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范文一：氨基转移酶

氨基转移酶（ALT，AST）及其同工酶

氨基转移是氨基酸代谢中基本生化反应之一，在机体内存在着多达60种氨基转移酶，丙氨酸基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）是其中最重要的两种。

ALT催化下列反应：

AST催化下列反应：

它们都需要磷酸吡哆醛（维生素B4）为辅基，不含磷酸吡哆醛的酶蛋白称为

脱辅基酶蛋白，没有催化活性。血清除含有有活性的全酶外，还有部分不含磷酸吡哆醛的酶蛋白，如在测定前，先加入足量磷酸吡哆醛，所测血清转氨酶活性常有明显升高。

AST有两种受不同基因控制的同工酶分别存在于细胞质（c-AST）和线粒体（m-AST）中，而一般认为ALT不存在同工酶，我国学者证实在人组织和血清中也存在类似AST的两种同工酶，即细胞质ALT（c-ALT）和线粒体ALT（m-ALT）。

【组织分布】

AST广泛存在于多种器官中，按含量多少顺序为心脏、肝、骨骼肌和肾，还有少量存在于胰腺、脾、肺及红细胞中，肝中AST大部分（70％）存在于肝细胞线粒体中。

ALT也广泛存在于多种器官中，含量最多的不是心脏，而是肝，顺序为肝、肾、心、骨骼肌等，与AST相比，在各器官中含量都比AST少，肝中ALT绝大多数存在于细胞质中，只有少量在线粒体中。

【生理变异】

此二酶生理变异较小，性别、年龄、进食、适度运动对酶活性无明显影响，每天虽有生理性波动，但无统计学意义。

表1 ALT和AST在疾病时的变化

【标本的采集、处理和贮存】

红细胞中AST和ALT分别为血清含量的15倍与7倍，所以明显溶血标本不宜测此二酶。

宜采用血清为测定标本，此二酶在4℃冰箱中贮存一周，活性无明显变化，最好不要冰冻，因为在融冻时很容易破坏酶的活性。

【参考值范围】

一般临床使用方法中不加入磷酸吡哆醛，其参考值范围较加入磷酸吡哆醛的为低，ALT为5-40U/L（37℃），AST为8-40U/L（37℃）。

【临床应用】

根据此二酶在人体器官中分布情况，临床医师习惯将ALT用在诊断肝脏疾病，测定AST诊断AMI。在AMI时，不论在出现升高时间，还是升高持续时间，其变化介于CK和LD之间，无特殊价值，随诊断AMI的新试验日益增多，国外已

建议不用。ALT在AMI时一般不增高或轻度增高，明显升高常说明有右心衰竭合并肝淤血，m-AST变化比总酶更慢，但其增高程度与坏死病变程度密切相关，是判断AMI预后的一个很好指标。

目前转氨酶测定主要用于肝胆疾病的诊断和鉴别诊断。ALT是我国目前测定次数最多的酶，假如能同时测定AST，并计算出文献上常提到的Deritis比值，即AST/ALT之比，在诊断和鉴别诊断上将是很有用的。

（一）丙氨酸氨基转移酶（ALT）

以前常简称GPT，近年来国外多以ALT为此酶缩写。ALT是我国测定次数最多的酶，这是因为我国肝炎较多，而肝是含ALT最丰富的器官，且大部分存在于肝细胞的胞质中。肝炎时，细胞膜通透性增加，由于肝细胞中ALT浓度约比血清高7000倍，只要有1/1000的肝细胞中的ALT进入血液就足以使血中ALT升高1倍，故此酶是肝损伤的一个很灵敏指标。肝炎时早在黄疸前期就升高，峰值可达数千单位，为正常上限的百余倍。一般而言在急性肝炎时，血清ALT活性高低与临床病情轻重相平行，又由于ALT半寿期较长，往往是肝炎恢复期最后降至正常的酶，是判断急性肝炎是否恢复的一个很好指标。此外在慢性肝炎特别是慢性活动性肝炎ALT也经常升高。因此临床医师对急慢性肝炎患者经常检查ALT并据此诊断和判断病情。

应注意两种情况，重症肝炎时由于大量肝细胞坏死，此时血中ALT可仅轻度增高，临终时常明显下降，但胆红素却进行性升高，即所谓的“胆酶分离”，常是肝坏死征兆。另一种情况是少数人血清中ALT长期持续升高，肝穿无明显病理改变，预后良好，对此现象目前仍在研究之中。

肝炎时ALT常有明显变化，但不能反过来认为凡ALT升高者就有肝炎，其它肝胆疾病如胆石症、胆囊炎、肝癌和肝淤血时也可升高。由于肝脏以外不少器官也含有ALT，因此在AMI、多发性肌炎、急性肾盂肾炎等患者血中ALT也可升高，但一般而言，这些疾病ALT升高很少超过正常上限10倍，常以400U/L为界，超过此值绝大多数可诊断为肝炎。但也有例外，有人报告个别肝淤血、胆石症等患者可超过此界，但在这种情况时，ALT变化往往很快，过几天复查，ALT就可降至400U/L以下。

（二）天冬氨酸氨基转移酶（AST）

以前常简称GOT，现多以AST为缩称，既往认为AST主要存在于心肌中，主要用于诊断AMI。但目前由于AST在AMI时升高迟于CK，恢复早于LD，故诊断AMI价值越来越小，国外不少学者认为诊断AMI，完全可以不测AST。

另一方面肝中AST含量虽低于心肌，但绝对含量（U/mg）仍高于ALT。肝中AST和ALT含量比值约为2.5：1.0。只是由于ALT主要存在于细胞质中，AST主要存在于线粒体中，病变较轻的肝脏疾病如急性肝炎时血中ALT升高程度高于AST，但在慢性肝炎，特别是肝硬化时，病变累及线粒体，此时AST升高程度超过ALT。故在国外对疑是肝炎患者常同时测AST和ALT，并计算AST/ALT比值，

正常约为1.15，急性肝炎第1、2、3和4周分别为0.7、0.5、0.3和0.2。如比值有升高倾向，应注意有无发展为慢性肝炎可能，慢性肝炎时可升到1.0以上，肝硬化时可达2.0，此比值对判断肝炎的转归特别有价值。

范文二：糖基转移酶

2009年第29卷

第5期, 703～715

有机化学

Chinese Journal of Organic Chemistry

V ol. 29, 2009 No. 5, 703～715

* E-mail: lixl@mail.hbu.edu.cn; Tel.: 0312-5971116.

Received November 28, 2007; revised October 10, 2008; accepted November 6, 2008.

国家自然科学基金(Nos. 20472015, 20672027)、河北省自然科学基金(Nos. 2005000106, B2008000588)、教育部科学技术研究重点(No. 206013)和国家博士后基金资助项目.

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有机化学 V ol. 29, 2009

图1 糖基转移酶催化的两种反应过渡态

Figure 1 Two schematic presentations in the transition state of glycosyltransferation

1 亚氨基糖衍生物

亚氨基糖(Iminosugar)是一类糖环上氧原子被氮取代的糖类衍生物, 又称为氮杂糖(Azasugar), 由于该类化合物与单糖结构相似, 且在体内更易质子化形成阳离子中间体, 与酶活性中心的酸负离子结合, 组成稳定的过渡态, 从而表现出强的糖苷酶抑制活性[17]. 而糖基转移酶与糖苷酶有类似的反应过渡态(作用机制), 因此亚氨基糖作为糖基转移酶抑制剂的研究较多, 已有多篇综述报道[8,18

～20]

表明GDP 与亚氨基糖可能在酶活性中心形成了复合体共同参与酶反应过程[25](图3).

2005年, Behr等在寻找抗真菌药物的研究中发现多羟基吡咯化合物5 (6-deoxy-homo DMDP)对啤酒酵母的几丁质合成酶(该酶催化N -乙酰基-D-氨基葡萄糖聚合形成几丁质, 其抑制剂可用于抗真菌药物的开发) 有很强的抑制作用[26], 进而考察了其异构体6的活性, 并在该类化合物的结构基础上合成了两类化合物7～12和13～16[27](图4), 以探讨其几丁质合成酶抑制活性和构效关系. 结果显示, 两类化合物的抑制活性(表1) 较化合物5的要低, 其原因可能是由于化合物结构或构型的改变, 使其不能更好的被酶识别.

, 图2列出了部分活性较高的亚氨基糖.

化合物1是一类结构简单但活性很高的选择性α-半乳糖基转移酶抑制剂[21], 而化合物2～4具有很好的选择性岩藻糖基转移酶抑制活性[22表现出更强的协同抑制效果

[24]

～24]

. 化合物4在2

μmol/L的GDP(鸟嘌呤核苷-5'-二磷酸二钠) 的参与下,

. 真核细胞内部通常含有

μmol级的GDP, 在使用亚氨基糖作为岩藻糖基转移酶抑制剂的体内

测试时, 也能观察到协同抑制作用[23]. 这

2 碳糖苷衍生物

碳苷(C -glycosides) 是糖环异头碳直接与碳原子相连接的糖苷衍生物, 由于其对酸和酶催化水解的卓越稳

图2 部分糖基转移酶抑制剂

Figure 2 Selected inhibitors of glycosyltransferase

No. 5

陈华等：糖基转移酶抑制剂研究进展

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表1 化合物5～16对几丁质合成酶的抑制活性a

Table 1 Inhibition of chitin synthesis by compounds 5～16 Compd. 5 6

图3 α-1,3-岩藻糖基转移酶的协同抑制模式

Figure 3 Proposed model for the synergistic inhibition of

α-1,3-fucosyltransferase

－

IC 50/(mmol?L 1)

Compd. IC50/(mmol?L －1) 12 13 14 15 16

1.6±0.2 0.82 4.33 18.9 10.7

0.065 4.0±0.5 2.6 5.7±0.8

N.I. at 8 mmol?L －138±4

N.I. at 5 mmol?L －17 8 9 10

N.I.: No inhibition.

钠) -半乳糖上的半乳糖基连接到N -乙酰氨基葡萄糖3位或4位羟基上. 由于半乳糖基转移酶催化许多重要的细胞表面的低聚糖如血型抗原和肿瘤、免疫过程涉及到的E-selectin 凝集素Sialy Lewis X等的生物合成而受到广泛关注[28], 其抑制剂可用于治疗器官移植排异等免疫系统疾病. Vidal等[29]根据酶催化反应过渡态特点, 设计合成了碳苷化合物17, 化合物对β-1,4-半乳糖基转移酶很好的抑制活性(IC50＝40 μmol/L)(图5), 与酶天然底物UDP-半乳糖(K m ＝51 μmol/L) (K m 为米氏常数) 相当. 化合物18没有抑制活性说明核苷部分对保证抑制剂活性

图4 几丁质合成酶抑制剂5～16

Figure 4 Chitin synthetase inhibitors of 5～16

是必须的. 分别以岩藻糖基和2-N -乙酰氨基葡萄糖基代替17中的半乳糖基得到的化合物19和20[29], 对岩藻糖基转移酶

(Fut3)和N -乙酰氨基葡萄糖基转移酶(LgtA)的抑制活性却并不高, 分别为IC 50＝2 mmol/L和IC 50＝3.5 mmol/L(相应天然底物的K m 值分别为43和540 μmol/L). 2.2 几丁质合成酶抑制剂

Chang 等[30]合成了结构与20类似的化合物21, 然而, 其对几丁质合成酶的抑制活性亦不理想(图6). 这表明, 至少对该酶而言, 亚甲基替代糖苷键氧原子并不会

定性, 自20世纪70年代初, 引起糖化学家和生物有机化学家的浓厚兴趣, 广泛用作糖苷酶、糖基转移酶抑制剂和糖类药物设计合成的先导化合物[9]. 2.1 半乳糖基转移酶抑制剂

半乳糖基转移酶催化UDP(尿嘧啶核苷-5'-二磷酸二

图5 碳糖苷糖基转移酶抑制剂

Figure 5 C -Glycoside based inhibitors against glycosyltransferase

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有机化学 V ol. 29, 2009

图6 几丁质合成酶抑制剂21～25

Figure 6 Chitin synthase inhibitors of 21～25

使活性提高. Grugier等[31]设计合成了几丁质合成酶抑制剂22～25, 但未见抑制活性数据报道. 2.3 唾液酸转移酶抑制剂

唾液酸转移酶催化唾液酸由供体底物C M P - Neu5Ac(胞嘧啶核苷-5'-单磷酸钠盐) 转移到半乳糖基的3或6位羟基上. 连有唾液酸的糖基抗原在许多生理过程中如炎症、细胞黏附等扮有重要的识别作用[32], 因此, 高活性唾液酸糖苷酶、糖基转移酶抑制剂的设计发现[15,33], 不仅可能阐明糖缀合物中唾液酸残基的功能, 而且可以开发为抗肿瘤转移, 免疫抑制和消炎药物

CMP-Neu5Ac

Schmidt 等[34]在唾液酸转移酶抑制剂设计合成方面做了卓有成效的研究工作, 他们合成的碳苷过渡态类似物均有很高的抑制活性, 有些达到nmol/L级(图7), 是迄今为止获得的为数不多的达到nmol/L级的几类糖基转移酶抑制剂之一. 这类抑制剂的结构特点符合Horenstein 提出的关于唾液酸转移酶反应过渡态模型[35,36], 结果证明: (1)平面的异头碳结构部位、(2)适当增加异头碳与离去基团CMP 的距离、(3)至少两个负电中心靠近糖基的断裂位置, 是高亲合性(高活性) 抑制剂的必要条件.

在上述的结构设计的基础上, 将半乳糖基引入到分

图7 有潜力的α-2,6-唾液酸转移酶抑制剂 Figure 7 Potential α-2,6-sialyltransferase inhibitors

子中, 构成双底物抑制剂化合物29～31[19](图8). 实验表明, 化合物29对α-2,3-和α-2,6-唾液酸转移酶的抑制率分别为K i ＝25和K i ＝16 μmol/L (K i 为抑制常数), 而30, 31对α-2,6-唾液酸转移酶有较好的抑制效果, 其K i 分别为60和7 μmol/L. 化合物32(氧苷化合物) [37]通过硫桥键在唾液酸3位连接了N -乙酰二糖, 其对α-2,3-N -和α-2,6-N -唾液酸转移酶的抑制率分别为K i ＝13和K i ＝10 μmol/L, 与这两种酶的亲和力大小要分别高出底物CMP-Neu5Ac 与两种酶的亲和力(K m 分别为74.1和42.7 μmol/L)的200和130倍. Izumi等[38]也合成了双底物碳苷类似物33 (图9), 其唾液酸部分与CMP 通过乙烯基相连, 但化合物显示微弱的对α-2,3-和α-2,6-唾液酸转移酶的抑制活性(表 2). 同时, 他们还合成了供体类似物34～37, 以考察唾液酸1位羧基对酶活的影响, 但所有化合物活性并不高, 且化合物35～37的活性均低于34表明唾液酸羧基在此类化合物中的重要性.

2.4 庚糖基转移酶抑制剂

庚糖基转移酶以ADP(腺嘌呤核苷-5'-二磷酸二钠) -糖为供体底物, 将庚糖转移到脂多糖(格兰氏阴性菌细胞外膜的重要组成部分) 的内部核心部位[39,40]. 由于在哺乳生物体系内没有比己糖更高级的单糖, 因此抑制它们的生物合成有望获得新型抗生素. Graziani等[41]合成了ADP D -甘油基-β-D -甘露糖庚糖类似物38 (图10), 用这些化合物正在开展对酶晶体学及其抗ADP D -甘油基- β-D -甘露糖庚糖差向异构化酶和抗ADP 庚糖基转移酶的活性研究 .

No. 5

陈华等：糖基转移酶抑制剂研究进展

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图8 有潜力的唾液酸转移酶双底物结构抑制剂 Figure 8

Potential sialyltransferase bi-substrate inhibitors

图9 唾液酸转移酶抑制剂 Figure 9 Sialyltransferase inhibitors

表2 化合物33～37对α-2,3-和α-2,6-唾液酸转移酶的抑制活性

Table 2 Inhibition of α-2,3- and α-2,6-sialyltransferase by com-pounds 33～37

Compd. 33

34 35 36 37

－

IC 50/(mmol?L 1)

α-2,3-ST 1.3 0.047 3.3 4.2 0.95

α-2,6-ST 2.4 0.34 4.3 3.2 2.3

图10 潜在的ADP 庚糖基转移酶抑制剂

Figure 10 Potential ADP heptosyl transferase inhibitors

X, 后者与肿瘤生长及免疫过程密切相关. 现已普遍认为α-1,3-岩藻糖基转移酶V 在体内活性的升高, 是肿瘤迁移恶化的重要原因, 其抑制剂可控制关节炎的发生和肿瘤的生长[42,6], 因此, 该酶抑制剂尤其是其亚氨基糖类抑制剂是人们研究的热点之一, 而其碳苷类抑制剂研究相对较少[8,18].

Vogel 等[43]合成了以碳链连接的双糖39, 40(图11),

2.5 岩藻糖基转移酶抑制剂

人α-1,3-岩藻糖基转移酶V 以GDP-岩藻糖为供体底物, 催化L -岩藻糖与唾液酸乳糖胺中的N -乙酰氨基葡萄糖3位羟基连接形成E-selectin 凝集素

Sialy Lewis

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有机化学 V ol. 29, 2009

其中39对一些糖苷酶如人胎盘α-L -岩藻糖苷酶(K i ＝28 μmol/L)和α-1,3-岩藻糖基转移酶VI (K i ＝120 μmol/L)具有抑制作用, 而其差向异构体40却没有活性. 39是报道的第一个具有糖基转移酶抑制活性的二糖碳苷, 它作为供体和受体抑制剂均可参与酶反应, 这可能是由于39的结构与Lewis X三糖中的α-L -岩藻糖-(1,3)D -GlcNAc (N -乙酰氨基葡萄糖) 结构部分类似, 而导致其混合抑制模式作用特点. 此外, 39作为受体抑制剂, 对人α-2,6-唾液酸基转移酶和牛奶中的β-1,4-半乳糖基转移酶都没有活性, 表现出良好的选择性. 一些简单的岩藻糖碳苷化合物41～50[44]也表现出一定的对α-1,6-岩藻糖基转移酶抑制活性(表3), 构效关系表明碳苷链1' 位上羟基或氨基的存在可以使化合物抑制活性提高, 如化合物43～48, 50

图11 设计的α-1,3-岩藻糖基转移酶VI 的抑制剂

Figure 11 Designed analogues for the inhibition of α-1,3-fucosyltransferase VI

3 氧糖苷衍生物

3.1 岩藻糖基转移酶抑制剂

研究表明2位N -乙酰氨基乳糖是大多数糖基转移酶的受体底物, 而其2' 和6位羟基在许多酶识别过程中并不必要[45,46], 但有可能与酶活性结合部位以外的其它部位作用, 所以在这两个位置进行结构修饰有可能获得活性更高的化合物, 以作为低聚糖生物合成及代谢过程中的选择性抑制剂. Galan等[47]合成了乙酰氨基乳糖类似物50～62(图12), 作为受体底物探讨2' 和6位不同取代基对不同的糖基转移酶(人重组α-1,3-岩藻糖基转移酶VI 和鼠肝重组α-2,6-唾液酸基转移酶) 的活性影响(表4). 结果表明, 电子效应可能比立体效应更能影响酶活性, 而6位游离的氨基以及2' 和6位的甲基取代会导致酶活性降低. 化合物63[48]是N -乙酰氨基乳糖的2' 差向异构体, 作为底物它不能被α-2,3-, α-2,6-唾液酸基转移酶和α-1,3-岩藻糖基转移酶III, IV, V和VI 识别, 但可以选择性的抑制α-1,3-岩藻糖基转移酶Ⅵ的活性(K i ＝0.475 mmol/L). 这是第一个对不同的岩藻糖基转移酶有选择性抑制效果的低聚糖化合物, 这表明, 酶活性中心结构上的区别可能是决定抑制剂选择性的重要原因.

表3 一些简单的C -岩藻糖苷作为α-1,6-岩藻糖基转移酶抑制剂

Table 3 Several simple C -fucoside as α-1,6-fucosyltransferase

inhibitors

Compd. R IC 50/(mmol?L －1)

41 H 18 42 Me 9

43 (R )

1.7

44 (S )

1.0

0.82

46 (R )

1.9

47 (S )

0.69

2.2

2.0

Von Ahsen等[49]通过改进的小型高通量筛选的方法(miniaturized high-throughput screening assay), 对798131个化合物进行了活性筛选, 以期发现高效的岩藻糖基转移酶VII (FucTVII)的抑制剂. 结果表明, 与该酶特异性受体底物结构极为类似的三糖化合物表现出良好的抑制活性, 其中化合物64 (图13) 的抑制活性最高, IC50＝10 μmol/L.

3.2 N -乙酰氨基葡萄糖基转移酶抑制剂

N -乙酰氨基葡萄糖基转移酶(LgtA)以UDP-N -乙酰

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陈华等：糖基转移酶抑制剂研究进展

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图12 选择性糖基转移酶抑制剂

Figure 12 Selective glycosyltransferase inhibitors 表4 α-2,6-唾液酸转移酶和α-1,3-岩藻糖基转移酶转移N -乙酰神经氨酸到糖基受体50～62的催化反应表观动力学参数a Table 4 Apparent kinetic parameters for the transfer of N -acetyl-neuraminic acid to glycosyl acceptors 50～62 by α-2,6-sialyltransferase and α-1,3-fucosyltransferase

K m /(mmol?L －

K m /(mmol?L －1)

α-2,6-SiaT αα-2,6-SiaT α-1,3-FucT 50 1.7±0.2 350±50 57 0.8±0.1 115±1051 4.1±0.8 390±50 58 1.1±0.3 40±1052 4.3

±0.4 290±50 59 3.1±0.6 40±1053 11.2±0.8 120±30 60 ND 450±7054 0.7±0.1 250±30 61 ＞10 NA 55 5.8±0.2 400±50 62 2.4±0.2 1540±50

1.4 ±0.2 190±20

ND: Not determined; NA: Not active.

图13 受体底物类似物作为岩藻糖基转移酶VII 抑制剂 Figure 13 Accept substrate analogue as fucosyltransferase VII inhibitor

氨基葡萄糖为供体底物, 催化N -乙酰氨基葡萄糖转移到

乳糖的端基半乳糖的3位羟基上, 同时氨基葡萄糖的异头碳构型翻转, 其活性的变化与恶性肿瘤的发生、转移密切相关[50]. 为考察酶对供体底物的专一性, Khaled 等[51]通过两种不同的连接方式合成了供体类似物65～69(图14), 发现只有化合物67具有微弱的酶抑制活性, 而以岩藻糖代替N -乙酰氨基葡萄糖得到的化合物70对岩藻糖基转移酶Ш的抑制活性也不高, 说明在酶与底物结合过程中, 离去基团UDP 有着重要的结合作用.

图14 N -乙酰氨基葡萄糖基转移酶(LgtA)抑制剂 Figure 14 N -Acetylglucosaminyltransferase (LgtA) inhibitors

Hanashima 等[52]在酶供体底物UDP-N -乙酰氨基葡萄糖上通过硫桥键连接三糖分子作为受体, 构成双底物结构抑制剂71～75(图15), 并测试了化合物对哺乳类动物的N -乙酰氨基葡萄糖基转移酶V 和IX (GnT-V和IX) 的抑制活性(表5). 数据显示所有化合物均具有较高的酶抑制活性, 且活性大小与硫桥链的长度有关. 化合物对GnT-IX 的抑制活性普遍高于对GnT-V 的, 说明前者对该类抑制剂可能更敏感.

3.3 半乳糖基转移酶抑制剂

Murata 等[53]针对酶反应中心保守的DXD 区域 (Mn2＋

结合区域, 图1), 以长链烃基代替二磷酸部分得

到了化合物76～79(图16), 在1 mmol/L浓度时, 所有化合物对β-1,4-半乳糖基转移酶没有抑制活性, 进一步说

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有机化学 V ol. 29, 2009

Takaya 等[54]在计算机模拟设计(3D docking simula-tion) 的基础上, 设计合成了化合物80和81 (图17), 发现其萘甲基可以通过与半乳糖基转移酶(βGalT-1)的色氨酸310 (Trp310)残基上的吲哚环相互作用, 而选择性的亲和标记该酶, 同时81还发现具有较高的酶抑制活性. 在此结果的启发下, 他们继而又合成了化合物82～87,

图15 双底物类N -乙酰氨基葡萄糖基转移酶(GnT)抑制剂 Figure 15 Bisubstrate-type inhibitor of N -acetylglucosaminyl- transferase (GnT)

表5 化合物71～75对GnT-V 和GnT-IX 的抑制活性 Table 5 Inhibitory activity of compounds 71～75 for GnT-V and GnT-IX

GnT-V GnT-IX 71 SCH2 7.9 10.1 72 73 74 75

SSCH 2 119.3 4.7 SCH 2SCH 2 47.1 17.6 S(CH2) 2SCH 2 26.9 21.5 S(CH2) 3SCH 2 18.3 15.1

图16 潜在的β-1,4-半乳糖基转移酶抑制剂

Figure 16 Potential β-1,4-galactosyltransferase inhibitors

－

K i /(μmol?L1)

以发现活性更高的酶抑制剂. 结果表明, 化合物82抑制活性最高, K i ＝1.86 μmol?L1高于供体底物UDP-Gal 的

－

K m ＝4.91 μmol?L1值. 有意思的是, 通过低温时间飞行

－

质谱(time-of-flight mass spectrometry)对酶作用机制研究, 发现在Mn 2离子存在下, 化合物82与酶的复合物

＋

不能与酶受体底物发生作用.

明负电性对于DXD 结合区域是很重要的. 不过, 化合物78, 79有更多的官能团(X—Y 通过不饱和键连接), 这将有利于抑制剂结构的进一步修饰, 以获得更高抑制活

性的化合物

图17 半乳糖基转移酶抑制剂

Figure 17 Galactosyltransferase inhibitors

No. 5

陈华等：糖基转移酶抑制剂研究进展

711

3.4 唾液酸转移酶抑制剂

Xia 等[55]合成了系列氟代粘液素核心2 (mucin core 2) 三糖88, 89和四糖90～92(图18), 以考察作为受体底物和抑制剂对唾液酸转移酶活性的影响. 结果表明氟原子取代位置的不同, 对酶的选择性不同. 以化合物90为例, 它是α-2,3(O )-唾液酸转移酶(102%, 酶催化效率) 良好的受体底物, 而对α-2,3(N )-和α-2,6(N )-唾液酸转移酶却是弱的受体底物 (酶催化效率分别是8% 和 3%), 同时对于α-2,6(N )-唾液酸转移酶是个竞争性抑制剂 (K i ＝1.9 mmol/L), 而对于α-2,3(N )-唾液酸转移酶完全没有抑制活性

图19 潜在的唾液酸转移酶抑制剂 Figure 19 Potential sialyltransferase inhibitors

4 非糖基供体过渡态类似物

4.1 岩藻糖基转移酶抑制剂

一些新的合成手段, 如点击化学(click chemistry)也应用在糖基转移酶抑制剂的合成上[58,59], 其中最成功的

图18 氟代粘液素核心2的三糖和四糖作为唾液酸转移酶的新型底物和抑制剂

Figure 18 Fluorinated mucin core 2 tri- and tetra-saccharides as novel substrates and enzyme inhibitors for sialyltransferase

例子当属Wong 等[16]利用该方法合成的化合物98 (图20), 它对α-1,3-岩藻糖基转移酶有很好的选择性抑制活性(表6), 个别达到nmol/L级, 而相对半乳糖基转移酶,

表6 化合物98对各种酶的抑制常数

Table 6 Inhibition constants of 98 for various enzymes Enzyme α-1,3-FucT III α-1,3-FucT V α-1,3-FucT VI α-1,3-GalT β-1,4-GalT

Chokhawala 等[56]在唾液酸的3位引入氟原子, 通过酶法合成了供体底物CMP-Neu5Ac 的氟取代类似物CMP-3F(axial)Neu5Ac (Gc) (93, 94) 和CMP-3F(equato- rial)Neu5Ac(Gc) (95～97) (图19). 这些化合物可作为探针分子用于探讨唾液酸糖苷酶和转移酶的作用机制[57], 同时也是潜在的酶抑制剂

IC 50/(μmol?L1)

－K i /(nmol?L1)

－

1.0±0.2 —

0.9±0.1 270±30 0.15±0.03 62±3 N.I. at 600 μmol?L1

－

— —

N.I. at 600 μmol?L

－1

N.I.: No inhibition.

图20 高活性和高选择性的人类α-1,3-岩藻糖基转移酶抑制剂

Figure 20 A potent and highly selective inhibitor of human α-1,3-fucosyltransferase

712

有机化学 V ol. 29, 2009

浓度在600 μmol/L时没有活性. 酶活性中心部位以外的额外结合力, 如疏水作用力, 可能是提高抑制剂活性的重要原因.

最近, Sun等[60]获得了来源于微生物Helicobacter pylori 的α-1,3-岩藻糖基转移酶(FucT)的晶体结构, 推测酶反应过程中, GDP与酶的结合力高于岩藻糖与酶的结合, 因此保留GDP 部分, 以其氨基衍生物与80个结构各异的羧酸以酰胺键连接, 合成了过渡态类似物99 (Eq. 1), 化合物未经纯化, 直接测试了对H. pylori FucT的抑

制活性. 结果表明, 所有化合物具有较高的抑制活性. K i 在10～100 μmol?L1之间. 他们还测试了化合物98对该

－

酶的抑制活性, K i ＝0.59 μmol?L1.

－

4.2 几丁质合成酶抑制剂

迄今发现的比较好的几丁质合成酶天然抑制剂是polyoxin D和Nikkomycin Z[61], 其结构特点是以多羟基、氨基取代的长链代替了二磷酸基. 针对这一结构特点, Finney等[62]以烷氧链和酒石酸为连接链合成了类似物100～113, 但均未能有效提高化合物与酶的亲和力

图21 几丁质合成酶抑制剂(1 mmol/L浓度时的抑制率) Figure 21 Chitin synthase inhibitors (inhibition rate at 1mmol/L)

No. 5

陈华等：糖基转移酶抑制剂研究进展

713

抑制效果不理想(图21). Plant等[63]参照polyoxin D的结构也做了类似的研究, 但未见化合物酶抑制活性报道.

6 总结

近年来, 随着糖生物学研究的发展, 人们对糖链及糖基转移酶在不同生理及病理过程中作用的认识在逐渐深入, 糖基转移酶抑制剂的研究也取得了显著进展. 尽管由于糖基转移酶的专一性、多样性, 以及酶立体结构信息的缺乏, 增加了抑制剂设计和构效关系分析的难度, 然而, 多数研究结果表明, 基于糖基转移酶反应过渡态结构设计的酶抑制剂具有较好的活性, 如唾液酸转移酶抑制剂(26～28) 和岩藻糖基转移酶抑制剂(99) 都表现出很高的活性, 这对于进一步设计发现高活性糖基转移酶抑制剂具有重要的指导意义; 而高活性糖基转移酶抑制剂的发现对于寻找新的抗肿瘤、抗免疫系统疾病等药物, 以及深入研究糖基转移酶的结构与功能, 尤其是其对一些重大生理病理过程如细胞粘附、迁移、增殖、肿瘤发生发展以及免疫系统疾病发生等的作用机理的进一步认识, 具有重要的科学意义

5 其它

以连有荧光基团的供体为探针, 运用高通量筛选技术可以获得多个不同结构特点的糖基转移酶抑制剂[13,64]. Hu等[65]针对核苷二磷酸糖基转移酶(MurG, 负责将UDP-GlcNAc 的N -乙酰氨基葡萄糖转移至类脂以合成胞壁质[66]), 以荧光探针化合物F1为供体, 对组合化学合成的近64000个化合物进行了高通量筛选. 结果表明, 含如图22所示的4种核心杂环结构的化合物对MurG 都有较高的抑制活性(图22). Gross等[67]运用类似的探针F1及其衍生物, 对O-GlcNAc 转移酶(OGT, 负责将UDP-GlcNAc 的N -乙酰氨基葡萄糖转移至特定的丝氨酸和苏氨酸残基上) 抑制剂进行了高通量筛选, 活性较好的抑制剂母体结构与上述结构相似(图23).

图22 4个保守的核心结构(A)和选择的MurG 抑制剂(B)

Figure 22 Four conserved core structures (A) and selected MurG inhibitors (B)

714

有机化学 V ol. 29, 2009

图23 活性较好的OGT 抑制剂 Figure 23 Validated OGT inhibitors

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(Y0711281 Lu, Y .)

范文三：硫酸类肝素-3-O-磺基转移酶B1对乙型肝炎病毒复制的影响

J ?417? 201l，V01(19，No(6中华肝脏病杂志2011年6月第19卷第6期Chin Hepatol，June

病毒性肝炎?

1硫酸类肝素一3-O一磺基转移酶B

对乙型肝炎病毒复制的影响

张祯祯胡接力苏怀彬罗强黄爱龙

【摘要】目的研究硫酸类肝素一3一O一磺基转移酶B1(HS3ST381)对HBV复制的影响。以HepG2细胞为阴性对照组，转染2(5“g pCH9一HBV(HBV表达质粒)的HepG2细胞方法照组;转染了2(5“g pCH9一HBV、1(5 lag pcDNA3(1(HS3ST3Bl表达质粒载为阳性对 pTZU6+I(干扰质粒构建载体)的HepG2细胞为对照组;转染了2(5“g 体)和2(0“g pCH9一HBV、1(5 ug pCDNA3(卜HS3ST381和2(0 ug pTZU6+I的HepG2细胞为实验组Al

tag pCHgMBV、 1(5?g pCDNA3(卜HS3ST381和2(0 lag pshll26(HS3ST381转染了2(5 扰组A。转染了2(5 ug pCH9一HBV和2(0 ug pTZU6+I的的干扰质粒)的HepG2细胞为干 pshll26的HepG2为干扰HepG2细胞为实验组B{转染了2(5?g pCH9一HBV和2(0“g blot和实时聚合酶链式反应技术检测HS3ST381共转染处理及未共转染组B。采用Southem 量，用双荧光素酶报告系统检测这种变处理的细胞内HBV复制中间体含量和病毒总RNA表达膜蛋白启动子l(spl)、包膜蛋白启动化与HBV启动子【核心启动子(cp)、X蛋白启动子(xp)、包素方差分析，P<0(05为差异有统计子2(sp2)】活性的关系。采用spssl7(0统计软件进行单因="" hbv学意义。="" 结果="" 以对照组hbv="" dna含量为1，实验组a、="" 干扰组a="">

别为10,?2,、31,?4,，对照组与实验组A比较，F=20(8， P=0(034，差异有统计学意义。与干扰组B HBV DNA水平上升了130,?11,。在HBV稳定表达细胞株中转染学意义。实验组A与干扰组A比较，F=24(9，P=0(021，差异有统计比较，试验组B lag时，HBV DNA水平分别是对照组的90(&pCDNA3(卜HS3ST381分别为0(5、1(0、1(5 ,o?3(1,、82(&,o?2(3,、21(O,?1(9,，与对照组比较，F值分别为22(7、20(3、26(5， P值分 HBV总RNA量为对照组总RNA 别为0(029、0(041、0(015，差异均有统计学意义。实验组A

量的 17(0,?2(7,，两组比较，F=25(6，尸=0(018，差异有统计学意义。干扰组A HBV总

的量恢复到对照组的74(0,?3(9,，实验组A与干扰组A比较，F=21(3，尸

RNA 统计学意义。但HS3ST381对总RNA的下调与HBV的启动子活性无关。=0(032，差异有复制和HBV总RNA水平均有下调作用，但总RNA的下调不是结论HS3ST381对HBV 子的结果。 HS3ST381直接作用于HBV启动【关键词】肝炎病毒，乙型;硫酸类肝素一3-0-磺基转移酶Bl;复制中间体 B virus of Down-regulation hepatitis replication by heparin sulfate?D—glucosaminyl-3-O-suffotransferase Jie-li,HUANG Molecu—381SUZhen—zhen,HUHuai-bin',LUO Qiang,ZHANG Ai-long(*KeyLaboratory

Medical 400016,on Infectious Diseases,Ministry ofEducation,Chongqing larBiologyUniversity,Chongqing

China author:HUANG Corresponding Ai—long,Emaih ahuan91964@yahoo(com(cn author:HU Co(corresponding Jie—ff-Email:hujielil977@163(corn [Abstract]Objective ToinvestigatetheeffectofHS3ST381 onhepatitisB virus(皿V)replicaction (

DOI:10(3760,cma(1(issn(1007-3418(2011(06(007

基金项目:国家自然科学基金(30800971) 作者单位:400016重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室(苏怀彬、罗强、胡接力、黄爱龙)，重庆医科大学附属儿童医院(张祯祯) 苏怀彬男，27岁，硕士研究生。通信作者:黄爱龙，Email:ahuan91964@lyahoo(com(cn|胡接力，Entail:hujielil977@163(tom 万方数据

?418?J 中华肝脏病杂志2011年6月第19卷第6期Chin Hepatol，June 201l，V01(19(No(6

Methods into to 7the classified transfected:(1)Blank ceUs wefeHepG2 plasmids group， groupsaccording nowhichI-IBVcontrol，transfected、 )lrittIplasmid transfected;2(Positive permits replication;(3) pCH9-HBV with control，transfected、 )l，imA，transfected Negative pCH9?HBV+pcDNA3(1+pTZU6+1;(4)Treatment with pCH9?HBV+pCDNA3(1-HS3ST3Bl+pTZU6+1;(5)Interference A，transfected pCH9一 HS3ST381 to interfere pCDNA3(1一HS3ST381+pshll26(a plasmid expression);(6)Treatment with fected with B，Wansfected B，trans- pCH9-HBV+pTZU6+1;(7)Interference pCH9一HBV+pshl HBV+ 126(The levels HBV in detected ofwerethe abovetotalRNAofSouthern DNAgroups by blotting(HBV Negative control， PCR to Treatment and Interference were Real—time determine the influence of HS3ST3B 1 AAby quantified on the HBV RNA of the four HBV over-expression transcription(11le acitivifiy promoters【core promoter (cp)，x antigen promoter(xp)，surface antigen promoterl(spl)，surface promoter2(sp2)】were assayed by Dual-Luciferase data was one ANOVA(with P<0(05 indi?="" reporter="" assay="" analyzed="" using="" system(nle="" way="" southern="" blot="" revealed="" in="" difference(resultdatathelevelofhbvdna="" statistically="" meaningful="" caring="" treatmentaandinterferenceaaccountedforl0,土2,and="" 31,?4,ofthatin="" contr01(comparedwith="" statistical="" difference="" existed="" between="" treatment="" a="" and="" f="" value="" to="" 20(8="" and="" control，a="" control，with="" equalling="">

value to 0(034 statistical difference also existed between Interfere and Treatment PAequalling respectively(A A(with value to 24( 9and value to O(021 level of DNA in FPHBV equalling eqalling respectively(The

B was raised 130,?11,as to that in Interference B(and the levels ofHBV DNA Experiment by compared showed a decrease when H7 cells were transfecred with 0(5，1(0，1(5 dose-dependent lag pCDNA3(1-HS3ST381 differences existed between control and transfected different dose H7withrespectively(Statistical ofpCDNA3(1- to and to and 0(015FvaluesPvaluesHS3ST3BI，with 22(7，20(3，26 (50(029，0(041 equallingequalling PCR revealed that the HBV total RNA in Treatment A accounted for 17(0,士2(7, respectively(Real-time Treatment of that in control and there was A and F difference astatisticalbetweencontrol，with valueequal- 25( 6and value in Interference was restored to 74(0,? to PDNAAto O(01 8(In addfion(HBV ling equalling in there that 3(9,of control，and was also a statistical difference between Treatment and Interference A， A HBV total with F value to 21( 3and P value to of equalling equalling 0(032(However，the downregulaiton RNA had to do with FIBV HS3ST381 can inhibit HBV nothing promoters activity(Conclusion replication HBVand reduce the level of total the of total not be the result of HBVRNARNA，but downregulation may direct intereaction of HS3ST3B 1 and HBV promoters( wordsl B [Key Hepatitis virus;Heparin sulfate??D??glucosaminyl??3-o—sulfotransferase 381;Rep- lication intermediate

sul— 硫酸类肝素一3旬一磺基转移酶 1(heparin B材料与方法 3B 1。fate—D—glucosaminyl一3一O—sulfOtransferase 1(实验材料:HBV表达质粒pCH9一HBV由第 HS3ST3B 1)是硫酸类肝素在生物合成中重要的修三军医大学西南医院兰林博士惠赠，该质粒含有饰酶，在各组织中都有表达，但在肝脏和胎盘中表 1(1拷贝的全长HBV基因组(ayw亚型)，由巨细达丰度最高【l-训。我们通过表达谱芯片研究发现，与胞病毒启动子启动前基因组RNA转录，转染细胞后 HepG2细胞基因表达谱比较，HepG2(2(15(人肝癌能合成包括前基因组pgRNA在内的4个转录产物: 细胞系HepG2细胞衍生，被稳定转染HBV基因后可 3(5 kbkb的前基因组RNA，2(4 kb的mRNA，2(1 以稳定的进行HBV基因组的复制，细胞上清液也可以的mRNA和0(7 kb的mRNA，3(5 kb的前基

检测到HBV DNA)中的HS3ST381是mRNA水平因组 RNA翻译出聚合酶蛋白与核衣壳蛋白; 下调较为明显的一个基因。因此，我们推测 2(4 kb的 2(1 mRNA翻译成大表面蛋白l kb的mRNA翻译 HS3ST3B 1可能与HBV的复制有关。成表面蛋白和主蛋白;0 (7 kb的mRNA翻译成X 为探讨HS3ST3Bl对HBV复制的影响，我们蛋白。HS3ST3B 1表达质粒pCDNA3(卜HS3ST3B 1和主要从以下两个方面进行研究:(1)HS3ST381是 HS3ST3B l干扰质粒pshll 26由本实验室构否有抗HBV活性;(2)HS3ST3Bi抗HBV的作用建。 pTZU6+1质粒用于构建HS3ST3B l的干扰质粒机制。 pshl 126。双荧光素酶报告系统购自美国Promega公万方数据

J 中华肝脏病杂志2011年6月第19卷第6期CMn Hepatol，June 201l，V01(19，No(6

司，其中核心启动子(core promoter，cp)、X启钠，pH 9(5)浸泡5 min。膜放在杂交袋中，加入

发动子(X promoter，xp)、表面抗原启动子1(surface 光底物液，挤出多余液体，X胶片曝光显影。

antigen promoter l，spl)、表面抗原启动子2 4(总RNA的提取:细胞转染后96 h，采

(surface antigen promoter 2，sp2)依赖的pGL3一Trizol法提取细胞总RNA，细胞经磷酸盐缓冲液用洗 cp，pGL3一xp，pGL3一spl和pGL3一sp2由本实涤后，根据培养瓶的底面积，按每10 cm2

ml 加入1 验室以pGL3-对照为骨架构建而成。HepG2细胞 Trizol处理细胞;室温孵育5 ml Trizol rain，1(0 和HepG2(2(15细胞由本实验室保存，HBV稳定加入0(2 ml氯仿，充分混匀，4?、12 表达株H7由本实验室构建并保存。JMl09感受态细 000×g离 ml 心20min;水相转入一新的1(5 EP管，加入 X 等胞购于北京鼎国生物技术有限公司，胎牛血清购自量异丙醇，混匀，室温静置10 min，4?、12 000

美国Hyclone公司，荧光定量试剂盒购自北京伯乐 g离心15 min;去上清液，0(5 ml无水乙醇洗涤

公司，限制性内切酶Nhe I，Hind?购于北京普洛沉淀，4?7000×g离心5 mira;75,乙醇清洗沉

淀，麦格生物技术有限公司，DL2000标志物、脱氧核离心，去上清液，干燥，溶RNA于10 ul

I DNA 焦碳酸二糖核酸酶I、蛋白酶K、入-EcoTl4 digest 乙酯处理的水。标志物购自大连宝生物工程有限公司。 5(实时聚合酶链式反应:定量PCR样品反应 2(细胞转染:在100 ml的培养瓶中，用含有体系为25“l，反应条件为:95?i0 min;95? 20 10,胎牛血清的MEM培养基在37?、含5,C02 S，60?30S(该步收集荧光)，共进行40 培养箱中培养HepG2细胞。采用0(25,的胰酶、环。所有循环结束后，绘制融解曲线，用于个循

判断扩 0(1,乙二胺四乙酸消化细胞，以l×105个,孔接增产物的特异性。定量PCR中HBV总

7一种细胞于6孔细胞培养板中，培养16 h后，按不同和反向引物分别办5 RNA的正向 CTT一3 的实验处理和转染试剂要求转染。 7，5 7一GCCTACAGCCTCCTAGTACA

ACCGACCTTGAGGCATA 一3’， blot 3(HBV核心颗粒DNA的提取及Southern 这对引物是根据HBV 4个转录产物共有序列设计;

检测:转染后96 h，收集HepG2细胞，每孔加入内参照D一肌动蛋白的正向和反向引物分别为:5， CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT一3 7一- 500“l的细胞裂解液，37?孵育15 rain，吹打充分 7，5 TGTGTTGGCGTACAG一3 裂解细胞，12 000×g-离心5 rainl转移上清液于新 7。每组实验均 AGCAC U,m1)37。C 重复3次，的EP管，3 pl脱氧核糖核酸酶I(1000 每次各样本均设复孔。

酶切4 h，去除颗粒外的核酸;加入250?l 35,的 6(HBV启动子报告质粒的构建:以pCH9一

聚乙二醇8000(含1(5 mol,L氯化钠)，冰上孵育 HBV为模板扩增HBV 4个启动子，4对引物都分别

1 Ih后，离心沉淀的HBV核心颗粒，20 l蛋白酶引入了Nhe I和Hind 111酶切位点，同时用Nhe u

K(20 mg,m1)45?消化过夜;酚氯仿抽提2次，乙和Hind?双酶切去掉pGL3-对照载体上的SV40 启醇沉淀DNA，干燥后溶于10“l双蒸水中。动子，然后将酶切处理的HBV启动子与酶切后的 HBV载 DNA于10 g,L的琼脂糖凝胶上电泳，电泳体骨架片段用T4-DNA连接酶16。C连接过夜。转 mol,L 完成后，用碱变性液(1 mol(5,L氯化钠，0(4 JMl09感受态细胞，菌落PCR筛选阳性克隆。化氢氧化钠)浸泡凝胶2次，每次30 rain，毛细管法反应条件:95?5 min;95?20 S， PCR 72?30 S，转移到尼龙膜紫外交联固定后，按试剂盒说明书进 s，35个循环;72?10 min。PCR 58?20产物做行杂交。杂交后用含1,十二烷基硫酸钠的2 X柠檬琼脂糖凝胶电泳鉴定，将阳性克隆送出测

序。HBV

5 rain;含1,十二酸钠盐溶液室温洗膜2次，每次10 启动子引物序列如下:HBV CP正义链: L AACGCTAGCTTGCCCAAGGTCTTAC一3 烷基硫酸钠的0( X5柠檬酸钠盐溶液68?洗膜2次，每 7一ATTAAG CTTG7，HBV mol,L马来酸，0(15 mol,L CP反义链:5 次15 mill。洗涤液(0( 10 CTTGGAGG C 7 TTGAAC-3 氯化钠，3(00 mol,L吐温20，pH 7(5)室温洗膜 XP正义链:5 7一AACGCTA HBV l

5 万方数据 rain。按l:10 000稀释 GCTCGCAGACGAAGGTCTC一3’，HBV XP反义 min，封闭液37?封闭30

抗一地高辛一碱性磷酸酶于封闭液中，3 7?孵育链:5’一ATTAAGCl了TGAGGCGCTATGTGTTG一 30 3 min，洗涤液37?洗膜2次，每次15 rain;检测液 7;HBV SPl正义链:5 7一AACGCTAGCCAAT

中华肝札墒杂女2011年6H*10卷第6蜘Chin J【Iepatol June 201I、。1 I 9 No 6 3’:HBV ATTAAGC，rTGGCCTGAGGATGAGTG

sI’2止义链:5。。

GCTCCT 3’，HBV ACCGCTAGCAACCTTTTCG SP2反义链:5’。^TT^AGCT TGCCA’I、

7。 GGAAACGATGT-3 7(舣荧光索酶分析:以cp启动于的叔光索分析为侧(将含有萤火虫荧光素酶的报告埙粒酶有海肾荧光索酶的pRlJ TK质粒的组台和含 HepG2细胞，见表l。96 h后，击上清共转染液升用磷酸盐缓冲液洗涤，37'C被动裂解缓冲液胞1 裂解HepG2细 5rain后，取裂解液10 u1，JJ

酶检测试剂Ii产生萤火虫荧光f 口人50?l荧光素

等弓。定景萤火虫荧光强度，岳_司一样品中加人

等量Stop&Glo试剂将上述反应猝灭，Inl n,j启动海肾荧光索酶反应，进行第2 次测量。将萤火虫的荧光强度值与海阿的荧光强度值相比，即可队用于实验组、对照组和干扰组之问的比较。|i1】样的处理可以用]:xp、spl和sp2启动子的双荧光素酶分析。

表1 |I嚷心启动了烈荧光紫酶丹析 2 5 0 注I实验组B(转染THBV和2pcH9ug 5 pTZU6_|1的}IcpG2细胞)一2:f扰组n(转染了2 pg 组刊转染硪粒 0 3 L_g pCIl91IBv和2 ug呻Il拍的HepG2细胞 )tI目性对州组 ?L3 cp DcDNA3】oTZu6_1、 pRLTK对照组 3 (转染r 5?g pCH9 HBV的He(DG2细胞)t 4阴性对照uC}{9 HBV (He(uc2细胞)?5:相对仆7质*标?l HS3ST381 攥验蛆^ 1]GL3tp pRLTK pCDNA3 目l 田2 1|S3ST3Bl对11BV复制水17的#响 1 HBVpTZU6i DCH9 TK I I[S3ST3BIcF扰蛆A ?L3 pRl pCDNA3

—————j生旦兰』生堡塑旦————————一注:IIS3ST3BI:硫酸娄朴案3 O磺基转社酶B1。pTZU6+I:

cu r扰艟柱构垃载蚌;pshll T扰啦桃z pGl(3 26:IIS3ST3BI

棱b聃动，萤火虫报告雁札口RL TK海肾荧光索睹报告质 IIS3ST3Bl点过嗑粒载件l pcH9 pCDNA3托; IIBV:}IfIV表达压粒

8(统计学力法:用S?SSl7(0统计软件进行单 3洼:l:HBV稳定表达株j7 (24庄117巾转染1)CI’NA3 斟素山差分析，尸<0(05为差异有统计学意义。 5="" 0="" i="" 5="" hs3st3bi丹b0为0="" 1="" ug;5削性zt照组(1tepg:细="" 胞);6相对丹于质量标准="" 结="" 果="" 田3在hbv稳定表达株中its3st31_ji对libv复m的彩响="" 1(hs3st3bl对hbv复制的影响:以对照组="">

是对照组的90(慨?3(【,、82(0,?2(妣、 o,? 21HBV HBV DNA含量为l，实验组A、干扰组A 1 9,，与对j!f}组比较，，值分别为22 7、DNA舍龋分刖为【O,?2,、31,i 4,，对照!H 与 26(5，尸值分别为0(029、0(04【、0(015，差20(3、实验组A比较，，20 8，P=0(034，差异有统计统计学意义，见阿3。学意义。实验组A与干扰组A比较，，24 9，尸= 异均有 0(02l，差异自统计 2(tIS3ST3Bl对I[BV总RNA的影响:实HBV 学意义，见图l。在pC}19

A HBv总RNA量为对NN-总RNA量的转染的HepG2绑胞中干扰内源性的ItS3ST3Bl(干验组 0,十 2(7,，两组比较(，25(6，尸=0 018，扰组H1，HBV DNA水平比未傲相应下扰处理的细 17 计学意义。干扰绀A HBV总RNA的量恢胞(实验组B)上升了1 30,?11,，见图2。为丁差芹有统 1 复到对照组的74(0,i 3(9,，实验组A o干扰组A比较，F 万方数据进一步验证HS3ST3Bl对H13V复制的影响，将 0 2l 3，P 032，差异有统计学意义，见图4。 7 pcDNA3(1 HS3ST381转染H13V稳定表达株H 3 HS3S’I'3Bl对HBV启动子活性的影l啊:中，结果艟示，存117中转染pCDNA3卜HS3ST3131

? bl!b

?瑚? ?。 —???: j???，

2 5 HBV l 5 ,:I央验缮A(转染r pz pcH9 ug

pCDNA3 1 0 HS3ST381和2 pg t=’TZU6+I的IIel崛2细胞); 瑚m2:对目组(转染T 2 5?g pCH9ttBV(1 5?g阱DNA31和 3 注:MI:相对分手质量标准?1:pGL3 cp双酶切?2:?I xp 2 0 ug pTZU6I【的HelX二2细胞)?3干扰组A(转染了2 5?g 3理酶切-3:岍I s01烈酶切t 4:p州(3?s02m畴切?M2: 0 I_lIS3ST3BI和2 ug嘟1ll拍的 pCH9HBV，15“gpcnNA3I ^耻oTl4digest DNA标志物 11eD【32细胞)?。与对照组比较，差异有统计学意义-6与实睑组A m田8 HBVn功子萤火虫荧光索酶报告质靴Nhe I和Hind 比较，差异有统科学意女 ??喇琼脂格凝艘电泳结粜圈‘1IS3ST381对IIBV总RNA的形响、 1cD stJ2 xp sgI 括性降低有关，我们对HBV的4个启动r活性进行了双荧光索酶报告系统分析。按照材料与方法中描述，成功扩增cp，xp，spl，sp2 4个启动子，见图 5，井把双酶切PCR产物连接到pGI，3

对照上，对 PCR验证的H日陆兜隆(图6，7)，提

取质粒，做Nhe

I和Hilld?双酶切搽定井测序，结果见图8。

在成功构建了spl、sp2、cp和xp报告质粒后， m对舒于瞻i标准，印核心启动于;xp:X蛋白启动按表l的处理转染HepG2细胞，测定不川处理的荧spl:包稹?白启动子l，stJ2:乜艇蛋向n动于2 4个启光隶酶活性。结果显示，cp、xp、spl和sp2 圈5 H11VR动子的PCR扩坩结果 1动子实验组的萤火虫荧光素酶活性分别为0(907 i L i0(054、0(945 0(035(0 612 0(018和l 032

0(04I，与对j!ff组比较，，位分月 27q、为2(I35、1(46 和2 46，P值分别为0(585、0 394、0(502和0(376，

,黜? 120

250 bp 100 blJ 主100

启动子克薹? 隆菌落PCR。M:H对”T艟?标准曩60 芸圉B c1)目xp克隆的茼落?CR F物琼脂耱凝筏电沫结果 ?40 20 0 s!Jl cp sp2 对照洼:吱xp 5验组A:转染了2 5 lIBV、1ItS3ST3BI ugpCll9ug 0 和2 ljg pTZU6_I的lte口G2细胞;对照组:转染r 2 0 5“* pC?9】1BV、l 5?g HDNA31日2 pTZU6+l的IIepG2L【g 麓黝勰慨十扰组A转礁r 2 5jlg pcH9HBV、l 5 pz HS3=S'I'3BI和纳 0 2 IJg坤hIl2^的}Iei正2细胞。印:棱D自动r(xp:x赁山启动九5pl茬而蛋白呐动rl，sp2:袤m嘣白?动千2，n:spl 10十袅??白启动于1克隆蔺落PCRt sp2:9个表?? 对照:叩lJ3对照自n动干2克隆菌蒋PCR，M:#J耐竹子质昔怀准圈9}IS3ST381对1IBV 4十启动T活性的*响蕾7 sp]?sp2克睦的茁落PCR P物琼脂耱艇畦电诛结果

万方数据

?422?J 中华肝脏病杂志2011年6月第19卷第6期Chin Hepatol，June 201l，V01(19，No(6

差异均无统计学意义。cp、xp、Spl和sp2 4个启动制并不清楚。子干扰组萤火虫荧光素酶活性分别为

0(740土0(012、在前期实验结果的基础上，我们不仅在HBV

瞬 0(721?0(023、0(616?0(016和0(628?0(014，时表达和稳定表达株中证实HS3ST3BI基因对

HBV 与实验组比较，F值分别为3(28、4(31、3(42和的复制有负向的调节作用，而且对其调节机

制进 3(66，尸值分别为0(249、0(065、0(241和0(135，行了初步研究。结果显示，HS3ST3B l也可

差异无统计学意义，见图9。调节HBV总RNA。进一步的双荧光素酶实验表负向明， HS3ST3B 1对HBV总RNA的下调是通过间接作用讨论实现的。目前，核苷类似物是临床针对HBV感染的常用参考文献药物，然而耐药问题却限制了抗病毒药物的长期疗 stnlcture andmuta-【1】Edavettal M，et a1(Crystal SC。Lee KA，Negishi效。病毒复制的宿主依赖性，使得从宿主细胞中寻 tional of sulfate 3-0-sulfotransferase isoform I(J analysis Heparan Biol 找抗病毒药物靶点成为抗病毒治疗的一个新策略【 31。Chem，2004，279:25789—25797(

JD，Selleck SB(Order out of of bind- 【2】Esko chaos:assembly ligand 因此，探索HBV与细胞因子的相互作用研究不仅可 sites in sulfate(Annu Rev ing heparan Biochem，2002。71:435— 以揭示HBV致病机制，还可为乙型肝炎及相关疾病 471( 的防治提供依据。Kamimura等【41的研究显示， B viruses:revffrse a different 【3】Nassal M(Hepatitis way(uanscription VirusRes，2008，134:235—249( HS3ST3Bl对于notch信号通路是有调节作用的，而 of Notch【4】Kamimura R，et K，RhodesJM，Uedaa1(Regulation sig?notch信号通路的活化程度直接影响下游蛋白的表 sulfate sulfotransferase(J Cell 3-Onaling by Drosophilaheparan达，可能直接影响病毒的复制，或者在一定程度上 Biol，2004。166:1069一1079( (收稿日期:2010-12—31)改变病毒生存的细胞环境，间接影响病毒的复制。然 (本文编辑:李秀英) 而，对细胞因子HS3ST3B l抗HBV活性的具体机

?读者?作者?编者?

本刊对来稿中统计学处理的有关要求 1(统计研究设计:应交代统计研究设计的名称和主要做法。如调查设计(分为前瞻性、回顾性或横断面调查研究);实验设计(应交代具体的设计类型，如自身配对设计、成组设计、交叉设计、析因设计、正交设计等);临床试验设计(应交代属于第几期临床试验，采用了何种盲法措施等)。主要做法应围绕4个基木原则(随机、对照、重复、均衡)概要说明，尤其要交代如何控制重要非试验因素的干扰和影响。 2(资料的表达与描述:用i?s表达近似服从正态分布的定量资料，用M(骗)表达呈偏态分布的定量资料;用统计表时，要合理安排纵横标目，并将数据的含义表达清楚;用统计图时，所用统计图的类型应与资料性质相匹配，并使数轴上刻度值的标法符合数学原则;用相对数时，分母不宜小于20，要注意区分百分率与百分比。 3(统计分析方法的选择:对于定量资料，应根据所采用的设计类型、资料所具备的条件和分析目的，选用合适的统计分析方法，不应盲目套用t检验和单因素方差分析，对于定性资料，应根据所采用的设计类型、定性变量的性质和频数所

具备的条件以及分析目的，选用合适的统计分析方法，不应盲目套用X2检验。对于回归分析，应结合专业知识和散布

图，选用合适的回归类型，不应盲目套用简单直线回归分析，对具有重复实验数据的回归分析资料，不应简单化处理，对于多因素、

多指标资料，要在一元分析的基础上，尽可能运用多元统计分析方法，以便对因素之间的交互作用和多指标之间的内在联系进行全面、合理的解释和评价。

4(统计结果的解释和表达:当P<><0(01)时，应说明对比组之间的差异有统计学意义，而不应说对比组之间具有显著性(或非常显著性)的差别;应写明所用统计分析方法的具体名称(如:成组设计资料的t检验、两因素析因设计="">

资料

的方差分析、多个均数之间两两比较的q检验等)，统计量的具体值(如f=3(45，X2=4(68，F=6(79等)，应尽可能万方数据出具体的P值(如尸=0(0238);当涉及到总体参数(如总体均数(总体率等)时，在给出显著性检验结果的同时，给出95,可信区间。再给

硫酸类肝素-3-O-磺基转移酶B1对乙型肝炎病毒复制的影响

作者: 苏怀彬，罗强，张祯祯，胡接力，黄爱龙， SU Huai-bin， LUO Qiang， ZHANG Zhen-

zhen， HU Jie-li， HUANG Ai-long 作者单位: 苏怀彬,罗强,胡接力,黄爱龙,SU Huai-bin,LUO Qiang,HU Jie-li,HUANG Ai-long(重庆医科大学感染

性疾病分子生物学教育部重点实验室,400016)，张祯祯,ZHANG Zhen-zhen(重庆医科大学

附属儿童医院)

刊名: 中华肝脏病杂志

英文刊名: CHINESE JOURNAL OF HEPATOLOGY 年，卷(期): 2011,19(6)

1.Edavettal SC;Lee KA;Negishi M Crystal structure and mutational analysis of Heparan sulfate 3-0-

sulfotransferase isoform I 2004

2.Esko JD;Selleck SB Order out of chaos:assembly of ligand binding sites in heparan sulfate 2002 3.Nassal M Hepatitis B viruses:reverse transcription a different way 2008

4.Kamimura K;Rhodes JM;UedaR Regulation of Notch signaling by Drosophila heparan sulfate 3-O

sulfotransferase 2004

1. 周鸿科.杨冬华.汤绍辉.黄卫.ZHOU Hong-ke.YANG Dong-hua.TANG Shao-hui.HUANG Wei 人胰岛素样生长因子 ?/P4启动子调控胸苷激酶载体的构建[期刊论文]-中华肝脏病杂志2011,19(6)

2. 刘菲.肖婷.汪玲.谢建萍.李国宏.梁巧玲.罗春慧.LIU Fei.XIAO Ting.WANG Ling.XIE Jian-ping.LI Guo-hong. HANG Qiao-ling.LUO Chun-hui 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法与PCR产物测序法检测乙型肝炎病毒耐药变异的比较[期刊论文]-中华肝脏病杂志2011,19(6)

3. 信息动态[期刊论文]-中华肝脏病杂志2011,19(6)

4. 吴玮.姚登福.董志珍.卞银珠.姚宁华.邱历伟.杨君伶.赛文莉.WU Wei.YAO Deng-fu.DONG Zhi-zhen.BIAN Yin- zhu.YAO Ning-hua.QIU Li-wei.YANG Jun-ling.SAI Wen-li HBV相关肝细胞癌患者核因子-κB异常情况及其临床意义[期刊论文]-中华肝脏病杂志2011,19(6)

5. 张阳.彭亮.谢婵.林炳亮.黄仰甦.谢俊强.高志良.罗光汉.ZHANG Yang.PENG Liang.XIE Chan.LIN Bing-liang. HUANG Yang-su.XIE Jun-qiang.GAO Zhi-liang.LUO Guang-han 体外培养乙型肝炎患者骨髓间充质干细胞的生物安全性及其质量控制[期刊论文]-中华肝脏病杂志2011,19(6)

6. 肖江强.施晓雷.韩冰.褚薛慧.顾劲扬.张悦.檀家俊.顾忠泽.丁义涛.XIAO Jiang-qiang.SHI Xiao-lei.HAN Bing .CHU Xue-hui.GU Jing-yang.ZHANG Yue.TAN Jia-jun.GU Zhong-ze.DING Yi-tao 壳聚糖支架上猪肝细胞的内源性逆转录病毒分泌[期刊论文]-中华肝脏病杂志2011,19(7)

7. 戴卓娅.龚建平.魏思东.DAI Zhuo-ya.GONG Jian-ping.WEI Si-dong 肝X受体-α对炎症的调节及其对神经元孤核受体-1的影响[期刊论文]-中华肝脏病杂志2011,19(7)

8. 郑建铭.施光峰.李宁.钱志平.朱梦琪.陈明泉.李谦.王新宇.ZHENG Jian-ming.SHI Guang-feng.LI Ning.QIAN Zhi-ping.ZHU Meng-qi.CHEN Ming-quan.LI Qian.WANG Xin-yu 乙型肝炎病毒干预后小鼠肝脏树突状细胞P-干扰素调节因子3表达的研究[期刊论文]-中华肝脏病杂志2011,19(6)

9. 信息动态[期刊论文]-中华肝脏病杂志2011,19(7)

10. 任锋.张海燕.朴正福.郑素军.陈煜.武志明.段钟平.REN Feng.ZHANG Hai-yan.PIAO Zheng-fu.ZHENG Su-jun. CHEN Yu.WU Zhi-ming.DUAN Zhong-ping 糖原合成酶激酶-3β在肝脏热缺血再灌注损伤中的作用及其干预[期刊论文]-中华肝脏病杂志2011,19(7)

引用本文格式:苏怀彬.罗强.张祯祯.胡接力.黄爱龙.SU Huai-bin.LUO Qiang.ZHANG Zhen-zhen.HU Jie-li.

HUANG Ai-long 硫酸类肝素-3-O-磺基转移酶B1对乙型肝炎病毒复制的影响[期刊论文]-中华肝脏病杂志 2011(6)

范文四：氨基转移酶ALT,AST及其同工酶

氨基转移是氨基酸代谢中基本生化反应之一 ,在机体内存在着多达 60种氨基转移酶 ,丙氨酸基转移酶 (ALT)和天冬氨酸氨基转移酶 (AST)是其中最重要的两种。

它们都需要磷酸吡哆醛 (维生素 B4) 为辅基 , 不含磷酸吡哆醛的酶蛋白称为脱辅基酶蛋白 ,没有催化活性。血清除含有有活性的全酶外 , 还有部分不含磷酸吡哆醛的酶蛋白 , 如在测定前 ,先加入足量磷酸吡哆醛 ,所测血清转氨酶活性常有明显升高。

AST 有两种受不同基因控制的同工酶分别存在于细胞质 (c-AST)和线粒体 (m-AST)中 , 而一般认为 ALT 不存在同工酶 , 我国学者证实在人组织和血清中也存在类似 AST 的两种同工酶 , 即细胞质 ALT(c-ALT)和线粒体 ALT(m-ALT)。【组织分布】

AST 广泛存在于多种器官中 , 按含量多少顺序为心脏、肝、骨骼肌和肾 , 还有少量存在于胰腺、脾、肺及红细胞中 , 肝中 AST 大部分 (70%)存在于肝细胞线粒体中。

ALT 也广泛存在于多种器官中 ,含量最多的不是心脏 ,而是肝 ,顺序为肝、肾、心、骨骼肌等 ,与 AST 相比 ,在各器官中含量都比 AST 少 , 肝中 ALT 绝大多数存在于细胞质中 , 只有少量在线粒体中。

【生理变异】

此二酶生理变异较小 , 性别、年龄、进食、适度运动对酶活

性无明显影响 , 每天虽有生理性波动 , 但无统计学意义。表 7-6 ALT和 AST 在疾病时的变化

疾病

ALT

AST

AST/ALT

病毒性肝炎

随不同病期和严重程度而异 , 常明显升高 , 可达 10-100倍正常上限

同 ALT , 但程度没有 ALT 明显 , 恢复到正常早于 ALT <>

重症肝炎

不超过 20倍正常上限 , 出现肝疸分离

增高程度常超过 ALT

>1.0

肝硬化

变化不定 , 常轻度增高

同 ALT , 但增高程度常超过 ALT

>1.0

右心衰竭合并肝溢血

正常或轻度升高 , 个别可高达 10倍正常上限增高程度常超过 ALT

>1.0

梗阻性黄疸

变化不足 , 常不超过 5倍正常上限

同 ALT

不定 , 常 <>

Gilbert 综合征

无变化

溶血性黄疸

无变化

AMI

正常或轻度升高

明显升高 , 与 CK 和 LD 相比 , 无何优点

>1.0

心肌炎

正常或轻度升高

急性期可轻度升高

>1.0

肌肉损伤

正常或轻度升高

可高达 2-5倍正常上限

>1.0

肌萎缩

明显上升 , 可达 8倍正常上限

同 ALT

>1.0

【标本的采集、处理和贮存】

红细胞中 AST 和 ALT 分别为血清含量的 15倍与 7倍 ,所以明显溶血标本不宜测此二酶。

宜采用血清为测定标本 , 此二酶在 4℃ 冰箱中贮存一周 , 活性无明显变化 ,最好不要冰冻 ,因为在融冻时很容易破坏酶

的活性。

【参考值范围】

一般临床使用方法中不加入磷酸吡哆醛 ,其参考值范围较加入磷酸吡哆醛的为低 , ALT 为 5-40U/L(37℃ ) , AST 为 8-40U/L(37℃ ) 。

【临床应用】

根据此二酶在人体器官中分布情况 , 临床医师习惯将 ALT 用在诊断肝脏疾病 , 测定 AST 诊断 AMI 。在 AMI 时 , 不论在出现升高时间 , 还是升高持续时间 , 其变化介于 CK 和 LD 之间 ,无特殊价值 ,随诊断 AMI 的新试验日益增多 ,国外已建议不用。 ALT 在 AMI 时一般不增高或轻度增高 , 明显升高常说明有右心衰竭合并肝淤血 , m-AST 变化比总酶更慢 ,但其增高程度与坏死病变程度密切相关 , 是判断 AMI 预后的一个很好指标。

目前转氨酶测定主要用于肝胆疾病的诊断和鉴别诊断。 ALT 是我国目前测定次数最多的酶 ,假如能同时测定 AST ,并计算出文献上常提到的 Deritis 比值 , 即 AST/ALT之比 , 在诊断和鉴别诊断上将是很有用的。

(一 ) 丙氨酸氨基转移酶 (ALT)

以前常简称 GPT , 近年来国外多以 ALT 为此酶缩写。 ALT 是我国测定次数最多的酶 ,这是因为我国肝炎较多 ,而肝是含 ALT 最丰富的器官 ,且大部分存在于肝细胞的胞质中。肝

炎时 ,细胞膜通透性增加 ,由于肝细胞中 ALT 浓度约比血清高 7000倍 ,只要有 1/1000的肝细胞中的 ALT 进入血液就足以使血中 ALT 升高 1倍 , 故此酶是肝损伤的一个很灵敏指标。肝炎时早在黄疸前期就升高 ,峰值可达数千单位 ,为正常上限的百余倍。一般而言在急性肝炎时 ,血清 ALT 活性高低与临床病情轻重相平行 ,又由于 ALT 半寿期较长 ,往往是肝炎恢复期最后降至正常的酶 ,是判断急性肝炎是否恢复的一个很好指标。此外在慢性肝炎特别是慢性活动性肝炎 ALT 也经常升高。因此临床医师对急慢性肝炎患者经常检查 ALT 并据此诊断和判断病情。

应注意两种情况 ,重症肝炎时由于大量肝细胞坏死 ,此时血中 ALT 可仅轻度增高 ,临终时常明显下降 ,但胆红素却进行性升高 , 即所谓的胆酶分离 ,常是肝坏死征兆。另一种情况是少数人血清中 ALT 长期持续升高 , 肝穿无明显病理改变 , 预后良好 , 对此现象目前仍在研究之中。

肝炎时 ALT 常有明显变化 , 但不能反过来认为凡 ALT 升高者就有肝炎 ,其它肝胆疾病如胆石症、胆囊炎、肝癌和肝淤血时也可升高。由于肝脏以外不少器官也含有 ALT ,因此在 AMI 、多发性肌炎、急性肾盂肾炎等患者血中 ALT 也可升高 , 但一般而言 , 这些疾病 ALT 升高很少超过正常上限 10倍 , 常以 400U/L为界 , 超过此值绝大多数可诊断为肝炎。但也有例外 , 有人报告个别肝淤血、胆石症等患者可超过此界 ,

但在这种情况时 , ALT 变化往往很快 ,过几天复查 , ALT 就可降至 400U/L以下。

(二 ) 天冬氨酸氨基转移酶 (AST)

以前常简称 GOT , 现多以 AST 为缩称 , 既往认为 AST 主要存在于心肌中 , 主要用于诊断 AMI 。但目前由于 AST 在 AMI 时升高迟于 CK ,恢复早于 LD ,故诊断 AMI 价值越来越小 , 国外不少学者认为诊断 AMI , 完全可以不测 AST 。

另一方面肝中 AST 含量虽低于心肌 , 但绝对含量 (U/mg)仍高于 ALT 。肝中 AST 和 ALT 含量比值约为 2.5:1.0。只是由于 ALT 主要存在于细胞质中 , AST 主要存在于线粒体中 ,病变较轻的肝脏疾病如急性肝炎时血中 ALT 升高程度高于 AST , 但在慢性肝炎 , 特别是肝硬化时 , 病变累及线粒体 , 此时 AST 升高程度超过 ALT 。故在国外对疑是肝炎患者常同时测 AST 和 ALT , 并计算 AST/ALT比值 , 正常约为 1.15, 急性肝炎第 1、 2、 3和 4周分别为 0.7、 0.5、 0.3和 0.2。如比值有升高倾向 ,应注意有无发展为慢性肝炎可能 ,慢性肝炎时可升到 1.0以上 ,肝硬化时可达 2.0,此比值对判断肝炎的转归特别有价值。

范文五：糖基转移酶超家族_田鹏

DOI:10.13488/j.smhx.2011.05.029

文章编号: 1000-1336(2011)05-0732-05

田鹏刘占林

西北大学生命科学学院，西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，西安 710069

摘要：糖基转移酶在糖基化反应中发挥作用，能够催化活性糖基从糖基供体转移到糖基受体，并形成糖苷键。生物体中存在着数量庞大的糖基转移酶类，形成超基因家族。本文概述了目前糖基转移酶的鉴定方法、划分归类以及与该基因家族有关的系统进化问题，并对高等植物基因组中该家族的进化研究进行展望。关键词：糖基转移酶；超基因家族；划分归类；进化中图分类号：Q55

从病毒到高等真核生物，糖基化反应都是生物体内最为重要的转化反应[1]，许多生物产物合成的最后一步，也是非常重要的一步，往往就是糖基化[2]，而糖基转移酶(glycosyltransferase, GT, EC 2.4.x.y)则是专门负责催化糖基化反应的酶类，它们将活性糖基从糖基供体转移到糖基受体，并形成糖苷键，产物包括寡糖、多糖、各种复合糖(糖蛋白，糖脂) 和多种多样的糖苷化合物(如花色苷、黄酮糖苷、白藜芦醇糖苷等) 。作为糖基供体的化合物种类很多，包括二糖或多糖、1-磷酸糖、核苷-2-磷酸糖、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸，而最主要的是核苷酸糖(nucleotide sugar)，如UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和UDP-葡萄糖醛酸。糖基受体可以是糖类化合物也可以是非糖类化合物，种类则更多。另外糖基转移反应所产生的糖苷键也有差异，主要包括α和β两种键型[3,4]。要识别不同的受体、供体以及形成不同的糖苷键，生物体内势必含有大量的糖基转移酶，而事实也正好如此，通过全基因组数据就已经发现，真核生物基因组里有大概1%的基因编码糖基转移酶[5]。

在植物中，糖基转移酶作用底物广泛，具有多

种功能和生物活性。糖基化能产生级联效应，改变植物化合物的生物活性、水溶性、稳定性、在细胞内和整体植株中的运输特性、亚细胞定位以及与受体的相互识别与结合特性，从而影响着植物生长发育的众多方面[6]。比如花色素苷合成对花的显色作用，一些糖苷化合物参与植物体内激素的平衡调节，等等[2]。另外糖基化还能降低或除去内源和外源物质的毒性。本文旨在介绍糖基转移酶超基因家族的划分归类及相关的系统进化问题，并对高等植物基因组中该家族的进化研究提出展望。植物中最早发现的糖基转移酶基因是诺贝尔奖获得者McClintock 所研究的控制玉米种子黑色素沉积的Bronze1基因，该基因后来被证实编码产生黄酮糖苷的UDP-糖基转移酶[7]。目前，鉴定糖基转移酶的方法主要有三种：(1)传统生物化学方法，这种方法是早期研究者所采用的方法，主要过程包括分离提取活性酶蛋白，然后研究该酶的底物特异性和酶的动力学特征。通过该方法可以区分一些糖基转移酶，并揭示其部分特征。但该方法过于繁琐且耗时，对于研究超基因家族来说工作量过大；(2)分子生物学方法，主要采用的技术就是分子克隆，通过构建cDNA 文库，然后利用已有的糖基转移酶基因设计的探针，从文库中筛选出可能的糖基转移酶基因。这一方法是目前通过实验来确定糖基转移酶基因的常规方法，研究者可以从这些实验数据中获得更多糖基转移酶的表达特征；(3)生物信息学方法，

收稿日期：2011-02-24

陕西省教育厅科学研究项目 (2010JK861)；教育部留学回国人员科研启动基金 (2005, 383号) 资助

作者简介：田鹏(1985-)，男，硕士生，E-mail ：tianpeng-151104@ 163.com ；刘占林(1972-)，男，博士，副教授，通讯作者，E-mail ：liuzl@nwu.edu.cn

主要通过使用同源搜索工具BLAST 或FASTA 等从目的物种的cDNA 或EST 数据库中获取可能的糖基转移酶基因序列，接下来就可以对该基因进行克隆来进一步确认。Kikuchi 等[8]在2006年的研究中就指出生物信息学在糖组学的研究中已体现出强大的优势，不仅用于糖基转移酶基因的发现和鉴定，还可以用于目的基因的功能预测、基因结构分析、亚细胞定位；或者对于蛋白质的结构域分析、疏水性分析、保守序列预测、甚至三维结构的预测等等。总之，生物信息学已成为糖组学或者其它组学研究中必不可少的有效工具。

基于以上这些方法，目前已经克隆并鉴定了多种植物的糖基转移酶基因[9]，分离得到大量的糖基转移酶蛋白，有些已测定了三维结构，这对于分析糖基转移酶与底物的识别和相互作用至关重要[10-13]。随着大规模基因组计划的进行，越来越多的糖基转移酶家族成员将被发现，除了对这些糖基转移酶的结构与功能进行研究外，关于这些基因的划分归类及其进化规律一直是糖基因组学关注的热点问题。

对于糖基转移酶的分类按照不同的规则，就有着不同的解释：

(1)按照糖基化反应的机制，糖基转移酶超家族可以被划分为两大类，即保留型(retaining, R)和反转型(inverting, I)。这种分类是从立体化学上来界定的，糖基供体上的异头碳的构型，转到受体上之后没有改变即为保留型，如果发生反转即为反转型[14]。

(2)按照蛋白质的三维折叠模式，大部分糖基转移酶被划分到GT-A 和GT-B 两大类。起初只有很少的糖基转移酶的三维结构被测定，其中最早的为兔肌糖原磷酸化酶和T4噬菌体β-葡萄糖基转移酶，后续又报道了一些，但这些蛋白质都只采用两种折叠模式，即GT-A 和GT-B 。GT-A 主要包括两个不同的结构域：一个N 端的核酸结合结构域和一个C 端的受体结合结构域，另外大多数GT-A 类型的蛋白质还有一个保守的DxD 模体(motif)；GT-B 则含有两个相似的Rossman 折叠结构域，这两个结构域被一个深的裂隙所分隔[13]。将糖基转移酶分为GT-A 和GT-B 两个超家族是普遍被接受的，Liu 等[15]在2003年的研究中，又将跨膜糖基转移酶归类为GT-C 超家族，这一组蛋白质在第一个胞外环上也有一个类似DXD 模体，但现

今没有证据可以证明GT-C 中的DXD 环和GT-A 中的DxD 模体是共同进化而来，因而GT-C 和GT-A 、GT-B 一样是另一个独立的超家族，这三个超家族总共占了糖基转移酶的75%左右。Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)是一个基于多序列比对和隐马科夫模型对蛋白质家族进行归类的数据库，采用了将糖基转移酶分为GT-A 、GT-B 、GT-C 三大支的观点，这三大支目前分别包括32、19、18个Pfam 基因家族成员(1) 。Martinez 等[16]在2003年的研究中通过PSI-BLAST 又发现部分果糖基转移酶拥有保守的序列片段，并建议将这些果糖基转移酶组成一个新的超家族，即GT-D 。Kikuchi 等[17]同时通过隐马科夫模型也将果糖基转移酶归到另一大类，后来他们在2006年的研究中又进一步指出果糖基转移酶可能有着不同的三维结构，因此他们支持将糖基转移酶归为四个超家族，并且指出在真核生物中这四个超家族有着很好的亚细胞定位相关性，他们推测真核生物中不同超家族的糖基转移酶分别由不同亚细胞定位的祖先基因进化而来[8]。

(3)按照酶的催化反应特征和底物特异性，这是国际生化与分子生物学联盟(International Union of Biochemistry and Molecular Biology, IUBMB)所推荐的划分依据。但是在大规模的基因组测序时代，有大批的糖基转移酶不断被发现，而要很快了解其生物化学特性并不容易，按照该规则对相应的酶进行分类就比较耗时费力。

(4)按照序列相似性，Henrissat 研究组对生物界中的所有糖基转移酶进行了系统的划分归类，并将其结果收录在CAZy(Carbohydrate Active enZYmes Database, CAZy, http://www.cazy.org/)数据库中，在1997年他们划分了26个家族[1]，2003年增至65个家族[5]，目前已增至92个(1) ，另外还有部分基因未作归类，意味着可能还有新的基因家族将被划分出来。Henrissat 的这种分类方法是对IUBMB 分类方法的补充，并有着极大的优点：首先序列相似性与蛋白质结构的保守性有着很高的相关性，进而与酶的功能联系到一起；其次，按照序列相似性将不同功能的糖基转移酶进行聚类，可以分析该酶在基因组中的进化特征，并解释不同功能的酶之间的亲缘关系[1]；另外，按照这种分类规则就可以对已知序列的蛋白质进行归类，这在基因组测序结果的注释过程中非常便

1　糖基转移酶超家族的划分归类

亚家族 CAZy Pfam

2(I) 6(R) 7(I) 8(R) 12(I) 13(I) 15(R) 21(I) 24(R) 25(I) 27(R) 31(I) 32(R) 34(R) 40(I) 43(I) 44(R) 45(R) 49(I) 55(R) 60(R) 64(R) 67(I) 71(R) 74(I) 77(R) 78(R) 81(R) 82(I) 84(I) 92(I)

1(I) 3(R) 4(R) 5(R) 9(I) 10(I) 19(I) 20(R) 23(I) 28(I) 30(I) 33(I) 35(R) 41(I) 63(I) 70(I) 72(R) 80(I)

22(I) 39(I) 48(I) 50(I) 53(I) 57(I) 58(I) 59(I) 66(I) 76(I) 83(I) 85(I) 87(I)

11(I) 14(I) 16(I) 17(I) 18(I) 26(I) 29(I) 37(I) 38(I) 42(I) 47(I) 51(I) 52 54(I) 56(I) 61(I) 62(R) 65(I) 68(I) 69(R) 73(I) 75(I) 79(R) 88(R) 89(R) 90(I) 91

PF00535 PF00483 PF01501 PF01128 PF02348 PF03142 PF01762PF04488 PF03552 PF01755 PF01704 PF01644 PF01697 PF02434PF03407 PF03414 PF03360 PF09837 PF05637 PF11051 PF02709PF09258 PF05679 PF03071 PF04646 PF01983 PF05704 PF11397PF03213 PF11316 PF06306 PF03314

PF00534 PF00201 PF08323 PF04101 PF01075 PF03033 PF00343PF02350 PF00982 PF02684 PF04230 PF04464 PF05159 PF06925PF08660 PF06722 PF05693 PF06258 PF04007

PF02366 PF09594 PF03901 PF09586 PF02516 PF02364 PF03155PF01277 PF04188 PF04602 PF05007 PF09852 PF04922 PF09913PF05208 PF11028 PF10131 PF07220

PF01531 PF02485 PF05060 PF04724 PF03808 PF00777 PF03254PF07388 PF06002 PF03016 PF00912 PF07922 PF04666 PF07429PF04577 PF03452 PF10250 PF11735 PF01973 PF03214 PF05686 PF12141

GT-A(CL0110)

GT-B(CL0113)

GT-C(CL0111)

Unclassified

注：表1数据从CAZy 、Pfam 数据库搜集整理而来。

利。因此Henrissat 的这种分类方法被普遍采用，Hashimoto 等[13]在2009年的研究中就按照序列相似性对36个真核生物基因组中的3426个糖基转移酶进行归类，划分了53个家族，并进一步归入6个与代谢途径相关的功能超家族，分别为合成N 型糖前体、GPI 锚、O 型糖和糖脂的糖基转移酶、以及负责糖链延伸和末端延伸的糖基转移酶，此外还有一些家族未归入这六大类。

糖基转移酶的进化分析与划分归类两个问题往往被放在一起进行讨论，因为进化分析中的聚类结果可用于指导划分归类，而既定的分类结果又可用于对系统聚类树的合理性进行检验，两个方面相辅相成。

糖基转移酶超家族的进化分析最早多见于对动物方面的研究中，Kaneko 等[18]在对动物基因组中的55个主要涉及N 型和O 型糖链合成的糖基转移酶的研究中指出，糖基转移酶中的众多成员来自于基因重复或染色体重复，并且估测了部分糖基转移酶的在脊椎动物中的分化时间，以及可能的基因重复事件发生的时期。在对基因进化速率的研究中发现，不同家族之间的糖基转移酶具有不同的进化速率，有的相对快一些，有的相对慢一些，甚至有的基因的非同义替换速

率(dN)与持家基因一样的低。Eisenberg 等[19]通过实验证明在人类基因组中一些糖基转移酶基因如：DDOST 、B4GALT3、MGAT1、EXTL3等正是持家基因，由此可见这些糖基转移酶有着很高的保守性。拟南芥是第一个被测序的高等双子叶植物，其基因组中的糖基转移酶基因得到了比较充分的研究[20-22]，特别是对第一个家族UDP-糖基转移酶(UGT)的研究比较透彻，而UGT 基因家族也是植物基因组中最大的糖基转移酶家族，拟南芥中已经发现了大约120个UGT 包括8个明显的假基因。虽然这些基因在序列上的相似性并不是很高，但在结构上却比较一致，说明这些基因都是由一个共同祖先进化而来；通过系统聚类树上可以发现植物还有一些特有的糖基转移酶序列，它们都含有比较保守的PSPG(putative secondary plant glycosyltransferase) 模体[22]。在植物中，研究者还比较关注的是与细胞壁合成或者纤维素合成相关的GT ，Ye 等[23]近期的研究中通过比较拟南芥、水稻、杨树、高粱、葡萄基因组中的GT14/GT14-样基因家族(该家族基因在细胞壁合成过程发挥作用) ，分析了这些基因在物种进化的同时所发生的基因重复、功能分化等状况。

基因家族的进化主要依赖于基因重复(gene dupli-

cation) 与基因产物的功能分化(functional diversification)的共同作用，糖基转移酶的众多成员主要是基因重复的结果。基因重复有多种方式：串联重复、片段重复、逆转录转座相关的重复、染色体重复、全基因组重复[24-28]。

植物基因组中的糖基转移酶数目大多要比动物中的多，这是因为植物是不动的有机体，它们的生存需要依靠快速的适应不断发生变化的生物和非生物环境，一个可能的结果就是产生大量的次级代谢产物，比如涉及到抗氧化胁迫的代谢产物，以及介导植物与其他生物进行交流的信号分子等。这些代谢产物往往要经历糖基化修饰，从而糖基转移酶在细胞稳态方面起到了重要的作用[20]。

拟南芥作为高等双子叶植物的代表，CAZy 数据库中现已收录了462个拟南芥的糖基转移酶(人类基因组中有225个) ，划归于42个不同家族。单子叶植物水稻的两个亚种粳稻品种日本晴和和籼稻品种9311先后完成全基因组测序，CAZy 对水稻日本组的糖基转移酶家族有着比较全面的概括，收录了574个，并且有着与拟南芥同样的家族种类与数目。对于这个结果，一个可能的解释是水稻中的糖基转移酶是以拟南芥为基础通过同源搜索而获得的，是否有新的成员尚未发现，还有待新的数据来证实；另一方面，如果结果确实如此，那么就说明，糖基转移酶超基因家族下的各个家族是在单双子叶植物分化之前便已存在。杨树作为第一个被全基因组测序的树木，CAZy 数据库对其糖基转移酶家族尚未得到比较全面的概括，如果事实如上述第二种，那么杨树中应该有着与拟南芥同样种类的糖基转移酶家族。因此需要搜集概括杨树糖基转移酶家族，了解其是否与拟南芥、水稻具有相同家族种类与数目的糖基转移酶家族。在多基因家族进化的研究中，通过比较拟南芥、水稻、杨树这三种经典的模式植物基因组中的相关基因，可以揭示在单双子叶植物分歧的进化历程中多基因家族在不同物种中的扩张、保留、变异等状况，从而在分子水平上解释基因的变化对于物种形成的影响。这种研究思路在许多前人的工作中都有所体现，例如Y ang 等[29]2008年对植物SBP-box 基因家族的研究，Xu 等2009年对F-box 超家族的研究, 等等。

植物基因组中庞大的糖基转移酶基因家族是基

[30]

因重复的结果，而基因重复有多种方式，除了要推测重复发生的时间外，还要对重复产生的方式进行解释，这对于了解基因组的进化机制至关重要。糖基转移酶超家族下有很多的不同基因家族，各家族的规模大小不同，那么基因重复在各家族间的状况应当不同，基因的进化速率亦有差异，而进化速率的差异应来自不同的选择压力，因此必须对各个基因家族的选择效应进行估测，揭示糖基转移酶基因家族形成与进化的历程，这是需要解决的另一个问题。此外，前人对于多基因家族进化的研究中已经逐步找到一些规律，Xu 等[30]在对F-box 超家族的研究中就指出，参与相对保守的代谢途径的基因(如胚胎发生、幼苗发育、昼夜节奏、花发育、衰老) 发生基因重复的现象较少；在参与相对比较特殊的生理过程的基因(如传粉、抗病、免疫等) 经历较频繁的基因加倍。这样的规律在糖基转移酶超家族中是否适用，有待继续深入研究。

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Glycosyltransferase supergene family

TIAN Peng, LIU Zhanlin

Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education,

School of Life Sciences, Northwest University, Xi’an 710069, China

Abstract Glycosyltransferases are responsible for glycosylation through transfering glycosyl from activated sugars to acceptor molecules and creating a glycosidic bond. There are many kinds of glycosyltransferases in vivo, which has formed a supergene family. The indentification, classification and evolution of glycosyltransferases were discussed in this paper, and their evolution in higher plants were also put forward here.

Key words glycosyltransferase; supergene family; classification; evolution

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