范文一：08 微生物的氨氧化作用机理研究进展

微生物的氨氧化作用机理研究进展

唐咸来

(广西壮族自治区科学技术厅 , 广西 南宁 530012)

摘 要 :对氨氧化微生物的生化作用机理 , 以及相关的氨单加氧酶 (AM O ) 和羟胺氧 化还原酶 (HA O) 及其基 因 表达的分子生物学研究进展进行了概述 , 提出了 氨氧化生物脱氮的主要发展方向。

关键词 :氨氧化 ; 氨单加氧酶 ; 羟胺氧化还原酶

中图分类号 :Q 936 文献标识码 :A 文章编号 :1671 9905(2008) 11 0036 04

目前 , 含氮化合物引起的水体污染和富营养化 日益加剧 , 已经造成了生态破坏、 资源匮乏、 水环境 污染等严重后果。

生物脱氮技术能够有效地去除污染水体和富营 养化水体及底泥环境中的氮素 , 具有十分重要的意 义和极大的实用价值。生物脱氮的理论基础是微生 物作用下的硝化作用和反硝化作用。硝化作用 (ni trification) 作为自然界氮循环的重要环节之一 , 是指 NH 4+或 NH 3被氧化为 NO 2-至 NO 3-的一系列生 化反应。亚硝化作用则是硝化作用从 NH 4+或 NH 3到 NO 2-的反应过程 , 是氮素循环的重要环节 , 由氨 氧化细菌 (NH 3 oxidizers, 又 被称为 初级 硝化细 菌 prim ary nitrifiers) 、 亚 硝化 细菌 (ammonia oxidizing bacteria) 来完成。从氮转化的角度来 看 , 亚硝 化细 菌在生态圈中居于重要地位 [1~2], 它们转化无机氨 态氮为亚硝酸盐氮 , 与氨化细菌、 硝化细菌等其它微 生物共同作用 , 推动氮素循环的不断进行。

作为生物脱氮硝化阶段的重要限速步骤 , 亚硝 化的作用机理和基于亚硝化作用的生物脱氮技术的 深入系统研究、 开发 , 能为高效节能的氨氮废水生物 处理工艺提供新的理论和思路。

1 氨氧化微生物

参与亚硝化作用的微生物主要是亚硝酸细菌 , 或称氨氧化细菌 , 有自养型和异养型之分。

1 1 自养氨氧化细菌

一般将氨氧化细菌归为硝化杆菌科。近年在硝 化细菌系统发育研究中 , 基于 16SrRNA 寡聚核苷酸 的序列比较分析最先为硝化细菌的系统发育多样性 提供了框架 [3]。自养亚 硝化细菌为硝 化杆菌科的 两个生理亚群之一 , 在自然界氮循环链中起重要作 用 , 能将氨态氮转化为亚硝酸盐氮 , 并从该氧化过程 中获得能量 , 同化无机 碳化合物如 CO 32-、 HCO 3-和 CO 2, 合成细胞物质。在细菌系统发育图谱中根 据 16SrRNA 序列同源性分析 , 把亚硝化细菌生理亚 群中的亚硝化单胞菌属归为紫色细菌群 (Proteobac teria) 的 亚群。其它基于 16S rRNA 序列同源性分 析或氨单加氧酶 (Ammonia monooxygenase, AM O) 序列分析进行系统发育关系的研究表明 , 除海洋亚 硝化球菌 (N itrosococcus oceanus ) [4]和 嗜盐亚硝化 球菌 (Nitrosococcus halop hilus ) [5]为紫色细菌群的 亚群 (Gamm a subdiv ision or gamma subclass) 外 , 亚 硝化细菌各属构成紫色细菌群 亚群 [2]。一般亚硝 化细菌的最适酸碱度是从中性趋于弱碱性的区段。 亚硝化细菌的培养温度因菌源而异 , 范围较宽。从 中温环 境 下 分离 的 菌 株 , 最 适 生 长温 度 为 26~ 28 , 从高温环 境下分离 的菌株 , 40 下生 长良 好 [6]。一般亚硝化细菌最佳 生长温度为 35 [7], 亚硝化单胞菌在 30~36 生长最好。欧洲亚硝化 单胞菌 (Nitrosomonas eur op aea ) 是研究得 最详细 的典型自养型氨氧化细菌 [8]。

除了亚硝化单胞菌属 (N itr osomonas ) 外 , 其它 能把氨氧化成 亚硝酸的细菌属包括亚 硝化螺菌属 (N itrososp ir a ) 、 亚硝化球菌属 (Nitr osococcus ) 、 亚 硝 化 弧 菌 属 (N itr osovibr io ) 、 亚 硝 化 叶 菌 属 (N itrosolobus ) 、 亚硝 化胶团菌 属 (N itr osogloea ) 、 亚硝化囊菌属 (N itrosocy stis ) 。土壤生境中常见的 是亚硝化单胞菌属、 亚硝化球菌属、 亚硝化叶菌属、 亚硝化螺菌属 [9]。海洋 生境中常见的 是亚硝化单

第 37卷 第 11期 2008年 11月 化 工 技 术 与 开 发

Technology &Development of Chemical Industry

Vol 37 No 11 Nov 2008

收稿日期 :2008 06 27

胞菌属、 亚硝化球菌属、 亚硝化螺菌属 [10]。盐湖生 境中则有亚硝化单胞菌属 [11]。

1 2 异养硝化微生物

自养硝化作用在自然界生物硝化过程中占主导 地位 , 但在某些环境中 , 真菌、 放线菌、 异养细菌等异 养硝 化微 生物 进行 化能 有机 营养 , 能 将氨 [12]、 羟 胺 [13]或有机氮化合物如肟等 [14}氧化成亚硝酸和硝 酸。

实际上 , 一个世纪以前就有关于异养硝化微生 物及其异养硝化作用的报道 , 近几十年研究者相继 从不同类型生境发现和分离了多种具有硝化活性的 异 养 微生物 (包 括细菌、 放 线菌、 真 菌 ) [15~27]。其 中 , 异养硝化细菌有反 硝化假单胞菌、 铜绿假 单胞 菌、 荧光假 单胞菌 [28]、 产 碱杆菌 [29]、 节杆 菌 [30]、 粪 产碱菌 [31~33]、 PB16假单胞菌 [34]以及一些新发现的 菌种 (或属 ) 。

2 氨氧化作用的生化机理

氨氧化细菌是一类化能自养型细菌 , 氨是其进 行自养生长的唯一能源。从热力学观点来看 , 亚硝 化细菌利用的基质为低级能源 [35~36]。相对于呼吸 链上的 电子载 体而言 , 氨 氧化 的氧化 还原 电位 值 E 0 (NO 2-/NH 4+) =340mV, 氧化磷酸化效 率很 低 , 所能产生的 ATP 非常有限。

亚硝化细菌中不存在基质水平磷酸化 , 它们依 靠氧化磷酸化来贮存能量。在 25 , pH 7的条件 下 , NH 3氧化 为 NO 2-的 吉布斯 自由 能为 -274 7 kJ (mol N) -1, 即使全部转化为 ATP, 最多 仅产生 8 4mol ATP (mol NH 4+) -1。 NH 3氧化所释放的 电子只能传递给呼吸链上较低端的物质 , 因此 NH 3的氧化反应不可能直接耦联到呼吸链上第一个成分 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (nicotine amide dinucleotide, NAD) 的还原反应 , 能量不得不用于使电子跃迁到 这一较高能级 , 即用于所谓的逆电子流过程中。这 些因素使得亚硝化细菌生长很缓慢 , 世代期为 8~ 36h [37], 经过 7~10d 的培养菌落很微小 , 大多直径 在 100 m 左 右。利用相同数量的 能量 , 亚硝 化单 胞菌所产生的细胞物质仅为异养菌的 1%~4%, 这 是因为需要消耗 ATP 和还原力来还原 CO 2。 异养微生物可以利用很多基质 , 包括无机 N 和 有机 N, 如铵、 胺、 酰胺、 N-烷基羟胺、 肟、 氧肟酸及 芳香硝基化合物等生成 NO 2-, 这也是异养 硝化作 此 , 异养硝化作用的底物及其代谢途径至今仍不甚 清楚 [38~40]。

异养硝化微生物的硝化速率较低 [41]。因此 , 只 有环境条件不利于自养硝化时 (如酸性环境 ) 才发生 异养硝化作用 [42]。尽管单位生物量的异养菌氧化 NH 3的速率较自养菌要慢 2~3个数量级 , 但异养菌 的生长速率快 , 对环境的适应性也强 , 因此其总体的 氧化 NH 3的速率并不比自养菌慢 [43]。 Robertson [44]等认为微生物并 没有从氧化 NH 3为 NO 2-的反应 中获取能量 , 只是它的氧化产物 NO 2-可作为反硝 化反应的电子受体 , 可能解除了反应过程中氧传递 对反应的限制。 A. B. Gupta [45]认为 Thiosp haer a p antotrop ha 是一种能氧化还原硫化合物的细菌 , 具 有同时异养硝化和好氧反硝化的能力。

3 氨氧化作用的关键酶及其分子生物 学研究

亚 硝 化 主 要 包 括 由 氨 单 加 氧 酶 (ammonia monooxyg enase, AMO) 催化的氨氧化成羟胺以及由 羟胺 氧 化 还 原 酶 (hydroxylam ine ox idoreductase, HAO) 催化的羟胺氧化为亚硝 酸的系列生化反应。 目前已经在 AM O 、 HAO 的分离纯化以及相关基因 序列分析与外源表达方面进行了比较深入的探讨。 3 1 氨单加氧酶及其基因表达

3 1 1 自养亚硝化细菌的 AM O 及其基因表达 迄今为止 , 尚未获得活性形式的自养硝化细菌 氨单加氧酶 , 它的亚基组成和三级结构也还没有完 全清楚。目前已分离到的认为可能是 AMO 亚基的 有 :AmoA, 膜 结 合 , 含有 活 性 位 点 , 27~30kDa; AmoB, 铜 -铁蛋白 , 38~43kDa; AmoC, 膜结合的多 肽 , 36kDa [46]。经 鉴定 , AMO 的 正常底 物是 NH 3而不是 NH 4+。同时已有 40多种化合物 (包括

37

第 11期 唐咸来 :微生物的氨氧化作用机理研究进展

的从头合成 [50]。

编码 自 养 硝 化 细 菌 AMO 的 基 因 有 3个 :amoA 、 amoB 、 amoC 。在欧洲亚硝化单胞菌及亚硝化 单胞菌 ENI-11(N itr osomonas sp . EN I-11) 中各 有 2个拷贝 , 其中 amoA 基 因含有 AMO 的活 性位

点 [51~52]

, amoA 和 amoB 位于同一操纵子 , amoB 在 amoA 的下游 , amoC 则位于 amoA 的上游。从在 E. coli 中进行 的克隆表 达实验 来看 , amo 基因 对 E. coli 有很大的毒害性 , 不能得到相应基因片段的克 隆或外源表达 [53]

。

图 1 N. europaea amo 基因位点图谱 [54]

3 1 2 异养硝化细菌的 AM O 及其基因表达 M oir 等从脱 N 副球菌 Pd1222中获得了部分纯 化的氨单加氧酶 [55]。 与欧洲亚硝化单胞菌的 AM O 相似 , 脱 N 副球菌的 AMO 也是一个膜结合蛋白 , 含 两个亚基 , 分别为 38kDa 和 46kDa 。纯化的酶是一 个醌醇氧化酶。从无细胞提取物来看 , 它比欧洲亚 硝化单胞菌的 AM O 更为稳定。后者经提取后易丧 失活 性 , 除 非 加入 一 些 稳 定 剂 如 牛 血 清 清 蛋 白 (BSA) 、 精胺或 Mg 、 Cu 离子等。 其次 , 也可 能含有 一个易变的 Cu 中心。 Cu 离子的加入可以明显刺激 酶活。同样 , 它也是一个对光敏感的酶 , 紫外线照射 同 样可以 抑制它 的酶活。不同 的是 , 1mmol L -1

(相当于 2 5%) 的乙炔并不能抑制它的酶活 , 推测 可能是乙炔不能进入它的活性中心。而欧洲亚硝化 单胞菌 AMO 则对乙炔非常敏感 [56]

。

目前 , 编码异养硝化细菌 AM O 的基因 研究还 不是很多。从已有的结果来看 , 因菌株的不同 , 异养 硝化细菌的 AMO 存在很大的差别。如恶臭假单胞 菌 (Pseudomonas p utida ) 的 AMO 和欧洲亚硝化单 胞菌 (N. europ aea ) 的 amoA 存在明显的序列相似 性 [57]

; 而 脱 N 副 球 菌 Pd1222(Paracoc cus deni tr if icans Pd1222) 与 自养硝化细菌的 AMO 又 存在 较大差异 [58]。并 且 , 脱 N 副球 菌的硝化基因 至少 含 ,

能在 E. coli 中得到表达。

3 2 羟胺氧化还原酶及其基因表达

目前 已 经 分 别 从 球 形 节 杆 菌 (Ar throbacter globif or mis ) 、 脱 N 副球菌 GB17(Paracoccus deni trif icans GB17) 即泛养 硫球 菌 LMD82(Thio sp haera pantotro p ha LMD 82) 、假 单 胞 菌 (Pseudomonas sp. ) [59]中获得了部分纯化的羟胺氧化酶。 3 2 1 自养硝化细菌的羟胺氧化还原酶及其 基因表达

纯化的羟胺氧化还原酶的结构研究表明 , 自养 硝化细菌的羟胺氧化还原酶是以一种复杂结构排列 的多体蛋 白 , 包 含 3个 亚基 , 共 有 24个血 红素 (Haem) 。每个亚基为 63kDa, 含 7个血红素 C 和 1个血红素 P-460。

编码欧洲亚硝化单胞菌 HAO 的 hao 基因 3个 拷贝其中之一存在一个核苷酸差异 , hao 三个拷贝 的编码区具有同一性 , 并与编码细胞色素 C554-HAO 的电子受体的 hcy 基因 紧密地连在一 起 [60]

。 hao 核苷酸序列长 1710bp, 并以一个顺反子转录 本进行表达 [61]。该基因还编码一个 18-24氨基酸 前导序列 , 在 HAO 转运及成熟过程中被去掉。

硝化细菌 HAO 的氨基酸序列似乎是独一无二 的 , 因为目前尚未发现它与数据库其它任何序列的 38 化 工 技 术 与 开 发 第 37卷

在 160bp 的上游区几乎完全相同。转录分析确定 了 hao1和 hao 2起始密码子 71bp 上游区的转录起 始位点 , 以及 hao 3起始密码子 54bp 上游区 3个 转录本起始位点有 70

启动子序列。与 AMO 相似 , HAO 的 mRNA 转录也由加入 NH 4+诱导 [62], 但还 不知道 3个拷贝是否差异表达。

3 2 2 异养硝化细菌羟胺氧化还原酶及其基因

表达

纯化或部分纯化的异养硝化细菌 HAO 与自养 细菌 HAO 存在明显差异 , 主要表现在 :(1) 异养 硝化细菌的 HAO 只是一个单体蛋白。如从假单胞 菌 S2 14(Pseudomonas sp. S2 14) 和 脱 N 副 球 菌 GB17获得的羟胺氧化还原酶 , 都是单体蛋白 , 分子量分别为 19kDa 和 18 5kDa 左右 ; (2) 这些 分离到的异养硝化细菌 HAO 都不含血红素 ; (3) 含非血红素 Fe 中心。有研究者认为可能非血红素 Fe 的羟胺氧化还原酶在异养硝化细菌中广泛分布。 这些酶的羟胺氧化活性可明显被亚铁离子激活而被 EDTA 抑制 ; (4) 可能与自养硝化细菌 HAO 的蛋 白序列无序列同源性。 N 端分析显示 , 脱 N 副球 菌 GB17与欧洲亚硝化单胞菌的 HAO 多肽没有明 显的序列同源性。而假单胞菌 S 14N 端起始的 15个氨基酸残基与脱 N 副球菌 GB17存在 27%的同

一性和 40%的相似性 ; (5) 自养硝化细菌羟胺的

氧化没有分子氧的加入 , 而好氧条件下 , 脱 N 副 球菌催化羟胺 氧化的过程是一个需要 分子氧的反 应 ; (6) 羟胺氧化的电子受体不同。假单胞菌和脱 N 副球菌或泛养硫球菌 , 其羟胺的氧化的电子受体 分别为细胞色素 C550和 C551, 每分子羟胺的氧化 产生 2个 电子 , 不产生 能量。而欧洲 亚硝化单胞 菌 , 每分子羟胺的氧化生成 4个电子 , 这 4个电子 中的 2个必须 用于 还原 细胞 色素 C554, 以 生成 AT P 和 NADH 。

4 结语

氨氧化作用机理研究得到广泛关注。氨氧化与 反硝化脱氮的耦合 , 特别是能够同步异养硝化和好 氧反硝化异养硝化微生物的发现 , 极大地丰富了生 物脱氮理论及工艺 , 对硝化作用的本质有了更充分 的认识。对氨氧化菌相关酶及基因的研究 , 有助于 彻底阐明氨氧化过程及机制 , 为氨氧化菌相关酶的 固定化和基因改造提供理论依据 , 并为将来大规模 利用基因工程菌进行高效废水生物处理奠定基础。 参考文献 :

(共 62篇 , 略 )

Study Advance on Mechanism of Ammonia Oxidization

TANG X ian lai

(Science and T echnology Depar tment of Guang xi, N anning 530012, China)

Abstract:The advances of biochemical mechanism and relative molecular biology of ammonia oxidizing microor g anisms w ere review ed. Feasible direction in biological nitrogen removal utilizing am monia ox idation w as put forward.

Key words:ammonia ox idization; am monia monooxygenase; hydroxy lamine xidoreductase (上接第 45页 )

Research on Backmixing in Flow Reactor

YA O Zhan j ing, G UO Rui, Z H ANG Chun sheng, BA O L iang , ZHAN G Yi z hong

(College of Chemistry and Chemical Engineering , Shanxi U niversity of Science &T echnology , Xi an 710021, China)

Abstract:Using tracer method and CST R model as the main body, the backm ix ing in four joint flow reactor under different fluid flow rate and stirring rate w ere determined to establish the system s mathematical model. T he results show ed that the fluid flow rate and stirring rate affected the degree of backmix ing. In the practical production process, by regulating these tw o factors, the reaction process could be controlled and regulated and

the reaction could develop in the most favourable direction.

Key words:backm ix ing; flow reactor; residence time distribution (RTD)

39第 11期 唐咸来 :微生物的氨氧化作用机理研究进展

范文二：海洋环境中的厌氧氨氧化细菌与厌氧氨氧化作用_姚鹏

第 33卷 第 4期 海 洋 学 报

V ol 133, No 14

2011年 7月

July 2011

海洋环境中的厌氧氨氧化细菌与厌氧氨氧化作用

姚鹏 1, 2, 于志刚 1, 2*

(1. 中国海洋大学 教育部海洋化学理论与工程技术重点实验室 , 山东 青岛 266100; 2. 中国海洋大学 海洋有机地 球化学研究所 , 山东 青岛 266100)

收稿日期 :2010-01-29; 修订日期 :2011-04-21。

基金项目 :国家自然科学基金重大国际 (地区 ) 合作研究项目 (长江口及邻近海域底边界层生物地球化学过程研究 ) (40920164004) 资助项目。 作者简介 :姚鹏 (1977) ) , 男 , 山东省菏泽市人 , 讲师 , 硕导 , 主要从事海洋有机生物地球化学研究。 E -m ail:yaopeng@ouc. edu. cn *

, 摘要 :厌氧氨氧化是细菌在厌氧条件下将氨氮氧化成氮气的过程 , 主要应用在污水处理反应器中 ,

最近几年发现在海洋环境中也广泛存在 , 并在海洋氮循环过程中发挥了重要作用 , 代表了海洋中一 个巨大的氮汇 , 对碳循环和全球气候变化也有重要影响 。 梯烷膜脂结构独特 , 是厌氧氨氧化细菌的 化学生物标志物 , 具有化学分类与古海洋学应用潜力 。 厌氧氨氧化作用及厌氧氨氧化细菌已成为 海洋生物地球化学 、 微生物学 、 有机地球化学等研究领域的热点 。 关键词 :细菌 ; 厌氧氨氧化 ; 氮循环 ; 16S rRNA; 梯烷膜脂

中图分类号 :P734; P735

文献标志码 :A

文章编号 :0253-4193(2011) 04-0001-08

1引言

厌氧 氨 氧 化 (anaerobic amm onium ox idatio n

(anamm ox ) ) 是指氨氮在厌氧条件下以亚硝酸氮为 电子受体直接反应生成氮气的过程

[1]

(图 1) 。 Bro -

da [2]

首先从理论上预测了该过程的存在 , 后来在污

水处理反应器中得到实证和广泛应用 [3-4], 最近几 年使用同位素标记、 基因序列、 生物标志物分析等多 种技术手段发现厌氧氨氧化在海洋和淡水环境中也 普遍存在 , 并且可能是海洋中无机氮更重要的汇 , 代 表了厌氧系统中氮丢失的一个重要过程 [5-10]。

16S r RNA 基因序列分析表明能够进行厌氧氨 氧化的是 一类厌 氧细 菌 , 属 于浮霉 菌门 (Plancto -my cetales ) 细菌的一个 深度分支 , 而浮霉菌被认 为 是细菌域最早的分支之一 , 因此厌氧氨氧化细菌很 可能也 影响 了 过去 的 海洋 生物 地 球 化学 循 环 过 程 [11]。另外 , 由于具有 /细胞器 0和缺少肽聚糖等特 性 , 浮霉菌成为研究细菌和真核细胞之间进化关系 的模式微生物 , 因此研究厌氧氨氧化细菌的系统进 化 也 有 助 于 了 解 生 命 起 源 和 地 球 系 统 演 化 过

图 1 海洋环境中氮循环概念图 (重绘自 Rattray 等 [12])

DNRA 表示硝酸盐 /亚硝酸盐异化还原为铵

程 [11, 13-15]。

和其他浮霉菌一样 , 厌氧氨氧化细菌也具有细 胞内膜结构 [16]

, 其中进行厌氧氨氧化的囊称作厌氧

氨氧化体 (anam mox osome) [17], 厌氧氨氧化体的膜 是一层厚厚的致密结构 , 其膜脂由形似楼梯一样排 列的 3~5个线性连接的环丁烷构成 的 /梯烷 (lad -

der ane) 0核心脂 (图 2) 和不同的极性头基组成 , 这种 特殊的结构能够保护厌氧氨氧化细菌在氨氧化过程 中不受反应中间体的毒害 [17-18]。不同的厌氧氨氧 化细菌具有不同的梯烷膜脂结构 , 因此对于厌氧氨 氧化细菌而言 , 梯烷 膜脂 具有 一定的 化学 分类 潜 力 [9, 19]。研究还表明 , 梯烷膜脂的结构和温度有一 定关系 [20], 基于此而建立的指标可以用来判断沉积 物中的厌氧氨氧化细菌是来自上层温暖水体还是在 较冷的表层沉积物中现场生产 , 并有可能用来重建 古海水表面温度 [12]

。

图 2厌氧氨氧化反应机理、 厌氧氨氧化细菌和细胞膜脂结构示意图 (重绘自 Sinning he Damst 等 [18]和 R attray 等 [12]) H ZO 代表肼氧化酶 , HH 代表肼水解酶 , NR 代表亚硝酸还原酶

厌氧氨氧化作用及厌氧氨氧化 细菌已成为海

洋生物地球化学、 微生物学、 有 机地球化学等研究

领域的热点 , 本文从氮循环、 分 子生态学和化学生

物标志物三个方面介绍海洋环境 中厌氧氨氧化的

研究进展。

2厌氧氨氧化与氮循环

在厌氧氨氧化过程发现之前 , 反硝化作用曾被

认为是去除海洋环境中的氮的最重要的过程 [21], 例

如 , 在低氧区发生的全球氮去除的汇 (30%~50%)

被主要归为反硝化 [22]。反硝化作用 是指细菌在缺

氧环境中利用硝酸盐或亚硝酸盐 作为氧化剂来氧

化有机物间 接生成 氮气的 过程 , 而厌 氧氨氧 化则

是在缺氧或 低氧条 件下 将氨 直接 氧化成 氮气 [5]。

自然海区的厌氧氨氧化作用长期 以来没有被人们

所认识 , 它 的发现 完善了 对海 洋氮循 环过程 的认

识 , 初步解 释了全 球氮通 量计 算中氮 不平衡 这一

困惑研究者多年的疑 问 [23]。厌氧氨氧化细菌能够

影响无机碳的固定 [24], 因此可以推测厌氧氨氧化会

影响大气中的 CO 2浓度 , 从而对全球气候变化产生

重要影响 [25]。

海洋环境中厌氧氨氧化活动的证据最早是在波

罗的海 的 大陆 架 沉 积 物中 发 现 的 , T ham drup 和

Dalsg aard [26]利用同位素标记研究表明高达 67%的

氮气生成和厌氧氨 氧化作用相关。在哥斯达 黎加

Go

的贡献为 19%~35%[27], 甚至在 北极海冰 中也有 19%的贡献 [28]。通过 16S rRNA 基因 序列遗传分 析 , Kuy pers 等 [5]发 现 从 世 界 上 最 大 的 缺 氧 盆 地 ) ) ) 黑海 ) ) ) 水柱中的次氧化区域富集得到的细 菌和进行厌氧氨氧化的浮霉菌成员有相关性 , 一系 列的分析结果 , 包括营养盐剖面、 荧光标记 RNA 探 针、 15N 示踪和梯烷膜脂的分布都表明从缺氧深层 水体向上扩散的氨被厌氧氨氧化细菌在氧化层以下 定量地消耗了 [5]。此后 , 关于海洋环境中厌氧氨氧 化的研究报道开始涌现 , 如在英国的泰晤士河口、 智 利北部缺氧水体、 秘鲁氧极小区等 [8, 29-30]。最近在 安哥拉本吉拉上升流系统中的低氧区也检测到了厌 氧氨氧化 , 表明厌氧氨氧化不仅发生在缺氧环境 , 而 且在溶解氧浓度较低的海域也存在 [6], 并推测在纳 米比亚海岸的低氧水体中厌氧氨氧化也是氮的一个 重要的汇 [31], 而在阿拉伯海低氧区 , 氮的流失的重 要贡献也被确认为来自于厌氧氨氧化细菌 [32]。 研究表明 , 一些厌氧氨氧化细 菌 (比如 Candi -datus /K uenenia stuttgar tiensis 0) 还具有将硝酸盐 或亚硝酸盐 异化还 原为 铵 (dissimilatory nitrate/ nitr ite r eductio n to amm onium, DNRA) 的能力 (见 图 1) , 能在 NH +4浓度为 10mmo l/dm 3的条件下将 NO -3还原至 NH +4[33]。 DNRA 过 程为厌氧 氨氧化 过程提供了底物氨氮 , 目前已经在安哥拉本吉拉的 上升 流中 得到 了 证实 [33]。由 于 DNRA -anam mox 2海洋学报 33卷

同位素标记法来区分 , 还需借助其他的示踪技术或 基因标记来研究 [25]

。另外 , 除了细菌的厌氧氨氧化 外 , 最近在海洋环境中 发现一些古菌 (Crenar chae -ota ) 也具 有氧化 氨的 能力 (am monia ox idation ar -chaea, AOA) [34]

, 但两者之间是共生关系还 是竞争 关系目前还不清楚。

在世界上不同的水体和沉积环境中 , 氮循环的 过程 , 特别是反硝化、 厌氧氨氧化等不同的氮去除过 程在其中所起的作用具有很大差异。参与反硝化、 厌氧氨氧化等氮循环过程的细菌种类也是不同的 , 它们面对环境变化 (比如溶解氧水平、 有机碳的供应 等 ) 的响应也就不同。因此 , 有必要对世界上不同水 体和沉积环境在不同理化条件下的氮循环过程进行 新的研究 , 将诸多新发现的过程考虑进去 , 这不但有 助于深入了解氮循环过程 , 而且对研究诸如有机碳 在再矿化过程中其他元素的循环过程也有益处。对 于厌氧氨氧化在我国海洋环境中氮循环过程的作用 和贡献的研究目前还未见报道 , 亟需开展相关研究。

3 厌氧氨氧化细菌的分子生态学

厌氧氨氧化细菌属于浮霉菌的一个深度分支 , 目前仅在 Candidatus A nammox oglobus , Candida -tus /B rocadia 0, Candidatus /J ettenia 0, Candida -tus /K uenenia 0和 Candidatus /S calindua 0五个属 中发现有限的细菌种类具有厌氧氨氧化能力 , 具有 较低的种类多样性

[14]

。基于系统发育和基 因组分

析的结果表明厌氧氨氧化细菌具有共同的祖先 , 属

于单一进化群体 [15]。

虽然目前发现的所有的厌氧氨氧化细菌种类都 具有相似的生理、 代谢特性和超微结构 , 但是不同 厌氧氨氧化细菌种类却具有较大的进化差异 [1](图 3) , 比如来自环境和污水处理反应器中的厌氧氨氧 化细菌平均只有 85%的 16S rRNA 基因序 列相似 而且它们的分布随生境及生态位不同表现出明显的 差异 [35]。 Cand idatus Scalind ua 主要 发现 于海 洋 环境 , 如 黑 海 次 氧化 水 柱 [5]

、 纳 米比 亚 上 升 流 系

统

[36]、 智利 和秘鲁氧 极小区 [8, 30]

和南海 深海沉 积

物 [37]

。近来应用新设计的引物进行 PCR 分析 , 在

多个淡水湖 (如坦桑尼亚 T ang anyika 湖 [38]和 德国 Rassnitzer 湖 [39]) 均 发 现 类 似 S calindula 的 16S rRNA 基因存在 , 甚至在永冻层土壤中也发现类似 基因 [35]; B rocadia 和 K uenenia 则主要发现于废水

[1]

现 , 比如在我国新沂河沉积物中就检测到和已知的 Candidatus /Brocadia anammox idans 0关系密切的 16S rRNA 基因序列 [40]; 最近发现的新成员 Candi -datus /Anammox oglobus p rop ionicus 0存在于包含 氨和亚硝酸盐的丙酸盐矿物培养基的培养物中 [15]

。 上述结果表明厌氧氨氧化过程可能广泛存在于几乎 任何含氮与低氧的生态系统中 [34]。

图 3 基于 16S r RN A 基因序列的厌氧氨氧化细菌

系统进化树 (重绘自 K uenen [1])

我国研究者对海洋环境中的厌氧氨氧化细菌的 研究主要集 中于南海。李 涛等

[41]

利用 16S rDNA

序列分析了南海南部陆坡表层沉积物细菌和古菌多

样性 , 并发现了 1条与厌氧氨氧化细菌有较远的亲 缘关系的序列 , 但是在西沙海槽表层沉积物中检测 到的序列则和文献 [42]报道的浮霉菌序列有很高的 同源性。 Shu 等 [37]对南海一深海沉积 物柱状样的 浮霉菌的多样性进行了较为系统的分析 , 并分离得 到两条厌氧氨氧化细菌 16S r RNA 序列 , 它们与已 知的 Cand idatus /Scalindua brodae 0, Cand idatus /Scalindua sor okinii 0和 Candidatus /Scalind ua w agneri 0序列 的 相似 性 均在 90%以上。洪 义国 等 [43]

从香港米浦湿地自然保护区以及南海深海海 底取样 , 研究了其厌氧氨氧化细菌多样性和分布的 广泛性 , 发现在 米浦以 及南 海生态 系统 中主 要为 S calindua 属细菌。

目前能用于 厌氧氨氧 化细菌 研究的 只有 16S rRNA 基因 , 仍没有确定可行的用于分析环境中厌 氧氨氧化菌的功能基因 , 主要原因在于厌氧氨氧化 细菌生长非常缓慢 , 每两个星期才分裂 1次 , 所以难 以获得其纯培养菌株 [11]

。以 16S rRNA 基因为靶 序列的荧光原位杂交技术 (fluor escence in situ hy -bridizatio n, FISH ) 是对现场厌氧氨氧 化细菌进行 3

4期 姚鹏等 :海洋环境中的厌氧氨氧化细菌与厌氧氨氧化作用

异性和适用性不一 , 仍然需要在探针设计上深入研 究 [44]

。 Str ous 等 [7]

利用环境基因组学的方法 , 对非 纯培养菌株 Candidatus /K uenenia stuttgar tiensis 0进行了全基因组测序分析 , 这是厌氧氨氧化细菌研 究的里程碑。厌氧氨氧化细菌全基因组的测定 , 进 一步明确了浮霉菌之间的系统进化关系 , 并且鉴定 了一些和厌氧氨氧化过程相关的功能基因 , 如与肼 代谢相关的功能基因肼水解酶 (hydrazine hydroge -nase, H H ) 及肼脱氢 酶 (hy drazine dehy drog enase, H D) 基 因 等 [7]。最 近 从 Cand idatus /K uenenia stuttgar tiensis 0中部分纯化得到一个具有将亚硝酸 盐快速还原为氨的高活性钙依赖性细胞色素 c 蛋白 酶 (与 DNRA 过程相关 ) , 而且基本确定了该酶的候 选基因 [33]。肼氧化酶 (hy drazine -ox dizing enzyme, H ZO) 是厌氧氨氧化反应的关键酶之一 , 这 种酶及 其潜在基因已经在一些类似的微生物体内得到了鉴 定 [45], 编码梯烷膜脂生物合成的基因最近也得到了 鉴定 [46]。今后的工作应聚焦于明确这些功 能基因 与厌氧氨氧化作用的关系 , 研究其对环境变化的响 应 , 一旦这些功能基因与厌氧氨氧化作用的关系被

确定 , 将大大提高分析环境中厌氧氨氧化细菌的针 对性和准确性 , 有助于深入了解这些细菌在生物地 球化学过 程中的作 用及其生 态重要 性 [25, 43, 47-48]。 另外 , 厌氧氨氧化已经成为废水处理的有效方法 , 具 有效率高、 成本低的优点 , 并且得到了广泛应用。从 自然环境中分离纯化具有高效厌氧氨氧化能力的菌 种 , 不但对厌氧氨氧化细菌的微生物学 研究 (如细 胞的内部 结构及 各部分 功能 分析、 功能 基因分 析 等 ) 具有重要意义 , 而且在废水处理中也 有实际的 应用价值。

4 厌氧氨氧化细菌的化学生物标志物

厌氧氨氧化细菌细胞中的厌氧氨氧化体由 1层 异常厚的、 不透水的细菌膜包裹 , 该膜由具有独特结 构的梯烷膜脂 (ladderane lipids) 构成 , 其核心由多达 5个的线性连接环丁烷组成 [18]

(图 4) 。这些梯烷膜脂 形成了 1个紧密的、 防止扩散的屏障 , 阻止厌氧氨氧 化反应中间体外泄 , 从而保持厌氧氨氧化代谢期间 的电化学质子浓度梯度 , 起到充分利用化学能及保护 细胞的其余部分不受 N 2H 4毒害的作用

[17]

。

图 4 厌氧氨氧化细菌完整梯 烷膜脂结构类型举例

(重绘自 Boumann 等 [19]和 R attray 等 [9])

梯烷膜脂分子具有独一无二的化学结构 , 还具 有独特的同位素特征 (明显的 13

C 亏损 ) [24]

, 因此其

不但在厌氧氨氧化生化反应过 程中发挥了重 要作 用 , 而且是研究厌氧氨氧化细菌活动的化学生物标 志物。研究还表明 , 梯烷膜脂的结构组成与厌氧氨 氧化细菌所经历的环境条件密切相关 , 这些分子可

能包含了大量的现在和过去厌氧氨氧化活动和海洋 环境的信息 [10]

。

对厌氧氨氧化细菌梯烷膜脂的研究最初主要着 眼于其核心脂组成 , 即梯烷的结构 [49], 并已成功地 作为厌氧氨氧化细菌的生物标志物应用在黑海次氧 化水柱 [5]

、 纳米比亚和秘鲁氧极小区

[6, 8]

及阿拉伯

4海洋学报 33卷

海 [32]。近年来随着高效液相色谱 -电喷雾电离 -质谱 联用方法的应用 , 分析完整的极性膜脂 (intact po -lar membrane lipids, IPLs) 成为可能 [50], 越来 越多 的研究聚 焦于 完整 的梯烷 膜脂 分析 [9-10, 19, 51-52]。 研究表明 , 完整的梯烷膜脂具有丰富的多样性 , 并具 有一定的化学分类潜力。梯烷膜脂核心是具有环丁 烷结构的 梯烷 , 一 般通过醚键和 甘油的 sn -2位 相 连 , 甘油的 sn -3位连接不同的极性头基 , 以磷酸基 为主 , 主要包括磷酸胆碱 (pho sphocholine, PC) 、 磷 酸乙醇胺 (pho spho ethano lam ine, PE) 和磷酸甘 油 (phosphog lycer ol, PG) [9, 19](见图 4) 。梯烷膜脂结 构的多样性在于甘油的 sn -1位所连接的烃基 , 这个 烃基可以是另一个梯烷结构 , 也可以是直链或甲基 支链的烷烃等 , 烃基可以通过醚键或酯键与甘油连 接 (见图 4) 。 Rattray 等 [19]的研究表明 , 不同的厌氧 氨氧化细菌所包含的主要梯烷膜脂结构也不同 , 而 且对于同一种细菌 , 当培养条件如温度等发生变化 时 , 膜脂结构也相应地发生变化。在厌氧氨氧化细 菌 Candidatus /K . stuttgartiensis 0中 , Rattray 等 [19]只检测到了很少量的非梯烷膜脂 , 推测除了厌 氧氨氧化体外 , 该细菌其他细胞膜脂也由梯烷膜脂 组成 , 这和其他三个属的厌氧氨氧化细菌不同。对 这些完整梯烷膜脂结构的分析有助于分析它们在不 同的厌氧氨氧化细菌种类中的组成和功能 , 为研究 影响其分布的因素提供基础。完整极性膜脂在细胞 死亡后能迅速分解 , 即丢掉极性头基 , 只保留核心脂 部分 , 因而被认为是活的微生物的化学标志物 , 能够 反映现存微生物群落结构和生物量 [53-54]。 Jaesch -ke 等 [10]率先研究了完整梯烷膜脂对海洋沉积物中 厌氧氨氧化的指示作用 , 并和梯烷核心脂的结果进 行了比较。他们发现在沉积物中完整梯烷膜脂普遍 要比梯烷核心脂的含量低 1~2个数量级 , 但是无论 是完整梯烷膜脂还是梯烷核心脂 , 都和同位素标记 实验的结果相一致 , 都能指示沉积物中的厌氧氨氧 化活动变化情况。在爱尔兰海 (水深 50~100m ) , 现存的 厌氧 氨 氧化 细 菌主 要集 中 在 沉积 物 上 层 2cm 左右 , 然后随 着深度迅速下降。在凯尔特 海 (水深 500~2000m) , 厌氧氨氧化细菌的活动深度 超过 2cm , 而且沉积物中梯烷膜脂的丰度随着水深 的增加也在增加 , 显示深层水体沉积物中厌氧氨氧 化作用要强于浅层水体 [10]。厌氧氨氧化细 菌完整 梯烷膜脂分析在更大范围的海洋环境中的应用将有 成和丰度的信息。

梯烷膜 脂还 可能 在古 环境 重建 中发 挥作 用。 Rattray 等 [12]研究了温度对不同环境中厌氧氨氧化 细菌梯烷膜脂生产的影响 , 发现在具有 5个环丁烷 结构的梯烷膜脂中 , 具有短碳链 (C 18) 的梯烷膜脂在 低温下占优势 , 而长碳链 (C 20) 在 高温下更 丰富一 些。基于这一关系 , Rattray 等 [12]定义了一个 N L 5指标 (index of ladderane lipids w ith 5cyclo butane rings) :N L 5=C 20-[5]-梯烷脂肪酸 /(C 18-[5]-梯烷脂肪酸 +C 20-[5]-梯烷脂肪酸 ) , 将不同温度 下得到的 N L 5指 标对温度 作图 , 发现两者 之间在 0~40e 的范围内具有对数关系 :

T =116ln 5

019-NL 5

+161(1) N L 5指标可以用来判断表层沉积物中厌氧氨氧 化细菌的来源 , 比如是来自上层温暖水体还是来自 较冷的表层沉积物中现场生产的 [12]。 N L 5指标也 能用于古环境研究 , 比如反演古海水温 度 [52], 但是 还需要深入地探讨。

在应用梯烷膜脂生物标志物对厌氧氨氧化细菌 与厌氧氨氧化作用进行研究时 , 最大的问题是缺少 相应的标准品 , 在结构的确定和定量上存在不足 , 使 得分析方法没有得到有效推广 , 影响了其深入发展 , 从培养的厌氧氨氧化细菌中分离梯烷膜脂或合成与 梯烷膜脂结构类似的化合物用于定性和定量分析是 今后研究的重点和难点。

5结语

海洋环境中的厌氧氨氧化是氮的生物地球化学 循环的重要过程 , 尤其是低氧和缺氧环境中氮去除 的重要途径 , 对碳循环和全球气候变化也有重要影 响。虽然已经取得了一些成果 , 但海洋环境中的厌 氧氨氧化细菌与厌氧氨氧化作用仍然是一个充满挑 战、 需要深入研究的方向。对世界上不同的水体、 沉 积环境中的厌氧氨氧化过程进行研究 , 将有助于我 们更好地了解这一过程及其影响因素。在以前的氮 循环研究中 , 大部分是没有考虑厌氧氨氧化作用贡 献的 , 在今后的研究中 , 应将这一新的 过程考虑进 去 , 对于全面深入地了解氮循环无疑是很有必要的。 采用环境基因组或宏基因组测序对海洋环境样品中 的基因组进行分析 , 有助于厌氧氨氧化细菌功能基 因的筛选 , 对于揭示微生物群落多样性、 种群结构、 5

4期 姚鹏等 :海洋环境中的厌氧氨氧化细菌与厌氧氨氧化作用

烷膜脂可以用来指示过去和现 在的厌氧氨氧 化活 动 , 基于梯烷膜脂的指标在古环境重建中也有一定 的应用潜力 , 这不但有利于了解现存的厌氧氨氧化 细菌生物量 , 对于了解厌氧氨氧化细菌及其作用对 环境变化的响应 (如与低氧的变化历史相结合 ) 也有 帮助。

目前已经在我国近海沉积物中发现了存在厌氧 氨氧化细菌的分子生物学证据 , 但是对于厌氧氨氧 化在氮循环过程中的作用、 厌氧氨氧化细菌的组成 和丰度等还没有研究 , 也缺少对梯烷膜脂这一厌氧 氨氧化细菌生物标志物的研究。厌氧氨氧化作用是 一个难得的可以从三个不同角度 , 即生物地球化学、 分子生物学和有机地球化学切入的课题 , 将不同的 技术手段联合运用 , 既可以得到不同的信息 , 又可以 互相佐证 , 值得开展深入研究。

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Anaerobic ammonium -oxidizing bacteria and anaerobic ammonium oxidation (anammox) in the marine environment

YAO Peng 1, 2, YU Zh-i g ang 1, 2

(1. K ey L abor atory o f M inis try of Education f or M ar ine Chemistr y T heory and T echnology , Ocean Univer sity of China, Qing dao 266100, China; 2. I ns titute o f M ar ine Or ganic Geochemis try , Ocean Univers ity of China, Qing dao 266100, China)

Abstract:Anaero bic amm onium ox idatio n (anammo x) is the pro cess of micro biolo gical conv er sion of am -m onium to dinitrog en gas and is mainly employed in w aste w ater engineers. In recent years, it w as found that anam mox w as w idely distributed in the m ar ine environments and played an impo rtant role in m ar ine nitrog en cycle, and influenced the carbon cycle and g lobal climate change. It has been recog nized as a m ajo r pathw ay for the remo val of fixed N fro m the marine ecosystem. Ladderane lipids are unique chemical bio -m ar kers o f anaer obic amm onium -ox idizing bacter ia, and have potential im plication for chem otax onomy and paleooceangraphy. Anaerobic ammonium -o xidizing bacter ia and anaero bic amm onium ox idation have be -come ho t -spot r esearch fields in the marine bio geochemistry , m icrobiolo gy and org anic g eochem istry. Key words:bacter ia; anaerobic am monium ox idation; nitr ogen cy cle; 16S rRNA; ladder ane lipids

8海洋学报 33卷

范文三：生活垃圾填埋场甲烷自然减排的新途径_厌氧与好氧的共氧化作用 (1)

生活垃圾填埋场甲烷自然减排的新途径 ——

— 厌氧与好氧的共氧化作用

周海燕 1,韩 丹 2

(1. 上海老港废弃物处置有限公司,上海 201302; 2. 同济大学,上海 200092)

摘 要:通过证实生活垃圾填埋场中甲烷厌氧氧化与好氧氧化的共存,提出了甲烷自然减排的新途径 。 分别选取 暴雨过后垃圾填埋表层 30~60cm 的覆土 、 1. 5m 以下的垃圾以及底层矿化垃圾做硫酸盐还原菌阳性反应实验,结果表 明:生活垃圾填埋体不同填埋层都存在不同数量级的硫酸盐还原菌,且底层矿化垃圾中的硫酸盐还原菌的数量最多, 表层覆土中最少 。 颗粒大小比例为 50%∶ 50%的垃圾样品表现出最佳的甲烷好氧与厌氧氧化效果,且厌氧氧化在共氧化 作用中的比例达到 20%以上 。 含水率为 25%时,矿化垃圾中微生物活性最大,好氧与厌氧氧化甲烷速率均达到最大; 当含水率接近 70%时,甲烷厌氧氧化的贡献率可达 30%以上 。 外源甲烷的补充可以驯化甲烷氧化微生物,其中甲烷好 氧氧化时间最大可缩短 50%;而甲烷通入量超过 2mL 后,甲烷好氧与厌氧氧化均受到抑制 。

关键词:生活垃圾填埋场;甲烷;好氧氧化;厌氧氧化;硫酸盐还原菌

中图分类号:X701文献标识码:A 文章编号:1005-8206(2011) 02-0059-04

New Way for Natural Mitigation of Methane in Domestic Waste Landfill Sites:

Co-oxidation of Anaerobic and Aerobic Oxidation

Zhou Haiyan 1, Han Dan 2

(1. Shanghai Laogang Waste Treatment Co., Ltd, Shanghai 201302; 2. Tongji University, Shanghai 200092)

Abstract :A new way for natural mitigation of methane was put forward by authenticating co-oxidation of anaerobic and aerobic oxidation of methane in domestic waste landfill sites. The soil at 30-60cm, the waste below 1. 5m from the surface, and the aged waste at the bottom, were selected for the experiments of sulfate-reducing bacteria positive reaction. The results showed that sulfate-reducing bacteria nearly existed in all landfill layers of waste landfill bodies, and aged waste at the bottom contained most, the surface soil contained least. Waste samples with 50%∶ 50%of coarse and fine particle size proportion showed the best methane oxidation effect of aerobic and anaerobic oxidation, and anaerobic oxidation accounted for above 20%.Microbial activity in aged waste and its methane co -oxidation rate both reached the maximum value as moisture content was 25%.Anaerobic oxidation rate could reach more than 30%as moisture content was close to 70%.Supplement of exogenous methane could culture methane-oxidizing bacteria and shorten the time of aerobic oxidation to 50%at the most. However, both aerobic and anaerobic oxidation would be weakened as the amount of exogenous methane was beyond 2mL.

Key words :domestic waste landfill site ; methane ; aerobic oxidation ; anaerobic oxidation ; sulfate-reducing bacteria

甲烷氧化是甲烷减排的重要途径,而生活垃 圾填埋场土壤覆盖层对甲烷的自然氧化是目前发 现的甲烷自然减排最主要的方式 。 通常情况下, 甲烷氧化指在有氧条件下,甲烷被甲烷氧化菌氧 化为二氧化碳 。 然而,越来越多的研究证实,在 淹水的土壤 、 河流以及海洋的沉积物中不仅发生 甲烷好氧氧化,而且也发生厌氧性氧化 [1-3]。 甲烷 厌氧氧化 (AOM ) 是海洋缺氧环境中最重要的微 生物化学过程,其发生的必要条件是甲烷补给和 适当的硫酸盐浓度,并存在活跃的 ANME-SRB 微 生物共存体 。

在生活垃圾填埋场,降雨向填埋场内补充水 分,加快填埋气体产生速度,然而过大的降雨可 导致垃圾堆体内孔隙减少从而阻碍填埋气体的释 放 。 当降雨导致垃圾浸泡时,氧气严重不足,甲 烷则可发生厌氧与好氧的共氧化 。 因此,在强降 雨过后的垃圾填埋场表层至一定深度的垃圾体都 是可能发生 AOM 作用的区域 。 尤其是渗沥液排 放不畅的垃圾填埋体下层,由于部分垃圾长期被聚积 在此的渗沥液浸泡,因此可能是 AOM 最活跃的区域 。 笔者分别选取垃圾填埋单元表层覆土 、 表层 1. 5m 以下的垃圾,以及刚刚开挖出来的 9a 矿 化垃圾作为实验样品 。 其中,矿化垃圾并非完全 达到无机化或矿化程度的垃圾,而是在垃圾填埋 场填埋多年,基本达到稳定化状态,已可进行开 采利用的垃圾 [4]。 矿化垃圾是一种性能优良的生 物介质,其微生物种类丰富尤其是甲烷氧化菌, 且密度较小 、 孔隙率高 、 有机质含量高 、 吸附和 交换能力强 。 目前矿化垃圾已应用于处理生活垃 、

环境卫生工程 Environmental Sanitation Engineering Vol.19No .2 April 2011

第 19卷第 2期

2011年 4月 ·59·

环境卫生工程 第 19卷

水领域,且正向越来越广阔的方向发展 [5]。 将以上 3种不同原材料作为研究对象,首先 证实了强降雨过后各种样品中甲烷厌氧氧化作用 的存在,然后分析在厌氧与好氧的共氧化过程中, 不同因素影响下 2种氧化作用对整个甲烷氧化的 贡献率 。

1实验材料与方法

1. 1样品及其预处理

实验样品均采自上海老港垃圾填埋场 。 该填 埋场地处上海南汇区,临近东海,常年多雨 。 采 样所在的填埋区垃圾填埋龄为 9a ,在未开挖区取 30~60cm 的表层覆土,在表层 1. 5m 以下取垃圾 样品;在开挖区取底层的矿化垃圾 。 取样期间正 值梅雨季节,样品明显被雨水浸泡过,呈黑色 。 采用多点采样,捣碎混匀,用 100目筛去除 杂质 。 然后称取 50g 混合样于干燥箱中烘干,测 定样品含水率 。 其他样品于室温下风干至含水率 20%左右,然后用 100目筛去除杂质,置于 1000 mL 的试剂瓶中,在 28℃ 好氧培养 2周,去除易 被微生物分解的有机质,备用 。 矿化垃圾的各种 理化性质见表 1。 用 0. 02mm 筛将样品分为颗 粒 >0.02mm 和 <0.02mm 2部分,然后按要求比="" 例称量后充分混匀="">

1. 2样品甲烷氧化活性的测定

1. 2. 1厌氧条件下甲烷氧化活性的测定

取样品 20g 于 100mL 血清瓶中,加 9mL 蒸馏水使得含水率在 70%左右,然后用异丁基橡 胶塞密封,再用纯氮气置换血清瓶中的空气 5~8 min , 28℃ 培养 7d 。 再用纯氮气置换血清瓶中 的空气 5min ,加入 1mL 纯甲烷,在 28℃ 培养 2d 后测血清瓶中的甲烷量 。

1. 2. 2好氧条件下甲烷氧化活性的测定

取样品 20g 于 100mL 血清瓶中,加 1mL 蒸 馏水使含水率在 25%左右,用异丁基橡胶塞密封, 再加入 5mL 纯甲烷,在 28℃ 培养 7d 后,用新 鲜空气置换血清瓶中气体,再用异丁基橡胶塞密 封,加入 5mL 纯甲烷,再于 28℃ 培养 7d 。 重 复 3次获得最大甲烷氧化活性的样品 。 然后用新 min 甲烷,在 28℃ 培养 2d 后测血清瓶中的甲烷量 。 1. 3检测方法

将水和矿化垃圾样品以 1∶ 3搅拌均匀后用 ZD-2型自动电位滴定仪测定 pH 和氧化还原电位 Eh ;活性有机质采用稀释热法测定; TN 采用德 国 Elementar vario EL Ⅲ 元素分析仪测定;有机质 采用重铬酸钾法测定;甲烷气体分析采用 GC-14B (岛津 ) 测定 。 所有数据为 3次所测结果的 平均值,数据处理采用 SPSS 17. 0for Windows 软件 。 以甲烷厌氧 /好氧氧化速率表征甲烷氧化作 用 。 其计算公式如下:

甲烷氧化速率 (mol/(d ·g ) ) =(1%-第 t 天 甲烷浓度 ) ×100×0. 77/(20×16×103×t ) 。

2结果

2. 1硫酸盐还原菌检验

采用 14d 简单检验方法 ——

— 测试瓶绝迹稀释 法:将水与 3种样品分别以 1∶ 3搅拌均匀后,取 悬浮液 1mL 分别用一次性无菌注射器注入到 1号测试瓶中进行接种稀释,充分振摇;再从 1号 瓶中抽取 1mL 经充分振摇后的水样注入到 2号 瓶中稀释,充分振摇;依次类推,稀释直到 5号 瓶 。 将上述所有稀释的测试瓶放在 28℃ 下恒温培 养 (现场采样温度 ±3℃ ) 。

培养 14d 后发现部分 SRB 菌测试瓶中的淡 黄色液体变黑,有的瓶中有明显的黑色沉淀,打

开瓶盖有浓烈的 H

2

S 气味,把浸有 AgNO 3液体的 试纸条置于瓶口,试纸迅速从边缘向内变黑,证

明有大量的 H

2

S 生成,并存在 SRB 菌 。

各样品硫酸盐还原菌阳性反应的结果如表 2~ 4所示,其中级数是由生长指标值在表 5中查询 所得,从而计算可得细菌量 。

由表 2~4可见,暴雨过后的表层覆土 、 垃圾 样品以及矿化垃圾中都存在硫酸盐还原菌,即在

样品类型 含水率 /%pH Eh/mVTN/%活性有机质 /%矿化垃圾 13. 217. 891530. 235. 81表层覆土 35. 746. 531970. 453. 63

表层 1. 5m 以下的垃圾 27. 997. 231750. 356. 58

表 1实验样品的理化性质

1号瓶 2号瓶 3号瓶 4号瓶 5号瓶 两组平行样

++++-+++--生长指标 210

级数 102

细菌量 /(个 /mL) 6×102

表 2表层覆土样品阳性反应结果

1号瓶 2号瓶 3号瓶 4号瓶 5号瓶 两组平行样

+++++ ++++-生长指标 210

级数 103

/(个 /mL) 6×103

表 3表层 1. 5m 以下垃圾样品阳性反应结果

·60·

第 2期

垃圾填埋体的表层至底层中都可发生甲烷厌氧氧

化 。 而从各样品中细菌量可见,矿化垃圾中的硫 酸盐还原菌的数量最多,表层覆土中最少 。 这与 不同填埋位置氧气的含量直接相关 。 氧气含量从 表层至底层逐渐减少,同一垃圾层上的好氧和厌 氧区域比例也不等,因此,对于氧气较多的表层, 甲烷的厌氧氧化作用明显弱于下层及底层,其在 自然减排过程中贡献率也不同 。 2. 2孔隙度对甲烷共氧化的影响

由于垃圾的压实程度 、 垃圾成分等都影响垃 圾的通透性,从而间接影响甲烷的氧化速率,因 此选用表层 1. 5m 以下的垃圾样品,以不同大小 颗粒样品探讨不同孔隙率的垃圾层对甲烷的氧化 作用 。 测定结果见表 6。

结果表明,不同大小颗粒比例的垃圾样品对

垃圾的甲烷好氧氧化速率无显著影响 (

t =2.774, Sig (2-taitod ) =0.051, p >0.05) ,而对于甲烷的 厌氧氧化影响明显大于好氧氧化 (t =2.909, Sig (2-taitod ) =0.043, p <0.05) 。="" 大颗粒与小颗粒比="" 例较为接近的样品甲烷好氧与厌氧氧化速率都相="" 对较高,且厌氧氧化在共氧化作用中的比例可达="" 到="" 20%以上="" 。="" 对于颗粒太细的样品虽然氧气浓度="" 低,有利于厌氧氧化,但同时甲烷扩散也受到一="" 2.="">

含水率对甲烷共氧化的影响

选用 9a 矿化垃圾考察不同含水率矿化垃圾

对甲烷的厌氧氧化效果,并在相同含水率条件下

用高纯氮置换血清瓶空气的方法测定甲烷厌氧氧化 速率,并与甲烷好氧氧化速率比较,结果见表 7。

由表 7可见,含水率为 1. 66%时,甲烷好氧

氧化与厌氧氧化速率都为零,这是因为含水率过 低,导致矿化垃圾中甲烷氧化菌失去活性 。 随着 含水率的提高,矿化垃圾中微生物活性逐渐增强, 当含水率达到 25. 79%时,矿化垃圾中微生物活 性最大,好氧与厌氧氧化甲烷速率均达到最大 。 统计分析表明,在血清瓶上部空间换氮气培养的 2d 以内,含水率在 25%以下的矿化垃圾对甲烷的 好氧氧化速率之间达到极显著性差异 (p <0.01), 而含水率为="" 25%以上时甲烷好氧氧化速率之间未="" 达到显著性差异="" (p="">0.05) 。 含水率达到 40. 44%后,矿化垃圾处在过饱和持水状态 (可见明水 ) , 分子氧和甲烷均难以迅速扩散进入矿化垃圾,此 时由于甲烷扩散速度和甲烷好氧氧化菌活性明显 下降,导致甲烷好氧氧化速率迅速下降,而甲烷 厌氧氧化速率仍保持原有相似水平,因此,甲烷厌 氧氧化的贡献率也逐步增大,甚至达到 30%以上 。 2. 4外源甲烷通入量对甲烷共氧化的影响

当矿化垃圾的含水率小于 20%时,在有氧条 件下,矿化垃圾的好氧氧化甲烷能力占主导地位, 在 24h 内即可将 1mL 甲烷完全氧化,如图 1所 示 。 为了考察甲烷通入量对甲烷氧化速度的影响, 每次待甲烷好氧完全氧化 (甲烷消耗殆尽 ) ,往好 氧氧化血清瓶中重新充入 1mL 甲烷,而厌氧氧 化的血清瓶则补充至 1mL ,如图 1中的 I~IV阶 段 。 由图 1可见,好氧条件下甲烷完全氧化时间 由 24h 逐渐缩短至 20、 17、 11h ,甲烷好氧氧化 而 表 4

9a 矿化垃圾样品阳性反应结果

1号瓶

2号瓶 3号瓶 4号瓶 5号瓶 两组平行样 ++++++

+

++

+

生长指标 200级数 104细菌量 /(个 /mL)

≥ 2. 5×104

表 5二次重复细菌量基数

生长 指标 细菌量基数 /(个 /mL) 生长 指标 细菌量基数 /(个 /mL) 生长 指标 细菌量基数 /(个 /mL) 生长 指标 细菌量基数 /

(个 /mL) 0000. 01000. 61213. 021220. 00010. 51011. 22002. 522025. 00100. 51101. 32015. 022170. 00110. 91112. 02106. 0222

11. 0

020

0. 9

120

2. 0

211

13. 0

样品

编号 样品组成

(颗粒大小 )

/%甲烷氧化

>0.02mm <>

mm 甲烷好氧氧化

速率 /(×10-6mol/(d ·g ) ) 甲烷厌氧化 速率 /(×10-6mol/(d ·g ) ) 甲烷的厌氧氧化 在共氧化 中的比例 /%

101002. 120. 219. 32230702. 350. 5418. 79350502. 720. 7020. 43470302. 010. 4919. 825

100

1. 650. 148. 24

表 6

垃圾样品的孔隙度对甲烷氧化速率的影响

样品 编号 含水率 /

%

甲烷氧化

甲烷好氧氧化速率 /(×10-6mol/(d ·g ) ) 甲烷厌氧化速率 /(×10-6mol/(d ·g ) ) 甲烷的厌氧氧化在 共氧化中的比例 /%11. 6600026. 870. 150. 0110. 17311. 911. 110. 1411. 514

15. 592. 170. 3513. 83521. 793. 760. 5613. 12625. 794. 160. 7415. 21740. 442. 550. 6921. 428

68. 92

1. 12

0. 53

32. 02

表 7

含水率对甲烷氧化速率的影响

周海燕,等 生活垃圾填埋场甲烷自然减排的新途径 —— — 厌氧与好氧的共氧化作用

·61·

环境卫生工程 第 19卷

速度变化不大,甲烷体积变化仅为 0. 1~0.2mL 。 由图 2可见,当甲烷通入量分别为 0. 5、 1. 0、 1. 5、 2. 0、 3. 0mL 时,甲烷氧化速率先增大后 减少,其中在甲烷通入量为 2mL 时,甲烷好氧与 厌氧氧化速率分别达到最大,为 2. 98×10-6、 0. 75×10-6mol/(d ·g ) 。 表明外源甲烷是影响矿化垃圾氧 化甲烷活性的重要因素 。 甲烷含量过低,甲烷氧

化菌无法获得足够的碳源来维持其生长,因此甲 烷氧化菌的数量与活性都大大降低,甲烷氧化率 也很低 。 当甲烷量在一定范围内逐渐得到补充时, 甲烷氧化菌不断得到驯化,活性逐渐增强,因此 图 1中氧化 1mL 甲烷所需要的时间越来越短 。 而当甲烷通入量超过 2mL 时,甲烷氧化作用反而

被抑制,这表明该进气量超过了 20g 矿化垃圾中 甲烷氧化菌的负荷 。

3

结论

以 9a 垃圾填埋区域内的覆盖层 、 浅层垃圾

以及底层矿化垃圾为研究对象,通过硫酸盐还原 菌阳性反应实验,证实了生活垃圾填埋体不同填 埋层都存在不同数量级的硫酸盐还原菌,从而表 明了甲烷好氧氧化与厌氧氧化的共存 。 从各样品 中细菌量可见,矿化垃圾中的硫酸盐还原菌的数 量最多,表层覆土中最少 。 不同大小颗粒比例的 垃圾样品对于垃圾的甲烷好氧氧化速率并无显著

影响,但对厌氧氧化影响明显大于好氧氧化 。 颗

粒大小比例为 50%∶ 50%的垃圾样品有最佳的甲烷 好氧与厌氧氧化效果,且厌氧氧化在共氧化作用 中的比例达到 20%以上 。 含水率约为 25%时,矿 化垃圾中微生物活性最大,好氧与厌氧氧化甲烷

速率均达到最大,且较高的含水率有利于厌氧氧 化,甲烷厌氧氧化的贡献率可达到 30%以上 。 外

源甲烷的反复补充可以驯化甲烷氧化菌,缩短甲 烷氧化时间,但甲烷通入量超过 2mL 后,甲烷 氧化则受到抑制 。 参考文献

[1]Conrad R. Soil Microorganisms as Cont Rollers of Atmospheric Trace Gas -

es (H 2

, CO , CH 4

, OCS , N 2

O , and NO ) [J ]. Microbiol Rev , 1996, 60

(4) :609-640.

[2]Gilbert B , Frenzel P. Rice Roots and CH 4

Oxidation :The Activity of Bac -

teria , Their Distribution and the Microenvironment [J ]. Soil Biol Biochem, 1998, 30(14) :1903-1916.

[3]Hanson R S , Hanson T E. Methanot Rophic Bacteria [J ]. Microbiol Rev , 1996, 60(2) :439-471.

[4]Zhao Y C , Lou Z Y , Guo Y L , et al. Treatment of Sewage Using an Aged-refuse-based Bioreactor [J ]. J Environ Manage , 2007, 82(1) :32-38. [5]ZhaoY C , Shao F. Use of an Aged-refuse Bioflter for the Treatment of Feedlots Wastewaters

[J ]. Environ Eng Sci , 2004, 21(3) :349-360. 作者简介:周海燕 (1969— ) ,高级工程师 。 主要研究生活垃圾填埋技术 、 垃圾渗沥液处理处置技术 、 市政污泥处理处置技术 、 垃圾填埋场臭气污染 控制技术等 。

E-mail :lgzhouhy@163.com 。

(责任编辑:刘冬梅 )

0. 51. 01. 52. 02. 53. 00. 0

2. 5

2. 01. 51. 0

0. 5

3. 0

好氧氧化速率

甲 烷 氧 化 速 率 /(×10-6m o l /(d ·g ) )

甲烷通入量 /mL

厌氧氧化速率 图 2甲烷通入量对甲烷氧化率的影响

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

·信息 ·

宁夏将无害化处置餐厨垃圾

宁夏餐厨垃圾无害化处理机制日趋完善,利

用餐厨污水生产沼气 、 泔水油生产生物柴油的 3个项目投建在即 。 这 3个生态 、 经济效益俱佳的 餐厨垃圾处置项目分别是:日处理污水 70t 、 产 生沼气 1400m 3的大型沼气工程项目;日处置泔 产生物柴油 4000t ,实现销售收入 2000万元; 餐馆油水分离机治理泔水油项目,为 2500家大 中型餐饮企业安置 2500台油水分离机,日处理 泔水 750t ,每年可为泔水油生物产油项目提供 5600t 工业油脂原料 。

0. 20. 40. 60. 81. 01. 21. 40. 0

70

60

50

40

30

20

10

80

厌氧氧化

好氧氧化

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

Ⅳ

氧化时间 /h

甲 烷 /m L

图 1甲烷体积在氧化过程中随时间的变化

·62·

范文四：脂肪酸β-氧化作用答案

1.什么是酮体？本实验如何计算样品中丙酮的含量？

答：在肝脏中，脂肪酸氧化分解的中间产物乙酰乙酸A、β-羟基丁酸及丙酮，三者统称为酮体。肝脏具有较强的合成酮体的酶系，但却缺乏利用酮体的酶系。 酮体是脂肪分解的产物，而不是高血糖的产物。本实验是根据反应： 2NaOH+I2 NaOI+H2O+NaI CH3COCH33+CH3COONa+2NaOH 而剩余I2 可用标准硫代硫酸钠滴定：

I2+2NaCl+H2O I2+2Na2S2O3Na2S4O6+2NaI

根据滴定的样品和滴定对照所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差，可以计算出由丁酸氧化生成的丙酮量。

2.为什么可以通过测丙酮的量来推算出细胞脂肪酸β氧化作用的强弱？

答：脂肪酸经β-氧化作用生成乙酰辅酶A。二分子乙酰辅酶A可缩合生成乙酰乙酸，乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可以还原生成β-羟丁酸。而本实验是脂肪酸的氧化作用，因此绝大部分的乙酰乙酸都氧化生成了丙酮，故可以用通过测丙酮量来推算其氧化强弱。

3.本实验为什么选用肝组织，选用其它组织是否可以，为什么？

答：是因为脂肪酸β-氧化只是发生在肝脏中，而其他组织中发生的很少或几乎不发生脂肪酸β-氧化，因此只能选取肝组织，而不能选其他组织.

范文五：醇的氧化作用

醇的氧化作用

來源：Chemistry at Work, J.R. Taylor, 1992 儀器、實驗技巧、安全、結構

( 出版社：John Murray ) 練習 3.3

5

10

有機分子的氧化作用與其還原作用相輔相成，兩者同樣重要。氧化作用實質上是顛倒了的還原作用。它包括除去兩顆氫原子、加入氧原子或以雜原子的官能團將氫原子取代。 雖然很多有機分子都可被氧化，可是，在有機合成中，由醇變成羰基化合物的轉大概是最常見的過程。而人們亦為這重要的轉化研究出很多試劑。一級醇首先會氧化成醛，但因為醛本身也很容易被氧化，因此一級醇的氧化通常會繼續，直至羧酸產生。可是，當我們選擇適當的試劑，便可以控制氧化作用，並使反應停留在醛的階段。二級醇容易被氧化成酮，但三級醇通常不被氧化。可是，在酸性的氧化環境中，三級醇通常會脫水並生成烯烴，這就使它們仍有被氧化的可能。

15

其中一種最常用氧化劑是由重鉻酸鈉和硫酸製得的鉻酸水溶液。其用處可以由2-甲基環己醇變成2-甲基環己酮的轉化說明。我們須使用過量的氧化劑，並在一個處於0℃的兩相的醚-水體系中讓反應發生。隨後的步驟不太複雜，只需將醚液層分離及洗淨，再在大氣壓下蒸餾，便可得到純化了的酮。

製備2-甲基環己酮 在100 cm3的燒杯中將10g二水合重鉻酸鈉溶解在30 cm3水中。其後，一邊快速攪拌溶液，一邊加入7.4 cm3濃硫酸，再加水，直至溶液置於冰浴中，並讓它冷卻30分鐘。 稍後，將2.7 g 2-甲基環己醇和30 cm3乙氧基乙烷加入一個250 cm3的圓底燒瓶，放進磁攪拌器及裝上活栓漏斗。攪拌其中的溶液，並將燒瓶放在冰浴中15分鐘。在保持燒瓶於冰凍的同時，將大約一半的冰凍的氧化溶液一滴一滴地加入那曾被快速攪拌的反應混合物中。在約五分鐘內，將利餘的氧化劑緩慢地加入，然後將混合物在冰浴中快速攪拌20分鐘。 將攪拌器停下來，讓液層分開。將混合物轉移至分液漏斗以將液層分離。用兩份15 cm3的乙氧基乙烷提取下面的水液層中的有機物。將三個醚液層結合，並用20 cm3碳酸鈉水溶液及4份20 cm3水將它洗淨。用無水硫酸鎂將醚液層乾燥。過濾乾燥劑後，用旋轉式蒸發器蒸發溶劑。將殘餘物轉移至一個10 cm3的燒瓶，並在大氣壓下將液體蒸餾﹕160至165℃間收集產物。記下產物的產量。

Adapted from Experimental Organic Chemistry, Harwood and Moody, Blackwell (1989)

20

25

30

35

問題： 1. a. b. c.

解釋下列各項：

一級、二級及三級醇 ( 第 9 至 12 行 )； 雜原子的官能團 ( 第 6 行 )； 兩相 ( 第 17 行 )。

2. 為2-甲基環己醇的氧化反應寫出離子方程。

3. 在製備2-甲基環己酮的過程中須採取甚麼安全措施？

4. 為何產生出來的溶液須用碳酸鈉溶液先淨 ( 第 31 行 )？在進行這步驟時須採取甚麼安全措施？為甚麼？

5. 繪出並標示所用到的儀器。

6. 計算2-甲基環己酮的理論產量。你會如何檢查產物的純度？

7. 提出一種試劑和條件以顯示： a. 這是一個羰基化合物，及 b. 它是酮而非醛。

8. 描述你將會在以下過程中使用的技術，並提出所需的安全措施。 a. 以乙氧基乙烷提取在下面的水液層。(第30行) b. 找出最終產物的份量。 (第33行)

[完]

Solution

1a) 一級醇的 -OH基團連繫到只與一個或零個烷基連接的碳原子。二級醇的 -OH基

團的碳原子已與2個烷基連接。三級醇的 -OH基團的碳原子已與3個烷基連接。 b) 該官能團連接到主鏈的原子並非C或H，如 –SH。 c) 水和醚屬於不同的相。 2)

CH3

OH

3

+2H++2e-

或

CH3

3

2-

+Cr2O7+8H+

3

3

+2Cr3++7H2O

OH

3) 由於濃硫酸具腐蝕性，因此要避免讓皮膚直接接觸它。

由於有機化合物十分易燃，因此要避免將它們放在明火中。在加熱 / 回流時使用防漰沸小粒。

4) 目的： 去除殘留在提取物中的酸。

安全措施： 定時打開分液漏斗的活栓，容許漏斗中的CO2逃逸以減低壓強。

6) 摩爾數比：甲基環己醇：甲基環己酮 = 1：1 因此理論產量 = 5.7g?

112

=5.6g 114

留意：醇須為極限反應物 ( i.e. 摩爾數：醇 =

5.7102-

= 0.05；Cr2O7 = = 0.032；H+ = 114308

2?7.4?10-3?18 = 0.27 比 = 3：1.98：15.98 )

方法：混合熔點

7a) 2,4-二硝基苯肼 / HCl ( 肯定的結果：光亮的沉澱物 )

b) 對溫和氧化劑的否定測試。例：托倫斯試劑 (AgNO3/NH3 ) [Out-syl]

8a) 溶劑提取。由於醚 ( 乙氧基乙烷 ) 十分易燃，因此避免明火。 b) 稱量形成的產物。

[End Solution]

Suggested Answers

1 Explain the following terms:

a primary, secondary, and tertiary alcohols (lines 6-10); b heteroatom functional group (line 3); c two-phase (line 16). a b c 2

Primary alcohol: -OH group attaching to C-atom which 1 or 0 alkyl group already attached

Secondary alcohol: the C-atom has 2 alkyl groups already attached Tertiary alcohol: the C-atom has 3 alkyl groups already attached functional group with the attaching atom not being C nor H e.g. –SH water and ether are of different phases.

Write an ionic equation for the oxidation reaction of 2-methylcyclohexanol.

CH3OH

→

CH3O

+ 2 H+ + 2 e-

CH3

OR

CH3

+ Cr2O72- + 8 H+ →

3

+ 2Cr3+ + 7H2O

3 3 4 5 6

OH

O

What safety precautions would you take during the preparation of 2-methylcyclohexanone?

Avoid skin contact with conc sulphuric acid as it is corrosive Avoid naked flame as the organic compounds are inflammable. Use anti-bumping granules during heating/refluxing the solutions

Why is the product solution washed with aqueous sodium carbonate (lines 33)? What precaution would you take whilst carrying out this procedure, and why?

To remove acid residue in the extract.

Open the stopcock of the separating funnel regularly to release pressure/allow CO2 to escape.

Sketch and label the apparatus used

READ it up from books.

Calculate the theoretical yield of 2-methylcyclohexanone. How would you check the purity of your product?

Mole ratio of methylcyclohexanol : methylcyclohexanone = 1:1 So theoretical yield = 5.7 g * 112 / 114 = 5.6 g You should check the alchol is the limiting reagent

(i.e. no. of moles: alcohol=5.7/114=0.05; Cr2O72- =10/308=0.032; H+ =

2x7.4x10-3x18=0.27

Ratio = 3 : 1.98 : 15.98 )

Name the reagent and conditions you would use to show that

a it was a carbonyl compound, and b it was a ketone and not an aldehyde. a b 7 a

2,4-dinitrophenylhydrazine/HCl (positive result: bright ppt.) Negative test to mild O.A. e.g. Tollens’ reagent (AgNO3/NH3) Describe the technique you would use, mentioning any precautions,

to extract the lower aqueous layer with ethoxyethane; b to determine the yield of the final product.

a. Solvent extraction. Avoid naked flame as ether (ethoxyethane) is highly

inflammable.

b. Weigh the amount of product formed.

[END]

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