revealedbyephrin—B2anditsreceptorEph—
93(5):741-753.
KiyokawaE,TakaiS,TanakaM,eta1.Overexpressionof
ERK,anEPHfamilyreceptorproteintyrosinekinase,invarious
humantumors[J].CancerRes,1994,54(14):3645—3650.
BerclazG,AndresAC,AlbrechtD,eta1.Expressionofthe
receptorproteintyrosinekinasemyk一1/htkinnormaland
malignantmammaryepithelium[J].BiochemBiophysRes
Commun,1996,226(3):869-875.
NikolovaZ,DjonovV,ZuercherG,eta1.Cell—typespecificand
estrogendependentexpressionofthereceptortyrosinekinase
EphB4anditsligandephrin—B2duringmammarygland
morphogenesis[J].JCellSci,1998,111(Pt18):2741-2751.
EastyDJ,HillSP,HsuMY,eta1.Up—regulationofephrin—A1
duringmelanomaprogression[J].JCancer,1999,84(5):
494.501.
MiaoH,BurnettE,KinchM,eta1.ActivationofEphA2
kinasesuppressesintegrinfunctionandcausesfoca1.-adhesion.-
kinasedephosphorylation[J].NatCellBiol,2000,2(2):62.
69.
ZischAH,StallcupWB,ChongLD,
eta1.Tyrosine
phosphorylationofL1familyadhesionmolecules:implicationof
theEphkinaseCek5[J].JNeurosciRes,1997,47(6):655.
665.
WahlS,BarthH.CiossekT.eta1.
Ephfin—A5inducescollapse
ofgrowthconesbyactivatingRhoandRhokinase[J].JCell
Biol,2000,149(2):263.270.
BanyardJ,Anand?ApteB,SymonsM.eta1.Motilitvand
invasionaredifferentiallymodulatedbyRhofamilyGTPases[J].
Oncogene,2000,19(4):580.591.
(收稿日期:2002-05-07修回日期:2002-08.21)
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