回忆_淡淡籴
范文一：酶活力测定方法的研究
实验二 酶活力测定方法的研究（1）
——淀粉酶活性的测定
一、 研究背景
酶Enzyme，指具有生物催化功能的高分子物质。酶通过降低化学反应的活化能来加快反应速率，因而具有高效性，同时酶具有高度的专一性。酶的催化活性可以受其他分子影响：抑制剂是可以降低酶活性的分子；激活剂则是可以增加酶活性的分子。酶的活性还可以被温度、化学环境（如pH值）、底物浓度以及电磁波（如微波）等许多因素所影响。酶在工业和人们的日常生活中的应用也非常广泛。例如，药厂用特定的合成酶来合成抗生素；加酶洗衣粉通过分解蛋白质和脂肪来帮助除去衣物上的污渍和油渍。
淀粉酶是一类水解淀粉的糖苷键的总称，按照其水解淀粉的方式，可以分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶是一种内切葡萄糖苷酶，催化水解α-1,4-糖苷键，生成α-麦芽糖和少量葡萄糖。β-淀粉酶从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1,4-葡聚糖链。对于象直链淀粉能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α-1,6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。
二、 研究目标
1. 掌握酶活力的测定方法
2. 进一步学会设计实验方案
3. 测定α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性
三、 研究策略
酶的活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数。
实验的总体思路是测定每分钟内催化生成的麦芽糖的量。
1. 酶的获取
淀粉酶广泛存在于禾谷物类的种子中α-淀粉酶是在萌发的过程中产生的。所以取萌发的种子浸提获取酶溶液。
2. 反应过程
β-淀粉酶不耐热，在高温下容易钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下发生钝化。尽管在种子的萌发过程中，提取液中同时含有两种淀粉酶，可利用这两种淀粉酶的不同特性加以处理，钝化其一，即可测定另外一种酶的活力。
3.产物的检测
淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用还原糖的3,5-二硝基水杨酸法测定。
四、 研究方案及可行性分析
研究方案：
α-淀粉酶耐高温，而β-淀粉酶在高温下易失活。可以在适当的高温下水浴，使β-淀粉酶失去活性，而α-淀粉酶的活性不受很大的影响，这样分解的淀粉可以认为是α-淀粉酶催化的产物。同时可以测量α-淀粉酶和β-淀粉酶的总活力，从而推出β-淀粉酶的活力。
可行性分析：
温度可以通过恒温水浴来实现。试剂等都是实验室常见的，仪器实验室也有。
五、 具体实验设计
1、所用相关试剂：
1%淀粉溶液，pH5.6的柠檬缓冲液，3,5-二硝基水杨酸，麦芽糖标准液，0.4M NaOH
2、相关仪器：
分光光度计，水浴锅，离心机
3、实验步骤：
（1） 酶液的制备
称取2g萌发的小麦种子；研磨成匀浆；转移到50ml容量瓶中至40ml左右，室温浸提15-20min后定容；混匀后3500rpm/min，离心20min，取上清液备用
（3） α-淀粉酶及β-淀粉酶总活性的测定
（4） 麦芽糖的测定
α-淀粉酶活性[(mg/g)/(g/min)]=[(A-A’)*样品稀释总体积]/[(样品重g)*5] (α-+β-)淀粉酶总活性[(mg/g)/(g/min)] =[(B-B’)*样品稀释总体积]/[(样品重g)*5]
A——α-淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度
A’——α-淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度
B——(α-+β-)淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度
B’——(α-+β-)淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度
六、 质疑及相关思考
酶的活力主要体现在初速度上，应该如何控制反应时间，从而得出的结果为酶促反应的初速度。
高温条件下β-淀粉酶的活性是否被完全抑制，同时α-淀粉酶的活性是否没有改变。
七、 思考题
1.酶活力测定实验的总体思路你认为应该是什么？
酶的活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数。
实验的总体思路是测定每分钟内催化生成的麦芽糖的量。而且酶促反应的初速度才是反应酶活的指标。
2.由上述总体思路你认为酶活力测定实验中最关键的设计应该是什么？为什么？在该项设计中要注意什么？
影响酶活力的因素很多，要测定酶的活力就需要创造合适的条件。材料中有两种淀粉酶，本实验的关键是如何抑制一种酶的活性，而另一种酶的活性没有太大改变。
在实验的过程中，水浴的时间一定要到位，如果干扰酶的活性没有被完全抑制，则会严重影响实验结果。
3.淀粉酶和转氨酶的作用各自有何特点？在设计其酶活力测定的具体实验方案时，你认为主要应该有哪些针对性的考虑？
淀粉酶和转氨酶属于不同类型的酶。淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶，转氨酶是催化?-酮酸和?-氨基酸之间转氨作用的酶，它们产物不同，最适条件不同。
保证在最适温度，pH等条件下测定其酶活力。
4．酶促反应的特点？规定酶活力单位的作用？酶活力单位想表征的内涵是什么？其规定有什么特点？
酶具有高效性和专一性，同时要求温和的反应条件。
规定酶活力单位可定量表示酶的催化效率。一个酶活力单位，是指在最适条件下（25?C，最适pH，充足底物），每分钟内能催化1 ?mol底物所需要的酶量。酶活力单位可以用于衡量酶的活性，从而在生产上起指导作用。
5. 所有酶活力测定方法中都有所谓的“对照管”的设计，为什么？其作用是什么？在对它的设计上有何特点？
最主要的作用是控制变量，对照管的设计是用于排除变量以外的其他变量对于体系的影响，尽可能的消除实验的误差。在测定α-淀粉酶的实验中，对照组先加NaOH的作用是使酶失活，从而结果中可以反映酶失活后没有产物生成，得出酶对于反应的进行十分重要。对照组除了要研究得变量意外其他的和实验组一样。
6. 以你们对相关知识的理解，试着分析一下禾谷类种子（如：小麦）萌发过程中的主要代谢特点及可能的代谢途径。
禾谷类种子萌发过程中，种子吸水，内部代谢增强。β-淀粉酶主要预存在胚乳中，α-淀粉酶的产生则与GA的诱导有关。盾片和胚芽鞘产生GA，转运到糊粉层，GA诱导糊粉层合成α-淀粉酶，α-淀粉酶合成后分泌到胚乳。胚乳水解产生的可溶性糖输送到胚的生长部位，作为营养利用。
7．众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均采取钝化?-淀粉酶的活力而测?-淀粉酶和测总酶活力的策略，为何不采取钝化?-淀粉酶活力去测?-淀粉酶活力呢？这种设计思路说明什麽？
温度变量更好控制，高温对于?-淀粉酶的活力没有多大影响，而对于β-淀粉酶则有很好的抑制作用。强酸或强碱的条件下也能催化淀粉的水解，同时在体系中引入了其他的离子，这对于实验的准确性是不利的。
8．有人认为本实验中可以用对照管调分光光度计的100%T 从而获知测定管的OD值，你的观点呢？为什麽？你认为本实验中设计的对照管与比色法测定物质含量实验中设计的空白管有何异同？
不可以，因为空白管是用于得出标准曲线中的麦芽糖含量，而对照管中可能含有少量的麦芽糖所以不能用对照管作为0基准。
空白管的作用是用来调节0点和透光率100%的，而对照管的目的是为了排除因为在种子萌发的过程中造成的少量的麦芽糖生成的影响。但两者从原理上都是为了消除部分影响因素对于光吸收的干扰。
范文二：酶活力的测定方法
酶活力的测定方法
摘要:
关键词:
1.引言
2.概述
2.1 酶
指一类具有催化功能的生物大分子，一般为蛋白质，也包含少数具有催化功能的RNA。
2.2 酶活力
酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
2.3测定酶活力的原理
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。
3. 测定方法
3.1 终止反应法:
是在恒温反应系统中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，加入强酸强碱或者SDS溶液，以及加热等方法使反应立即停止，然后用化学法、放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成量或底物的消耗量。这种方法是最经典的测定酶活力的方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。 3.1.1 还原法
酶与底物在特定的条件(如温度、PH值、底物浓度等)下反应，酶可以促使底物释放出具有还原性的基团，而当向这些反应体系中添加化学试剂，酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应，既而生成有颜色的物质。之后通过在特定的波长下比色，即可求出还原产物的含量，从而及时出酶活力的大小。 3.1.1.1 DNS法
我们经常用的试剂主要为DNS溶液(3,5-二硝基水杨酸)。在果胶酶活力(主要为外切-多聚半乳糖醛酸酶)的测定中，因该类酶以果胶酸为底物，可使其完全分解为D-半乳糖醛酸，这一产物为醛糖的一种，故可与DNS溶液共热产生棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和含有呈色氨基化合物的反应液颜色深浅成正比的原理，在540nm下测其吸光度值，从而就算出果胶酶的酶活力。
3.1.1.2 MBTH法
该法是利用MBTH(3-甲基-2-苯丙噻唑酮腙)与酶液中的还原端基反应生成
3+嗪，过量的MBTH被Fe氧化成阳离子，再与嗪反应生成青蓝色化合物，在一定范围内，还原端基的量和反应液的颜色强度呈正比，测定波长为630nm或者650nm。该法的灵敏度极高，比DNS法高很多。
3.1.2 粘度法
该法是通过测酶对底物粘度的降解率来衡量酶的活性高低。底物粘度可以通过测流量的粘度计以及振动旋转粘度计等现代电子设备，引起的电阻变化被转化为酶活力单位。虽然此法比较灵敏，但是操作复杂繁琐且重复性比较差，并不太常使用。
3.1.3 HPLC法(高压液相色谱法)
酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取一定量的溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰
从而换算出酶活力的数值。这种方高和半峰高后,计算出酶促反应生成物的含量,
法精确度比较高。
3.1.4 免疫学方法
主要与免疫电泳法和免疫凝胶扩散法，这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应，通过待测酶和标准酶进行比较厚，最终确定酶活力，这种方法也非灵敏，但缺点则是不同厂家生产的酶产品需要有不同的抗体发生反应，增加了测定成本。
3.1.5琼脂凝胶扩散法
该法的理论基础是刚果红与多糖的显色反应。将酶作用的底物与琼脂融合熔融后，倒入培养皿中或载玻片上制成琼脂平板。再用打孔器在琼脂平面上打出一个小孔。之后再小孔内点加酶，并培养24小时候，用染色剂显色或用展开剂展开显示出水解区，利用水解直径和酶活力的关系测定酶活力。但是该法占用时间长，且精确度比较低，
3.1.6酶联吸附分析法
3.1.7底物染色法
该方法主要是对底物进行化学修饰后使其带有特定的荧光物质或者染料，在待测酶的催化下释放染料或者荧光物质，通过是防御乙醇中的染料或荧光物质的多少来反映酶活的大小。可用的染料主要有雷马氏亮蓝、刚果红等。在测木糖酶的酶活力时可以采用这种方法。此法操作简单，但由于底物制备的特殊性，提高了测定成本，此外该法对温度、离子强度、乙醇浓度及影响染色片段溶解度的因素非常敏感。
3.1.8酸碱滴定法
在测定脂肪酶活力时，可采用这种方法，
3.2 连续反应法:
无须终止反应，而是在酶反应过程中用光化学仪器或电化学仪器等来监测反应的进行情况，对记录结果进行分析，然后计算出酶活力。
4. 测定实例
5. 结语
6. 参考文献
范文三：酶活力的测定方法
实验四 α-淀粉酶实验活力的测定方法
一、实验目的
了解并掌握淀粉酶的测定步骤，掌握其方法。
二、实验原理
液化型淀粉酶（α-淀粉酶）能催化水解淀粉，生成分子较小的糊精和少量的麦芽糖及葡萄糖。本实验利用呈色反应来测定液化型淀粉酶水解淀粉作用的速度，从而测定淀粉酶活力的大小。
三、器材和试剂
1.器材
多孔白瓷斑、50ml三角瓶或大试管（25mm*200mm）、恒温水浴箱、烧杯、容量瓶、漏斗、吸管、纱布。
2.试剂
（1）原碘液 称取I211g、KI22g，加少量水完全溶解后，再定容至500ml，于棕色瓶中
保存。
（2）稀碘液 吸取原碘液2ml，加入KI20g，用蒸馏水溶解定容至500ml，于棕色瓶中保存。
（3）标准“终点色”溶液。
①准确称取氯化钴40.2439g、重铬酸钾0.4878g,加水溶解并定容至500ml。
②0.04%铬黑T溶液。准确称取铬黑T40mg，加水溶解定容至100ml。
取①液80ml与②液10ml混合，即为标准色。冰箱保存。
（4）2%可溶性淀粉 称取烘干可溶性淀粉2.00g，先一少许蒸馏水混匀，倾入80ml沸水中。继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100ml。此溶液需要新鲜配制。
（5）0.02mol/L、pH6.0磷酸氢二钠溶液 称取Na2HPO4·12H2O45.23g和C6H8O7·H2O8.07g,用蒸馏水溶解定溶至1000ml，配好后以酸度计或精密试纸校正pH。
（6）α-淀粉酶粉。
四、操作步骤
1.待测酶液的制备
（1）精密称取酶粉1-2g，放入小烧杯中。
（2）用少量的40℃0.02mol/L(恒温水浴箱中进行) pH6.0的磷酸氢二盐-柠檬酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研3-4次，最后全部转入容量瓶中，用缓冲溶液定容至刻度，摇匀，通过四层纱布过滤，滤液供测定用。（如为液体样品，可直接过滤，取一定量滤液入容量瓶中，加入缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，备用。）
2.测定
（1）将“标准色”溶液滴于白瓷板的左上角空穴内，作为比较终点色的标准。
（2）在50ml的三角瓶中（或大试管中），加入2%可荣幸淀粉液20ml，加缓冲溶液5ml在60°C水浴中平衡约4-5min，加入0.5ml酶液，立即记录时间，充分摇匀。定时用滴管取出反应液约0.25ml，滴于预先充满此稀碘液（约0.75ml）的调色空穴内，当空穴颜色由紫色变为棕红色，与标准色相同时，即为反应终点，记录时间T（min）.
五、计算
1g酶粉或1ml酶液于60°C、pH6.0的条件下，1h液化可溶性淀粉的克数，称为液化型淀粉酶的活力单位数。
酶活力单位=60/T*20*2%*n*1/0.5*1/m
式中 n:酶粉稀释倍数
60：1h(60min)
0.5:吸取待测酶液的量，ml;
20*2%:可溶性淀粉的量，g;
T:反应时间，min;
m: 酶粉取样量。
六、说明
1.全部时间控制在2-2.5分钟，否则应改变稀释倍数，重新测定。
2.实验中，吸取2%可溶性淀粉及酶液的量必须准确，否则误差较大。
七、思考题
1.在测定酶活力的过程中，应注意什么问题？
2. α-淀粉酶习惯单位的定义是如何规定的？
3.诺维信公司α-淀粉酶和糖化酶的活力单位是如何规定的？
范文四：酶活力测定方法
蛋白酶活力测定: 参照中华人民共和国专业标准 SB/ T10317-1999蛋白酶活力测定方法( Asha 等, 2007)。
纤维素酶DNS酶活力测定方法
DNS, 活力, 纤维素酶, 测定 1 定义
1g固体酶粉在40℃和pH值4.2条件下，每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位，以u/g表示。 2 原理
纤维素酶分解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量，表示酶的活力。 3.试剂和溶液
3.1 1％葡萄糖标准溶液（同β－葡聚糖酶酶活测定） 3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液
取1g羧甲基纤维素钠（粘度300～600厘泊）,加入pH4.2的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤，此溶液在4℃冰箱贮存，有效期3天。取滤液100ml， 20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮冰箱备用。
3.3 DNS 试剂（同β－葡聚糖酶酶活测定） 4仪器和设备
4.1恒温水浴锅(40℃±0.2℃) 4.2分光光度计
含10mm比色皿，可在550nm处测量吸光度。 5测定步骤
5.1 标准曲线绘制
分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中，加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml，于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。冷却后，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。 5.2待测酶液的制备（同β－葡聚糖酶酶活测定） 5.3 比色测定
精确吸取经待测稀释酶液0.5ml，40℃预热5min，加入经40℃预热的CMC液1.5ml（每个样品同时作3支平行试管），于40℃水浴精确反应10min，立即加入DNS试剂3.0ml终止反应，以后按标准曲线制作步骤测定样品吸光度。
同时进行空白对照测定，取稀释酶液0.5ml，先加入DNS试剂3.0ml，再加入CMC液1.5ml，其余步骤同于样品测定。
6.计算
X=cn/(0.5*10)
式中：X－样品的酶活力，u/g；
c－由样品的平均吸光度从标准曲线或回归方程求得的相对应的葡萄糖的量，mg；
n－样品的稀释倍数(制备成的酶液ml数/2g酶粉)，ml/g； 0.5－参与反应的酶液量，ml； 10—反应时间，min。
空白对照液的配制：
(1)精确加入0.2ml稀释酶液。 (2)精确加入1.8 ml pH = 4.8醋酸缓冲溶液。 (3)放入新华1号滤纸一条。
(4)精确加入3ml DNS试剂。
(5)随同对照样，放入沸水浴中反应15min(注意：参见操作步骤6)。 (6)冷却后加入蒸馏水定容到25ml。
9．以空白对照液调零点，在λmax = 550nm下，用分光光度计测量吸光度值。
滤纸酶活力 = A × 5 × 200 × 1000 / 60 （u/g） A 吸光度值在标准曲线上对应的葡萄糖量（mg）。
CMC酶（Cx）活力测定方法
用pH = 4.8醋酸缓冲溶液配制1%CMC溶液。
准确称取1g酶粉，用蒸馏水定容到2000ml，配制0.5g/L的稀释酶溶液。 在有标准刻度线的试管中加入1.8ml1%CMC溶液。 再加入0.2ml稀释酶液。
在50±1℃水浴中保温反应30min后，立即加入3ml DNS试剂。 空白对照液用1.8ml1%CMC溶液加入3ml DNS试剂，再加入0.2ml稀释酶液。 同时在沸水浴中反应10min，加入蒸馏水定容到25ml。
以空白对照液调零点，在λmax = 550nm下，用分光光度计测量吸光度值。
Cx酶活力 = A × 5 × 2000 × 1000 / 30（u/g）
全活性：取4支15ml试管，每支试管中加入1.5 mL.39℃预热的2%羧甲基纤维素钠（内含0.1 mg/mL硫柳汞），其中1号试管为试剂空白，加入0.01 M，pH6.8磷酸钠缓冲液1 ml； 2号试管为酶样空白，什么也不加；3,4号试管为酶样平行样，各加入1 ml酶液，4支试管同时放入39℃水浴回旋震荡培养60 min。培养后4支试管立即加入3 mL DNS（3,5-一硝基水杨酸溶液），再在2号试管中加入1 ml预先制备好的酶液，用旋涡震荡仪混匀后在开水浴中煮沸5 min，取出后用水冷却5min。以1号试管为空白，在紫外分光光度计上560 nm处进行比色。
以D-葡萄糖作为标样，葡萄糖标准曲线的绘制：称取无水葡萄糖1.00g，溶于100 mL容量瓶中，制成浓度为10 mg/mL葡萄糖溶液，再从中依次吸收1，2，3，4，5，6 ml各溶于100 mL容量瓶中，制成浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL溶液，吸取1.0 mL葡萄糖溶液加入3 mL DNS，煮沸5 min，冷却5 min于560 nm处比色，绘制标准曲线。
Folin酚法测定蛋白酶活力
一、原理
采用福林-酚试剂法。福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。 二、 试剂 1) 福林-酚试剂
向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO2?2H2O)、25g钼酸钠及700mL的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以小火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴液溴，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。 2) 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液
精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。 3) 0.4mo1/L碳酸钠溶液
精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。 4) pH值3～6醋酸缓冲液
精确取NaAc?3H2O16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合，用去离子水稀释定容至1000mL。 5) 2%酪蛋白底物缓冲液 a) 测试酸性蛋白酶缓冲液
精确称取酪蛋白20g，加入0.1mol/L氢氧化钠20mL(用去离子水配制)，在水浴中加热溶解，然后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL。当日配用或置于冰箱中保存。 b) 测试中性蛋白酶缓冲液
精确称取酪蛋白20g，置于1000mL三角瓶中,加入0.2mol/L Na2HPO4溶液(去离子水配制)610mL，在沸水浴中搅拌使其溶解，冷却后过滤，加入0.2mol/L Na2HPO4溶液(去离子水配制)390mL，用去离子水定容至1000mL，即成pH7.0、2%酪蛋白溶液。当天配用或置于冰箱中保存。
6) 100μg/mL酪氨酸溶液
精确称取100mg酪氨酸，逐步加入0.lmol/L盐酸溶解后，用去离于水定容至100mL放入冰箱中保存，临用时用去离子水稀释10倍。
三、操作步骤
1. 酪氨酸标准曲线的绘制
取18支试管分成6组(每组3支，平行样)，编号，按表1分别加入标准酪氨酸、去离子水、0.4mol/L的碳酸钠和福林-酚试剂，混匀后，放入40℃水浴保温20min，然后在721型分光光度计上进行比色测定(波长660nm)，以浓度为0μg/mL酪氨酸溶液做空白对照。
2. 样品酶活的测定
酶液适当稀释。取4支试管编号(1号为空白对照)，分别加入酶液1mL,1号管立即加入
0.4mol/L TCA溶液2mL，使酶失活，另3支样品加入lmL pH 7.0、浓度为2%酪蛋白底物缓冲液(如测酸性蛋白酶活力加pH3.6、2%酪蛋白底物缓冲液)，迅速混匀，并立即放入40℃恒温水浴准确计时，保温10min后，立即加入0.4mol/LTCA溶液2mL，终止反应，同时向1号空白管中加入1mL2%酪蛋白底物缓冲液，摇匀，继续置于水浴中保温20min，取出离心或过滤除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各试管滤液1mL，分别移入另4支试管中，再加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL和己稀释的福林-酚试剂1mL，摇匀，保温显色20min后，进行比色测定(波长660nm)。对照标准曲线，计算酪氨酸含量。 四、蛋白酶活力计算
蛋白酶活性定义:在一定pH值(pH3.6或7.0)和40℃温度条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。
1.3.2 淀粉酶活性测定 1.3.2.1 标准曲线的绘制
分别吸取1.0％葡萄糖标准溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每毫升含葡萄糖200、400、600、800、1000、1200ug的标准溶液，按表A1的操作步骤一起反应。以葡萄糖含量为纵坐标（0.5ml以上稀释液葡萄糖含量分别为：100、200、300、400、500、600μg），以吸光值为横坐标，绘制标准曲线，列出直线回归方程（Y=KX+B）。
1.3.2.2 样品测定
将各峰收集的样品经一定稀释后按下表所示步骤操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支管中加入试剂的时间间隔要绝对一致：
表A1
反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4,000rpm离心10min，上清液以标准空白调零，在分光光度计540nm波长处测定样品空白（A0）和样品溶液（A）的吸光值，A－A0为实测吸光值。用直线回归方程计算样品淀粉酶的活性。
1.3.2.3 活性计算
酶活力单位定义：在60℃、PH6.0条件下，每小时从1％的可溶性淀粉溶液中释放出1微摩尔葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位（U）
淀粉酶活性U按下式计算：
K×（A－A0） S×（30÷60）×180
其中：U——样品淀粉酶活性，U/ml； K——标准曲线斜率；
F——样品溶液反应前的总量，ml； S——样品测试量；表1中S＝0.5ml； 60——1小时为60min； 30——反应时间，min。 180——葡萄糖的分子量。
两个平行样品的测定结果用算术平均值表示，保留整数。
范文五：实验二 酶活力测定方法的研究
实验二：酶活力测定方法的研究
生物093 孙文雅 0902040319
一、研究背景
酶是生物体维持各种生命活动的重要物质，它是生物体内各种代谢反应的催化剂，在所
有生物体的生命活动中起着至关重要的作用。酶能够在十分温和的条件下，快速高效率地催
化各种生化反应，维持机体的正常生命活动。生物体中存在许多种的酶，每一种酶都有它特
异的作用对象，即具有专一性，这是由于各种酶的反应条件及作用机理都不相同。
要进行酶活力的测定，我们首先要明确的即是该酶在生物体内保持最大催化活性的生化
反应条件。在体外进行酶活力测定要针对酶的特异性进行，
我们对于不同酶的测定方法势必会有很大差异，那么该如何对某种酶活力的测定进行具
体细节的设计与分析呢？除去反应条件的控制外，具体材料的选择及具体操作步骤的设计上
上是否要遵循同一准则呢？在进行同一种酶在不同的材料中、不同发育时期的活力测定时，
测定方法是否可以生搬硬套呢？如果不是，又该如何把握具体细节的设计与修正呢？这些具
体细节的把握又是以何为依据的呢？这些疑问都需要我们在实验中进行深入的探讨与研究。
本次实验主要以淀粉酶与转氨酶的活力为主要测定对象，希望能从中寻找到对于上述疑
问的解答思路。而实验前我们首先需要了解及准备的则是淀粉酶的性质、最适反应条件及作
用机理。
淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按其水解淀粉的作用方式，可以分成α-
淀粉酶、β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的两种，广泛存在于禾谷类的
种子中。休眠的种子中只有β-淀粉酶存在，而α-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。α-
淀粉酶是内切酶，它可以水解淀粉内部任何部位的α-1,4-糖苷键；β-淀粉酶是外切酶，它
只能从淀粉的非还原末端依次水解一个个麦芽二糖，但它不能越过已经存在的α-1,6-糖苷
键继续切割；这两种酶的最终产物均主要为麦芽糖。在性质方面，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6
以下则发生钝化，而β-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，因此在测定过程中，若两种酶同
时存在，可利用这两种酶的不同性质加以处理，钝化其一，即可单独测定另一种酶的活性。
二、研究目标
在把握实验总体设计思路的基础上，通过对淀粉酶活力测定实验的具体操作设计，以我
们比较熟悉的禾谷类种子的萌发状态及其代谢特点为具体研究对象，依照我们借助于前人的
成果所设计的实验具体方案，进行淀粉酶活力的测定，体会分析具体测定细节设计上的差异，
并对获得的结果进行深入的分析探讨，修正并认可该实验的具体设计方案，从而获取相关设
计理念并完成酶活力测定实验操作的训练。
三、研究策略
1、首先从理论上对两种淀粉酶的性质及催化原理进行了解、对比，找到两种酶催化的
最适条件（温度、pH等），并通过对两种酶性质的探讨，明确如何在两种酶同时存在的前提
下只测定其中一种酶活力的控制方法，以及如何通过实验测定结果反映出酶催化活力的大
小。
2、在明确α-淀粉酶与β-淀粉酶特性的基础上，选择理论上操作最方便可行的处理方
法，即选择β-淀粉酶进行钝化，测定α-淀粉酶的活力及两种酶总的催化活力。之所以认为
这种方法是最方便可行的，有以下原因：倘若选择使两种酶分别钝化的方式单独测定另一种
酶的活力，在对酶液的处理上势必会增加一些额外的工作量，而且我们也不能保证两种处理
方法是否会对另一种酶造成不必要的损失；而只对一种酶进行钝化处理则可避免工作量的加
大，缩短实验时间，避免了酶液长期放置可能会对酶活力造成的影响，当然这是在假设两种
酶的活力不会互相影响的前提下的最好选择，但如果最终实验结果的分析表明，两种酶存在
相互作用的话，我们就不得不分别对两种酶进行测定了；另外，控制温度比控制溶液的pH
值要容易得多，这也是我们选择使β-淀粉酶而非α-淀粉酶钝化的原因。
3、设计具体的实验操作方案，注意对酶进行处理的实验条件的控制及缓冲液的选择，
并通过光电比色法对共同产物（麦芽糖）含量的测定衡量酶催化活力的大小。在这里，根据
其催化产物的特点和现有测定方法规定酶活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦
-1-1芽糖毫克数（毫克麦芽糖·克鲜重·分钟）。
4、记录实验数据，计算分析两种淀粉酶的活力，并判断实验方案的可行性。
四、研究方案及可行性分析
1、该实验的理论基础是：在某种条件下，给予一定的条件，单独或同时测定某种或某
些酶催化产物的含量来反映酶的催化活力。实验中需要进行待测酶液的制备、控制反应条件
对某种酶进行钝化处理及使酶在保持最大活力下对底物进行催化反应、利用光电比色法对酶
的催化产物进行含量测定等操作，在理论上这些操作均是前人研究后的成果，不存在是否具
有可操作性的疑问，但操作过程中仍需谨慎，特别是对于反应条件的设定需严格控制，否则
极有可能造成实验结果不准确。总体来说，该实验方法是具有可行性的，是能够得到令人满
意的实验结果的。
2、预期的实验结果分析：
①实验结束后我们应该能从麦芽糖的标准曲线上得到两个酶催化处理后的麦芽糖含量，
一个是在β-淀粉酶进行钝化处理的前提下对α-淀粉酶活力单独测定的结果，另一个是对两
种酶总活力测定的结果，从第二个结果中减去α-淀粉酶的测定结果，即可得到β-淀粉酶的
活力，完成实验要求。
②倘若两种酶总活力的测定结果比α-淀粉酶单独测定的结果要小，假使反应条件的控
制不存在问题，这时我们就需要考虑两种酶是否存在相互作用这一疑问了，为了验证这一问
题，还需设计其他实验方案进行探究。
五、具体实验设计
1、所需的主要材料、试剂、仪器
⑴实验材料：萌发的小麦种子（芽长一厘米左右）
⑵实验试剂：
①%1淀粉溶液 ②pH5.6的柠檬酸缓冲液（A液、B液）
③3,5-二硝基水杨酸溶液 ④麦芽糖标准液（1mg/ml） ⑤0.4M NaOH溶液
⑶实验仪器
①盘架药物天平 ②722-光栅分光光度计 ③恒温水浴箱 ④离心机
2、具体操作步骤
⑴酶液的制备（蒸馏水浸提）：2g小麦种子→少量石英砂，以蒸馏水作为匀浆液研磨成
匀浆→少量多次用蒸馏水转至50ml容量瓶约至40ml→颠倒浸提15～20min→定容→
3500r/min离心20min→取上清液（即初始酶液）????????????预计耗时1h
取所制备的酶液5ml，放入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀。
⑷麦芽糖的测定
①标准曲线的制作??????????????????????预计耗时30min
pH5.6柠檬酸缓冲液：调解反应体系pH为淀粉酶的最适pH；
0.4M NaOH：营造碱性条件使酶失活，终止反应体系；
3,5-二硝基水杨酸：在碱性条件下，与还原糖共热，被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色 物质)，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色
深浅的程度量呈一定的比例关系，可做定量测定。
六、质疑及相关思考
1、质疑
从理论上分析来看，实验最终应该能得到满意的结果，测得以麦芽糖含量表示的的酶活力。但对于为何不使α-淀粉酶而使β-淀粉酶钝化这一问题，除去追求实验步骤上的简单易操作外，是否与两种酶的活性大小有关，是否还存在其他关于生化特性方面的解释，仍有些疑问，希望老师能够给以解答。另外，对于一种材料中两种淀粉酶活力的测定，仅能在某些方面方面反应实验设计的具体细节上的差异，对于设计思维上的把握可能还会有所欠缺，如果能再测定一种性质、最适反应条件及反应机理与淀粉酶完全不同的酶的活力，相信我们对于具体设计思路的把握会有更深入的认识。
2、思考题
⑴酶活力测定实验的总体思路你认为应该是什么？
首先对该酶的性质及催化机理进行了解，找到该酶催化的最适反应条件，选择合适的缓冲液及温度，保证酶在最适环境条件下进行生物催化反应，测定酶在每分钟内消耗的底物量或生成的产物量作为酶活力的反映值。
⑵由上述总体思路你认为酶活力测定实验中最关键的设计应该是什么？为什么？在该项设计中要注意什么？
①最关键的设计应该是对于酶的最适反应条件（最适温度及pH、充足底物）的控制； ②因为只有在最适反应条件下进行的酶催化反应才能反映出酶真实的催化活性； ③要注意选择合适的缓冲体系及维持准确的恒温环境。
⑶淀粉酶和转氨酶的作用各自有何特点?在设计其酶活力测定的具体实验方案时你认为主要有哪些针对性考虑？
①淀粉酶最适温度为40℃，最适pH为5.6，强碱性条件下失活；其中α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下发生钝化，β-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化；两种酶存在共同产物麦芽糖。
因此，在设计实验方案时，倘若在两种酶共存的体系（如实验中要用到的萌发的小麦种子）中，需要控制合适的条件使其中一种酶钝化后，在测定另一种酶的活力；另外，在设置对照阻止反应发生以及在底物由饱和变为不饱和之前终止反应时，可以使用强碱性溶液（如0.4M NaOH溶液）。
②转氨酶最适温度为37℃，最适pH为7.45，强碱性条件下失活；最主要的两类转氨酶为谷丙转氨酶和谷草转氨酶；其中谷氨酸-丙酮酸转氨酶(GPT)能催化α-酮戊二酸与丙氨酸转氨生成谷氨酸和丙酮酸，而谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（GOT）能催化α-酮戊二酸与天门冬氨酸转氨生成谷氨酸及草酰乙酸，草酰乙酸在柠檬酸溶液中经苯胺处理脱羧亦可生成丙酮酸。
因此，在对上述两种酶共存体系进行酶活力测定时，只需改变底物种类即可分别测定两种酶的活性，而且都可以通过测定每分钟生成丙酮酸的量来反映酶活力；另外，也可使用强碱性溶液（如0.4M NaOH溶液）来终止反应体系。
⑷酶促反应的特点？规定酶活力单位的作用？酶活力单位想表征的内涵是什么？其规定有什么特点？
①通过显著降低反应活化能，提高催化效率；对所催化的反应具有高度专一性；相对于无机催化反应，酶促反应条件温和；在生物体内，酶的活性受到严格调节。
②规定酶活力单位是为了通过相同的准则来反映各种酶催化活性的大小。
③一个酶活力单位是指在最适条件下每分钟能催化1μmol底物转化为产物所需要的酶量，即单位时间内催化单位底物所需的酶量，是通过酶量的大小来反映酶的催化活性，所需酶量越大，酶活力单位数越大，酶的催化活性越低。
④该规定没有通过人们惯用的反应速率，即单位时间内底物的消耗量或产物的生成量来
衡量单位酶的催化活性，而是以酶量来衡量。
⑸所有酶活力测定方法中都有所谓的“对照管”的设计，为什么？其作用是什么？在对它的设计上有何特点？
①为了减少系统误差。
②通过与“对照管”的测定结果进行比对，可以从中减去试剂、仪器等造成的系统误差。 ③设计“对照管”时要注意保证所加试剂除待测物质外其他含量均一致。
⑹以你们对相关知识的理解，试着分析一下禾谷类种子（如：小麦）萌发过程中的主要代谢特点及可能的代谢途径。
休眠的种子中只有β-淀粉酶的存在，说明对于维持休眠期种子的正常生命活动只需要β-淀粉酶催化降解少量淀粉即可满足；而α-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的，说明随着种子的萌发，β-淀粉酶催化降解所得的麦芽糖已经不能满足种子生命活动的需要，还必须借助α-淀粉酶的催化降解作用来补充；因此，可以得出结论，种子在萌发过程中对于淀粉（实际应为葡萄糖氧化分解所提供的能量）的消耗量是逐渐增多的，其中淀粉的代谢存在两种途径，分别由α-及β-淀粉酶进行催化。
⑺众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均采取钝化β-淀粉酶的活力而测α-淀粉酶和测总酶活力的策略，为何不采取钝化α-淀粉酶活力去测β-淀粉酶活力呢？这种设计思路说明什麽？
①钝化β-淀粉酶的活力而测α-淀粉酶的活力需要进行的是高温恒温处理，而钝化α-淀粉酶则需要控制溶液的pH，两者相比，温度控制更为方便，且不会对最后的结果造成额外的影响；另外，我个人认为，从两种淀粉酶的催化原理上分析，α-淀粉酶的催化活力应该高于β-淀粉酶，因此，测定所得α-淀粉酶在单位时间内产生的麦芽糖量应该高于β淀粉酶，由于在测定时对于较大测量值的测定产生的随机误差会相对偏小，因此选择钝化β-淀粉酶而测α-淀粉酶的活力这一方法，测得的结果更为准确。
②这种设计思路说明在涉及具体实验方案时，应该尽量选择简单易操作，且实验结果更准确的方法。
⑻有人认为本实验中可以用对照管调分光光度计的100%T 从而获知测定管的OD值，你的观点呢？为什麽？你认为本实验中设计的对照管与比色法测定物质含量实验中设计的空白管有何异同？
①不可以。
②如果用对照管调分光光度计的100%T，那么我们所绘制的标准曲线就会失去其效用，利用所测吸光度从曲线上所获取的麦芽糖含量反映的并不是实际所得麦芽糖的量，这其中减少了除去3,5-二硝基水杨酸外其他所加试剂对吸光度所造成的影响，会使得实验数据偏低，因此，不可用对照管代替空白管调分光光度计的100%T。
③空白管是指只加显色剂不加待测物的对照，而对照管则是除去进行反应所得产物外，其他条件的处理均要与测定管保持一致，目的是除去其他试剂对吸光度所造成的影响。
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