小小果99561791
范文一：荧光定量pcr计算公式 荧光定量PCR 计算
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1. “结果”中已经补充具体数据，谢谢编辑老师。
2. 30只日本大耳白兔，体重2.0,2.5 kg，编号后，采用查随机数字表，随机均分为NUTD组、实验对照组和空白对照组，谢谢编辑老师。
3. 图片已经更改为单独插入，谢谢编辑老师。
4. 表2中小数点已经统一，谢谢编辑老师。
5. 荧光定量PCR结果中USMCBKcaα mRNA(2.89?0.67)和BKcaβ mRNA(4.59?1.22)表达相对BC组mRNA(BKcaα:1.02?0.21;BKcaβ:1.03?0.28)分别上调2.89和4.59倍，是如何计算,
答:采用荧光定量PCR数据处理方法:2- CT法;即
?Ct(NUTD组),X基因 Mean Ct值-β-actin 基因 Mean Ct;
1
?Ct(实验对照组),X基因 Mean Ct值-β-actin 基因 Mean Ct;
?Ct(空白对照组),X基因 Mean Ct值-β-actin 基因 Mean Ct;
??Ct(NUTD组-空白对照组),?Ct(NUTD组)-?Ct(空白对照组);
??Ct(实验对照组-空白对照组),?Ct(实验对照组)-?Ct(空白对照组);
NUTD组mRNA相对于空白对照组mRNA的表达水平=2- CTNUTD-;谢谢编辑老师;
6. 2- CT对就是荧光定量PCR数据处理的结果值。
7. 原图4、5表达内容与表3是否重复,另，柱状图横、纵坐标比例不协调，如需保留，
应对横坐标进行调整，柱子过宽。
答:是不重复的，表3是荧光定量PCR测量mRNA的结果，而图4、5表达内容是western bolt测量的蛋白表达结果;横坐标柱子已经相应调整，见图，谢谢编辑老师; (组空白对照组)
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3
范文二：荧光定量pcr
一、 RNA 的提取 (详见 RNA 提取 及反转录 )
不同组织样本的 RNA 提取适用不同的提取方法, 因为 Real-Time PCR 对 RNA 样品 的质量要求较高, 所以, 正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法, 在实 验过程中要防止 RNA 的降解,保持 RNA 的完整性。
在 总 rna 的提取 过程中, 注意避免 mRNA 的断裂 ; 取 2ug 进行 RNA 的甲醛变性胶电 泳检测,如果存在 DNA 污染时,要用 DNase I进行消化 (因为在处理过程中 RNA 极易降解,建议体系中加入适量 RNA 酶抑制剂 ) 。
二、 DNase I 消化样品 rna 中的 DNA
用 DNA se I 消化 DNA
组份 加量
模板 (RNA) 10ug
RNase Inhibitor 4ul
DNase I buffer 10ul
DNase I 10ul
DEPC 处理 H2O 至 100ul
混匀,37℃ 90min
三、 RNA 琼脂糖凝胶电泳
1.1%的 琼脂糖凝胶 电泳凝胶的配制:
1) 称取琼脂糖 0.45g 放入三角瓶中,向其中加入 4.5ml 的 10×MOPS缓冲液和 39.5ml 的 DEPC 水,放微波炉里溶化。
2) 待冷却到 60摄氏度左右时, 加入 1ml 甲醛, 摇匀 (避免产生气泡 ) 。 倒入凝胶 板上凝固 30min 。
2. 取各个 RNA 样品 4μl,加入 6×RNA电泳上样缓冲液 2μl混匀,加入变性胶加 样孔中。
3.120V 电压下电泳 25min 。用凝胶紫外分析仪观察,照相保存。
4.RNA 电泳结果如下图所示。可见 28S 和 18S 两条明亮条带,无 DNA 条带污染。
四 .RNA 反转录为 cDNA
反转录程序 (以 MBI 的 M-MLV 为例 )
组份 加量 (20ul体系 ) 加量 (40ul体系 )
模板 (RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整 ) 3ug(根据条带的亮度适当调 整 )
引物 T18(50uM)(或其他引物 ) 2.0ul 4.0ul
DEPC 处理 H2O 至 12.5ul 至 25ul
混匀,70℃ 5min,立即冰浴
5*buffer 4.0ul 8.0ul
dNTP(10mM) 2.0ul 4.0ul
RNase Inhibitor 0.5ul 1.0ul
混匀,37℃ 5min
M-MLV 1.0ul 2.0ul
42℃ 60min ,70℃ 10min
反转录引物的选择与 Real-Time PCR引物设计的要求
1) 随机六聚体引物:
当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时,可采用 随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA 。用此种方法时,体系中所 有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板, PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的 特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源于 rRNA 。
2)Oligo(dT):
是一种仅对 mRNA 特异的方法。 因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3' 端 Poly(A+)尾, 此引物与其配对,仅 mRNA 可被转录。由于 Poly(A+)RNA只占总 RNA 的 1-4%,故 此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性方面 均要小。特别适合检测多个基因的表达,这样可以节约反转录的试剂, cDNA 可 以多次使用, 可用于检测稀有基因是否表达、 从极少量细胞中定量检测特定 mRNA 的表达水平。
3) 特异性引物:
最特异的反转录方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物,若 PCR 反应用二种特异性引物, 第一条链的合成可由与 mRNA3’端最靠近的配对引物起 始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA ,导致更为特异的 PCR 扩增。
做 Real Time PCR时,用于 SYBR Green I/Eva Green 法时的一对引物与一般 PCR 的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求:
① Tm=55-65℃
② GC=30-80%
③ PCR扩增产物长度:引物的产物大小不要太大,一般在 80-300bp 之间都可。 ④ 引物的退火温度要高,一般要在 60℃以上。
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。 而且引物设计时应该考虑到 引物要有不受基因组 DNA 污染影响的能力, 即引物应该跨外显子, 最好是引物能 跨外显子的接头区,这样可以更有效的不受基因组 DNA 污染的影响。
至于设计软件, PRIMER3, PRIMER5, PRIMER EXPRESS都应该可以的。做染料法 最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。 对于引物, 你要有从一大 堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备 ---寻找合适的引物非常不易。
五、 cDNA 与引物质量检测
取 0.2ml 薄壁 PCR 管,编号。向各管中加入含染料 2×PCR TaqMix10ul;加入正 反向引物各 0.5ul(引物浓度 10uM) ,向管中加入混合的 cDNA 各 1ul 。各管补加 水至 20ul 。
组份 加量
2×PCRTaqMix 10ul
10uMPrimer FW 0.5ul
10uMPrimer RV 0.5ul
Template DNA 1ul
ddH2O 混匀至 20ul
混匀,置于 TP600PCR 仪中。95℃ 5min;95℃15s,60℃35s ,40cycles;72℃ 5min;4℃ pause。
取扩增产物各 8μl , DL2000 分子量标准 5μl/泳道。 1%琼脂糖凝胶 120V 电压下 电泳 25min 。用凝胶紫外分析仪观察。
选择特异性好,扩增效率高的引物作为实时荧光使用引物。
六、利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况:
由于 RNA 纯化后得率不同、 RNA 反转录为 cDNA 的效率不同等客观因素,用于定 量分析的初始样品浓度不同, 因此, 在进行基因表达调控研究中都会用一些看家 基因来标准化,以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的看家基因有 beta-actin , GAPDH , 18SrRNA 等。因此,在做基因表达调控分析时至少要做两 个基因,目的基因和一个看家基因。
七、定量 PCR检测:
取 0.2ml 薄壁 PCR 管,分别编号。向各管中加入 2×qPCR TaqMix12.5ul, 10uM 各基因正反向引物混合物 0.5ul , 对应的 cDNA 各 1ul 。 一管中不加模板用作阴性 对照。各管补加水至 25ul 。
组份 加量
模板 (cDNA)/ddH2O 1.0ul
10uM 引物 F/R 0.5ul
2×qPCR Mix 12.5ul
ddH2O 11.0ul
混匀, 置于 SLAN 荧光定量 PCR 仪中。 95℃5min 预变性后, 95℃15s→65℃35s(荧 光检测 ) , 40cycles 。荧光定量 PCR 一般把退火和扩增设成一个温度,只在扩增 出现问题时才会考虑设梯度。
八、扩增曲线和溶解曲线
溶解曲线全部为单峰表明为特异性扩增。
一般而言, 荧光扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段, 荧光信号指数 扩增阶段和平台期,其形状是一条平滑的 S 型曲线。
如果在荧光背景信号阶段出现很多拐点, 可能的原因是体系未混匀或者存在固态 杂质 ;
如果向下探头后又很快抬头然后又向下探头, 可能原因是体系中模板量太高, 建 议模板稀释后再用。
如果引物二聚体存在则阴性对照会出现抬头现象, 这在 Real-Time PCR 中很难避 免 ;
若是阴性对照的溶解曲线出现和样品中同样的峰, 说明体系配置中存在污染, 则 实验结果不可用。
在溶解曲线中出现双峰有三种可能:
① 引物峰,引物峰通常是两峰中的前面一个,消除的办法是降低体系中的引物 量或重新设计引物 ;
② 在做基因表达差异时容易出现 DNA 被扩增峰 (只在引物跨内含子时存在 ) ,出 现原因是提取 RNA 时存在 DNA 污染,可以通过电泳验证,这时要重新消化 RNA 样品中的 DNA;
③ 扩增非特异,这时要重新摸扩增条件或重新设计并验证引物。
九、表达差异的计算方法
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数 ; 相对定量方法则是比较经过处理 的样品和未经处理的样品目标转录本或是目标转录本在不同时相的表达差异之 间的表达差异。
2-△△CT 方法是实时定量 PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。
在有些情况下, 并不需要对转录本进行绝对定量, 只需要给出相对基因表达差异 即可。 显然, 我们说 X 基因在经过某种处理后表达量增加 2.5倍比说该基因的表 达从 1000 拷贝 /细胞增加到 2500拷贝 /细胞更加直观。
2-△△CT 方法的推导 (详见实时定量 PCR 和 2-△△CT 法分析基因相对表达量 )
补充:在 DNase I 消化样品 RNA 中的 DNA 后,需要对样品重新进行氯仿抽提, 具体实验流程如下:
消化后总体积 10Oul ,体积太少,不利于抽提,我们往往补加 200ulDEPC 水。
1. 向离心管中加入等体积氯仿 (约 300ul) ,剧烈颠倒,充分混匀至中层出现白 色片状沉淀。4℃14000 rpm离心 8min ,取上清 (约 250ul) 。
2. 加入 1/10体积的 NaAC(3M)(约 25ul) 和预冷的等体积异丙醇 (约 280ul) , -20℃放置 20min 。
3. 4℃14000 rpm离心 15min ,去上清,注意不要触到沉淀。
4. 加入 1ml 的 75%乙醇,4℃14000rpm 离心 3min ,去上清。
5. 瞬时离心, 用 200ul(或 10ul) 的枪头小心吸去离心管底的残存液态 (勿吸到管 底的沉淀 ) 。
6. 把离心管放置于超净台晾至约 5-10 分钟 (勿完全干燥,否则很难溶 ) 。加入 30~50μl 的无 RNase 的水,静止 1min 后,振荡 30sec ,瞬时离心。
7. 将提取的 RNA 立即进行下游实验,或放 -20℃保存。
范文三：荧光定量pcr原理
中山大学
博士后研究工作报告糖原合成酶激酶－３Ｂ对恶性胶质瘤细胞分
化的影响及机制
Ｅｆｆｅｃｔａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｇｌｙｃｏｇｅｎｓｙｎｔｈａｓｅｋｉｎａｓｅ一３Ｂ（ＧＳＫ－３肛）ｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆ
ｍａｌｉｇｎａｎｔｇｌｉｏｍａｃｅｌｌｓ
英文缩略语
ＤＭＥＭ
ＦＢＳ
ＥＤＴＡ
ＭＴＴ
ＰＢＳ
ＤＴ，ｒ
ＳＤＳ
ＧＦＡＰ
ＲＮＡｉ
ｓｉＲＮＡ
ＧＳＫ一３Ｂ胛Ｙ删１㈣”㈣％㈣删—●肌Ｉ主要英文缩略词表英文全称中文全称Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ＳＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍＤＭＥＭ培养基佗ｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ胎牛血清ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄｄｉｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ乙二胺四乙酸３一（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙ１）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ四甲基偶氮唑蓝ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ磷酸缓冲液ｄｌ－ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ二硫苏糖醇ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ十二羟硫酸钠ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙａｃｉｄｐｒｏｔｅｉｎ胶质纤维酸性蛋白ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＲＮＡ干扰ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ小干扰ＲＮＡｓｙｎｔｈａｓｅｋｉｎａｓｅ－３ｐ糖原合成酶激酶－３Ｄｇｌｉａｌｇｌｙｃｏｇｅｎ
中文摘要
目的：研究糖原合成酶激酶一３Ｂ（ＧｌｙｃｏｇｅｎＳｙｎｔｈａｓｅＫｉｎａｓｅ，ＧＳＫ一３Ｂ）对恶性胶质瘤细胞分化的影响及其机制。
结果：Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示，ＧＳＫ－３Ｂ蛋白表达在对霍乱毒素诱导分化敏感的恶性胶质瘤Ｃ６、Ｕ－８７ＭＧ细胞株中显著高于对霍乱毒素诱导分化不敏感的Ｕ－２５１、Ｔ－９８Ｇ细胞株（尸５倍）。９
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２．干扰ＣＳＫ－３ｐ抑制恶性胶质瘤细胞分化
使用ｓｉＧＳＫ．３ｐ２号片段，可发现干扰效率达至ｔＪ９１．６％，且呈计量依赖性，可有效进行后继试验（图２Ａ、Ｂ）。图２Ｃ、Ｄ显示，成功转染ｓｉＧＳＫ一３Ｂ的Ｃ６细胞可成功阻断霍乱毒素引起的细胞形态改变和ＧＦＡＰ上调。提示干扰ＧＳＫ一３Ｄ可抑制恶性胶质瘤细胞分化。
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诱导分化治疗
胞分化是由幼稚细
程。近年来，肿瘤
种细胞分化紊乱，引起细胞分化抑制的特异性基因在一定条件下是可逆的【１１】。诱导分化治疗正是基于上述认识而产生，它可解除肿瘤细胞的发育缺陷，使其进一步分化并逆转其增殖、浸润、转移等恶性表型，使之最终成为正常或接近正常的细胞，从而成为控制肿瘤的一种新途径。
目前分化诱导剂诱导瘤细胞分化的确切作用机制尚未明确，目前认为可能与调节肿瘤细胞周期；调节信号传导通路；调控癌基因表达；细胞因子通路等因素有关。充分了解肿瘤分化过程以及这一过程的调控环节，将有助于恶性肿瘤的诱导分化研究。
我们研究发现，ＧＳＫ．３Ｄ水平与细胞可诱导分化能力密切相关，在霍乱毒素可诱导分化的恶性胶质瘤株ＧＳＫ．３ｐ高表达，而霍乱毒素不可诱导分化瘤株ＧＳＫ．３Ｄ表达水平低；且ＧＳＫ．３Ｂ活性在胶质瘤细胞分化过程中逐渐升高。强烈提示ＧＳＫ．３Ｂ在恶性胶质瘤细胞分化过程中的重要作用。ＧＳＫ．３ｐ干扰可抑制胶共聚焦实验进一步确认，在恶性胶质瘤细胞分化过程中伴随ＧＳＫ．３１］／ｅｙｃｌｉｎＤＩ蛋白核浆转位。因此，可以认为，ＧＳＫ．３１３可能是恶性胶质瘤诱导分化的标志性蛋白，在特异性细胞诱导分剂存在下，活化入核，与核内的ｃｙｃｌｉｎＤ１相互作用，
ＤＩ出核降解，从而控制恶性胶质瘤的分化。
ＣｙｃｌｉｎＤＩ苏氨酸残基２８６或２８８位磷酸化可促进其降解【１２，１３，１４１。ＧＳＫ．３Ｂ是目前唯一报道的在ｎ鹏．２８６位点磷酸化ｃｙｃｌｉｎＤ１的激酶【１５１。ＧＳＫ－－３Ｉ］去磷酸激
Ｄ１磷酸化【ｌ们。磷酸化的ｃｙｃｌｉｎＤＩ
从胞核转位至胞浆，经蛋白酶体泛素化作用发生水解。ＧＳＫ．３６最初认为是调节质瘤细胞分化，而ＧＳＫ一３Ｄ过表达可启动不可诱导分化的胶质瘤细胞分化。激光启动ｃｙｃｌｉｎ活后，从胞浆转位至胞核，使位于胞核的ｃｙｃｌｉｎ胰岛素反应组织中糖原合成的一个重要的丝氨酸／苏氨酸激酶，胰岛素通过ＰＫＢ／Ａｋｔ通路可使ＧＳＫ３失活从而促进糖原合成；其后的研究发现它参与肿瘤发生、细胞增生、分化及细胞周期调节等多种细胞活动【１他¨。这些功能大多源自其对众多参与这些过程的关键蛋白的磷酸化作用。我们的实验结果显示，霍乱毒素
物学、分子生物学等方法深入探讨ＧＳＫ一３Ｄ在恶性胶质瘤细胞分化过程中的关键性作用，阐明ＧＳＫ－３Ｂ调控恶性胶质瘤分化的信号通路及分子机制。有望为恶性胶质瘤的诱导分化研究提供高度原创的理论成果，并为临床恶性胶质瘤诱导分化治疗提供新的靶点和实验依据。
参考文献
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ＬｅｓｚｅｚｙｎｉｅｃｋａＭ，ＲｏｂｅｒｔｓＴ’ＤｅｎｔＰ＇ｅｔａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｔｈｅｒａｐｙｏｆｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒ：
ｓｃｉｅｎｃｅａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＰｈａｎｎａｅｏｌＴｈｅｒ，２００１，９０：１０５—１５６．
Ｌｉ《Ｙｉｎ形ＷａｎｇＸ，Ｚｈｕ彤ＨｕａｎｇｒＹａｎＧＣｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎｉｎｄｕｃｅｓｍａｌｉｇｎａｎｔ
ｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｖｉａｔｈｅＰＫＡ／ＣＲＥＢｐａｔｈｗａｙ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．
Ｓ，ＨａｌｌＡ．Ｃｄｅ４２ｒｅｇｕｌａｔｅｓＧＳＫ一３ｂｅｔａａｎｄａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ
ｃｏｌｉｔｏｃｏｎｔｒｏｌｃｅｌｌｐｏｌａｒｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ．２００３；４２１（６９２４）：７５３—７５６．２１ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌｐａｔｔｅｒｎｓ６：２９２４．２９３０．２．Ｂａｏｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ４４４（７３．Ｃｕｒｒａｎｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｔｒｉａｌｓ．Ｊ４ｂａｓｉｃ５ｇｌｉｏｍａ２００７；１０４（３３）：１３４３８－１３４４３６．Ｅｔｉｅｎｎｅ－Ｍａｎｎｅｖｉｌｌｅｐｏｌｙｐｏｓｉｓ
７．Ｈｉｎｏｉ，Ｔ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｋｉｓｈｉｄａ，Ｍ．，Ｔａｋａｄａ，Ｓ．，Ｋｉｓｈｉｄａ，Ｓ．，Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ａ．Ｃｏｍｐｌｅｘｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓｐｏｌｙｐｏｓｉｓｅｏｌｉｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔａｎｄａｘｉｎｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓｇｌｙｃｏｇｅｎｓｙｎｔｈａｓｅｋｉｎａｓｅ－３ｂｅｔａ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎａｎｄｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｅｓｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２０００，２７５，３４３９９—３４４０６．
８．ＲａｓｋＫ，ＮｉｌｓｓｏｎＡ，ＢｒａｎｎｓｔｒｏｍＭ，ｅｔａ１．Ｗｒｉｔｓｉｇｎａｌｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｉｎｏｖａｒｉａｎｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｕｍｏｕｒｓ：ｉｎｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎａｎｄＧＳＫ３ｂｅｔａ．ＢｒＪＣａｎｃｅｒ．２００３；８９：１２９８－１３０４．
９．Ｏｕｇｏｌｋｏｖ，Ａ．Ｖ，Ｂｏｎｅ，Ｎ．Ｄ．，Ｆｅｍａｎｄｅｚ－Ｚａｐｉｃｏ，Ｍ．Ｅ．，Ｋａｙ，Ｎ．Ｅ．，Ｂｉｌｌａｄｅａｕ，Ｄ．Ｄ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｇｌｙｃｏｇｅｎｓｙｎｔｈａｓｅｋｉｎａｓｅ一３ａｃｔｉｖｉｔｙｌｅａｄｓｔｏｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓａｎｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｃｈｒｏｎｉｃｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａＢｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．２００７，１１０，７３５－７４２．
１０．Ｏｕｇｏｌｋｏｖ，Ａ．Ｖ，Ｆｅｍａｎｄｅｚ?Ｚａｐｉｅｏ，Ｍ．Ｅ．，Ｓａｖｏｙ，Ｄ．Ｎ．，Ｕｒｒｕｔｉａ，Ｒ．Ａ．，Ｂｉｌｌａｄｅａｕ，Ｄ．Ｄ．Ｇｌｙｃｏｇｅｎｓｙｎｔｈａｓｅｋｉｎａｓｅ－３１３ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓｉｎｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ－ＫＢ－ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌｉｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００５，６５，２０７６—２０８１．
１１．ＢｅｅｒｅＨＭ，ＨｉｃｋｍａｎＪＡ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：ａｓｕｉｔａｂｌｅｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｃａｎｃｅｒｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ７．ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓ，１９９３，８（４）：２９９—３２２
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２０．ＯｒｍｅＭＨ，ＧｉａｎｎｉｎｉＡＬ，ＶｉｖａｎｃｏＭＤ，ｅｔａ１．Ｇｌｙｃｏｇｅｎｓｙｎｔｈａｓｅｋｉｎａｓｅ一３ａｎｄＡｘｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎａｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ—ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐａｔｈｗａｙｔｈａｔｒｅｇｕｌａｔｅｓｎｅｕｒｉｔｅｏｕｔｇｒｏｗｔｈｉｎｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａｃｅｌｌｓ．ＭｏｌＣｅｌｌＮｅｕｒｏｓｃｉ，２００３，２４：６７３—６８６．
２１．ＭａｎｏｕｋｉａｎＡＳ，ＷｏｏｄｇｅａＪＲ．Ｒｏｌｅｏｆｇｌｙｃｏｇｅｎｓｙｎｔｈａｓｅｋｉｎａｓｅ一３ｉｎｃａｎｃｅｒ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｂｙＷｎｔｓａｎｄｏｔｈｅｒｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ．ＡｄｖＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２００２，８４：２０３—２２９．
附件
１）个人简历
１９７８年８月出生，主要从事神经药理学与肿瘤药理学研究。
２００７年１０月～今，中山大学附属第三医院，博士后
２００４年７月＂一２００７年９月中山大学，药理学专业，获医学博士学位２００１年７月＂－－２００４年９月武汉大学，药理学专业，获医学硕士学位１９９６年７月＂－＇－＇２００１年９月武汉大学，临床医学，获医学学士学位２）在站期间发表的论文和论著
１．曼皑，ＬｕＨ，“ＧＹａｎＧＧｌｙｃｏｇｅｎｓｙｎｔｈａｓｅｋｉｎａｓｅ一３ｐｒｅｇｕｌａｔｅｓａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ
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２．ＬｕＨ，地奉（ｃｏ－ｆｉｒｓｔａｕｔｈｏｒ），ＳｈｕＭ，ＴａｎｇＪ，ＨｕａｎｇＹＺｈｏｕＹＬｉａｎｇＹＹａｎＧ
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３）在站期间获得的科研基金及承担的其它课题
ｌ国家自然科学基金青年项目（编号：３０８０１４０８）：缺氧诱导因子ＨＩＦ．１ａ在
恶性胶质瘤分化中的作用及分子机制。项目负责人。
２第四十三批中国博士后科学基金面上资助项目（编号：２００８０４３０８０５）：缺
氧对恶性胶质瘤分化的作用及机制研究。项目负责人。
３第一批中国博士后科学基金特别资助项目（编号：２００８０１２６６）：缺氧对恶
性胶质瘤分化的作用及机制研究。项目负责人。
４）在站期间参加国内外学术会议情况
２００９年４月１８～２１日参加在河南省郑州市召开的十一届全国生化与分子药理学学术会议，发表论文摘要“糖原合成酶激酶．３１３对恶性胶质瘤细胞分化的影响及机制＂。
４）在站期间承担教学和／或工作情况在站期间参与承担研究生实验及论文写作指导工作。
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２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ．ＴｈｉｒｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｕｎＹａｔ－ＳｅｎＵｎｉｖｅｒｓ．吖．Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ．Ｃｈｉｎａ
３ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ．ＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｕｎＹａｔ－ＳｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ．Ｃｈｉｎａ
ＫｅｙｗｏｒｄｓＡｂｅｒｒａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｓａｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｆｅａｔｕｒｅｏｆｎｅｏｐｌａｓｔｉｃｔｍｎｓｆｏｒｍａ－ＣＲＥＢ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｌＣＢＰ）／’ｐ３００；ｃｏｂａｌｔｄｏｎ，ｗｈｉｌｅｈｙｐｏｘｉａｉｎｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒｓｉｓｂｅｌｉｅｖｅｄｔｏｂｅｌｉｎｋｅｄｔｏａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｃｈｌｏｒｉｄｅ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ＨＩＦ－１《ｍａｌｉｇｎａｎｔｂｅｈａｖｉｏｒａｎｄｐｏｏｒｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｇｌｉｏｍａｓｈｙｐｏｘｉａａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓｒｅｍａｉｎｓｐｏｏｒｌｙｄｅｆｉｎｅｄ．ＨｅｒｅＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅｗｅｓｈｏｗｔｈａｔｒａｔＣ６ａｎｄｐｒｉｍａｒｙｈｕｍａｎｍａｌｉｇｎａｎｔｍｉｏｍａｃｅｌｌｓｃａｎｂｅＧ．Ｙａｎ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．ｉｎｄｕｃｅｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏａｓｔｒｏｃｙｔｅｓｂｙｔｈｅｗｅｌｌ．ｋｎｏｗｎａｄｅｎｙｌａｔｅｃｙｃｌａｓｅＺｈｏｎｇｓｈａｎＳｃｈｏｏＩｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ．ＳｕｎＹａｔ－Ｓｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒｆｏｒｓｋｏｌｉｎ．Ｈｏｗｅｖｅｒ．ｈｙｐｏｘｉａ．ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ—ｌ伍ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｔｉｍｕ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．７４ＺｈｏｎｇｓｈａｎＲｏａｄｍＩａｔｅｄｂｙｔｈｅｈｙｐｏｘｉａｍｉｍｅｔｉｃｓｃｏｂａｌｔｃｈｌｏｒｉｄｅｏｒｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅｂｌｏｃｋｓｔｈｉｓＧｕａｎｇｚｈｏｕ．５１００８０．ＣｈｉｎａｄｉｆｆｅｒｅｎｄａｆｉｏｎａｎｄｔｈｉｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓｉｓｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅｕｐｏｎｗｉｔｈｄｒａｗａｌｏｆｔｈｅＦａｘ：１８６）２０名７３３０５７８
Ｔｅｌ：ＩＢ６）２０．８７３３３２５８ｈｙｐｏｘｉａｍｉｍｅｕｃｓ．Ｉｍｐｏｒｔａｎｔｌｙ．ｋｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ．１疆
ｂｙＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅＦｅｎｃｅｒｅｓｔｏｒｅｓｔｈｅｄｉｆｉｒｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆｔｈｅｃｅｌｌｓ。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｇｍ＠ｍａｉｌ．ＳｙＳＵ．ｅｄｕ．ｃｒｌ
ｅｖｅｎｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｃｏｂａｌｔｃｈｌｏｒｉｄｅ．ｗｈｅｒｅａｓｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｙｐｏｘｉａ．
。Ｔｈｅｓｅａｕｔｈｏｒｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄｅｑｕｅｌｆｙｔｏｔｈｉｓｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ—Ｉ俚ｔｈｒｏｕｇｈｒｅｔａｒｄｅｄｕｂｊｑｕｉｔｊｎａｔｉｏｎｂｙｖｏｎＨｉｐｐｅｌ—Ｌｉｎｄａｕｗｏｒｋｔ１１ｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｅａｂｒｏｇａｔｅｓｔｈｅｉｎｄｕｃｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｍｏｒｅ?
ｏｖｅｒ。ｔａｒｇｅｔｉｎｇｏｆＨＩＦ．１ｕｓｉｎｇｃｈｅｔｏｍｉｎ，ａｄｉｓｒｕｐｔｅｒｏｆＨＩＦ．１ｂｉｎｄｉｎｇｔｏ
ＩＲｅｃｅｉｖｅｄ２６Ａｕｇｕｓｔ２００９．ｒｅｖｉｓｅｄｉｔｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｃｏ．ａｃｔｉｖａｔｏｒＣＲＥＢ．ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＢＰ）／ｐ３００．ａｂ０１．２Ｏｃｔｏｂｅｒ２００９，ａｃｃｅｐｔｅｄ１４Ｏｃｔｏｂｅｒｉｓｈｅｓｔｈｅ
２００９Ｊｄｉｆｆｅｒｅｎｄａｔｉｏｎ．ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｆｈｙｐｏｘｉａ．ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ－ｌ覆．Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｃｈｅｔｏｍｉｎｉｎｂｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈｆｏｒｓｋｏｌｉｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｏｉ：１０．１１１１／ｉ．１７４２－４６５８．２００９．０２４４１．ｘｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｍａｌｉｇｎａｎｔｇｌｉｏｍａｇｒｏｗｔｈｉｎａｎｉｎｖｉｖｏｘｅｎｏｇｒａｆｔｍｏｄｅｌ．Ａｎａｌｙ－
ｓｉｓｏｆ９５ｈｕｍａｎｇｌｉｏｍａｔｉｓｓｕｅｓｒｅｖｅａｌｅｄａｎｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｈｙｐｏｘｉａ—ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ
ｆａｃｔｏｒ－Ｉａｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｉｔｈｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇｔｕｍｏｒｇｒａｄｅ．Ｔａｋｅｎｔｏｇｅｔｈｅｒ，
ｔｈｅｓｅｆｉｎｄｉｎｇｓｓｕｇｇｅｓｔａｋｅｙｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｐａｔｈｗａｙｉｎｖｏｌｖｉｎｇ
ｈｙｐｏｘｉａ．ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ－ｌｄｔｈａｔｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓｔｏａｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｄｅｆｅｃｔｉｎ
ｍａｌｉｇｎａｎｔｇｌｉｏｍａｓａｎｄｓｈｅｄｓｎｅｗｌｉｇｈｔｏｎｔｈｅｄｉｔｉｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｔｈｅｒａｐｙｏｆ
ｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒｓｂｙｔａｒｇｅｔｉｎｇｈｙｐｏ】【ｉａ—ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ－ｌａ．
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Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
Ｄｅｖｉａｔｉｏｎｆｒｏｍｔｈｅｔｉｓｓｕｅ／ｌｉｎｅａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ－ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ【ｌ】．ＴｈｅａｂｅｒｒａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｃｅｌｌｓｔｉｏｎｐｒｏｇｒａｍｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌａｓｐｅｃｔｓｏｆｓｈｏｗａｂｎｏｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｄｉｓｔｉｎｃｔＡｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓ
ＣＢＰ．ＣＲＥＢ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ：ＣＲＥＢ．ｃＡＭＰ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ；ＤＦＯ，ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ；ＦＢＳ．ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ；ＧＦＡＰ．ｇｌｉａｌｆｉｂｒＪｌｌａｗａｃｉｄｐｒｏｔｅｉｎ：Ｇｌｕｔ?１．ｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ－１；ＨＩＦ?１．ｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ一１：ＭＴＴ．３－ｔ４．５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ一２－ｙ１）?２，５－ｃｌｉｐｈｅｎｙｌ‘ｌｅｔｒａｚｏｌＪｕｍｂｒｏｍｉｄｅ；ＰＣＮＡ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ；ｐＶＨＬ．ｖｏｎＨｉｐｐｏＩ－Ｌｉｎｄａｕｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｐｒｏｔｅｉｎ；ｓｉＲＮＡ．ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ；ＶＨＬ．ｙｏｎＨｉｐｐｅＩ－Ｌｉｎｄａｕ；ＶＥＧＦ．ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ．
ＦＥＢＳＪｏｕｒｎａｌ２７８（２００９）７勰１－７３Ｄ４ｏ２００９ＴｈｅＡｕｌｈｏｒｓＪｏｕｒｎａｌｅｏｍｐ始Ｕｏｎｏ２００９ＦＥＢＳ７２９１
致谢
感谢我的导师李刚教授以及博士导师颜光美教授。从课题的选题、开展，到实际问题的讨论、解决，均得到了导师细致而关键的指导和帮助，使本文的工作得以顺利完成。两年年来导师严谨的科学态度，锲而不舍的钻研精神和远见卓识的创新精神，是我学到的最宝贵的精神财富，将使我受益终生。
衷心感谢科研科张勇科长，韩莉老师与祖晨曦老师，为本研究的顺利进行提供了各种帮助与支持。最后感谢我的先生、父母与妹妹多年来给予的关心与支持。
范文四：财务定量指标计算公式
附件1：
企业财务绩效定量评价指标计算公式
一、盈利能力状况
（一）基本指标
1．净资产收益率=净利润/平均净资产×100%
平均净资产＝（年初所有者权益＋年末所有者权益）/2
2．总资产报酬率=（利润总额+利息支出）/平均资产总额×100% 平均资产总额＝（年初资产总额＋年末资产总额）/2
（二）修正指标
1．主营业务利润率=主营业务利润/主营业务收入净额×100%
2．盈余现金保障倍数＝经营现金净流量/（净利润＋少数股东损益）
3．成本费用利润率=利润总额/成本费用总额×100%
成本费用总额=主营业务成本+主营业务税金及附加+经营费用（营业费用）+管理费用+财务费用
4．资本收益率＝净利润/平均资本×100%
平均资本＝[（年初实收资本＋年初资本公积）＋（年末实收资本＋年末资本公积）]/2
二、资产质量状况
（一）基本指标
1．总资产周转率（次）=主营业务收入净额/平均资产总额
2．应收账款周转率（次）=主营业务收入净额/应收账款平均余额
应收账款平均余额=（年初应收账款余额＋年末应收账款余额）/2
应收账款余额=应收账款净额＋应收账款坏账准备
（二）修正指标
1．不良资产比率=（资产减值准备余额＋应提未提和应摊未摊的潜亏挂账＋未处理资产损失）/（资产总额＋资产减值准备余额）×100%
2．资产现金回收率＝经营现金净流量/平均资产总额×100％
3．流动资产周转率（次）＝主营业务收入净额/平均流动资产总额
平均流动资产总额＝（年初流动资产总额＋年末流动资产总额）/2
三、债务风险状况
（一）基本指标
1．资产负债率=负债总额/资产总额×100%
2．已获利息倍数=（利润总额＋利息支出）/利息支出
（二）修正指标
1．速动比率=速动资产/流动负债×100%
速动资产=流动资产-存货
2．现金流动负债比率=经营现金净流量/流动负债×100%
3．带息负债比率＝（短期借款+一年内到期的长期负债+长期借款+应付债券+应付利息）/负债总额×100%
4．或有负债比率=或有负债余额/（所有者权益+少数股东权益）×100%
或有负债余额=已贴现承兑汇票+担保余额+贴现与担保外的被诉事项金额+其他或有负债
四、经营增长状况
（一）基本指标
1．销售（营业）增长率＝(本年主营业务收入总额－上年主营业务收入总额)/上年主营业务收入总额×100%
2．资本保值增值率=扣除客观增减因素的年末国有资本及权益/年初国有资本及权益×100%
（二）修正指标
1．销售（营业）利润增长率＝（本年主营业务利润总额－上年主营业务利润总额）/上年主营业务利润总额×100%
2．总资产增长率＝（年末资产总额－年初资产总额）/年初资产总额×100%
3．技术投入比率=本年科技支出合计/主营业务收入净额×100%
范文五：荧光定量pcr两步法rt-pcr试剂盒
荧光定量 PCR 两步法 RT-PCR 试剂盒
一、试剂盒组成:
Material Provided ZK00302 (50次 )
2X First-Strand Buffer RT-mix
Random primer (0.1μg/μl) Oligo(dT)18 primer (0.1μg/μl) DEPC-treated Water
hotstart fluo-PCR mix (2X) Protocol 500 μl 50 μl 50 μl 50 μl 1ml 1250ul
1份
注意:所有试剂必须在 -20℃保存。 有效期 6个月
二、简介:
本试剂盒提供的试剂能从微量的 mRNA 或总 RNA 中高效率的合成出 cDNA 第一链。 采用的是高效 Reverse Transcriptase,它能非常有效地以 RNA 为模板,在 Oligo(dT) primer, Random Primers或其它特定的引物与 RNA 退火后,从引物的 3’-末端合成与 RNA 互补的 DNA (cDNA 第一链) 。
本试剂盒中荧光定量 PCR 核心 mix ,对体系进行了优化,增加了扩增效率,同时使用 更简单,提高工作效率。
三、准备工作:
1)用 0.1%DEPC水过夜室温或 37C 处理 1.5 ml Eppendorf 管和取液用 10μl, 200μl 和 1 ml Tip, 高温蒸气灭菌, 80℃烘干备用。
2)制备 RNA 模板。总 RNA 和 mRNA 均可以作为 First-Strand cDNA合成的模板材料。本 试剂盒每次反应需要 500ng-2μg 左右 总 RNA 或者 25-50ng 左右的 mRNA 。 RNA 溶于 DEPC -H 2O ,体积不大于 8μl 。
四、 First-Strand cDNA合成:
注意:戴手套进行以下操作,严防 RNase 污染。
1.在 1.5ml Eppendorf管中加入 500ng-2μg 总 RNA, 或 25-50ng poly(A)+ mRNA。 加入 DEPC -H 2O 使总体积为 8μl 。
2.加入 1μl Random primers,或 1μl Oligo(dT)18 primer,或者 1ul 的特异性下游引物 (25pmol/ul)。小心混匀。
3. 65℃保温5分钟。
4.室温放置 10分钟。室温高速离心 5秒钟,将所有溶液收集到管底。
5.按次序分别加入下列试剂:
2X First-Strand Buffer 10ul
RT-mix 1ul
Total: 20ul
6.小心混匀,如果是用 Random primers ,建议 25℃ 10分钟, 40℃ 50分钟;如果是用 Oligo(dT)18 primer,建议 42℃ 50分钟;如果是用特异性的下游引物,建议 48℃ 50分钟。
7.然后 90℃处理5分钟。冰上冷却,室温高速离心 5秒钟,将所有溶液收集到管底。
8.反转录好的 cDNA 可以用于 PCR 扩增、荧光定量 PCR 检测或 cDNA 的 2nd 链的合成。 五、荧光 PCR 反应
反应液配制
反应液组份 加量 (μl)终浓度 备注
Hotstart Fluo-PCR mix 25 1×
上游引物 用户提供
下游引物 用户提供
探针 用户提供
用户提供
无菌去离子水 用户提供
总体积
六、扩增条件
使用 taqman 探针,用 0.2ml 薄壁管做反应的仪器建议使用如下程序:
94℃ 4分钟→ 94℃ 30秒→ 60℃ 1分钟
40个循环
使用 taqman 探针,用毛细管做反应的仪器建议使用如下程序:
93℃ 2分钟→ ℃ 15秒→ ℃ 30秒
40个循环
七、注意事项:
引物如何选用取决 RNA 模板的类型。 Oligo(dT)18引物用于 RNA 3’-末端有 poly(A)+结 构的 cDNA 合成,合成效率高,特异性好。 Random primer则适用各种 RNA, 合成效 率高,通用性好,但特异性较差,对 RNA 模板的质量要求较高,通常要求 RNA 模 板无 DNA 污染。如果合成的 cDNA 仅仅用于扩增特定的基因,合成 cDNA 第一链的
引物也可以是用户特定的引物,序列与 RNA 互补。
制备的 cDNA 可以不纯化直接用作 PCR 模板,用量为 1-5μl 。如使用过量, 1st strand cDNA 合成反应体系中的盐和 Random primers将会抑制 Taq DNA聚合酶的活性。 如果有必要 cDNA 1st strand纯化,可按下列方式纯化:cDNA 合成反应结束后(步 骤6) ,在反应体系中加入 RNase A, 37℃保温 10分钟,用柱子回收 cDNA 。 如果后续操作对 cDNA 的用量不是很多,可以相应减少用,整个体系可以缩小到 10ul ,各试剂的用量相应减半;荧光定量 PCR 反应体系也可以减半使用。
如果是用 beacon 等其它杂交探针,建议扩增程序用三步法。
本试剂盒不建议用 sybr green I染料法检测。
Only for Research!
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