范文一：微生物菌肥有哪些使用方法？

目前，微生物菌肥凭其独特的优势备受人们关注，已有越来越多的农民在使用微生物菌肥。微生物菌肥不但能改良土壤结构、消除土壤板结、培肥地力，还具有增强抗逆，改善作物品质等功效，不管是经济作物，还是大田作物、果树蔬菜、苗木花卉、药材等都能用菌肥，使用方法很广泛。具体有以下几种：

1、拌肥：1～2公斤菌肥与化肥、复合肥、有机肥或腐熟农家肥混匀后作底肥、追肥，可撒施、沟施或穴施。

2、拌种：用适量水将玉米、大豆、花生等大粒种子淋湿，每亩种子用菌肥0.5～1公斤(压碎)拌匀，阴干或风干后播种。

3、沾根灌根：每亩用菌肥1～2公斤，压碎并兑水5～8倍，沾根或兑水200-400倍直接灌于根部。注意沾根时勿将附着在根系上的泥土洗掉。

4、喷施：将金宝贝菌肥溶于适量水中，取其上清液，过滤，充分兑水喷施即可，滤渣可再施于植物根部。

5、冲施：每亩用菌肥1～2公斤与化肥混合，用适量水稀释后，随水冲施。

6、混苗床土：每平方米苗床用金宝贝菌肥(压碎)300-500克，与苗床土混匀后播种。

7、单施：已施过化肥、腐熟有机肥的土壤，可再单独用菌肥2公斤左右，沟施、穴施、灌根或冲施。

8、花卉施肥：每公斤盆土可用本品10～15克作追肥或底肥。

9、果树施肥：每亩用2～4公斤与其他肥料混匀，穴施、环状沟施或放射状沟施均可。

范文二：土壤微生物的调查方法有哪些

篇一:土壤微生物多样性研究方法

应用生态学报 2004 年 5 月

第 15 卷 第 5 期

CHIN ESE J OU RNAL O F A PPL IED ECOL O

GY ,May 2004 ,15 (5) ?899,904

土壤微生物多样性研究方法

3

钟文辉蔡祖聪 1

1 ,2 3 3

1

( 中国科学院南京土壤研究所 ,南京 210008 ; 南京师范大学化学与环境科学学院 ,南京 210097)

2

【摘要】 概述了研究土壤微生物多样性的主要方法. 传统上 ,土壤微生物群落的分析依赖于培养技术 ,使 用各种培养基最大限度地培养各种微生物群体 ,但仍只能培养和分

1

离出一小部分土壤微生物群落. 使用 Biolog 分析、磷脂脂

肪酸分析和核酸分析等方法 ,可研究和表征那些现在还不能

够被培养的土壤微生物 , 从而获取关于土壤微生物群落多

样性的更多和更完整的信息.

关键词 土壤 微生物多样性 Biolog 磷脂脂肪酸 核酸

分析

文章编号 1001 - 9332 (2004) 05 - 0899 - 06 中图分类号

S15413 文献标识码 A

Methods f or studying soil microbial diversity. ZHON G Wenhui

2

1 ,2

,CA I Zucong ( I nstit ute of S oil S cience , Chi2

11

nese A cadem y of S cience , N anji ng 210008 , Chi na ; College of Chem ist ry an d En v i ron ment al S cience , N anji ng N or m al U ni versity , N anji ng 210097 , Chi na) . 2Chi n . J . A ppl . Ecol . ,2004 ,15 (5) :899,904 .

This paper gave a review on t he main met hods for st udying soil microbial diversity. Traditionally ,t he analysis of soil microbial communities relied on cult uring techniques ,using a variety of cult ure media. However ,only

2

a small f raction of t he soil microbial community has been cult ured and isolated wit h t his app roach. Ot her met hods such as Biolog GN analysis ,p hosp holipids fat ty acids analysis and nucleic acid2based analysis can be used to st udy and characterize soil microbes which currently cannot be cult ured ,and to get more and complete information about soil microbial community.

Key words Soil , Microbial diversity , Biolog , FL FA , Nucleic acid2based analysis.

1 引言

生物多样性包括物种多样性、遗传(基因) 多样性和生态

系统多样性. 土壤微生物多样性包括在栖息地中微生物分类

群的多样性和在微生物分类群内的遗传多样性 ,以及包

括群

落结构的变异性、相互作用的复杂性、营养水平( t ropic

level)

和共位群(guild) 数量(功能多样性) 在内的生态多样性.

其中

遗传多样性可认为是遗传信息在微生物聚集地或群落中

的

量和分布 ,反映微生物群落中总的遗传潜力. 功能多样性

则 [ 33 ]是指发生在一个群落中的碳源利用模式或作用过

3

程数 .

土壤微生物多样性的研究方法大体上可分为两类 :一类 是用于分析土壤中可培养的微生物群落 ;另一类是用于分析

土壤的整个微生物群落. 第一类分析方法基于微生物分离菌

(isolates) 的形态判别、微生物分离菌在 Biolog GN 微滴定板 中的反应和微生物分离菌的脂肪酸甲酯谱( FAM E p rofiles)

等. 后一类分析方法不需要培养微生物 ,包括群落水平的生

理特性(CL PP) 分析 (如在 Biolog GN 微滴定板中的反应分

析) 、磷脂脂肪酸(p hosp holipid fat ty acids , PL FA) 方法和核酸 分析( nucleic acid2based analysis) 方法等.

2 琼脂培养基培养方法

板上将菌落分离出来 ,并对分离菌进行鉴定. 由所得到的分

类组或分类群的分布情况可了解群落的结构.

,故培养基的选择

培养基的成份影响微生物的生长状况

[ 34 ,64 ]

可强烈影响所得菌落的多样性 . 菌落形成单位 ( CFU)

4

[ 40 ,49 ]的数量通常随培养基营养浓度的降低而增加 . 然而 ,只 [ 16 ] 有一小部分土壤微生物群落可用这种方法得到. F ? gri 等

用荧光显微镜检术检出的细菌数比用培养基培养得到的细 [ 3 ]

菌数提高 100,1000 倍. 根据 Amann 等 的评估 ,大约 80 %

,99 %的微生物种不可培养或未能得到培养 ,说明大部分微

生物的特征不能用传统的琼脂培养基平板培养技术来描述.

此外 ,琼脂培养基培养方法需要使用包括分子生物学手段在

内的分析技术 ,才能完成对微生物种的鉴定 ,分析工作烦琐 ,

工作量大. 由于以上局限性 ,在出现新的评价微生物多样性

的方法 ,特别是分子方法以后 ,该传统方法已逐渐失宠.

平板上的微生物群落的组成. 在后一种情况下 ,需从琼脂平

3 Biolog GN 方法

Biolog GN 分析方法是一种群落水平的生理特性分析方

5

法. 它是基于微生物利用碳源能力的不同 , 利用 Biolog GN

系统来研究微生物的碳源利用模式的方法. Biolog GN 微滴

国家杰出青年基金资助项目(40125004) . 3 3 通讯联系人. 2002 - 02 - 20 收稿 ,2003 - 07 - 15 接受 .

定板的每一个孔中含有一种不同的碳源(共 95 种) 、其它营

这是用于估计微生物多样性的传统方法. 琼脂培养基培 养方法是在琼脂培养基平板上接种培养 ,可作以下用途 : 跟 踪特定分类组( group) 或功能组的微生物数量 ,并评价在该

3

900 应 用 生 态 学 报15 卷

养物和四氮唑染料. 接种微生物悬浮物于微滴定板孔中后 ,

落结构. 总 PL FA 谱中某些特征脂肪酸分别对细菌、真菌和

放线菌是特异的

[ 74 ]

学特异性 ,是特别有效的生物标记物 ,可用于了解微生物群

6

将滴定板保温一段合适的时间 ,通过测定伴随的四氮唑染料

的还原 ,而定期监测底物的氧化. Biolog GN 微滴定板原来用 [ 6 ]

作对细菌分离菌进行分类利用模式等功能多样性

. 然而 ,这种方法现已被改进 ,用 . Biolog GN 分析方法当作此用途

,且在大多数情况下 PL FA 的某专一类

于表征土壤微生物群落的功能潜力 ,即被用于估计诸如碳源 [ 21 ]

时 ,接种物是来自土壤微生物群落的混合物 ( 而不是纯培 养) ,所得结果采用一定的统计方法进行分析.

采用该方法时接种量

和培养时间很重要. 研究表明 ,底

[ 20 ,23 ,77 ]

型在某一土壤微生物分类群中占优势. 至今 ,已经积累了大 量关于微生物脂类的脂肪酸组成的数据. PL FA 或酯链

PL FA ( EL2PL FA) 的总量已被用作土壤样品中微生物生物量

[ 80 ]

的指示物(indicator) . 细菌含有在其它生物中常见的直链 脂

7

肪酸 ,如油酸或顺型异油酸[ 十八碳2112稀酸(顺) ,简写为 18?1ω7 或 18?1ω7c ]等单不饱和脂肪酸( MU FA) .

然而 ,细菌

[ 38 ]

物的氧化取决于所用接种物的组成和密度

接种的微生物的生理状态可能影响底物利用的动力学和模 [ 35 ]式 . 在测定过程中 ,微生物只在含有适合其利用碳源的孔 [ 21 ,23 ,77 ]

中生长

. 另外 ,被

独特的脂肪酸是具分枝链、环丙基和β2羟基脂肪酸. 这些脂

. 因此 ,所观察到的底物利用模式可能只反映

了那些在 Biolog GN 微滴定板孔中能够生长的微生物的功

贡献

. 所得到的碳源利用模式也不一定反映接种的微

[ 62 ]

能特性 ,且很可能不是所有的微生物都对 Biolog 反应特征有 [ 23 ,28 ]

生物群落中数量上占优势的成员的功能潜力

.

8

该方法已用于了解土壤

[ 23 ,41 ,77 ]

. 支链脂肪酸主要发现 肪酸在其它生物体中不普遍存在

于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性的硫酸盐还原菌、Cytop haga

[ 24 ]

,而环丙基脂肪酸常见于革兰氏阴性菌株以 和黄杆菌属

[ 57 ]

2 去饱和酶途径的真细菌特征 ,很多这种细菌是革兰氏阴性

菌

[ 79 ]

及革兰氏阳性厌氧菌株 . MU FA 特别是 18?1ω7 具有厌氧

. 虽然 MU FA 可出现在革兰氏阳性和阴性细菌中 ,但

和根际

[ 20 ]

在革兰氏阳性细菌中它们对总 PL FA 的相对贡献很少 ( <

20 %) ,故 MU FA 可用作革兰氏阴性细菌的通用生物标 记

[ 57 ]

9

中微生物群

落间的差异 ,也有的研究者用它确定非土著微生物或转基因

植物对土壤[ 13 ,75 ] 、植物凋落物[ 32 ,52 ] 、根际[ 28 ] 和叶际[ 28 ] 微生

. 多不饱和脂肪酸( PU FA) 被认为是真核生物的特征性 脂

[ 66 ]

肪酸. 亚油酸 (十八碳29 , 122二稀酸 (顺 , 顺) , 简写为 18 ?

物群落的影响.

对快速生长和适合在实验条件下生长的小部分群落成员有

强烈的选择性

[ 62 ]

Biolog GN 方法具有快速而可再现的特点. 然而 ,该方法

2ω6) 可作为真菌的一个通用生物标记. 但 Sundh 等 推断 ,

这种脂肪酸可能不是对每一生态系统都合适的生物标记 ,可 能只在植物细胞不存在的生态系统中是真菌的较好标记.

非酯链未取代脂肪酸 ( non2ester2linked unsubstantiated

FA ,N

10

[ 60 ]

,故与从琼脂平板分离微生物的传统方法

有同样的局限性 ;另一缺点是被测试的底物不能准确地代表 出现于生态系统中的底物类型. 因此 ,Biolog 反应特征只能 粗略地代表实际土壤微生物群体底物利用的动力学特征.

4 磷脂脂肪酸方法

EL2U N SFA) 是鞘脂和缩醛磷脂的组分. 鞘脂已发现存

在于拟杆菌属/ 黄杆菌属

. 近来也发现革兰氏阴性多聚氯

[ 46 ]

酚降解细菌(被鉴定为 Sp hingomonas 属) 含有鞘脂 . 缩醛 磷脂主要存在于梭状芽孢杆菌属等厌氧细菌中

[ 79 ]

[ 74 ]

,只有很

411 PL FA 在微生物中的分布

少数的好氧和兼性厌氧细菌含有缩醛磷脂

[ 75 ]

. 真菌菌丝中 已

被检测出存在长链非酯链羟基取代脂肪酸 ( non2ester2

linked hydroxyl substit uted FA , N EL2H YFA)

11

. 在脂肪酸第

[ 37 ]

磷脂脂肪酸谱( PL FA p rofile) 常被用于研究复杂群落中

[ 54 ,79 ]

微生物的多样性 . 磷脂是所有生活细胞的细胞膜的基

[ 29 , 32]

10 位碳原子处甲基分枝是放线菌所特有的

微生物的重要脂肪酸见表 1 .

. 表征几大类

本组分. PL FA 是磷脂的组分 ,具有结构多样性和高的生物

表 1 表征微生物的 PL FA微生物类型 Microbial group 细菌Bacteria in general

Table 1 PL FA signatures of microbes

磷脂脂肪酸标记 Phosp holipids fatty acid signat ures

2

22

革兰氏阴性细菌 Gram negative bacteria 厌氧细菌 Anaerobes

好氧细菌 Aerobes

硫酸盐还原细菌 Sulfate reducing bacteria

2

12

甲烷氧化细菌 Met hane oxidizing bacteria 嗜压/ 嗜冷

细菌Barop hilic/ p sychrop hilic bacteria

含有以酯链与甘油相连的饱和或单不饱和脂肪酸( 如

15 ?0 、i15?0 、a15?0 、16 ?0 、i16 ?0 、16 ? 1ω5 、

16?1ω9 、16?1ω7t 、17?0 、i17?0 、a17?0 、cy17?

0 、18?1ω5 、18?1ω7 、18?1ω7t 、i19?0 ,a19?0 和

cy19?0 等) Contain sat urated or monounsat urated fatty

acids ester linked to glycerol

含有多种分枝脂肪酸 Contain more branched fatty acids

含有多种羟基脂肪酸 Contain more hydroxylated fatty acids ; MU FA

cy17?0 ,cy19?0

16?1ω7 、16?1ω7t 、18?1ω7t

10Me16?0 、i17?1ω7 、17?1ω6

16?1ω8c ,16?1ω8t ,16?1ω5c ,18?1ω8c ,18?

1ω8t ,18?1ω6c

2

黄杆菌 Fl av bacteri u m bal ust i n u m

芽孢杆菌 B aci l l us spp 1 放线菌 A ct i nobacteri a

真菌 Fungi

蓝细菌 Cyanobacteria 微藻类 Microalgae

原生动物 Protozoa

13

20?5 ,22?6

i17?1ω7 ,Br 2O H 15?0

各种枝链脂肪酸 Various branched chain fatty acids

10Me16?0 、10Me17?0 、10Me18?0 等

含有特有的磷脂脂肪酸如 18?1ω9 、18?2ω6 、18?3ω6 、18?3ω3 Contain a specific PL FA such as

18?1ω9 、18?2ω6 、18?3ω6 、18?3ω3

含有多不饱和脂肪酸如 18?2ω6 Lipids containing

polyunsat urated fatty acids such as 18?2ω6

16?3ω3

20?3ω6 、20?4ω6

i 、a 、cy 和 Me 分别表示反异(anteiso) 、异(iso) 、环丙基(cyclop ropyl) 和甲基( met hyl) 分枝脂肪酸

2

5 期 钟文辉等:土壤微生物多样性研究方法

901

412 PL FA 的分离和分析

413 PL FA 方法的特点和局限性

PL FA 方法是一种快速、可靠而可重现的分析土壤微生

的提取主要采用简单提取、扩展提取和商用微生物鉴定系统

( M ID I) 提取等方法

14

[ 79 ]

PL FA 的提取和分析是 PL FA 方法的关键步骤. PL FA

物群落结构的方法 ,可用于表征在数量上占优势的土壤微生

.

物群落 ,包括不可培养微生物. 该方法最适合用作总微生物

简单提取用于提取 EL2PL FA. 先用有机溶剂提取土壤 中

的细胞脂类 ,将提取液上样于硅酸键合固相抽提柱( solid2 p hase2ext raction silicic acid bonded p hase column ,

SP E2SI) ,分 别用氯仿、丙酮和甲醇洗脱 ,可将脂类裂解 ,并分离出中性

脂、糖脂和磷脂. 用温和碱性甲醇将磷脂水解和皂化 ,得到酯 链脂肪酸甲酯( EL2FAM E) ,进一步用 GC 或 GC2MS 进行定 性和定量测定. 这种提取方法不能将非酯链 PL FA ( N EL2

PL FA) 从脂类中解离和提取出来.

扩展提取方法是在简单提取方法的基础上延伸的 ,可用 于

提取包括 EL2PL FA 和 N EL2PL FA 在内的全 PL FA. 用与 简单提取方法相同的操作方法从土壤样品中抽提脂

15

类 ,将磷

脂从脂类中解离出来 ,用碱性甲醇水解和皂化 ,接着用氨丙 基键合 , SP E 柱 (aminop ropyl2bonded SP

E2column , SP E2N H2 ) 分离皂化产物 ,得到未取代脂肪酸甲酯. 酯链羟基取代脂肪 酸( EL2H YFA) 甲酯和不皂化脂. 未取代脂肪酸甲酯用苯磺 酸键

合. SP E 柱 ( benzenesulp honic2acid2bonded SP E

column , SP E2SCX) 分离 ,得到酯链饱和脂肪酸 ( EL2SA TFA) 、酯链单 不

饱和脂肪酸( EL2MU FA) 和酯链多不饱和脂肪酸( EL2PU2

FA) 组分. 不皂化脂经酸水解后 ,用 SP E2N H2 柱分离 ,可得到

非脂链脂肪酸 (包括 N EL2U N SFA 和 N EL2H YFA) . 得到的 EL2PL FA 和 N EL2PL FA 进一步用 GC 或 GC2MS 进行定性

和定量分析. 采用这种方法可使多数类型的脂肪酸根据它们 结合成脂类的本来状况(酯链 ,非酯链) 而得到分离. 检测结 果用多变量统计方法加以分析.

除上述方法外 ,有些研究者还用 M ID I 来提取和分析脂

[ 9 ,24 ,30 ]

16

肪酸

类中裂解出来 ,在 80 ?下加入甲醇盐酸溶液 ,使脂肪酸甲基

化形成 FAM E ,提取 FAM E ,进行 GC 分析等几个步骤

[ 24 ]

. 其操作方法包括用皂化/ 裂解液将脂肪酸从脂

. 最

后 ,用 M ID I 开发商提供的自动程序软件对 FAM E 进行分 析. 该方法的主要问题是提取的脂肪酸包括来自有生活力的 细胞脂类和可能部分来自于细胞外的脂类

[ 79 ]

.

用简单提取方法和 M ID I 方法提取土壤 PL FA 得到的

[ 9 ,19 ]

脂肪酸谱相似 ,一般有 20 至 48 种脂肪酸(最多 72 种) ,

其中直链脂肪酸和不饱和脂肪酸分别占 15 %,25 %和 30 % ,50 % ;甲基分枝脂肪酸占 25 %,40 %. 采用扩展提取方法 检测到的 PL FA 的数量介于 190 至 360 种之间 ,且显示出不

17

同地点、不同耕种方式的土壤中脂肪酸的总量和种类数以及 百分比分布有显著差异

[ 65 ,81 ]

. N EL2PL FA 占总 PL FA 量的

21 %,25 % , EL2SA TFA 和羟基取代脂肪酸(包括 EL2H YFA

和 N EL2H YFA) 也大量存在.

18

范文三：医学微生物菌种长期保存方法探讨

CHINA TROPICAL MEDICINE Vol. 9 No.7 July 2009 中国热带医学 2009 年第 9 卷第 7 期 1358

,检验医学,

医学微生物菌种长期保存方法探讨

李文广

摘要:目的 为探讨一种能长期保存菌种的理想方法，以便更好地为科研、教学提供标准菌株。 方法 将需保存

的菌株纯化后，用保护剂鲜牛奶制成常用菌悬液、高浓菌悬液，分别分装菌种管中置-70?超低温快速预冻过夜，冷冻干

67 1010 燥机真空干燥封口，-30?保存。 结果 浓度为 10~10个/ml 和 5~10个/ml 的菌液经 15 年保存后菌株的存活率分

别为 92.3%和 100%，经 20 年保存后菌株的存活率分别为 61.53%，98.46%。 结论 鲜牛奶高浓菌悬液冷冻真空干燥

可长期保存各种微生物菌种。

关键词:菌种;长期保存;高浓菌悬液;超低预冻;真空干燥 中图分类号:

R37 文献标识码:B 文章编号:1009-9727(2009)7-1358-02

An improved method for long -term preservation of medical bacterial strains. LI Wen -guang.(Laboratory

Department of Hainan Medical College，Haikou 571101，Hainan，P. R.China)

Abstract: Objective To explore for long -term preservation of medical bacterial strains. Methods The purified

medical bacterial strains were highly purified and put into bacterial tubes after preparation of supernatant with fresh milk，

then stored at ultra-low temperature of -70? overnight，finally sealed with freeze-drying vacuum for preservation at-30?.

Results The survival rate of bacteria preserved for 15 years at concentrations of 106~107/ml and 510~1010/ml were 92.3%

and 100% ，and that presercved for 20 years were 61.53% and 98.46%. Conclusion Bacterial strains can be preserved

with fresh milk-mediated high concentration and vacuum freeze-drying method .

Key words: Bacteria; Long-term preservation; High concentrationi; Frozen under ultralow temperature; Vacuum drying

菌种保存对于微生物学的教学和研究是一项重要的基础 洗，肥皂水煮沸，自来水冲洗，再用蒸馏水浸泡过夜，以达中性，工作。因每一类型微生物都具有不同的特性，而在教学和研究 然后管口塞上脱脂棉，121.3?30min 高压蒸汽灭菌，干燥备用 。中必须使用微生物菌种重复实验结果。要使菌种长期保存，且 1.1.4 真空冷冻干燥机、真空泵。

1.2 方法 将需保存菌种分批分别接种在各自生长良好的平 其生物学性状和遗传性质不变，必须选择适宜的培养基和更好

更稳定的保存方法，我们以往只采用传代保存法和悬液保存 板上，经 37?18h 培养分纯鉴定，后将各菌种分别接种到适宜

法，经数年应用，发现不但耗材耗时，而且有些菌种经数月或数 年的斜面培养基上经 37?26~28h 培养，在各斜面管内分别加入

传代保存后再不能存活及保持其生物特性。为能长期保存菌 种，已准备好的保护剂牛奶1.0~1.5ml/ 支，洗下菌苔，各菌种分别配

67 1010 自 1988 年开始应用常用菌悬液和高浓菌悬液真空冷冻干 燥制成 10~10个/ml 和 5~10个/ml，两种浓度菌悬液，然后用 法对菌种进行保存及观察研究，现将研究结果报告如下。无菌长颈毛细吸管吸取菌悬液滴入菌种管球部，每管分装 1 材料与方法 0.2ml，向管颈部塞入无菌脱脂棉，以不紧为宜，同时配制 1 支 1.1 材料 1%氯化钴牛奶溶液干燥指示管，均置-70?下快速冷冻过夜，次 1.1.1 菌种 伤寒沙门菌(H50097)、福氏志贺菌(51571)、日取出迅速放入已预冷的冷冻干燥机中进行一级真空抽干，待痢疾 志贺菌?型 (51570)、大肠埃希菌 (44110)、普通变形杆菌 指示管出现由粉红色变全兰色时，再进行二级抽干 12h，然后在 (49102)、铜绿假单胞菌(10102)、金黄色葡萄球菌(26001)、乙 真空条件下熔封菌种管，随机抽样检查菌种真空度，合格者 型溶血性链球菌(32210)、白喉棒状杆菌(38007)、肺炎链球菌 置-30?作长期保存。

(31001)、脑膜炎奈瑟菌(29018)、淋病奈瑟菌(29106)、白假丝 从第 2 年起我们每年对所有保存菌种分别取 1 支复苏，观

察两种方法的存活数及存活率，同时对各复苏菌株作主要的生 酵母菌 (10231)。 以上菌种中除 1 株真菌购自中国科学院微

物学性状观察。 生物研究所外，其它菌种均购自中国药品生物制品检定所。

1.1.2 保护剂牛奶的准备 取新鲜原牛奶煮沸，离心后吸取下 2 结果

常用菌悬液和高浓菌悬液保存 10~20 年后各菌种的存活 层奶液，经脱脂棉过滤，如此反复 3 次脱去脂肪，115.6?10min

数量及存活率(见表 1)。 高压蒸汽灭菌后，4?冰箱保存备用。

1.1.3 菌种管的处理 先经清洁液浸泡 12h 以上，自来水冲

* 作者单位:海南医学院医学检验系 ，海口海南 571101

中国热带医学 2009 年第 9 卷第 7 期 CHINA TROPICAL MEDICINE Vol. 9 No.7 July 2009 1359

表 1 常用菌悬液和高浓菌悬液保存各种菌的存活情况

~ O m 1 l/ O ~ lO m 1 5 l/ ? ?O ?5 6??O ?lO ll?l5 ? 6??O ll?lll?l?l?l? ? ? fl C% 3 fl C% 3fl C% 3 fl C% 3fl C% 3 fl C%

fi fi? lOClOO.O3 5ClOO.O3 4C8O.O3 ?O lOClOO.O3 5ClOO.O3 5ClOO.O3 ?O

?* ? ?O lOClOO.O3 5ClOO.O3 !C6O.O3 ?O lOClOO.O3 5ClOO.O3 5ClOO.O3

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ABCD.? ?O lOClOO.O3 5ClOO.O3 ?C4O.O3 ?O lOClOO.O3 5ClOO.O3 5ClOO.O3

EF@GH? ?O ICIO.O3 !C6O.O3 lC?O.O3 ?O lOClOO.O3 5ClOO.O3 4C8O.O3

JKGH? ?O lOClOO.O3 4C8O.O3 ?C4O.O3 ?O lOClOO.O3 5ClOO.O3 5ClOO.O3

A1LMN? ?O lOClOO.O3 5ClOO.O3 5ClOO.O3 ?O lOClOO.O3 5ClOO.O3 5ClOO.O3

OP ?6O l?ICII.?3 6OCI?.!3 4OC6l.53 ?6O l!OClOO.O3 65ClOO.O3Q 64CI8.53Q 注:* 两种浓度菌种待存 20 年后有明显差异。 67 从表 1 可见常用菌悬液 10~10个/ml 浓度保存的菌种保 存物的含水量。经 20 年来我们对所保存的菌种作复苏观察其

67 存到 10 年脑膜炎奈瑟菌复苏出现 1 株未存活，保存到 15 年淋 存活数及存活率，结果在同条件下保存的 10~10个/ml 低菌悬

病奈瑟菌、铜绿假单胞菌又出现未存活株，保存 20 年仅有白假 液菌种，保存 10 年后就出现了未复活株，20 年后对于营养要求 10丝酵母菌 100%存活，其余均出现未存活株。高浓菌悬液 5~ 高，生长条件特殊的脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌、 乙10 10个/ml 浓度菌种保存到 15 年所有菌种 100%存活，保存 20 型溶血性链球菌、白喉棒状杆菌等其存活数及存活率明显性 降低，

年仅有脑膜炎奈瑟菌出现未存活株。 1010 5~10肠道杆菌福氏志贺菌、伤寒沙门菌等也有未复活株。而 3 讨论 个/ml 高浓菌悬液保存菌种，保存 15 年后还全部存活，

目前菌种保存方法众多，有四大类:传代法、干燥法、冷冻 20 年后所有复苏株仅有 1 株脑膜炎奈瑟菌菌株未存活。表明采 [1]法和真空冷冻干燥法。无论哪种方法，其原理都是创造一个抑 用高龄菌保存菌种可使菌体细胞新陈代谢活动降低，有效保存

制细胞代谢的环境，即低温、干燥、缺氧、营养缺乏新陈代谢活 微生物，高浓菌悬液保存菌种可提高其存活期，迅速超低温预 动处于高度静止状态等。而菌种的保藏研究分为两个方向:一 冻可保持菌体细胞结构成份原状，利于细菌存活，二级真空干

是基层单位需寻找简单实用、经济的方法，如传代培养保存法、 燥既保持菌体细胞干燥度，又避免细胞反复冻结造成保存中菌 载体保存法等，这些方法不但耗费人力和物力，且菌种容易污 体死亡，因而能更长期保存菌种，并能提高其存活率，又不会发 染，对营养要求高及特殊的菌种不易保存外，经反复传代保存 生菌株的变异。

后菌株又易发生变异，不适用于菌种的长期保存。二是科研机

构需寻找长期保藏又稳定的方法，如液氮超低温保存法、冷冻 参考文献:

干燥法等。冷冻干燥法是目前保藏技术领域中研究最多、应用 ,1, 李雁，郑从义 . 微生物物种多样性的保持与其资源保藏,J,. 氨基 酸最为广泛的一种方法，由于影响其效果因素较多，如微生物的 和生物杂志，2003，25(3):4~6. 生理状态、PH 环境、保护剂类型、保存剂浓度、细菌浓度、预冻 ,2, 马洪波，冯子力，谭华 . 菌(毒)种保存及复苏技术,J,. 中国国境卫 生

温度及时间、冷冻干燥条件、细菌含水量等等。为延长菌种保存 检疫杂志，2006，29(4):244.

的存活期、存活率，我们对以下几点进行了尝试。 ,3, 马绪荣，苏桂模 . 药品微生物学检验手册,M,. 北京:科学出版社，

67 [2]2001，489. ?提高菌液浓度:菌种冻干常用菌液浓度10~10 个/ml，

,4, 王奕峰，金子辰，吴立梦 . 微生物菌(毒)种保藏及管理,J,. 上海预 防1010 [3]而我们将冻干菌种菌液浓度制备成 5~10个/ml。?微生物 医学杂志，2007，19(2):87. 的生理状态:为延长其存活率，菌龄我们采用超过对数生长期 收稿日期:2008,09,10 的 26~28h 培养物保存。?预冻温度及时间:以往常规采用逐级 修回日期:2009,04, 10[4]预冻，我们现经过-70?超低冷冻 12~18h 后在减压真空下干

燥。?菌种冷冻干燥:采用二级 12h 以上真空干燥，彻底去除保

范文四：微生物与人类健康有哪些关系

微生物与人类健康有哪些关系 0【导读】形形色色的生命造就了这个蓝色星球的庄严与美丽。我们身边不仅有绿树鲜花、飞禽走兽，在我们周围，还广泛存在着()一大群微生物。他们体积微小，常不为我们肉眼所见，然而正是这些小生命却深远的影响着比他们体积大几亿甚至几十亿倍的人类，影响着几乎所有的生命。 我们人类不得不对它们刮目相看，不得不想方设法去认识它们、了解它们，下面我们一起来看看微生物与人类健康有哪些关系。

微生物与人类健康有哪些关系

1、健康是人类永恒的话题。每个人都希望自己有一个健康的身体，但不可否认的现实却是各种各样的疾病一直困扰着大家，特别是由于饮食习惯的逐步变化及环境污染的影响，近年来各种慢性病更是呈井喷趋势。虽然人们常说吃五谷杂粮哪有不生病的，但问题是为什么我们吃的东西比以前营养丰富了，国人的健康水平却并没有明显改善，一些疾病特别是心脑血管疾病和恶性肿瘤已成为威胁人类健康的头号杀手，医院往往是人满为患。大家不禁要问:健康的标准是什么,如何才能够拥有健康的身体,疾病特别是慢性疾病产生的真正原因又是什么,真正健康的身体离我们究竟有多远,

2、微生物与健康的关系一直是人们关注的话题，但长期以来我

们对肠道微生物与健康关系的了解却非常有限。一百多年前，诺贝尔医学奖获得者、被尊称为“乳酸菌之父”的梅契尼科夫就认为:肠道健康的人身体才健康，肠道菌群产生的毒素是人体衰老和疾病产生的主要原因。他提出的人体自身中毒学说认为人体垃圾因为某些原因过量沉积在体内，导致慢性中毒，从而引发多种疾病。

3、但由于缺少直接的证据，肠道微生物与人类健康之间的关系一直没有得到很好的解释。

4、近年来，随着高通量测序和宏基因组学等新的研究方法的不断开发和应用，肠道微生物对人类健康的影响重新引起重视，成为当前生命科学和医学的研究热点，一些国家相继实施了人体微生物组计划并取得了突破性进展。现有数据表明，肠道是人体最大的微生态系统，栖息着总数约10的14次方、1000-2000余种、重量约为1-2公斤的微生物。

5、这些肠道微生物编码基因的总数超过330万，约为人类编码基因总数的100倍，因此肠道微生物又被认为是人体的第二基因组。肠道微生物基因组与人体基因组一起，通过与环境因素的相互作用，通过不同方式影响我们的健康。

6、肠道微生物从功能上可以分为共生、益生和病原微生物三大类，其中主要是细菌，也包括真菌、病毒和噬菌体，它们在人体肠道中保持着一种动态的平衡。如此庞大的肠道微生物群体通过与宿主的

长期协同进化，已经成为一个与人体密不可分的后天获得的重要“器官”。

7、肠道微生物这一“器官”发挥的功能多种多样，包括物质代谢、生物屏障、免疫调控及宿主防御等，肠道微生物不仅帮助人体从食物中吸收营养，还能够合成氨基酸、有机酸、维生素、抗生素等供我们利用，并可以将产生的毒素加以代谢，减少对人体的毒害。不同的饮食习惯和生活方式对人体肠道微生物种类有很大的影响，例如高脂肪的饮食可以导致有益的双歧杆菌减少甚至消失。因此，肠道微生物和人体存在着互利共生的关系，对于维持人的健康发挥着重要的作用。

8、除物质合成与代谢功能外，肠道复杂的微生物生态系统与机体免疫系统之间的关系也极为密切。肠道微生物不仅可以作为天然屏障维持肠上皮的完整性，防止病原微生物入侵，还通过调节肠道粘膜分泌抗体作用于肠道免疫系统，并进一步影响天然免疫和获得性免疫，因此肠道微生物又被认为是人体最大的“免疫器官”。

9、肠道微生物维持的免疫平衡在机体自身免疫疾病的预防过程中起着重要作用，当某些因素导致肠道菌群发生改变时，会进一步影响到人的其它免疫系统，这种免疫平衡一旦被打破，就容易导致各种疾病的产生。

范文五：微生物发酵饲料有哪些好处

微生物发酵饲料有哪些好处

1、提高饲料利用率

微生物菌中的微生物菌群能捣毁饲料原料中的植物细胞壁, 将纤维素、 果胶 质等难以降解的大分子物质转化为单糖和寡糖等小分子物质, 并生成多种有机酸、 微生素、 生物酶以及多种生长因子, 大大提高所发酵物料的营养水平和消化利用 率,使动物“食而不化”,“食不长肉”的现象得到彻底改观。

2、节省精料,促进禽畜的生长

粗饲料由于经过微生物的作用, 一部分难以消化吸收的物质变成了简单容易 消化吸收的物质,提高了饲料的营养价值 ; 发酵时大量繁殖起来的微生物本身就 含有蛋白质、 脂肪等丰富的营养物质, 所以禽畜吃了以后不仅生长快, 同时还能 节省精料。

3、能有效降低饲养成本

经发酵后的能量饲料转化成了菌体蛋白饲料, 用该发酵物料配制全价料, 可 减少 50%左右的蛋白质饲料的用量,可不用鱼粉,从而大大降低饲养成本。

4、使饲料除毒脱毒

有益微生物经过自身代谢及产物, 使饲料内 (特别是菜籽饼和棉籽饼 ) 所含有 毒、 有害物质被降解而脱除, 从而大大提高了饲料的安全性, 使棉籽饼或菜籽饼 可替代豆粕使用。

5、扩大了饲料的来源

玉米秸、 麦秸、 豆秸、 甘薯藤、 稻草、 青草、 树叶麦麸、 豆波、 玉米、 稻糠、 木薯渣。 粉渣、 草粉、 秸秆等绝大部分都可以使用金宝贝饲料发酵剂制成发酵饲 料,扩大了饲料来源。

6、改善饲料适口性

用金宝贝生物菌发酵后的饲料呈金黄色泽, 手感滑爽, 气味清香, 口感极佳, 很适合生喂, 动物喜吃而且多吃, 大大节省燃料及人工成本, 可以提高饲料利用 率,节省精料,促进禽畜生长,有效降低饲养成本等好处。

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