葡萄查耳酮合酶基因克隆及其进

范文一：葡萄查耳酮合酶基因克隆及其进化分析（可编辑）

葡萄查耳酮合酶基因克隆及其进化分析

中国科技论文在线////0>.

葡萄查耳酮合酶基因克隆及其进化分析1,2 1,2 1,2*

侯和胜 , 蔡建平 , 佟少明

(1. 辽宁省植物生物工程重点实验室;

5 2. 辽宁师范大学生命科学学院,大连 116029 )

摘要 : 利用 RT-PCR 技术从葡萄中克隆得到两个查耳酮合酶(CHS )的 cDNA 开放阅读框

(ORF ) 序列, 分别命名为 VvCHS1 和 VvCHS3 。其中,VvCHS1 序列长 1182bp, 编码 393

个氨基酸;VvCHS3 序列长 1170bp , 编码 389 个氨基酸。对两个 CHS 基因编码的氨基酸序

10 列分析表明二者均具有 CHS 基因家族的保守结构域。多序列比对和系统发生分析结果表明

两个 CHS 基因与其他高等植物 CHS 基因具有较高的相似性,然而 VvCHS1 和 VvCHS3 在

结构和功能上出现歧化。

关键词 :葡萄遗传 ;查耳酮合酶;基因克隆;进化分析

中图分类号 : 请查阅《中国图书馆分类法》

15Cloning and evolution analysis of chalcone synthase from

Vitis vinifera

1,2 1,2 1,2

Hou Hesheng , Cai Jianping , Tong Shaoming

1. The Key Laboratory of Plant Biotechnology of Liaoning Provence;

20 2. School of Life Science,Liaoning Normal University,Dalian 116029

Abstract: Two chalcone synthase genes were cloned by using RT - PCR method from Vitis

vinifera. The open reading frames ORF of two CHS cDNAs were named VvCHS1 and VvCHS3

respectively. The sequence of VvCHS1 is 1182 bp, coding 393 amino acids and the sequence of

VvCHS3 is 1170 bp , encoding 389 amino acids. The results of amino acid sequence analysis

25 showed that both CHS genes have a conservative domain structure of CHS gene family. Amino

acids sequence alignment of VvCHS1, VvCHS3 with some selected higher plant CHS genes

indicated that the VvCHS1 and VvCHS3 shared high sequence similarity with other plant CHSHowever, the VvCHS1 and VvCHS3 might divers from evolution and functionsKey words: Vitis vinifera genetics;chalcone synthase ; gene cloning; evolution analysis

300 引言

葡萄的产量大约可占全球水果产量的25% 。葡萄果实中含有极其丰富的营养物质, 因此

常常用于制成果汁、葡萄干和葡萄酒等。查尔酮合酶chalcone synthase ,CHS 是将苯丙烷

类代谢途径引向类黄酮合成的第一个关键酶 , 它催化3 分子的丙二酰辅酶A malonyl CoA

35 与1 分子的香豆酰CoAcoumaryl CoA生成4 ,5 ,7- 三羟基黄烷酮narigenin chalcone 。类

黄酮类物质是广泛存在于高等植物中的次生代谢物,包括黄酮、异黄酮、黄烷酮、查耳酮、

[1-4]

花色素苷、原花色素。研究表明 ,类黄酮作为植物体内一种重要的保护性物质 ,在植物

中具有重要的生理功能, 包括协调植物与微生物的关系、抵御病原菌侵害、参与豆科植物根

瘤菌形成、吸引昆虫和动物、促进花粉管生长、防止紫外线伤害、促进色素形成等等。在应

40 用方面, 类黄酮类物质具有软化血管、抗癌、清除体内自由基等生理功能, 已经成为植物次

[5-10]

生代谢物应用研究的热点。CHS 基因是一个较大的基因

家族 , 属于聚酮化合物合酶

(PKS ) 超家族的一个分支。CHS 的基因结构非常保守 , 除金鱼草的一个CHS 基因含有2 个

内含子外, 其余的都只有一个内含子。内含子的位置位于第65 位的半胱氨酸密码子内第一和

基金项目:教育部博士点基金(20092136110001 )

作者简介: 侯和胜 (1955-1 ) , 男, 教授, 主要研究方向: 植物生理与生物化学. E-mail: hesheng_hou@126

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二位碱基之间, 其长度从几十个碱基对到几千个碱基对不等。其编码区长约1.2kb , 外显子1

[11-12]

45 编码约57 ~64 个氨基酸, 外显子2 编码约340 个氨基酸。为探讨CHS 在葡萄次生代谢中的

调节和代谢途径转换作用, 采用RT-PCR 的方法, 克隆得到葡萄CHS 基因开放阅读框, 并对其

DNA 和氨基酸序列进行生物信息学分析,为加深理解葡萄CHS 基因功能奠定基础并提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

50 葡萄材料: 为本实验室种植的栽培种葡萄 (Vitis vinifera ) ; 克隆载体: 为 pMD19-T simple

vector 购于宝生物工程 (大连) 有限公司;E.coli DH5α : 为本实验室保存原菌;实验中

所用引物: 由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成; 反转录试剂盒: 购自上海 Invitrogen

公司; 胶回收试剂盒: 购自北京 TIANDZ 公司 ;DEPC : 购自生工生物工程 (上海) 股份有

限公司。

55 1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成根据其他物种中已报道的查耳酮合酶基因序列及葡萄基因组数据库

(////. ) 信息 , 进行 BLAST 比较 , 获得

2 个 VvCHS 基因完整开放阅读框序列 , 分别命名为 VvCHS1 和 VvCHS3 。利用 Primer

60 Premier5.0 软件设计引物,引物序列为:VvCHS1-F 5' TAGAAGCCAGTAAAGCAGG 3' ;

VvCHS1-R5' TCACCCAAGAATGACTACG3' ;VvCHS3-F 5' TACCACAAGCCTCATCCC

3' ;

VvCHS3-R 5' GCAATCTATTACACCATACCCT 3' , 由生工生物工程 ( 上海) 有限公司合成。

1.2.2 葡萄CHS 基因 cDNA 克隆葡萄叶片总 RNA 的提取采用改良的 SDS 方法进行操作,获得的 RNA 用 1% 琼脂糖凝胶电

65 泳检测。然后用上海 Invitrogen 公司反转录酶合成 cDNA,以反转录

的 cDNA 为模板用引物对

VvCHS1 、VvCHS3 进行扩增。VvCHS1 扩增程序为:94 ?预变性 5min ;94 ?变性 30s ,54 ?

退火 30s ,72 ?延伸 1min ,共 30 个循环;最后,72 ?延伸 10min 。VvCHS3 扩增程序为:

94 ?预变性 5min ;94 ?变性 30s ,47 ? 退火 30s ,72 ?延伸 1min,共 30 个循环; 最后,72 ?

延伸 10min 。按试剂盒操作指导回收凝胶电泳后与预期目的片段大小一致的泳带, 电泳检测

70 后连接克隆载体 (pMD19-T simple vector ) 并转化感受态细胞 (E.coli DH5α ) , 通过蓝白斑

筛选及菌液 PCR 鉴定阳性克隆后,送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.3 生物信息学分析

测序结果在GenBank 中进行Blast 分析, 利用在线软件ProtParam 、 SignalP server 、 TNHMM

server 、EXPASY 、SWISS ?Pbd 预测所编码蛋白的分子量、理论等电点、信号肽、跨膜结构

75 域、疏水性、二级结构及高级结构等。使用ClustalX 进行同源序列比对, 输出结果使用Mega4.0

软件进行Neighbor-joining 法Bootstrap 进化树校验。

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2 结果与分析

2.1 葡萄 RNA 提取及 CHS 基因全长 cDNA 的获得

提取得到的葡萄总 RNA 凝胶电泳结果见图 1 。从图 1 可以看出, 提取的总 RNA 完整无降

80 解,质量较高,可以满足后续实验的要求。

图1 葡萄叶片总RNA 1%琼脂糖凝胶电泳Fig.1 1% argaros gel electrophoresis of total RNA from V. vinifera

85图2 葡萄VvCHS1 和VvCHS3 基因扩增电泳图

M. DNA 标准分子量DL2000;1.VvCHS1;2.VvCHS3

Fig.2 Argaros gel electrophoresis of VvCHS1and Vvchs3 from V.

vinifera

M. DNA marker DL2000;1.VvCHS1;2.VvCHS3

90以葡萄叶片 cDNA 为模板, 用设计的葡萄 CHS 特异性引物进行 PCR 扩增 (图 2 ) , 得到

单一条带,且大小与预测的相符。将扩增得到的条带切胶回收后与 pMD-19T 连接,转化到

E.coli DH5α 感受态细胞中,分别进行菌液 PCR 检测和测序检测,检测结果证实克隆得到

VvCHS1 和 VvCHS3 的完整 ORF 序列,ORF 序列大小分别为 1182bp 和 1170bp 。95 2.2 VvCHS 基因蛋白质一级结构及疏水性分析

利用在线网站(////. )对得到的 2 个 VvCHS 的核

酸和氨基酸序列进行理化性质分析。结果见表 1 。

表1 VvCHS1 和VvCHS3 核酸和氨基酸序列组成及其理化性质

Tab.1 Composition and physical and chemical characteristics of

nucleic acid and amino acid sequences of

100 VvCHS1 and VvCHS1

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ORF

名称终止密码子编码分子量/kDa 理论不稳定

核苷酸数/bp

氨基酸数等电点系数

VvCHS1 1182 TGA 393 42.8 5.98 36.77

VvCHS3 1170 TGA 389 42.6 6.1837.58

利用 SignalP 和 TMHMM server 在线程序分别对 2 个 VvCHS 蛋白进行信号肽和跨膜结

构域预测。预测结果显示,该蛋白中不存在信号肽序列图 3 和跨膜结构域(图 4 )。这表

明 VvCHS 蛋白不是分泌蛋白,它在细胞中合成, 直接在细胞内发挥作用,而不分泌到细胞

105 外。

图3 VvCHS1 和VvCHS3 蛋白的信号肽预测结果

Fig.3-1 The signal peptide prediction of VvCHS1 and VvCHS3 proteins

1.VvCHS1; 2. VvCHS3

110

图4 VvCHS1 和 VvCHS3 蛋白跨膜结构域的预测

Fig.4-1 The transmembrane domain prediction of VvCHS1and VvCHS3

proteins

1.VvCHS1; 2. VvCHS3

115利用 ExPASy Protscale tool 预测 VvCHS1 与 VvCHS3 蛋白质的疏水性 , 采用

Kyte-Doolittle 算法。正值的氨基酸具有更大的疏水性 ; 负值的氨基酸则更加亲水。如图 5

可知,两蛋白疏水区与亲水区交替存在。

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120 图 5 VvCHS1 和 VvCHS3 蛋白的疏水性分析

Fig.5 The hydrophobicity analysis of VvCHS1 and VvCHS3 proteins

1.VvCHS1; 2. VvCHS3

2.3 VvCHS1 和 VvCHS3 蛋白二级结构的分析分析结果表明, 葡萄 VvCHS1 和 VvCHS3 蛋白二级结构以 α- 螺旋为主, 其次是无规卷曲,

125 延伸链占的比例较小, 无 β- 转角区域。蛋白质的功能很大程度上取决于其空间结构, 其中 α-

螺旋主要功能是对蛋白质骨架起到稳定作用, 而无规卷曲结构决定了蛋白质的功能, 特别是

酶的功能部位常常处于这种构象区域。

表2 VvCHS1 和 VvCHS3 蛋白二级结构分析

Tab.2 The analysis of secondary structure of VvCHS1 and VvCHS3

proteinsα helix extended strand β turn random coil

VvCHS1

43.76% 21.63% 0% 34.61%

VvCHS3

42.42% 21.59% 0% 35.99%

1302.4 VvCHS1 和 VvCHS3 蛋白三级结构预测

将VvCHS1 与VvCHS3 蛋白的氨基酸序列提交到 SWISS-MODEL , 得到两蛋白的高级结构预

测结果 (图 6)。从图中可以看出, 二者的高级结构主要以 α- 螺旋为主 , 并占有较大比例 ,

其次为无规卷曲,而延伸链所占比例很小,这与二级结构所预测结果相符。

135图6 VvCHS1 和VvCHS3 的三级结构

Fig.6 The tertiary structure of VvCHS1and VvCHS3

1.VvCHS1; 2. VvCHS3

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2.5 植物 CHS 基因系统发生及其进化分析在 NCBI database 和 TIGR functional genome database 等数据库中利用 BLAST 搜索得

到 CHS 家族中目前已报道的 cDNA 全长核苷酸序列,推导出其编码的氨基酸序列共 20 条。

并整合为 Fasta 格式。根据氨基酸序列做进化树分析 (图 7 ) 。结果表明,20 个来源于不同

145 植物的 CHS 聚类到三个大组中, 第一组最大, 包括 14 个蛋白 ; 第

二组次之, 包括 4 个蛋白 ;

第三组只有两个蛋白。其中,第一组的 14 个蛋白又分为至少 3 个亚组 :5 个葡萄 VvCHSs

除 VvCHS3 外,其余 4 个形成第一亚组;豇豆和豌豆形成第二亚组;番茄、矮牵牛、蓝莓

和葡萄 VvCHS3 形成第三亚组。本文报道的 VvCHS1 和 VvCHS3 分属不同的两个亚组,表

明植物 CHS 基因在植物的进化过程中发生了歧化, 形成了该基因在构成和功能上的多样性。

150 与 VvCHS3 同组的番茄、蓝莓和矮牵牛都是富含花青素的植物,说明 VvCHS3 与花青素合

成密切相关。而 VvCHS1 及其与其聚类在同一亚组的其他三个 VvCHSs 与相思树和非洲菊

亲缘关系更近,其催化形成的查尔酮主要转化形成哪一种次生代谢物还需要进一步的研究。葡萄VvCHS4

1000

葡萄VvCHS5

1000

葡萄VvCHS1

葡萄VvCHS2

224

相思树AcCHS 非洲菊GtCHS 260

拟南芥AtCHS 187

豇豆CpCHS 1000

豌豆PsCHS 198

番茄SlCHS 772

710

矮牵牛PeCHS 770

423

矮牵牛MgCHS 葡萄VvCHS3 493

蓝莓BlCHS 龙眼DlCHS 997

563

荔枝LcCHS

甜橙CsCHS

144

可可树TcCHS

土沉香AsCHS

276

白杨树PaCHS

155图 7 葡萄CHS 与其他高等植物CHS 氨基酸序列的系统发生分析 Fig7 Phylogenetic comparison of deduced amino acid sequences of select

CHS-like genes from higher plants3 结论

采用RT-PCR 技术从葡萄中克隆得到两个查耳酮合酶 (CHS)的cDNA 开放阅读框 (ORF)序

160 列VvCHS1 、VvCHS3 。其中 ,VvCHS1 序列长1182bp ,编码393 个氨基酸;VvCHS3 序列长

1170bp , 编码389 个氨基酸。对两个CHS 基因编码的氨基酸序列分析表明均具有CHS 基因家

族的特征多肽序列:RLMMYGCFAGGTVLR 。系统发生分析结果表明两个CHS 基因编码

的氨基酸分属于第一大组的不同亚组, 在进化中产生了歧化, 形成了植物CHS 的多样性。本

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范文二：COD的测定方法

COD 的测定方法

重铬酸钾法

定义

COD 也称作化学需氧量,是指在一定条件下,经重铬酸钾氧化处理时, 水中的溶解性物质和悬浮物质所消耗的重铬酸钾相对应的氧的质量浓度。

原理

在水样中加入已知量的重铬酸钾溶液, 并在强酸介质下以银盐作催化剂,经沸腾回流后,以试亚铁灵作指示剂,用硫酸亚铁铵滴定水样中未被还原的重铬酸钾, 由消耗的硫酸亚铁铵的量换算成消耗氧的质量浓度。

在酸性重铬酸钾条件下, 芳烃及吡啶难以被氧化, 其氧化率极低; 在硫酸银的催化作用下,直链脂肪族化合物可有效地被氧化。

应用范围

此方法适用于各种类型含 COD 值大于 30mg/L的水样,未经稀释的水样的测定上限为 700mg/L。

此方法不适合氯离子大于 1000mg/L(稀释后)的含盐废水测定步骤

1、取 20ml 或适量试样加水稀释至 20mL (根据污染物或氯离子浓度确定) 。

2、向锥形瓶中加入硫酸汞 (除去氯离子对 COD 的干扰, 原理是:经加热回流后硫酸汞可与氯离子结合成可溶性的氯汞络合物。 )

3、向试料中加入 10mL 重铬酸钾和沸石,连通冷凝管,并从冷凝管上端缓慢加入 30mL 硫酸汞 -硫酸试剂(以防止低沸点的有机物的逸出)不断旋动锥形瓶使之混合均匀。加热,溶解沸腾后回流 2小时。冷却后用 20-30mL 水自冷凝管上端冲洗冷凝管后,取下锥形瓶,再用水稀释至 140mL 左右。

4、冷却至室温后,加入 3滴 1,10—菲啰啉指示剂,用硫酸亚铁铵滴定。溶液颜色由黄色经蓝绿色变为红褐色即为终点。记录下硫酸亚铁铵所消耗的体积。

5、同时作空白实验(全部用蒸馏水代替水样)

计算方法

CODcr (mg/L)=(V1-V2) *8000/V0

V1——水样消耗的硫酸亚铁铵的体积:mL

V2——空白实验所消耗的硫酸亚铁铵的体积:mL

C ——硫酸亚铁铵的浓度:mg/L

8000—— 1/4O2的摩尔质量,以 mg/L为单位的换算值

范文三：硼测定方法

职业与健康

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