范文一：微生物学及应用

《微生物学与应用》课程教学大纲

一、 课程说明

(一)开课对象:生物技术与应用专业

(二)课程性质:

《微生物学与应用》 课程是生物技术、 生物工程等专业学生的专业必修课程。 该课程是 一门实践性很强的学科, 要求在教学中密切联系生产实际, 培养学生严谨的科学态度, 创新 精神与分析问题、解决问题的能力。

(三)课程目的:

通过 《微生物学与应用》 课程的学习, 要求学生初步掌握运用微生物资源生产发酵产品 以及防治有害微生物的原理和方法; 了解常见微生物生产的生产工艺以及微生物在冶金、 能 源、 环境等领域的应用等, 从而为从事微生物行业的研发和技术工作提供理论基础和技术支 持。

(四)课程的基本原则:

1、理论与实践相结合的原则

2、传统教学与现代教学相结合的原则

3、教师教与学生学相结合的原则

(五)学时数、学分数及学时数具体分配:

学时数:64

学分数:4

(六)教学方法和教学方法建议:

课堂授课:本课程采用课堂教学与实验教学相结合的方法,针对不同的内容采用不同 的教学方法。 要求学生课前认真预习, 教师认真备课, 要有备课笔记, 上课时合理运用多媒 体教学。

课后习题:根据每章内容都留有课后作业,并每次均由老师批发并给出成绩,及时反 馈教学信息。

(七)考核方式和成绩记载说明:

理论考试为闭卷。作业 /平时学习:30 % ,考试成绩占 :70 %

实验成绩采用考查法进行考核。

二、课程内容纲要与各章的基本要求

第一章 绪论

教学目标:

了解微生物及其特点,应用微生物学的发展及应用前景,了解微生物基础技术。

教学重点、难点:

重点:微生物及其特点;微生物基础技术。

教学时数:2

教学内容:

第一节 微生物及其特点

第二节 微生物学的发展史

第三节 微生物的应用

第四节 微生物基础技术

第二章 显微技术

教学目标:

掌握光学显微镜的使用方法。 了解显微镜的种类和用途, 光学显微观察样品的制备过程。 教学重点、难点:

重点:显微镜的种类和用途;光学显微观察样品的制备;光学显微镜的使用方法。 难点:光学显微观察样品的制备。

教学时数:2

教学内容:

第一节 显微镜的种类和用途

第二节 光学显微观察样品的制备

第三节 光学显微镜的使用

第三章 微生物鉴别技术

教学目标:

掌握微生物鉴别技术的原理和常用技术。了解常见微生物类群的特征。

教学重点、难点:

重点:常见微生物类群的特征;微生物鉴别技术的原理和常用技术。

难点:微生物鉴别技术的原理和常用技术。

教学时数:8

教学内容:

第一节 细菌

第二节 放线菌

第三节 酵母

第四节 霉菌

第五节 病毒

第六节 其它原核微生物简介

第七节 微生物鉴别技术

第四章 微生物生长测定技术

教学目标:

掌握微生物培养基的种类及其制备方法, 微生物生长繁殖的特点及其测定技术。 理解微 生物的生长规律。 了解微生物培养所需的营养要素及其作用, 环境因素对微生物生长的影响。 教学重点、难点:

重点:微生物培养所需的营养; 微生物培养基的种类及其制备方法; 微生物的生长规律; 微生物生长繁殖的测定技术。

难点:微生物培养基的种类及其制备方法;微生物生长繁殖的测定技术。

教学时数:6

教学内容:

第一节 微生物的营养

第二节 微生物培养基及制备技术

第三节 微生物的生长规律

第四节 微生物生长繁殖的测定技术

第五节 环境对微生物生长的影响

第五章 消毒与灭菌技术

教学目标:

掌握消毒和灭菌的定义和内涵。 理解影响灭菌和消毒效果的因素。 了解常用物理消毒灭 菌法的类型和优缺点,常用化学消毒灭菌法的类型及其优缺点。

教学重点、难点:

重点:消毒和灭菌的定义; 常用物理、 化学消毒灭菌法的类型和优缺点; 影响灭菌和消 毒效果的因素。

难点:常用物理、化学消毒灭菌法的类型和优缺点。

教学时数:6

教学内容:

第一节 概述

第二节 物理消毒灭菌法

第三节 化学消毒灭菌方法

第四节 影响消毒与灭菌效果的因素

第六章 微生物纯培养技术

教学目标:

掌握微生物代谢的含义和基本类型。 理解次生代谢产物的含义、 产生途径及其应用。 了 解微生物产能代谢、耗能代谢的基本过程以及代谢调节的方法,微生物纯种培养技术。 教学重点、难点:

重点:代谢的含义和基本类型; 微生物产能代谢、 耗能代谢以及代谢调节的方法; 次生 代谢产物产生途径;微生物纯种培养技术。

难点:微生物产能代谢、 耗能代谢的基本过程; 次生代谢产物产生途径; 微生物纯种培 养技术。

教学时数:8

教学内容:

第一节 代谢概论

第二节 微生物的产能代谢

第三节 微生物的耗能代谢

第四节 微生物的代谢调节

第五节 次级代谢及次级代谢产物

第六节 微生物纯种培养技术

第七章 微生物育种技术和菌种保藏

教学目标:

掌握微生物菌种的保藏原理、 方式及适用条件。 理解遗传变异的物质基础。 了解原、 真 核微生物基因重组的过程和意义,微生物育种的常用技术手段。

教学重点、难点:

重点:原、 真核微生物基因重组的过程; 微生物育种的常用技术; 微生物菌种的保藏原 理、方式及适用条件。

难点:微生物基因重组的过程;微生物育种技术。

教学时数:6

教学内容:

第一节 遗传变异的物质基础

第二节 原核微生物的基因重组

第三节 真核微生物的基因重组

第四节 微生物育种

第五节 菌种保藏技术

第八章 微生物在食品及制药工业中的应用

教学目标:

掌握微生物检测在食品及制药工业中的应用和技术手段。 了解常见微生物产品的类型和 现状,食品的卫生要求和微生物学标准,制药行业卫生要求和微生物学标准。

教学重点、难点:

重点:微生物产品的类型;食品和制药行业的微生物学标准;微生物检测。

难点:微生物检测。

教学时数:4

教学内容:

第一节 工业微生物产品

第二节 食品的卫生要求和微生物学标准

第三节 制药行业卫生要求和微生物学标准

第四节 微生物检测

实践部分

实验Ⅰ显微、微生物鉴别及测定技术

实验Ⅱ微生物的分离与纯培养技术

实验Ⅲ病毒实验技术

实验Ⅳ微生物应用技术

三、推荐教材及参考书目课

1. 《微生物资源开发利用》 ,姜成林主编 ,中国轻工业出版社, 2001

2. 《药用微生物技术》 ,李越中主编,化学工业出版社, 2004

3. 《微生物生理学》 ,李季论等编,北京农业大学出版社, 1993

4. 《微生物学教程》 (第二版) ,周德庆著,高等教育出版社, 2002

5. 《环境微生物工程》 (第一版) ,马文漪等主编,南京大学出版社, 1998

6. 《普通微生物学》 ,陆卫平、周德庆等译,复旦大学出版社, 1990

范文二：应用微生物学

应用微生物学 Applied Microbiology

应用微生物学 概论 微生物的生长 微生物的代谢 微生物的遗传与遗传育种 微生

物基因工程 微生物的基因操作系统 微生物酶工程 微生物发酵工程 微生物代谢工

程

概 论 基本概念 应用微生物学的发展 微生物细胞的结构 重要的应用微生物

定义 应用微生物学: 应用微生物学: 以一定的直接或间接应用目标研究微生物及 其相互作用和与环境的作用的科学。 其相互作用和与环境的作用的科学。(applied microbiology) 利用微生物与微生物学基础知识， 利用微生物与微生物学基础知识，通过生物 技术手段来实现一定应用目标的学科。 技术手段来实现一定应用目标的学科。 (microbiology in application)

微生物的特点 资源量大(多样性丰富) 资源量大(多样性丰富) 生物量大(生长迅速) 生物量大(生长迅速) 可塑性大(便于操作) 可塑性大(便于操作) 个体小(便于运输、携带) 个体小(便于运输、携带) 完成自然界的物质循环 造福人类 引起灾难

当前人类面临的问题 资源的压力 环境的挑战 传染病的新生与复发

微生物的应用部分 细胞 基因 基因产物( 蛋白质) 基因产物(酶、蛋白质) 代

谢产物

应用微生物学需解决的问题 微生物菌种的获得和优化 微生物培养条件的建立和

优化 微生物的应用

应用微生物学研究的一般流程 提出问题(工业、农业、环境、健康、国防 ) 提

出问题(工业、农业、环境、健康、国防…) 微生物, 微生物, Yes 菌种 发酵

应用 解决问题 解决问题 解决问题 No

应用微生物学的发展 微生物学的发展是与应用紧密联系的 逐步建立方法认识微生物 Leenwenhock (1673) 显微镜 Jenner (1798) 牛痘 Basteur (1860s) 发酵、低温灭菌、自然发生 Koch (1881) 纯培养 微生物形成产业 Fleming (1929) 青霉素 Waksman (1944) 链霉素 现代生物技术 Cohen (1972) DNA 重组

微生物细胞的结构 细胞壁――形态保持、物质交换、信号识别 形态保持、物质交换、 细胞壁 形态保持 细胞膜――转运 细胞膜 转运 细胞质――酶、反应场所 细胞质 酶 细胞核――遗传物质 细胞核 遗传物质 核外遗传物质――线粒体、质粒 线粒体、 核外遗传物质 线粒体

重要的应用微生物 病毒: 噬菌体 病毒:?-??噬菌体 细菌:大肠杆菌( 细菌:大肠杆菌 E.coli) 棒杆菌( 棒杆菌 Corynebacterium) 放线菌:链霉菌( 放线菌:链霉菌 Streptomyces) 酵母菌:酿酒酵母( 酵母菌:酿酒酵母 Saccharomyces cerevisia) 真菌:曲霉( 真菌:曲霉 Aspergillus)

第一章 微生物的生长 微生物生长的条件 培养基 生长动力学

微生物细胞的化学组成 细胞中几种主要元素的含量 (干重的百分数) 元 素 C N

O H 细菌 50~53 酵母菌 45~50 霉菌 40~63 7~10 ~40 ~7 灰分物 2~10 质 7~10

5~10 细胞干物质中主要组分和含量(%) 细菌 酵母菌 霉菌 蛋白质 50~80 32~75 20~40 碳水化 12~28 27~63 7~10 合物 脂类 5~20 10~20 2~15 6~8 4~40 1 12~15 7.5~12.4 ~20 ~8 ~30 ~7 核酸

微生物生长的条件―物质条件 水 微生物类群 细菌 酵母菌 霉菌 耐干霉菌 耐

高渗酵母菌 aw=Pw/Pw0 最低aw值 0.91 0.88 0.80 0.65 0.60 溶液 30%葡萄糖

1%葡萄糖 +40%蔗糖 饱和蔗糖 饱和NaCl aw 0.96 0.96 0.76 0.78

微生物生长的条件―物质条件 碳源和氮源 O H P S K Ca Mg Fe Mn Cu Zn Mo Co

Ni V B Cl Na Si 维生素、 维生素、氨基酸等

微生物的营养类型 光能无机营养型( Photolithoautotrophy) 光能无机营养型(光能自养型 Photolithoautotrophy) 光能有机营养型( Photoorganoheterotrophy) 光能有机营养型(光能异养型 Photoorganoheterotrophy) 化能无机营养型(化能自养型 Chemolithoautotrophy) Chemolithoautotrophy) 化能无机营养型( 化能有机营养型( Chemoorganoheterotrophy) 化能有机营养型(化能异养型 Chemoorganoheterotrophy)

微生物生长的条件―环境条件 pH 中性(弱酸、 )、嗜酸 嗜酸、 中性(弱酸、碱)、嗜酸、嗜碱 最适、生长、 温度 最适、生长、耐受 严格(专性)好氧、兼性、耐氧厌氧、 氧气 严格(专性)好氧、兼性、耐氧厌氧、严格厌氧 压力 渗透压 极端环境微生物 (extremophile) 不可培养微生物 (VBNC vive but non-cultured)

极端微生物与不可培养微生物 极端环境微生物 (extremophile):依赖于一种或多种 依赖于一种或多种 极端物化因子生存的微生物 嗜热菌: 嗜热菌:50-80?C (hyperthermophiles>80?C) ? ? 嗜冷菌: 嗜冷菌:<16?C ? 嗜酸菌: 嗜酸菌: <3 嗜碱菌: 嗜碱菌: >9 嗜盐菌: 嗜盐菌: >3M 嗜压菌 不可培养微生物 (VBNC vive but non-cultured)

培养基 提供微生物生长所需物质与环境条件 的体系

培养基的组成要素 碳源、氮源、 碳源、氮源、提供各种元素的无机盐 生长因子

或含生长因子的物质 固化基(固体培养基) 水、固化基(固体培养基) pH、渗

透压(糖、盐浓度)、灭菌条件 盐浓度)、 )、灭菌条件 、渗透压(

培养基的种类 按物理状态:固体、液体、 按物理状态:固体、液体、半固体 按

化学组成:合成、丰富、 按化学组成:合成、丰富、半合成 按使用目的:种子、

发酵、筛选、 按使用目的:种子、发酵、筛选、再 生、 富集…… 富集

培养基的选择和设计原则 适用: 适用:利于达到目的 利于下游工艺 重复性好 经

济: 经济:原料价格 原料用量 全工艺综合平衡 安全: 安全:环境影响 生物安

全 培养基的选择和设计是应用微生物学研究的重要内容

生长动力学 增值曲线 70 (Multiplication curve):60 ): 细胞数-时间 细胞数 时

间 50 生长曲线 (growth curve): ): 细胞量-时间 细胞量 时间 40 30 20 10 0

12 16 20 0 4 8 增值 曲线 生长 曲线

微生物生长的实验计量 显微计数 菌落计数 浊度测定 细胞干重

微生物生长的数学描述 比生长速度(specific growth rate) 比生长速度 ? = dx/xdt 细菌 酵母菌 放线菌 真菌 0.6-1.2 0.3-0.5 0.1-0.3 0.1-0.3 生物量倍增时间

(biomass doubling time) 生物量倍增时间 td=ln2/ ? 增值度(multiplication degree) 增值度 x/xo

第二章 微生物的代谢 微生物初级代谢 微生物次级代谢 代谢调节

微生物的代谢 微生物细胞所进行的生化反应的总和 物质代谢 能量代谢 信息代

谢 细胞内及细胞与环境间的物质转换的过程 载体

微生物初级代谢 微生物从环境摄取物质、获得能量、 微生物从环境摄取物质、获

得能量、合成自身新物质 的过程 营养物 ? 能量(用于生长) 合成代谢 ? 细胞

组分 能量 (用于运动和物质转运) 酶 分解代谢 能量来源 废弃物

重要的初级代谢途径 糖酵解途径 糖代谢的共同分解途径 将糖最终氧化为二氧化碳和水， 三羧酸循环 将糖最终氧化为二氧化碳和水，并产生大量能量 产生四碳糖、 磷酸戊糖途径 产生四碳糖、五碳糖和七碳糖等多种中间产物 ED途径 ED途径 细菌代谢葡萄糖产生乙醇的途径 氨基酸合成途径

糖酵解途径(Embden-Meyerhof pathway) 葡萄糖经酶的催 化降解成丙酮酸并 伴有

ATP生成的过 伴有 生成的过 在动物、植物、 程。在动物、植物、 微生物细胞中，

微生物细胞中，这 一过程是分解葡萄 糖产生能量的共同 代谢途径。 代谢途径。

GLC SOL GND ? HXK ZWF ?G6P ? G15L ? P6G ? RU5P ? PGI F6P PFK??FBP F16P ?? FBA GLY?G3P? GLY G3P DHAP ? GAP ? TPI ? TDH P13G ? PGK ? 3PG ? GPM 2PG ? ENO PEP? ? PYK PDC ADH ? PYR ? ACA ?

ETH ?

三羧酸循环(Krebs cycle) PYR ? ACoA MDH ? CIT MAL ? OAA ? CTT FUM ? ?

?ACO FUM ICI SDH?? OSM ? IDP SUC ? SUCC ? AKG? LSC KGD 丙

酮酸进一步氧化脱羧形成乙酰辅酶A 乙酰辅酶A再经过氧化、脱羧， 丙酮酸进一步

氧化脱羧形成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A再经过氧化、脱羧，最 终产物为二氧化碳和

水，并伴有大量能量产生的一系列反应过程。 终产物为二氧化碳和水，并伴有大量

能量产生的一系列反应过程。

磷酸戊糖途径 氧化(产生 氧化(产生NADPH ) 非氧化 (分子重排 ) RU5P P6G

RKI ? ? RPE R5P X5P G15L G6P TKL GAP S7P TKL E4P F6P TKL

ED途径 存在于某些缺乏完整EMP途径的微生物中，是微生物特有的, 将2-酮-3脱

氧-6-磷 酸葡糖酸(KDPG)裂解为丙酮酸和3-磷酸甘油醛。

氨基酸合成途径 GLC ? PPP? R5P ? His 3PG ? PEP ? PRY ? OAA ? Ser, Gly, Met (3,磷酸甘油酸衍生型) ,磷酸甘油酸衍生型) ? Phe, Try, Trp (芳香族氨基酸) 芳香族氨基酸 氨基酸) ? Ala, Val, Leu (丙酮酸衍生型) 丙酮酸衍生型)

? Asp ? ASA ? Lys(草酰乙酸衍生型) 草酰乙酸衍生型) ? ? TCA Asn HS ? Thr ? ? AKG Met Ile ? Arg ? Glu ? Gln (α,酮戊二酸衍生型) 酮戊二酸衍生型) ? Pro

微生物次级代谢 次级代谢是相对于初级代谢的概念， 次级代谢是相对于初级代谢的概念，指微 生物在一定的生长时期(一般为稳定期) 生物在一定的生长时期(一般为稳定期)以初 级代谢物为前体、 级代谢物为前体、合成对微生物生命活动没有 明确功能的物质的过程。 明确功能的物质的过程。 次级代谢(前体聚合、 次级代谢(前体聚合、 初级代谢 结构修饰、装配) 结构修饰、装配) 营养物 前体 (初级代谢物) 初级代谢物) 次级代谢物

次级代谢的生物学意义 次级代谢的生理意义目前尚无定论， 次级代谢的生理意义目前尚无定论，但它肯定对微生物是有意 义的，否则这种需要多种酶类协同参与、 义的，否则这种需要多种酶类协同参与、并在精细的调节机制控 制之下的代谢过程是不会在生物体内保存下来的。 制之下的代谢过程是不会在生物体内保存下来的。 维持初级代谢的平衡 次级代谢产物作为储藏物质的一种形式 使菌体在生存竞争中占优势 与细胞分化有关

青霉素 S CH3 R-CO-NH-HC―CH C ?B ? A ? CH3 OC---N ---- CH ? COOH 侧

链: R-CO母核:噻唑环 A ，β -内酰胺环 B

几种青霉素的侧链和抗生素效价比较 青霉素 侧链R基 在试管内的抗生素效价

(U/mg) 金黄色葡萄球菌 (G)苯甲基青霉素 C6H3-CH21667 900 1500 1670 2300 枯

草杆菌 1667 1500 970 660 700 (X)对羟基苯甲基青 HO-C6H3-CH2霉素 (F)戊烯

基青霉素 (FH2)n-戊基青霉素 (K)n-庚基青霉素

CH3CH2CH=CHCH3CH3CH2CH2CH2CH2 CH3CH2CH2CH2CH2 CH2CH2-

青霉素的生物合成

代谢调节 细胞为维持正常的生理功能， 细胞为维持正常的生理功能， 它的组分、代谢物、 它的组分、代谢物、能量和电子载 体的合成大体上应保持恒定。 体的合成大体上应保持恒定。当环 境或细胞自身发生某种变化时， 境或细胞自身发生某种变化时，可 以通过一定的反馈作用来达到平衡 生长，这种反馈作用即代谢调节。 生长，这种反馈作用即代谢调节。

代谢调节与育种 研究微生物的代谢规律和调控机制， 研究微生物的代谢规律和调控机制，除了 有理论意义， 有理论意义，更重要的是能有目的地改造微生 物使它能最大限度地生产人类所需的代谢产品， 物使它能最大限度地生产人类所需的代谢产品， 并为此提供最适合的环境条件，从而发展生产， 并为此提供最适合的环境条件，从而发展生产， 造福人类。从某种意义上讲， 造福人类。从某种意义上讲，越是理想的高产 菌株， 菌株，就越偏离它在自然进化中建立起来的调 控机制。 控机制。许多遗传育种工作就是为获得目标代 谢产物合成不受或少受代谢调控的“不正常” 谢产物合成不受或少受代谢调控的“不正常” 菌株。 菌株。

代谢调节的位点 DNA ?? RNA ? 酶 底物 (营养物) ? 底物 (或中间物) 产

物 ? ?底物进入，?酶的活性，?酶的合成

代谢调节的本质:酶的调节 酶合成的调节:诱导与阻遏 基因水平 酶合成的调节:

诱导与阻遏―基因水平 酶活性的调节:反馈抑制 蛋白质水平 酶活性的调节:反馈

抑制―蛋白质水平

适应现象 例1，大肠杆菌乳糖代谢: ，大肠杆菌乳糖代谢: β ? 半乳糖苷酶 乳糖 --------------------?半乳糖 + 葡萄糖 E.coli生长于无乳糖培养基， β ? 半乳糖苷酶:3 分子/细胞 E.coli生长于含乳糖培养基， β ? 半乳糖苷酶:3000-5000 分子/细胞 例2，大肠杆菌色氨酸代谢: ，大肠杆菌色氨酸代谢: E.coli生长于无彼崤嘌铣缮彼岷铣擅福?当色氨酸浓度增加时，色氨酸合成酶浓度下降。 细胞需要某种酶时才合成，反映出细胞的自我调节机理。 细胞需要某种酶时才合成，反映出细胞的自我调节机理。这种诱 导物诱导可诱导酶的产生与辅抑物抑制可阻遏酶的产生的现象称适应 现象。 现象。 乳糖:诱导物 诱导物(inducer) 色氨酸:辅抑物 辅抑物(corepressor) 诱导物 辅抑物

底物与诱导物 底物不等于诱导物 对β ? 半 乳糖苷酶 作底物 作诱导物 乳糖

IPTG 苯基半乳 苯基硫代 糖苷 半乳糖苷 (异丙基 硫代半乳 糖苷) + + - +

+

乳糖操纵子 i P O Z Y A 调节基因 i :编码阻遏蛋白 启动子 P :有CAP(CAP与cAMP复合物)和RNA聚合酶两个位点 操纵基因 O:阻遏蛋白结合位点 结构基因 Lac Z: β ? 半乳糖苷酶 Lac Y: β ? 半乳糖苷透性酶 Lac A: β ? 半乳糖苷转乙酰酶

协同诱导和顺序诱导 协同诱导 I ? a、b、c 顺序诱导 I ?a B ?b C ?c a b c

A?B?C?D

操纵子(operon) I P O S1 S2 S3 调节基因 启动基因 操纵基因 结构基因 ? 变构 ? (+ or -) 外界信号? 外界信号?调节蛋白 I or CoR 操纵子:一组功能相关的基因共同组成的转录单位， 操纵子:一组功能相关的基因共同组成的转录单位， 它们结构上紧密联系、功能上协同表达， 它们结构上紧密联系、功能上协同表达，接受同一调控序 列的调控。 列的调控。

诱导与阻遏 调节 调节蛋白活性 操纵子 结构基因 酶合成 诱导 诱导 阻遏 阻遏

正 负 正 负 ? ? ? ? 打开 打开 关闭 关闭 表达 表达 不表达 不表达 ? ? ? ?

反馈抑制 反馈抑制: 反馈抑制:在合成代谢途径中，代谢终产物抑 制途径中第一个酶的作用。 E1 E2 E3 E4 A B C D E 反馈抑制能对环境变化做出快速反应 特点: 特点: 1，只有终产物或其结构类似物有反馈抑制 2，受抑制的是途径中的第一个酶 3，反馈抑制是可逆的

别构酶(allosteric enzyme) 有多亚基和四级结构 有结合底物的活性中 心和结合调

节物的别 构中心 活性中心和别构中心 在酶分子的不同部位

分支生物合成途径的调节 P1 A 协同反馈抑制 同功酶反馈抑制 累积反馈抑制 顺

序反馈抑制(细调) 顺序反馈抑制(细调) B C P2

协同反馈抑制 P1 A B C P2 合成代谢途径中的第一个酶有几个变构中心， 合成代谢途径中的第一个酶有几个变构中心，分别可与不同终 产物结合，每一种终产物对第一个酶都没有反馈抑制作用，只有 产物结合，每一种终产物对第一个酶都没有反馈抑制作用， 当几种终产物同时过量时才有反馈抑制作用。 当几种终产物同时过量时才有反馈抑制作用。

同功酶反馈抑制 P1 A B C P2 合成代谢途径中的第一个酶有几种结构略有不同的同功酶， 合成代谢途径中的第一个酶有几种结构略有不同的同功酶，每 一种终产物只对一种同功酶有反馈抑制作用，只有当几种终产物 一种终产物只对一种同功酶有反馈抑制作用， 同时过量时，才使几种同功酶同时被作用而抑制合成反应。 同时过量时，才使几种同功酶同时被作用而抑制合成反应。

积累反馈抑制 P1 A B C P2 每一种终产物对第一个酶都有一定的反馈抑制作用，

每一种终产物对第一个酶都有一定的反馈抑制作用，他们合在 一起达到最大程度的

反馈抑制。 一起达到最大程度的反馈抑制。

顺序反馈抑制 P1 A B C P2 合成代谢途径中的第一个酶的效应物不直接是终产物而是代谢 分支点的中间物，每一种终产物抑制分支后的第一个酶，使分支 分支点的中间物，每一种终产物抑制分支后的第一个酶， 点的中间物积累，然后抑制合成代谢途径的第一个酶。 点的中间物积累，然后抑制合成代谢途径的第一个酶。 这一调节作用可根据不同终产物的量分别调节，是一种细调。 这一调节作用可根据不同终产物的量分别调节，是一种细调。 在许多分支代谢的调节中，细调与粗调往往同时发生。 在许多分支代谢的调节中，细调与粗调往往同时发生。

第三章 微生物的遗传与菌种选育 微生物的遗传物质 基因突变 基因重组 遗传育

种

微生物的遗传物质 核酸(DNA RNA) 核酸 染色体 染色体外遗传物质

DNA是遗传物质的实验证明 肺炎双球菌转化 S? ------? dead， ? ? ， S? R? ? ? dead ------? S? ------? S? ? ? ? ? ? S? ------? alive， R? ------? alive ? ? ， ? ? 噬菌体感染 T2(DNA-32P,protein-35S) ---? E.coli ---?上清T2( 35S ) ? ? ( ? 沉淀E.coli( 32P ) ( 双螺旋模型

遗传育种 基本过程 基因突变、重组、导入、敲除… 筛选 出发菌株 ?

包含变异株的群体 ? 优良变异株 ? 目的株 ??检验 ??检验 产生变异

株 选择变异株 检验变异株

基因突变 大的突变，如染色体的畸变，染色体的数目与结构发 大的突变，如染色体的畸变， 生改变、断裂、大片段缺失、移位等， 生改变、断裂、大片段缺失、移位等，可影响到很多 基因的功能。这类突变对细胞的损伤很大， 基因的功能。这类突变对细胞的损伤很大，往往导致 细胞的死亡。 细胞的死亡。 小的突变，只涉及DNA分子中一个或少数碱基的改变， 分子中一个或少数碱基的改变， 小的突变，只涉及 分子中一个或少数碱基的改变 又称为点突变。 又称为点突变。 点突变发生较多，存活的突变体也较多，因此 点突变发生较多，存活的突变体也较多， 有时基因突变就专指点突变。 有时基因突变就专指点突变。

基因突变的类型 基因型 置换: 转换( 颠换(transversion) 置换:G A, C T 转换 transition);G,A C,T颠换 ; 颠换 移码(frameshift):DNA分子中一对或几对核苷酸的增加或缺失 移码 : 分子中一对或几对核苷酸的增加或缺失 表型 形态: 形态:造成形态发生改变的突变 致死:造成个体死亡或生活力下降(半致死) 致死:造成个体死亡或生活力下降(半致死)的突变 条件致死: 条件致死:在一定条件下有致死效应的突变 生化:没有形态效应的突变，如营养缺陷、 生化:没有形态效应的突变，如营养缺陷、抗药性等 翻译 同义、错义、无义 同义、错义、无义(UAG, UGA, UAA)、终止码、抑制 、终止码、

基因突变的特性 稀有性 随机性 独立性 可逆性 稳定性 突变率低(可通过理化处理提高突变率) 突变率低(可通过理化处理提高突变率) Kmr 10-5, Apr 10-6, 回复突变率也很低 Kmr Apr 10-11 突变率:一个世代或一定时间内发生突变的概率。 突变率:一个世代或一定时间内发生突变的概率。

几种微生物每次复制的突变率 微生物 噬菌体M13 噬菌体λ 噬菌体T2、T4 大肠杆

菌 酿酒酵母 粗糙脉胞菌 平均 基因组大小 (bp) ) 6.4×103 4.9×104 1.7×105 4.6×106 1.2×107 4.2×107 突变率 碱基) (碱基) 7.2×10,7 7.7×10,8 2.4×10,8 5.4×10,10 2.2×10,10 7.2×10,11 突变率 基因组) (基因组) 0.0046 0.0038 0.0040 0.0025 0.0027 0.0030 0.0034

诱变剂 能引起微生物遗传物质发生改变的 化学、物理、 化学、物理、生物因子

化学:碱基类似物( 溴尿嘧啶 羟胺、亚硝酸) 溴尿嘧啶、 化学:碱基类似物(5-溴尿嘧啶、羟胺、亚硝酸) 烷化剂(亚硝基胍、硫酸二乙酯) 烷化剂(亚硝基胍、硫酸二乙酯) 物理:短波(紫外线) 物理:短波(紫外线) 射线( 射线 射线、 射线 射线) 射线(X-射线、γ射线) 生物:噬菌体、质粒、 生物:噬菌体、质粒、转座子

诱变剂的作用 诱变剂 5-溴尿嘧啶 溴尿嘧啶 羟胺 亚硝酸 亚硝基胍 硫酸二乙酯 溴化乙啶 紫外线 γ射线 射线 转座子 诱变作用 碱基错配 胞嘧啶脱酰胺 A、C、G脱酰胺 、 、 脱酰胺 A、C烷基化 、 烷基化 A、C烷基化 、 烷基化 嵌入碱基对 嘧啶二聚 DNA单链或双链断裂 单链或双链断裂 碱基取代、 碱基取代、断裂 对DNA的影响 的影响 转换(AT ? GC) 转换 转换(GC?AT) ? 转换 转换(AT ? GC)、缺失 转换 、 转换(GC?AT) ? 转换 转换(GC?AT) ? 转换 移码 转换(GC?AT)、巅换、 转换 ? 、巅换、 缺失、 缺失、移码 结构改变、 结构改变、缺失 缺失、重复、 缺失、重复、插入 诱变能力 弱 弱 中 强 强 弱 中 强 强

基因突变的应用----诱变育种 虽然分子生物学技术已普遍用于育种， 虽然分子生物学技术已普遍用于育种，诱变育种仍是 重要而基本的育种方法。 重要而基本的育种方法。 诱变育种的基本步骤: 诱变育种的基本步骤: 出发株?诱变剂处理?初筛?复筛? 出发株?诱变剂处理?初筛?复筛?鉴定 一般要进行多次，以积累有益突变。 一般要进行多次，以积累有益突变。 诱变谱系: 诱变谱系: 诱变剂处理1 诱变剂处理 出发株 中间株1 中间株 诱变剂处理2 诱变剂处理 中间株2 中间株 ?…? 目的株 ?

诱变育种的关键环节 出发株:性状、 出发株:性状、潜力 诱变处理:诱变剂选

择、 诱变处理:诱变剂选择、剂量 筛选:方法、 筛选:方法、筛选量 High-throughput

screening

致死率与诱变效果 120 100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 存活数 突变株数

诱变育种的新技术 离子注入 激光 微波 超声 太空

突变株的筛选 初筛: 初筛:弃去大量无价值菌株 复筛: 复筛:选出少数有价值

菌株 方法: 方法: 直接测定 利用可观察现象 营养限制培养基 选择培养基

组成型育种 β ? 半乳糖苷酶 加诱导酶抑制剂 培养基: 培养基: 乳糖+邻硝基 邻硝基-β-D-岩藻糖苷(诱导型酶抑制剂) 岩藻糖苷( 乳糖 邻硝基 岩藻糖苷 诱导型酶抑制剂) 只有组成型能利用乳糖 交替培养法 培养基1: 培养基 :乳糖 培养基2: 培养基 :葡萄糖 交替培养使组成型优势扩大

交替培养法 组成型 106 乳糖 葡萄糖 乳糖 葡萄糖 乳糖 葡萄糖 106 -108 107- 109 108- 1010 109 -1011 1010 -1012 1011 -1013 诱导型 106 106 ?2x106 2x105 -2x107 2x106 -4x106 4x105 -4x107 4x106-8x106 8x105 -8x107 组成型: 组成型:诱

导型 1:1 50:1 50:1 2500:1 2500:1 125000:1 125000:1

营养缺陷型育种 营养缺陷型 CA A B B D C C B 积累 D 积累

抗反馈抑制育种 原理: 原理: 结合于调节中心) 产物 + 酶(结合于调节中心) 反馈抑制 类似物+ 结合于调节中心) 类似物 酶(结合于调节中心) 影响生长 抗类似物的变异株 类似物与酶的调节中心不能结合 产物与酶的调节中心不能结合 反馈抑制解除 产物能过量积累

抗反馈抑制育种举例 苏氨酸 C.crenatum AS 1.542 0 mg/ml MNNG LR-1458 AHVr 6mg/ml <1 MNNG LRA-96 AHVr 8mg/ml ,Met- 3.5 MNNG LRA-359 AHVr 10mg/ml ,Met- 6.5 LRA-359-66 DES D20-23 AHVr 20mg/ml ,Metm85 7.0 9.0 13.0 Asa Hse Met Thr Ile AHV(α-氨基 β-羟基戊酸 α 氨基 羟基戊酸

氨基-β 羟基戊酸): Thr, Ile结构类似物 结构类似物

抗底物类似物育种* 海因酶(二氢嘧啶酶) 海因酶(二氢嘧啶酶) 5-氟尿嘧啶:

底物 尿嘧啶 类似物，诱变剂 氟尿嘧啶: 尿嘧啶)类似物 氟尿嘧啶 底物(尿嘧啶

类似物， 大量产生分解底物 类似物)的酶 底物(类似物 抗底物类似物 大量产生分

解底物 类似物 的酶 培养剂:平板培养剂 培养剂:平板培养剂+ 5-氟尿嘧啶 氟尿

嘧啶 UV J43 0.275 NTG J404 0.714 BO419 1.34 NTG+5-FU M39 4.32 IU/ml

产物压力法* L,乳酸 ADH 丙烯醇 ―? 烯醛(对细胞有毒性) NTG 乳酸 乙

醇 ADH AS3.3461 68 16 50 丙烯醇 HBF,12(从21株中选出) 96 4 12

基因重组 基因重组是遗传物质大范围的改变， 基因重组是遗传物质大范围的改变，涉及一 个或多个基因、部分染色体甚至整个基因组。 个或多个基因、部分染色体甚至整个基因组。 有性生殖:与高等生物相同，限于产有性孢子微生物 有性生殖:与高等生物相同， 细胞融合: 细胞融合:通过原生质体 结合: 结合:通过细胞间接触 转导: 转导:通过噬菌体为媒介 转化:游离DNA直接进入宿主细胞 转化:游离 直接进入宿主细胞 感染:病毒DNA进入细胞 感染:病毒 进入细胞

细胞融合育种 溶菌酶 A+B溶菌酶 A-B+ 亲代细胞 A-B+ 原生质体 融合原生质

体 融合子 A+BPEG A+B+ 再生 (A-B-) A+B+ (A-B-)

原生质体的制备 细胞培养: 细胞培养:对数初期 去除细胞壁: 去除细胞壁:缓

冲液渗透压和酶反应条件 利用原生质体诱变育种可提高突变率

原生质体融合 化学融合: 化学融合:PEG 电融合 激光诱导融合

融合子的筛选 选择性培养基 双亲本的优良性状 灭活

菌种的保藏 菌种保藏方法 液体隔绝法 冷冻干燥法 低温保藏法 菌种保藏中

心 ATCC ( American Type Culture Collection) IFO (Institute for Fermentation, Osaka) CGMCC (China General Microbiological Culture Collection Centre) ACCC (China Agricultural Culture Collection Centre) CACC (China Antibiotic Culture Collection Centre) CICC (China Industrial Culture Collection Centre)

第四章 微生物基因工程 基本概念 工具酶 载体 目的基因的获得 DNA体外重组

体外重组 基因的转移 工程菌的筛选

基因工程基本概念 名词: 名词: genetic engineering, DNA recombination, recombinant DNA techniques , gene manipulation, gene cloning, molecular cloning… 基

本材料: 基本材料: 供体，载体， 供体，载体，受体 一般过程: 一般过程: 基

因 转入受体? 体外重组?转入受体?分离鉴定 载体

工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 连接酶 DNA聚合酶 聚合酶I 聚合酶 Taq

DNA聚合酶 聚合酶 逆转录酶 S1核酸酶 核酸酶 碱性磷酸酯酶

限制与修饰 E.coli C EOP=1 EOP=1 λ.C EOP=1 EOP=10-4 λ.K E.coli

K

限制性内切酶 一类专一性很强的核酸内切酶， 一类专一性很强的核酸内切酶，包括对碱基的专 一性和磷酸二酯键断裂方式的专一性。 一性和磷酸二酯键断裂方式的专一性。 类型 ? 发现时 作用位 间 点 1968 不完全 限定 限定 限定 识别位点与作用 位点的关系 不同 所需辅助因 子 Mg2+,ATP … Mg2+ Mg2+ ? ?

1970 1972 相同 不同

限制性内切酶的命名与作用特点 命名: 命名:根据分离到该酶的菌株 例:Hind

? Hemophilus influenza d ? 作用特点: 作用特点: 1，识别4~6个核苷酸序列 2，

中心对称 3，可产生粘性末端或平末端

几种限制性内切酶 enzyme BamH I Bcl I Bgl II EcoR I Hind III Mbo I Pst I Sau 3A Sma I Taq I Xma I salt M M M H M H M M * L L Temp(?) 37 60 37 37 37 37 30 37 37

65 37 sequence G?GATCC T?GATCA A?GATCT G?AATTC A?AGCTT ?GATC CTGCA?G ?GATC CCC?GGG T?CGA C?CCGGG ** 2nd activity **

限制性内切酶的识别序列与产生哪??识别序列与产生的末端都相同 识别序列不

同， 识别序列不同，产生的末端相同 识别序列相同， 识别序列相同，产生的末端

不同 识别序列与产生的末端都不同

限制酶的反应条件 Buffer NaCl Tris L 0 10mM(pH7.4) M 50mM 10mM(pH7.4) H 100mM 50mM(pH7.4) * 20mM KCl 10mM(pH8) MgSO4 10mM 10mM 10mM 10mM DTT 1mM 1mM 0 1mM 第二活性 EcoR I 当甘油,10% (12~20)，Mn2+代替

Mg2+, pH8.5时，识别AATT

DNA连接酶 3’ --------OH ATP Ppi E E-AMP E A P P-------5’ P-------T4: ATP, Mg+2

E.coli: NAD, Mg+2 --------?H AMP ---------------------------

DNA聚合酶I MW 103,000 5’-3’聚合酶活性 聚合酶活性 5’-3’外切酶活性 3’-5’外切酶活性 外切酶活性 DNA聚合酶I 经枯草杆菌蛋白酶切得 经枯草杆菌蛋白酶切得Klenow片段 片段 MW 69,000 5’-3’聚合酶活性 聚合酶活性 3’-5’外切酶活性 外切酶活性

Taq DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶，从水生栖热菌 聚合酶， 耐高温的 聚合酶 (Thermus aquaticus)分离得到。由于聚合 分离得到。 分离得到 酶链式反应(polymerase chain reaction 酶链式反应 PCR)应用的不断扩大， Taq DNA聚合酶 应用的不断扩大， 应用的不断扩大 聚合酶 已成为分子生物学研究最重要的工具酶之 一。

聚合酶链式反应(PCR) ????????????? 变性 (~94?C) ? ) ?????????????? 5 ??????????????3 ??????????????? ?????????????? 退火( 退火(~37?C) ? ) 3‘? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 5’ 延伸( 延伸(~72?C) ? ) ??????????????? 聚合酶Klenow片段延长退火引物，由于在 片段延长退火引物， 用DNA聚合酶 聚合酶 片段延长退火引物 变性温度下酶失活，每经过一轮就需补充酶。 变性温度下酶失活，每经过一轮就需补充酶。1987年 年 耐热DNA聚合酶的发现 聚合酶的发现PCR使得以实用。 使得以实用。 耐热 聚合酶的发现 使得以实用

PCR反应系统 DNA模板 模板 引物( 引物(20~30bp，内部无二级结构) ，内部

无二级结构) 底物( 底物(4 dNTPs) ) 热稳定的DNA聚合酶 热稳定的 聚合

酶

逆转录酶 发现于感染RNA病毒的动物组织，以 病毒的动物组织， 发现于感染 病毒的动物组织 RNA为模板合成 为模板合成DNA，又称依赖 为模板合成 ，又称依赖RNA的 的 DNA聚合酶，常被用来合成 cDNA，是 聚合酶， 聚合酶 ， 获得真核基因的重要工具酶。 获得真核基因的重要工具酶。

S1核酸酶 作用于单链DNA的核酸酶，来自米曲霉 的核酸酶， 作用于单链 的核酸酶 (Aspergillus oryzae)，降解单链 ，降解单链DNA，不降 ， 解双链DNA和DNA-RNA杂合分子，用于制 杂合分子， 解双链 和 杂合分子 平末端和去掉cDNA合成时的发夹环。 合成时的发夹环。 造DNA平末端和去掉 平末端和去掉 合成时的发夹环

碱性磷酸酯酶 除去DNA 5’末端的磷酸，以提高重组效率 末端的磷酸， 除去 末

端的磷酸 细菌碱性磷酸酯酶BAP 耐热) 细菌碱性磷酸酯酶BAP (耐热) 可完

全失活) 小牛肠道碱性磷酸酯酶 CIP(68?C可完全失活) ( 可完全失活

载体 能运载外源基因，进入受体细胞并在其中复制、转录、 能运载外源基因，进入受体细胞并在其中复制、转录、翻译的特 殊物质。 殊物质。 基因重组 基因转移 基因表达 稳定性、分泌、分离纯化… 稳定性、分泌、分离纯化 能自我复制 能进行基因操作 可接纳与运载外源基因 有选择方法 有期望的性状

克隆载体与表达载体 克隆载体:拷贝数高， 克隆载体:拷贝数高，利于得到基因

表达载体:表达量高， 表达载体:表达量高，利于得到蛋白 这两类载体没有绝对

的区别。 这两类载体没有绝对的区别。

质粒(plasmid) 一种染色体外遗传因子，为闭合的环状双链 分子， 一种染色体外遗传因子，为闭合的环状双链DNA分子， 分子 大小从10 不等， 大小从 -1~102kb不等，可以自我复制并且在细胞分裂 不等 时保持恒定地传递给子代细胞。 时保持恒定地传递给子代细胞。 质粒DNA带有与质粒复制有关的基因、抗药性基因以 带有与质粒复制有关的基因、 质粒 带有与质粒复制有关的基因 及其他一些基因，这些基因表现为与宿主有关的性质， 及其他一些基因，这些基因表现为与宿主有关的性质， 如转移、稳定性、分泌性质、特殊的代谢途径、限制、 如转移、稳定性、分泌性质、特殊的代谢途径、限制、 修饰等。 修饰等。 拷贝数:一个细胞内质粒DNA分子的个数，与质粒复 分子的个数， 拷贝数:一个细胞内质粒 分子的个数 制区的结构有关。 制区的结构有关。

质粒的类型 复制类型: 复制类型: 严紧型:质粒 复制较严格受染色体DNA复制控制，复制 复制控制， 严紧型:质粒DNA复制较严格受染色体 复制较严格受染色体 复制控制 时需有新的蛋白质合成，一般拷贝数较少。 时需有新的蛋白质合成，一般拷贝数较少。 松弛型:质粒DNA复制不受染色体 松弛型:质粒 复制不受染色体DNA复制控制，复制时不 复制控制， 复制不受染色体 复制控制 需要新的蛋白质合成，一般拷贝数较多。 需要新的蛋白质合成，一般拷贝数较多。 接合类型(根据其引起细菌接合转移的能力): 接合类型(根据其引起细菌接合转移的能力): 接合(conjugative)质粒:有Tra基因，一般较大，拷贝数较少。 质粒: 基因， 接合 质粒 基因 一般较大，拷贝数较少。 非接合(non-conjugative)质粒:没有 质粒: 基因。 非接合 质粒 没有Tra基因。 基因

质粒的制备 培养、 培养、收集带质粒的细胞 裂解细胞(生物、化学、物理) 裂解细胞(生物、化学、物理) 除去核酸外的其它细胞成分(苯酚、氯仿) 除去核酸外的其它细胞成分(苯酚、氯仿) 除去染色体DNA、RNA(生物、化学、物理) 除去染色体 、 (生物、化学、物理) 浓缩、 浓缩、纯化

质粒载体 能在受体系统复制 有尽可能多的限制酶的单一切点 有正选择标记 分子量较小(拷贝数高、转化效率高、操作方便等) 分子量较小(拷贝数高、转化效率高、操作方便等) 能高效表达外源基因 在细胞分裂时保持稳定 外泌性、 外泌性、不可转移性等 穿梭(shutle)质粒 质粒 穿梭

噬菌体 噬菌体是以细菌为宿主的病毒，由遗传物质核酸与蛋 噬菌体是以细菌为宿主的病毒， 白质外壳组成，只有在宿主细胞里才能繁殖。 白质外壳组成，只有在宿主细胞里才能繁殖。 按形状分类: 按形状分类: 蝌蚪状噬菌体(T4)、球状噬菌体(?X174)、线状噬菌体 、球状噬菌体 蝌蚪状噬菌体 、线状噬菌体(Ff) 按遗传物质分类: 按遗传物质分类: RNA噬菌体 噬菌体(MS2)、单链 噬菌体(M13)、双链 噬菌体(λ) 噬菌体 、单链DNA噬菌体 噬菌体 、双链DNA噬菌体 噬菌体 按与宿主的关系分类: 按与宿主的关系分类: 烈性噬菌体、 烈性噬菌体、温和噬菌体 温和噬菌体可能构建为载体

温和噬菌体的生活史 非溶源菌 溶源化 感染 复愈 λ 营养期 菌裂解) (菌裂解)

溶源菌 诱导

噬菌体载体 能感染受体细胞， 能感染受体细胞，并能在细胞内复制 在非必须区内有多种限制酶的单切或双切位点 能容纳不同大小的外源DNA片断并包装成感染性颗粒， 片断并包装成感染性颗粒， 能容纳不同大小的外源 片断并包装成感染性颗粒 重组噬菌体有一定产量 能形成噬菌斑， 能形成噬菌斑，并能通过噬菌斑的形成与表型区分重 组与非重组噬菌体 生物学安全性

噬菌体的制备 培养寄主菌 接种噬菌体 固体培养: 固体培养:双层平板法 液体

培养: 液体培养:至培养液澄清 噬菌体DNA的制备:苯酚反复抽提 的制备: 噬

菌体 的制备 关键是得到高浓度的噬菌体) (关键是得到高浓度的噬菌体)

目的基因的获得 化学合成 酶促合成 cDNA合成 合成 PCR 鸟枪法

化学合成基因 用化学法合成目的基因的条件: 用化学法合成目的基因的条件: 1，已知基因的核苷酸序列，或至少要知道该基因产 ，已知基因的核苷酸序列， 物的

氨基酸序列 2，基因必须很小 ， 举例: 举例: 生长激素释放抑制因子(somatostatin) 生长激素释放抑制因子 10L E.coli 发酵液 5 mg somatostatin

cDNA合成基因 mRNA 5’ dT 5’ AAAn 3’ TTTn 5’ (合成引物 合成引物) 合成引物 AAAn 3’ (模版 模版) 模版 逆转录酶:合成RNA-DNA 逆转录酶:合成 碱处理:得单链cDNA 碱处理:得单链 DNA聚合酶:合成带发夹环的双链 聚合酶: 聚合酶 合成带发夹环的双链DNA S1核酸酶:去发夹环，得双链 核酸酶: 核酸酶 去发夹环，得双链DNA

PCR合成基因 已知基因序列 已知基因保守区序列 反向PCR 反向 RT-PCR

反向PCR 用限制酶R1切出已知序列及其上下游区(2,3kb)， 稀释 各片段自我连接成环 用在已知序列内只有单切点的限制酶R2再切开 用与已知序列5’端互补的引物PCR，原已知序列的两端 已在中间被大量扩增 限制 只能扩增紧靠已知序列两端的序列 R1应能产生大小合适并包括待扩增序列，R2应在已知序列内只有 单切点

鸟枪法 用适当的限制酶将含有目的基因的供体基因组切成不同大小的 DNA片段 片段 根据需要收集一定大小的DNA片段，这些片段应比目的基因大， 片段， 根据需要收集一定大小的 片段 这些片段应比目的基因大， 其中包括了带有目的基因的片段 将这些DNA片段连接到载体上 得到大量不同的重组DNA， 片段连接到载体上， 将这些DNA片段连接到载体上，得到大量不同的重组DNA，其中 包括了带有目的基因的重组DNA 包括了带有目的基因的重组 将所有重组DNA转化受体细胞，得到大量不同的重组子，其中包 将所有重组 转化受体细胞，得到大量不同的重组子， 转化受体细胞 括了带有目的基因的重组子 从大量重组子中筛选带有目的基因的重组子。 从大量重组子中筛选带有目的基因的重组子。由于鸟枪法克隆的 基因不是专一的， 基因不是专一的，因此筛选时要运用一些特殊的方法与技巧

鸟枪法供体基因组的切割 选择限制酶与反应条件时应考虑: 选择限制酶与反应条

件时应考虑: 片段大小 目的基因的完整性 片段的末端 识别6核苷酸序列 识别

核苷酸序列 识别4核苷酸序列 识别 核苷酸序列 46=4096 44=256

基因库 建立一定概率的基因库所需的克隆数: 建立一定概率的基因库所需的克隆数: N = ln ( 1-P ) / ln ( 1-f ) P:所需的概率 : f :克隆的片段与整个基因组的长度比 概率需2301个克隆 例:细菌基因组4000kb，克隆片段 细菌基因组 ，克隆片段4kb ，90%概率需 概率需 个克隆 99%概率需 概率需4603个克隆 概率需 个克隆 克隆片段40kb ，90%概率需 概率需229个克隆 克隆片段 概率需 个克隆 99%概率需 概率需458个克隆 概率需 个克隆

cDNA文库 mRNA的数量和复杂程度要远远低于基因组 的数量和复杂程度要远远

低于基因组DNA 的数量和复杂程度要远远低于基因组 N = ln ( 1-P ) / ln ( 1-n ) P:

所需的概率 : n:低丰度 与总mRNA之比 :低丰度mRNA与总 与总 之比

DNA体外重组 易于操作 外源DNA DNA片段可回收 外源DNA片段可回收 插入

片段与载体启动子阅读框一致

DNA体外重组的方式 体外重组的方式 平末端连接 粘性末端连接 载体与外源DNA用同一限制酶酶切 用同一限制酶酶切 载体与外源 载体与外源DNA分别用产生相同粘性末端，但识别 分别用产生相同粘性末端， 载体与外源 分别用产生相同粘性末端 序列不同的两种限制酶酶切， 序列不同的两种限制酶酶切，在切载体的限制酶活性 存在的条件下连接 定向克隆 部分补齐法 HindIII?AGCT, BamHI?CTAG ? ? 人工接头法

连接效率 连接效率:载体与外源 连接得到重组DNA在总连 连接效率:载体与外源DNA连接得到重组 连接得到重组 在总连 接产物中的比例 影响连接效率的因素 DNA浓度 浓度 DNA片段长度 片段长度 DNA片段的卷曲度 片段的卷曲度 DNA末端的状态 末端的状态 载体与外源DNA的比例 载体与外源 的比例 判断连接效率的两个参数 片段长度, 分子内粘性末端的有效浓度 j=(3/2πlb) 3/2 l: DNA

片段长度 b: DNA片段卷曲度 π 片段长度 片段卷曲度 全部粘性末端的浓度 i=2N0M10-3/ml M:摩尔浓度 摩尔浓度 j = i 自连与互连相等， j < i 互连为主， j > i 自连为主 自连与互连相等， 互连为主，

基因的转移 转化( 直接进入细胞的过程， 转化(transformation):游离 :游离DNA直接进入细胞的过程，目前主 直接进入细胞的过程 要有感受态 感受态(competance)和原生质体 要有感受态 ) 原生质体(protoplast)转化 转化 转染(transfection):游离的噬菌体 直接进入细胞的过程， 转染 :游离的噬菌体DNA直接进入细胞的过程，转 直接进入细胞的过程 染率较低， 染率较低，一般采用感染 感染(infection):DNA包装进病毒颗粒后进入宿主细胞的过程 感染(infection):DNA包装进病毒颗粒后进入宿主细胞的过程 转导(transduction):通过噬菌体为媒介在细菌间转移遗传物质的 转导 : 过程 结合(conjugation):通过细胞间接触，遗传物质从供体细胞转入 结合 :通过细胞间接触， 受体细胞的过程 物理方法

结合转移的条件 细胞紧密接触 转移(tra)基因:至少包括 个基因，编码鞭毛和一些 基因: 个基因， 转移 基因 至少包括12个基因 膜结构 泳动(mob)基因:两个区域(1)编码泳动蛋白 (2) 基因: 泳动 基因 两个区域( ) ) 结合泳动蛋白形成松散结合体 ，使质粒分子在这区域 上打开一个缺口( 上打开一个缺口(nic/bom区) 区 结合型质粒:带有 的质粒(tra+、mob+) 结合型质粒:带有(tra、mob)的质粒 、 的质粒

结合转移的材料 受体细胞 供体细胞，含有被转移质粒( 供体细胞，含有被转移质粒(包括外源 基因及mob区，无nic/bom区的质粒不能 基因及 区 区的质粒不能 被转移)和助体质粒(helper，带tra+)， 被转移)和助体质粒 ， ， helper也可是细胞 也可是细胞 助体细胞 (helper，带tra+) ，

结合转移的方法 滤膜杂交 分别培养细胞 混合菌液，浓缩细胞 混合的浓缩菌液滴于无菌滤 膜，铺于培养基平板 培养细胞，洗下菌液 稀释后置于选择性平板上培 养 菌液杂交 分别培养细胞 受体菌涂于培养基平板 滴5ul供体菌液于受体菌平板 培养细胞 长出菌落后转移到选择性平 板上培养

工程菌的筛选 初筛: 初筛:筛出重组子 复筛: 复筛:筛出带目的基因的重组子

琼脂糖凝胶电泳 lg? = lg?0 - Krτ ? :泳动率 ?0 :自由泳动率 τ :胶浓度 泳动

率， 自由泳动率， 泳动率 自由泳动率 胶浓度 Kr :与胶的性质、分子大小、构

象有关的常数 与胶的性质、分子大小、 与胶的性质 oc (opened circular or nicked circular) DNA L (linear) DNA ccc (covalent closed circular) DNA

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 用于分析DNA小片断、RNA、蛋白质等 小片断、 用

于分析 小片断 、 凝胶的浓度与聚合 蛋白产物分析 双向(2D)电泳 双向 电泳

分子杂交 原位杂交 印迹法(blot) 印迹法 Southern blot Northern blot Western blot

Southern- Western blot

原位杂交法

印迹法 Southern blot:DNA经ararose电泳后转移到膜上，再 与探针杂交来分析DNA的技术。由C. E. Southern发明 而得名 Northern blot:RNA经ararose或PA电泳后转移到膜上， 再与探针杂交来分析RNA的技术 RNA Western blot:蛋白质经PA电泳后转移到膜上，再通过 免疫方法来分析蛋白质的技术 Southern-Western blot:蛋白质经PA电泳后转移到膜 上，再与DNA探针来鉴定蛋白质分子与DNA的特异性 结合

免疫学方法 直接免疫分析 三明治(sandwich)法 三明治 法 ELISA(enzyme linked

immuno-sorbant assay)

直接免疫分析 原位裂解含Ag的菌共价结合到 膜上后，直接与I125标记的Ab反应

后 放射自显影

三明治法 一个抗原可有几个抗原决定簇(antigenic determinant)，可与一个以上抗体

起反应。 抗体1结合在支持物上 ? 与细胞抽提物中的 1 抗原结合 ?与标记的抗

体2结合 ? 放射自 显影

ELISA(enzyme linked immunosorbant assay) 免疫学方法与酶学方法结合的分析系

统 Carrier-Ag-Ab1-Ab2-Enzyme 通过测酶来测定抗原，灵敏度高

基因产物分析 细胞裂解物 PAGE分析 高表达产物分析 Minicell和Maxicell系统分

析

DNA序列分析 A T C G 加减法 化学法 双脱氧法 3’

AACGTATTGCTACTGCC 5’

加减法 模板 3’ 引物 5’ DNA polymerase I 4 dNTP (P32标记一种) DNA

polymerase I dCTP dGTP dTTP -A (A) (A) (A) DNA polymerase I(3’外切) +A

dATP A A A

化学法 P32标记3”末段 硫酸二甲酯处理(G>A) :使G的7位和A的3位N部分甲基化，中性 pH加热，G(少量A)碱基脱落，再用0.1 mol NaOH处理，加热到 90?C使糖基脱落 硫酸二甲酯处理后加稀酸: A先断裂(A>G) ，再用0.1 mol NaOH 处理，加热到90?C使糖基脱落 DNA与肼反应(C+T) :C、T脱落成核糖脲，与哌啶作用在C、T 处切断DNA DNA与肼反应时加2M NaCl (C) :可抑制T脱落

双脱氧法 4种反应体系中掺入ddATP、 ddCTP、 ddGTP、 ddTTP，反应分别止于

A、 C、 G、T 控制dNTP与ddNTP的比例，可得不同长度的DNA片段

测序用酶 Klenow片段在dA:dT丰富区测序较准确，逆转 录酶对dC重复区识别较好，可以互相补充。 用Taq酶可在70 ?C进行，能清除模板的二级 Taq 70 C 结构，防止链合成提前终止，并增加引物的特 异性。 T7 DNA聚合酶又称测序酶。延伸链的聚合能 力强，延伸速度快，可从靠近引物5bp处直到 1kb处。

M13噬菌体序列分析系统 M13噬菌体:丝状噬菌体，基因组为环状单链DNA， 在

细胞内的复制型(RF)为环状双链DNA MCS LacZ M13mp18 (7.25kb)

质粒的稳定性 质粒稳定性的检测方法: 质粒稳定性的检测方法: 100% 一定代

期或时间 ? 选择性培养基 非选择性培养基 非选择性培养基(M) 选择性培养基

选择性培养基(m) 选择性培养基 质粒丢失率 = (M-m)/M ×100%

质粒不稳定性的分类 分离不稳定性(segregational instability): 分离不稳定性 : 质粒在细胞培养过程整个质粒的丢失 结构不稳定性(structural instability): 结构不稳定性 : 重组质粒外源DNA的丢失或发生缺失、插 的丢失或发生缺失、 重组质粒外源 的丢失或发生缺失 入、重排等

分离不稳定的影响因素与改善途径 影响因素 载体类型 克隆DNA的来源 克隆 的来源 质粒大小 质粒拷贝数 分配功能 温度 改善途径 选择恰当质粒 范ㄊ室说目寺』蚶丛?限制插入片断大小 用高拷贝数质粒 引入稳定功能或编码必需产 物的基因

结构不稳定的影响因素与改善途径 影响因素 强启动子的存在， 强启动子的存在，产物过量 可能影响质粒的复制等功能 改善途径 用低拷贝数质粒或染色体插 入载体 用热诱导启动子， 用热诱导启动子，时间控制 基因表达 引入使单链DNA高效转化为 引入使单链 高效转化为 双链DNA的序列 双链 的序列 除去引起缺失作用的序列 DNA复制时经过单链为中介， 复制时经过单链为中介， 复制时经过单链为中介 引起分子内重排 DNA重复序列在复制时引起 重复序列在复制时引起 缺失

期中思考题 请各列举1个可应用微生物来解决的 实际问题和不可应用微生物来解

决的实 际问题，并简单说明理由。

范文三：应用微生物学

微生物的可利用性:：利用微生物的菌体、代谢产物、代谢活力

微生物应用的一般方法：采样→（富集）→初筛→复筛→小试→中试→大试→正式生产

分离菌种、试验、生产、初筛

要求：① 快速，能尽快检出目的微生物，② 敏捷，能迅速处理众多样品；③ 经济，一次能筛选多个目的微生物

方法：① 平板培养并检测法；② 摇瓶培养平板检测法

利用溶解、降解、沉淀、显色、生长、抑菌等现象指示目的菌。如用指示剂发现有机酸和胺类，用碳酸钙法检出有机酸。但若氮源是酸性盐或碱性盐则可能造成假产酸产碱现象，需进一步用纸层析法确定。

复筛：将平板初筛的菌株用摇瓶液体培养或固体培养后抽提物质进行精确定量测定（如蛋白酶用分光光度法；脂肪酶用NaOH滴定法）筛选高产菌株。一个菌株通常要做3~5个重复。

精确测定法可信度大，但操作繁琐，测定时间长，工作量大。因而有时把摇瓶复筛的发酵液用平板法和精确法结合进行测定：把所有摇瓶复筛菌株的发酵液，用平板法测定一遍（同步重复2~3块板），将其中活性圈大而清晰的菌株发酵液进一步用精确法测定，选出较优良的菌株2~3株。

酒的大类：1、发酵酒：发酵后直接或过滤后饮用的酒。该类酒营养丰富、酒精浓度低。

2、蒸馏酒： 当酒精浓度为18%左右时，酵母的活动就停止，因此只靠发酵不能生产酒精含量高于18%的酒精饮料，但可以用蒸馏的方法得到。

世界上六大蒸馏酒：中国白酒、白兰地、威士忌、郎姆酒、伏特加、金酒。

3、配制酒：在发酵酒和蒸馏酒的基础上，采用浸泡、混合、勾兑等方法添加了色素、甜味剂、药物或调味料的酒，如各种药酒和鸡尾酒。

葡萄酒的种类：按含糖量分：红葡萄酒（用红皮葡萄连皮一起酿造、在发酵后进行压榨、红色色素溶于酒中的葡萄酒。）、白葡萄酒（用白葡萄或去皮红皮白肉葡萄酿造、在发酵前进行压榨、不含红色色素的葡萄酒。）、甜葡萄酒（含糖量大于50g/L的葡萄酒。）、干葡萄酒（酒精发酵完后含糖量小于4g/L的葡萄酒。）、半干葡萄酒（含糖4.1-12g/L。）、半甜葡萄酒（含糖12.1-50g/L）。

自然发酵法：选成熟、品质好、清洁的葡萄，破碎（白葡萄酒还要压榨除渣）后添加一定量的二氧化硫，自然发酵（经常搅拌）2-3天后补加一些糖和硫酸铵，继续发酵至酒精浓度达10%以上。

纯酵母法：在葡萄汁中加入二氧化硫3-4小时后接入1-3%的纯酵母（一般是椭圆酵母），25-30℃发酵5-9天。

红、白葡萄酒常用SO2浓度（mg /L ）

SO2的作用：选择性促发自然酒精发酵。多数腐生性微生物对SO2敏感，而酵母菌有抗性。抗氧化。 SO2形成的亚硫酸盐比葡萄酒中的其它物质更容易被基质中的氧氧化为硫酸盐，从而抑制或推迟葡萄酒中其它成分的氧化作用。

老熟（陈酿）：刚发酵好的红葡萄酒呈鲜红色，有涩味，几乎无法饮用，至少应放置8-10个月。 此间产生各种香气和香味物质，成熟后变成琥珀色。

葡萄酒在老熟达到顶峰并稳定一段时间（一般为5-10年）后开始变质。

三、啤酒

啤酒是以麦芽（多是大麦芽）为主料，以大米或其它谷物、酒花为辅料，经酵母发酵酿制而成的含有二氧化碳、起泡的低酒精度饮料 。

啤酒的种类：1、按酵母菌性质分：上面啤酒：发酵结束后酵母菌（如卡尔斯伯酵母S. carlsbergensis ）浮在上面的啤酒。下面啤酒：发酵结束后酵母菌（如酿酒酵母S. cerevisiae）沉于下面的啤酒。

我国和其他多数国家生产的啤酒是下面啤酒，只有少数国家（如英国和美国）生产上面啤酒。

2、按保鲜处理分：鲜啤酒：不经保鲜处理，低温下可存放 1 星期。熟啤酒：包装后进行巴氏灭菌，保质期60天（二

级）至120天（一级优级）以上。纯生啤酒：在0℃左右用孔径0.4-0.6微米的膜过滤除菌，保质期60天至90天以上 。 啤酒生产过程：浸泡：用水浸泡大麦约2天，使其吸水膨胀、变软，注意换水通气。发芽：将水放干，12-20℃发芽5-8天，至芽长为麦粒长的2/3-3/4即可，注意保持水分和通气。焙燥：目的是停止麦芽生长和去除麦芽的生青气味。先在50℃左右使水分降至8-10%，再在65℃使水分降至3%左右。制备麦芽（多用大麦）。加酒花：在糖化液中加入啤酒花，煮沸1-1.5小时，过滤冷却。 啤酒花赋予啤酒特有的苦味和芳香味

后发酵：目的：去除双乙酰、硫化氢、乙醛等造成的“生酒味”。使残糖继续发酵并饱和二氧化碳。使酒液澄清。方法：将主发酵完的嫩啤酒贮存于地下室的酒桶内，上部留10-15厘米空隙，敞口发酵2-3天以去除生酒味，然后封口使二氧化碳逐渐饱和，随着时间的延长和温度的降低，更多复合物析出、沉降，使酒澄清。贮酒时间为1-5个月。 黄酒的生产流程：1、制麦曲2、制酒药（小曲）3、制酒母4、发酵。

将小麦粉碎，加30-35%的水，自然发酵（约30天）或加入纯种米曲霉发酵而成。

以早籼米粉、辣蓼草末加水，接种或自然发酵而成。

将糯米浸水40-45小时至水分含量约24-26%，蒸煮15-30分钟，淋冷至7-9℃ ，拌入酒药，堆成空圆堆状，26-28℃2天后即有甜液出现，当甜液达4/5高度时，加入糯米重量15%左右的麦曲与水的混合物，搅拌均匀，保温20天左右即可，其间应适当搅拌。

清酒的生产流程：1、制米曲2、制酒母3、发酵

1.将精白大米浸透蒸熟后冷却到35℃左右，接种米曲霉，30℃左右堆积发酵，每隔6-8小时打散翻曲，培养30-40小时。

2. 将冷至7-9℃的蒸米和米曲、水混合（7:3:11），7-8℃发酵。8-12小时后每隔数小时搅拌一次，第四天时品温开始上升，10天左右温度升至16-20℃ ，此时产生了足够的乳酸抑制细菌生长，而酵母菌仍可生长，再发酵20天左右即可。

3. 将摊冷的蒸米和米曲、酒母、水一同落缸，搅匀后18-20℃发酵，8小时后开始搅拌，控制温度不超过30℃ ，10-12天后结束。

六、中国白酒：按糖化剂和发酵剂分

大曲：以小麦、大麦、豌豆为原料，粉碎加水制成块状曲胚，自然发酵3个月而成

按制曲过程中的最高温度，大曲主要分为高温曲（60℃以上）和中温曲（50℃以下）

2、中国白酒的生产方式：固体法、液体法、半固体法

糖化、发酵、蒸馏均为固体形式，糖化和发酵同时进行，多数白酒采用。又分为糖化、发酵、蒸馏均为液体形式。原料糖化→接酒母→发酵罐内发酵→蒸馏塔蒸馏，较少数白酒采用 。

固态糖化，液态发酵、蒸馏，部分小曲酒采用。

食醋分为酿造醋、再制醋、合成醋三大类

酿造醋是在酿酒工艺基础上，添加醋酸菌将酒精氧化成醋酸而成的醋。

再制醋是以酿造醋为基料进一步加工而成的醋，如五香醋、蒜醋、姜醋、固体醋等。

合成醋是以化学合成的醋酸配制而成的醋。

2、醋酸发酵：当酒精发酵5-7天，缸温达38 ℃ ，酒精含量7-8%（夏天不低于6%，酒精含量超过8%将抑制醋酸菌生长，可降低原料淀粉含量来控制）时拌入4%粗糠和3-4%成熟醋醅。每天倒缸翻醅（通风散热）一次以控制品温在37-39℃。当醋醅温度下降到35 ℃ 、酸度不再上升时表明醋酸发酵已经结束。将近结束两天前加盐（醋醅的1.5-2%）防止过度氧化。

3、淋醋： 用三循环法：成熟醋醅用二醋浸泡20-24小时后缓慢淋出的醋为头醋，即食醋的半成品；头醋渣用三

醋浸泡淋出的醋为二醋；二醋渣用清水浸泡淋出的醋为三醋。若不能及时淋醋，应加入食盐抑制醋酸菌继续生长，防止醋酸过氧化。

酱油制作（低盐固态法）：制曲、发酵、浸油、灭菌、配兑、装瓶

制曲

一级种曲：85%麸皮加15%豆饼粉，再加入一倍的水拌匀后分装20g/三角瓶，灭菌打散冷却后接入2环米曲霉斜面孢子，31℃培养，16小时后早晚各扣瓶一次，三天后孢子长满曲料即可。

二级种曲：配料同上，灭菌冷却至35-38℃后接入0.1%一级种子，摊开1-2厘米厚，室温30℃左右保温约16小时后品温升至38℃左右曲料表面微白色、开始结块时应搓碎摊平降温。再经6-8小时后温度又升至36℃、全部长满白色菌丝、结块良好时划割成小块以利通风降温，保持品温34-36℃ ，总计约72小时后成熟。

成曲：豆饼与麸皮8:2至6:4混匀，加一倍水，30分钟后蒸煮灭菌，迅速冷却至35-40℃接入0.3%二级种曲，摊料25-30厘米厚，通风并保持品温35℃左右，至普遍长出淡黄绿色孢子（约需24-28小时）即可。

豆酱制作：制曲、制酱 豆腐乳制作：菌种准备、前发酵、后发酵

菌种准备

毛霉（或根霉）孢子悬液或干粉。2、面黄：用面粉培养米曲霉而成。3、红曲：用大米培养紫红曲霉而成。

面包制作：发酵、烘烤、发酵

先将1/3的面粉加水和酿酒酵母（1-2%）混合成面团发酵2h，称为小发酵。然后将其余面粉加水，再加入经小发酵的面团，混合均匀，进行大发酵，发酵温度30 ℃ ，时间1-4h。

酵母菌分解面粉中的葡萄糖、果糖和蔗糖，再加上淀粉酶与转化酶的作用，产生CO2、醇和一些有机酸。 CO2被面团中的面筋包围，不易跑出，因而面团逐渐胀大。

烘烤

发酵后的面团经加工造型后放在220℃以上的高温炉中烘烤，面团内CO2受热膨胀逸出，造成了面包多孔海棉状结构。面团中的其他发酵产物，构成了面包特有的香昧。若发酵面团经加工造型后在100℃蒸汽中蒸熟，即成馒头。

泡菜制作：泡菜水配制、加料发酵

泡菜的制作原理：主要是在厌氧条件下利用乳酸细菌进行乳酸发酵和少量的酵母菌进行乙醇发酵的作用。

发酵：将蔬菜洗净，剔除粗皮、须根、老叶及病叶，沥干或晾干后装入坛中，装至半坛时将香料包放入，装至离坛口6cm处，用竹片将原料压住。随即注入已配制好的泡菜水，务必将原料淹没，最后将坛口密封，置阴凉处自然发酵。1-2d后打开坛口，适当添加原料和泡菜水，装满至坛口下 3 cm时为止。

泡菜的成熟时间因原料的种类及泡制时的气温而异。一般新配制的泡菜在夏天需要5-7 d，冬天需要 12-16 d。叶菜类比根、茎类泡制时间短。加入陈泡菜水可以大大缩短泡制时间。

甜酒制作：蒸米、装坛、发酵、后熟

食用药用菌栽培：纯种分离（一级种、母种）：孢子分离法、涂抹法、钩悬法、组织分离法、菌体组织分离法、椴木组织分离法

表面消毒：用75％酒精擦洗或0.1％升汞冲洗表面一至二次后，再用无菌水冲洗几次。

微生物饲料：调制干草、青贮饲料、秸秆微贮饲料、发酵粗饲料、饲料酵母、白地霉饲料、光合细菌饲料、微藻饲料、烃蛋白饲料

二、青贮饲料：把新鲜的青饲料，如玉米杆、根茎类、栽培牧草等，经切碎并填入和压紧在青贮窖或青贮塔中，密封后经过微生物的发酵作用而调制成的一种多汁、耐贮藏、能供家畜全年使用的饲料。这种调制饲料的方法称为青贮。

原理：青贮原料上附着的乳酸菌等微生物在厌氧条件下，将青贮原料中的碳水化合物（主要是糖类）变成有机酸（主要是乳酸），抑制了有害细菌（如腐败菌和丁酸菌等）和霉菌的生长，从而使青贮料得以保存并带有芳香酸甜的味道，提高了适口性。

八、微藻饲料：小球藻饲料、螺旋藻饲料

微藻会大量富集一些对人和动物有害的物质如重金属，因此不能用含有重金属或其他有害物质的废水来培养。 小球藻饲料：小球藻含有50％（干）的蛋白质、丰富的维生素和叶绿素，是优良的蛋白质饲料。

培养液：每千克水加入尿素0.6克、磷酸二氢钾0.25克、硫酸镁0.25克。此外，人畜粪尿、堆肥浸汁、无毒的有机物废水也是培养小球藻的良好培养液。池深10厘米，接种3～4天后，当水变成浓绿色时即可收获。收获时，每次

舀出3/4的绿水，剩下1/4的绿水加入新鲜培养液后继续培养。

螺旋藻饲料：螺旋藻是常用微藻（小球藻、绿藻、螺旋藻）中蛋白质含量最高（60－70％）、营养最全面、消化吸收及适口性最好、无毒无副作用 、安全性最高的藻种。培养螺旋藻的池深10厘米，pH8～ 10，温度30℃，为了获得高产，应通入 二氧化碳，同时要进行搅拌。当培养条件适宜时，产量（干重）可达40吨/公顷。

饲料添加剂：饲用抗生素、饲用酶制剂、微生态制剂

饲用酶制剂：聚糖酶、植酸酶、淀粉酶和蛋白酶、酯酶和环氧酶

植酸酶：所有植物性饲料都含有1％-5％的植酸盐，它们含有占饲料总磷量60％-80％的磷，但单胃动物无法分解利用植酸盐。植酸酶能水解植酸盐，一方面使其中的磷以无机磷的形式释放出来，被单胃动物所吸收；另一方面使得与植酸盐结合的锌、铜、铁等微量元素及蛋白质释放，提高利用率。植酸酶还能降低粪便含磷量约30％，减少磷对环境的污染。

霉菌毒素如玉米赤酶烯酮，细菌毒素如单孢菌素，是饲料在潮湿环境下易产生的微生物毒素。

酯酶能破坏玉米赤酶烯酮，环氧酶能分解单孢菌素，生成无毒降解产物。

2、微生态制剂是活的微生物制剂，可以调整和维持消化道微生物区系的平衡，提高动物生产性能和抗病能力。 微生态制剂菌种的要求是对致病菌有较强的抑制作用（竞争或拮抗）；营养要求低；对胃肠道酸碱环境有较强耐受力；对磺胺有一定的耐药性；用于家禽的菌种还应能耐受41～43 ℃的培养条件。

目前应用较多的菌种有嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、需氧性放线菌、酵母菌等。

微生态制剂一般应密封保存在阴凉环境，温度不宜超过45℃，并尽量避免与抗生素混用或接触消毒剂。

微生物医药：抗生素、免疫制品、酶抑制剂、受体拮抗剂、维生素

抗生素：β-内酰胺抗生素、大环内酯类抗生素、多烯大环内酯类抗生素、蒽沙大环内酯类抗生素、四环类抗生素、氯霉素、肽类抗生素、氨基糖苷抗生素、抗肿瘤抗生素

β-内酰胺抗生素：青霉素、头孢霉素、青霉素、发酵青霉素、半合成青霉素

青霉素的核心是6-氨基青霉烷酸。商品头孢霉素都是半合成的。

免疫制品：免疫抑制剂、免疫增强剂、疫苗、类毒素、免疫血清

l、死疫苗：将病原微生物用物理方法(如加热)或化学方法(如用甲醛处理)杀死但保留其抗原性制成，适用于抗原性高而毒性强的菌株。缺点：不能在体内繁殖，维持抗原刺激的时间短，免疫力不高，所以接种量大，对人体的副作用也大，有时还会引起机体发热、全身或局部肿痛等反应，常须以小剂量多次注射。优点：容易保存。

常见的死疫苗有百日咳、伤寒、副伤寒、霍乱、流行性乙型脑炎和斑疹伤寒、狂大疫苗等。

2、活疫苗：用毒力丧失或减弱但仍保持抗原性的病原体突变株制成。如卡介苗(预防结核病)、炭疽疫苗、牛痘疫苗、鼠疫疫苗、脊髓灰质炎疫苗以及麻疹疫苗等。优点：免疫力持久，用量小，只需一次接种，副作用小。缺点：易失效，难保存。

制备活疫苗的菌株来源有两种：一是从具有免疫力的带菌机体中选择弱毒株(如鼠疫疫苗)；二是用人工培养法使病原体变异以降低毒力(如麻疹疫苗、卡介苗)。

制备活疫苗所用菌株，其无毒或弱毒性状必须很稳定，即使反复进入易感机体也不会恢复毒力，否则就不能用于制备活疫苗。

3、自身疫苗：是用从患者病灶中分离的病原菌制成的死疫苗，作多次皮下注射后，可治疗那些反复发作并久经抗生素治疗无效的慢性细菌性感染疾病。如葡萄球菌引起的慢性化脓性感染，大肠杆菌引起的慢性肾炎等。

4、亚单位疫苗：将病原微生物中的有效成分提出来制成的疫苗，既可提高免疫效果，又可减少副作用，如腺病毒的衣壳亚单位疫苗、乙型肝炎的表面抗原亚单位疫苗以及大肠杆菌菌毛亚单位疫苗等。

类毒素：用0. 3％-0.4％的甲醛脱毒，但仍保持其抗原性的外毒素。最常用的类毒素有白喉类毒素和破伤风类毒素。 免疫血清：含有特异性抗体的血清叫免疫血清，用于人工被动免疫。

抗毒素：用类毒素免疫动物（通常是马）获得的免疫血清，如白喉抗毒素或破伤风抗毒素。抗毒素可中和相应外毒素的毒性，主要用于由外毒素所致疾病的治疗或应急预防。

球蛋白：胎盘球蛋白是从健康产妇的胎盘中提取的丙种球蛋白，主要成分为IgG 。

血清球蛋白是从血清中提取的丙种球蛋白，主要用于预防麻疹和传染性肝炎等疾病。

α-葡糖苷酶抑制剂：微生物产生的α-葡糖苷酶抑制剂可延缓膳食中糖类的消化吸收，从而有效地控制饭后高血糖，而不会发生其它降糖药物容易引起的低血糖等不良反应。（90％的糖尿病患者，因胰岛素分泌不足或胰岛素作用受阻而

使糖的代谢受到影响，造成饭后高血糖。控制饭后高血糖对于这类糖尿病的治疗及预防并发症有着重要意义）。

维生素C：即L-抗坏血酸，实用的微生物生产途径（部分参与）有两条：

微生物农药：杀菌剂、杀虫剂、除草剂 、四抗菌素、阿弗麦菌素、苏云金芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、金龟子芽孢杆菌、杆状病毒

微生物杀虫剂：一、四抗菌素（Telranactin）：也称杀螨素，是日本1971年从金色链霉菌S-3466（S. aureus S-3466）的菌丝体中提取获得的，由四个相同的高无活酸单体组成，属大环内脂类抗生素。

四抗菌素在其它方面的应用：（1）防治家禽的球虫病：在饲料或饮水中加入100-500ug／ml的四抗菌素，能有效地防治由球虫在鸡的盲肠和小肠上引起的病变。（2）防治猪的赤痢病：饲用10ppm的四抗菌素，能有效预防猪赤痢病；饲用100pprn以上的四抗菌素，1周内就能完全治好严重感染赤痢的小猪。（3）防治软体动物的危害：每亩土施用20g四抗菌素，24小时内能将有蜗牛等软体动物全部杀死。

二、阿弗麦菌素：阿弗麦菌素是日本和美国1979年用有机溶剂从Streptomyces avermililis提取获得的杀虫抗生素，属大环内脂类抗生素，含有8种主要组分。

方法与效果：阿弗麦菌素没有抗细菌、真菌和原虫活性，但抗杀蠕虫活性很强。阿弗麦菌素作为γ-氨基丁酸（GABA）的激动剂，在无脊椎动物体内引起神经信息传导抑制，使寄生虫发生麻痹而被排出体外（哺乳动物的GABA神经都限于中枢神经系统，所以阿弗麦菌素对哺乳动物的神经药理作用极小，从而显示出极高的选择性）。阿弗麦菌素不抑制蛋白质合成，又不是离子载体，副作用小，很安全，即使将用药浓度提高到有效浓度的50倍也对动物无毒性，对多种作物无药害。饲料中添加0.0002％的阿弗麦菌素，可以完全治愈螺旋线虫病；牛、羊、狗等家畜口服，对各类线虫、钩虫、蛔虫的驱虫率达90％-100％，但对肝蛭等吸血虫无效，服用阿弗麦菌素的动物排出的粪便仍有杀虫作用。

阿弗麦菌素能被肠道吸收，而且能透入粘膜和肌肉，因此不仅对消化道内寄生虫有效，对皮肤和皮下的寄生虫也有效。

亩用阿弗麦菌素0.5-22g就能有效控制柑桔锈壁虱、红蜘蛛、棉叶螨、广螨、马铃薯甲虫、梨虱和潜叶虫等多种害虫，并且对商品有机酸盐类、氨基甲酸甲脂类、氯化碳水化合物以及除虫菊脂类等杀虫剂有耐药性的螨类仍然有效。此外，阿弗麦菌素对仓库害虫大谷盗、粉虫以及家庭害虫蜚蠊、衣蛾、蠹（du）虫、家蝇等也有效，对土壤线虫有显著的驱杀效果，每公顷施药160-240g即可控制线虫危害。

三、苏云金芽孢杆菌：一种革兰氏阳性土壤细菌，既可腐生，又可寄生于昆虫。苏云金芽孢杆菌的作用更像化学杀虫剂，而不像传染源病原。

苏云金芽孢杆菌在芽孢形成过程中产生一个芽胞及一个或多个较大的蛋白质性质的晶体内含体——伴孢晶体，伴孢晶体可耐受紫外线照射，经几年储藏仍保持稳定。

在营养体生长的旺盛期，苏云金芽孢杆菌的某些菌株会产生一种分子量低、热稳定性高的毒素，称为β外毒素。该毒素的结构类似核苷酸，可以抑制哺乳动物细胞DNA依赖RNA聚合酶的活性。由于它的类似核苷酸结构可能导致昆虫畸形，注射到哺乳动物中具有毒性。

伴孢晶体含有不具活性的原毒素分子——δ-内毒素，被敏感昆虫幼虫吞食的晶体在碱性中肠液中溶解，随后原毒素被肠道蛋白酶降解，形成有活性的蛋白质毒素。成熟的毒素结合在幼虫肠道上皮细胞膜的特殊受体上，插入膜中，形成运输阳离子的直径10～20A的小孔，继而解除了离子和质子通透障碍，水伴随着离子流入肠道细胞，导致肠道细胞肿大、裂解。离子调节的缺乏也会导致肠道和嘴部肌肉麻痹，昆虫停止进食，最终导致死亡。

有的菌株产生单一的δ内毒素，有的则产生许多具有不同特征的δ内毒素。

四、球形芽孢杆菌

球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus）好氧，普遍存于土壤和水环境中，可以杀灭蚊子幼虫而对其它昆虫无害，其杀灭重要蚊子（库蚊和疟蚊）幼虫的能力高于苏云金芽孢杆菌。

球形芽孢杆菌的一些菌株，可以通过分解污染严重的水体中的有机物生活。与苏云金芽孢杆菌相似，球形芽孢杆菌某些菌株可以产生一种晶体蛋白毒素，它对敏感蚊幼虫的作用模式与苏云金芽孢杆菌毒素既有相似之处又有不同点。

球形芽孢杆菌的大小分别为51kDa和42kD的两种主要晶体蛋白质对幼虫都没有毒，但却都是产生毒性所必需的，因此称为二元毒素。蚊幼虫吞食晶体后，晶体在中肠碱牲环境中溶解， 51kDa和42kDa的蛋白质分别被加工成43kDa和39kDa蛋白质。毒蛋白结合于中肠上皮细胞，干扰特定蛋白的ADP核糖基化，导致幼虫进食受抑制并最终死亡。

五、金龟子芽孢杆菌：是各类金龟子科甲虫的病原菌。与苏云金芽孢杆菌和球形芽孢杆菌不同的是，金龟子芽孢杆菌不产生毒素，而是在被幼虫吞食后侵入血腔内迅速繁殖，两天内就能致死幼虫。幼虫死后，细菌转变成芽孢，单

个幼虫尸体内多达10的10次方个芽孢。金龟子芽孢杆菌使用的局限性是宿主太专一，必须用金龟子幼虫培养，因此只能进行小规模商业化生产，主要用于观赏植物和草坪的保护。

微生物肥料：是用于施用以改善作物营养供应、减轻病虫害、促进生长、增加产量和改良品质的微生物制品。 微生物肥料的种类：固氮微生物肥料、解磷微生物肥料、解钾微生物肥料、菌根真菌肥料、抗生菌肥料、植物促生根圈细菌、微生物复合肥料。

酒精（乙醇）发酵：微生物酒精生产主要用酵母菌进行，发酵过程和酿酒一样，但原料多采用更便宜的工农业废料（如糖蜜），并且提取酒精时在蒸馏步骤上增加了精馏步骤。另外，酒精生产也可以用细菌进行。

丙酮丁醇发酵：一、生产菌种：丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌、粉红梭菌是用于丙酮丁醇生产的代表菌株，它们能够直接利用淀粉，严格厌氧。二、生产流程：1、种醪制备：将1-2克砂土孢子接入10毫升5％玉米醪→37℃于真空干燥器培养24小时→接入5％玉米醪种母瓶→ 培养24小时→接入6％玉米醪第一种母罐→培养12-15小时→接入8％玉米醪第二种母罐→培养24小时。

丙三醇（甘油）生产：发酵型酵母、高渗酵母、耐盐藻类

发酵型酵母厌氧培养时，pH低于8生成酒精，但在pH高于8或者添加转向剂亚硫酸氢盐或碱式盐（如磷酸氢二钾）时生成甘油。亚硫酸氢盐与乙醛生成乙醇磺酸盐；碱式盐使两分子乙醛发生歧化反应生成乙酸和乙醇，使乙醛不能用于再生辅酶Ⅰ，迫使磷酸二羟丙酮还原为甘油。

高渗酵母包括耐盐酵母和耐糖酵母，属于呼吸型酵母，生长需氧，它们处于高渗环境时能在细胞内积累丙三醇和其它多元醇，不需要亚硫酸氢盐等转向剂。高渗酵母生产丙三醇及其它多元醇的产率受生长条件如培养基的组成、供氧水平、温度等的影响。

高的供氧速率有利于葡萄糖的利用和丙三醇的生成而不利于乙醇的形成。

葡萄糖是最常用的碳源。丙三醇生产的最佳糖浓度不是固定的，而是与供氧速率有关，供氧充分可显著提高最适的糖浓度，超过最佳糖浓度则产率下降。

最普通的氮源是酵母浸膏和玉米浆，再加少量的尿素或铵盐，使用糖蜜为碳源不用加酵母浸膏。发酵温度对葡萄糖的利用影响不大，有时影响不同产物的比率，最佳温度一般在30～35℃。

高盐环境中的藻类，具有生成胞内丙三醇抵抗高盐环境的生存机制。耐盐绿藻（Dunaliella、Astermonas）能产生50％干重的胞内丙三醇。

藻类生长和丙三醇生产所需的最佳盐浓度是不同的，故丙三醇生产分两步：培养阶段和生产阶段。

培养阶段（1-2天）：在养池中通入海水，池底连续通入二氧化碳以除去硫化合物和其他有毒物质，再加入4mmol/L KNO3、 1mmol/L NH4H2PO4、 0.5mmol/L NaCl，接入藻种，最大面积接触阳光照射，pH7-9，10-40℃培养。

生产阶段（几小时）：将培养好的藻体沉淀、离心，流入含4.5mmol/L NaCl的渗透罐。在渗透罐内细胞体积缩小排除部分水分，增加胞内溶质浓度，同时胞内储存的多糖只需较少的太阳能和二氧化碳就转化成丙三醇以应答瞬时渗透压环境的改变，随后继续利用太阳能和二氧化碳进一步合成丙三醇以平衡胞外的渗透压环境。

有用的微生物多糖：黄原胶、聚酯、葡聚糖、小核菌葡聚糖、出芽短梗孢糖、琥珀聚糖和热凝胶、藻酸

聚酯 ：如果碳氮比高，氮或氧限量，许多细菌积累脂族聚酯——聚-3-羟基烷酸，积累量占细胞干重的30％～80％。这些细菌包括好氧和厌氧的异养型细菌（如拜氏固氮菌和生枝动胶菌）、许多甲基营养型生物、好氧和厌氧型光营养生物（佛氏绿胶蓝细菌、深红红螺菌、奥氏着色菌）和古细菌（如地中海富盐菌）。

用有机溶剂从不同来源的细菌中萃取获得的聚-3-羟基烷酸的相对分子质量可达2×105，相应的聚合度约20000。 研究表明聚羟基烷酸是热塑性材料，而且是可以生物降解的。

聚-（R）3-羟基丁酸的分子结构和物理特性与聚丙烯相似，但聚丙烯是高度抗生物降解的，而聚-3-羟丁酸在许多环境中最终完全降解。聚丙烯和聚-3-羟丁酸之间的密度差异导致它们的产品在水中不同的沉浮能力。

在适合条件下，真养产碱杆菌以葡萄糖作为唯一碳源生长，产生聚-3-羟基丁酸，当加入丙酸，就形成3-羟基丁酸和3-羟基戊酸的无规共聚物（3-HB-co-3-HV共聚物），该共聚物随机分布的3-HV单位在共聚物中占有可预测的比例。

其他一些微生物在单一基质中生长，就能合成3-HB-co-3-HV共聚物。

3-HV在共聚物中所占的摩尔百分比极大地影响了3-HB-co-3-HV共聚物的物理性质。随着3-HV在共聚物中所占摩尔百分比的提高，熔解温度逐步降低（但分解温度保持不变），塑料的结晶度百分比从聚-3-羟基丁酸的80％以上，下降至含25％3- HV摩尔百分比的30％以下，共聚物的弹性和刚性也提高了几倍。

单一的聚-3-羟基丁酸形成脆性塑料，其熔点（177℃）只比分解温度低约10℃，因而加工困难。

微生物有机酸：柠檬酸、乳酸、丙酮酸、苹果酸、衣康酸、葡萄糖酸、亚麻酸、二十碳五烯酸、 二十二碳六烯酸、谷氨酸、赖氨酸、核苷酸

柠檬酸的用途：1、大量用于食品酸化添加剂，特别是软饮料和糖果，还可避免蔗糖因溶解度小而结晶成粒。

2、可与水中的碳酸盐作用生成二氧化碳（发泡）和柠檬酸盐，有助于药物的有效成分快速溶解，还可增加某些泻药和麻醉药的溶解作用，并可改善口味。还是血液抗凝剂。

3、柠檬酸盐有很好的洗涤剂性质，作为添加剂能取代磷酸盐配制易于生物降解的洗涤剂，以避免富磷化环境污染。含柠檬酸的洗发液能使头发具有光泽且富有弹性。可与铬矾、糊精、甘油和氯化铵等配制成固发液。

4、还可用作二氧化硫吸收剂、油井处理剂、纺织助剂、金属清洁剂、烟草添加剂和废水处理剂等。

二、生产菌种：淀粉原料用黑曲霉，烃类原料用假丝酵母

三、发酵工艺：柠檬酸对碳钢有腐蚀作用，而对一般不锈钢没有腐蚀作用，所以接触柠檬酸酸的设备必须用不锈钢制造。

四、发酵方法：固体发酵法、液体浅盘发酵法、液体深层通气法

五、提取（钙盐法）：1、沉淀：发酵液过滤得清液，加入石灰乳或碳酸钙形成柠檬酸钙沉淀，过滤，90-95 ℃热水洗涤。2、酸解：将柠檬酸钙加水搅拌成糊状，80 ℃以上搅拌加入硫酸进行置换。硫酸加量不足时柠檬酸中含有柠檬酸钙，导致浓缩时不能结晶；过量时会分解柠檬酸并腐蚀设备。3、脱色：将酸解的滤液用树脂或活性炭脱色。4、除阳离子：用树脂。5、真空浓缩并结晶。

乳酸的用途：乳酸可作为食品酸味剂和防腐剂、医用矿质离子的酸根，还可用作皮革业的脱灰剂以及用于生产乳化剂和润滑剂。乳酸聚酯塑料可用于外科缝合线与人工假肢。

菌种：糖质原料一般用德氏乳杆菌，乳清原料用保加利亚乳杆菌，纸浆废液用糖乳杆菌。

发酵：培养料在90-95 ℃灭菌1-2小时，冷至50接种，48-50 ℃培养3-4天。添加碳酸钙或氢氧化钠控制pH在

5.5-6间，低于5时发酵受抑制。

乳酸的提取：1、钙盐法：发酵液→氢氧化钙中和至pH11-12→压滤→氯化镁处理→浓缩→静止3-4天结晶→过滤得乳酸钙晶体→熔融→硫酸酸解→静止6小时以上→吸滤→浓缩→离子交换→浓缩、脱色→砂芯过滤

2、直接法：发酵液→（过滤→活性炭脱色）→加硫酸→过滤→静置→浓缩 →离子交换 →浓缩、脱色→砂芯过滤

3、锌盐法：发酵液→氢氧化钙中和至pH11-12→压滤→加硫酸锌 →过滤得乳酸锌晶体→加硫化氢 →过滤除去硫化微生物酶制剂用途：酶制剂广泛应用于食品、医药、纺织、皮革以及生物工程等领域，如生产干酪、面包、饮料酒、葡萄糖和果葡糖浆，澄清果汁和蔬菜汁，嫩化肉制品，纺织品脱浆，洗衣粉和洗涤剂添加剂，生物工程工具酶。

微生物酶制剂由于品种齐全、生产周期短、产量高而成为酶制剂中的主力军。

微生物酶制剂既可取代性能相同的动、植物主要酶制剂种类，又能生产出在100℃起催化作用的高 温-淀粉酶和在pH10～12起作用的洗涤剂蛋白酶等品种。

淀粉酶的用途：制糖、果汁澄清、发酵工业淀粉糖化、消化助剂、纺织品退浆。

淀粉是D－葡萄糖的线性或分支状均聚物的混合物。淀粉的无机酸水解是通常在含20％淀粉悬浮液、pH2和140℃的条件下进行，逆产物的形成以及葡萄糖的再聚合，将葡萄糖的产率大约限制在理论值的50％，还需用碳酸钠中和。酸水解的主要缺点是葡萄糖产率低，形成大量无机盐并需要抗腐蚀设备。

纺织品退浆

在布匹纺织生产过程中，摩擦导致线纤维高度机械性扭曲。应用淀粉浆，即上浆，增强了对扭曲的抗性，防止了因摩擦以及静电作用所引起的线断裂。然而，布料后续加工过程（染色、漂白和精加工），需要完全将淀粉除去。

根据高温细菌α-淀粉酶的稳定性所采用的连续退浆工艺是去除浆料的主要技木环节。在90℃热水中预洗10s后，将布料一至多次通过65～80℃的酶处理液，每次处理20s，处理液含0.5％～1％（m／V）枯草芽孢杆菌α-淀粉酶，0.05％（m／V）氯化钙（稳定酶）和0.2％～0.5％（m/V）非离子表面活性剂（湿润剂），然后漂洗布料。

二、蛋白酶 ：广泛应用于皮革脱毛软化、丝绸脱胶精炼、洗涤添加剂、蛋白胨明胶制备、肉类嫩化、酒类澄清、医药工业（注射用水解蛋白，消炎剂，血栓溶解剂）、奶酪生产、氨基酸及调味品生产。

微生物中产酸性蛋白酶的以霉菌为主，如黑曲霉、根霉、青霉等；产中性蛋白酶的主要是枯草杆菌、灰色链霉菌、曲霉等；产碱性蛋白酶的主要是枯草杆菌、短小芽孢杆菌等。

市场上大约80％家用洗涤剂含有0.015％～0.025 ％的蛋白酶。

家用洗涤剂中的酶必须具有以下特性：①高温（至70℃）条件下稳定；②对非离子表面活性剂有抗变性作用；③

在碱性范围（PH8～11）保持高活性；④催化活性不需要金属离子（所有的洗涤剂含有螫合剂，如乙二胺四乙酸或三聚磷酸，这些螫合剂将使得许多金属离子不能够被利用）；⑤对漂白的氧化剂（如次氯酸盐和过硼酸盐）有抗性。

枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶和地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶极好地满足了这些要求，广泛用于洗涤剂中。

凝乳酶 ：粗制凝乳酶是未断奶牛犊第四胃中的提取液，具有凝结功能的成分是蛋白水解酶，称为凝乳酶。

牛凝乳酶的周期性短缺已促使应用来源于粟疫霉（Endothica parasitica）、米赫毛霉（Mucor miehei）和微小毛霉（M. Pusillus）的真菌天冬氨酰蛋白酶来代替粗牛凝乳酶。

凝乳酶首先以381个残基前体物——前凝乳酶形式合成，并在分泌过程中加工成含365个残基的凝乳酶原，后者没有酶活性，但在低PH值条件下，多步自催化水解为323个残基的蛋白水解酶——凝乳酶。粗制凝乳酶实际上是凝乳酶原和凝乳酶的混合物。

纤维素酶：纤维素酶属诱导酶，有β-糖苷键的物质大多可作为诱导物。纤维素酶的产生菌有细菌、放线菌、高等真菌。纤维素由葡萄糖以β-1，4糖苷键相连而成。

石油开采步骤：1、一次采油：石油包含在贮油岩层的海绵状孔隙中，当油井钻成后，靠底层压力将石油运移到地面称一次采油。

2、二次采油：用注水井高压注水将原油赶出的方法称为二次采油。

3、三次采油：在二次采油后使用各种方法降低原油粘度或增加注入水粘度，缩小油与水的粘度差，控制水的流动性，避免“指状”流动，增大驱油面积，进一步将油开采出来的方法称为三次采油。

混相驱油、蒸汽驱油、表面活性剂驱油、聚合物驱油

三次采油：指将在地面上培养微生物产生的多糖或表面活性剂注入油层来提高原油采收率的方法。

采油工业广泛应用的微生物多糖有：右旋糖苷葡聚糖，普鲁兰糖，小核菌葡聚糖，黄原胶。

以烃为碳源的微生物是生物表面活性剂的重要来源。假单胞菌、节杆菌、不动杆菌、棒杆菌是产生生物表面活性剂的主要微生物类群。微生物生物表面活性剂属糖脂类或脂肽类物质，发酵后经萃取提纯。

地上微生物采油：将筛选培养的单一或混合菌株与营养物注入油层，使微生物在油层中繁殖，或只将营养物注入油层来激活油层中的微生物，靠微生物的活动及各种代谢物的作用从而提高采收率的方法。

与环境有关的微生物主要应用有两方面：环境监测与环境污染治理。

不同形态的地衣对大气污染的耐受能力不同，壳状地衣＞叶状地衣＞枝状地衣。

根据地衣形态分布把大气的污染程度分为四级：最严重污染区-----地衣绝迹；严重污染区-----只有壳状地衣；轻度污染区-----只有壳状地衣和叶状地衣；清洁区----- 3种地衣都有。

有机污染的微生物监测：自然水体中的腐生细菌数与有机物浓度成正比。

根据水体中腐生细菌的数量，可以将水体划分为多污带、中污带和寡污带。

根据腐生细菌数与细菌总数的比值，可以把水体分为α-腐生带、β-腐生带和多-腐生带。

大肠菌群：包括大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属，在48小时内发酵乳糖产酸产气，革兰氏阴性，需氧或兼性厌氧。

自然环境中的大肠菌群细菌不能在44.5℃生长，而粪便中的大肠菌群细菌能在44.5℃生长。

粪大肠菌群数：在44.5℃测定的大肠菌群数。总大肠菌群数：在37℃测定的大肠菌群数。

我国生活用水标准规定，1升水中的总大肠菌群数不得大于3。

2、粪链球菌：是存在于人和温血动物粪便中的链球菌的统称，为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的短链状球菌，在自然水体中不能自行繁殖。

测定粪大肠菌群/粪链球菌之值，可以判断粪便污染来源。人粪中该值为4.3－4.4，动物粪便中为0.05－0.8。

3、产气荚膜梭菌：为革兰氏阳性、产芽孢、还原亚硫酸盐的厌氧梭菌，存在于人和温血动物粪便内。由于芽孢对不良环境抵抗力强，产气荚膜梭菌在水体中存活期较长，适用于有毒水体的粪便污染监测，检出阳性就表明粪便污染。

若产气荚膜梭菌检出阳性而粪大肠菌群及粪链球菌检出阴性，表明是陈旧污染或样品放置太久。

四、有毒物质的微生物检测

发光细菌法：发光细菌（明亮发光杆菌）在对数期有很强的发光能力。当环境条件不良或有毒物质存在时，发光能力受到影响而减弱，其减弱程度与毒物的毒性大小和浓度成一定的比例关系。通过灵敏的光电测定装置，检查在待测物添加前后发光细菌的发光强度变化可以评价待测物的毒性。

硝化细菌法：硝化细菌在好氧条件下能把铵离子氧化成硝酸根。测定硝化细菌的相对代谢率可以检测水及土壤中

的有毒物，并以此评判水体、土壤环境及环境污染物的生物毒性，对于宏观生态环境健康程度的评价有重要意义。

污水的微生物处理

污水处理按程度可分为一级处理、二级处理和三级处理。

一级处理也称为预处理，主要通过格栅等过滤器除去粗固体。

二级处理称为常规处理，主要去除可溶性的有机物。

三级处理则称为高级处理，主要是去除氮、磷和其他无机物，还包括出水的氯化消毒。

（一）、活性污泥法

活性污泥：是以好氧性细菌为主体的微生物和水中的悬浮物质、胶体物质混杂在一起形成的肉眼可见的絮状颗粒，一般呈黄褐色，因水质不同也有呈深灰、灰褐、灰白等色，大小约0.05-0.5mm，表面积为20-100cm2／ml，比重约1.002-1.006，静置时能凝聚成较大的绒粒而沉降。活性污泥具有很强的吸附力，pH缓冲力和氧化分解有机质的能力。

曝气池：初次沉淀池（简称初沉池）废水先进入初次沉淀池，去除原废水中有机的和无机的悬浮固体、浮油，悬浮固体沉入池底，浮油经隔油回收。

曝气池是废水处理的核心部分，通过曝气使曝气池处于好氧状态，并使有机污染物与活性污泥充分接触，完成吸附和氧化分解过程。

二次沉淀池（简称二沉池）：在二次沉淀池中活性污泥与水分离，沉至池底，澄清水排放。

活性污泥膨胀：活性污泥结构松散、沉降力下降，随水流出曝气池及沉降池的现象。主要是由于丝状细菌比例过大引起。

造成污泥膨胀原因：①BOD:N和BOD:P的比值高；②pH值低；③BOD负荷高；④进水中的低分子碳水化合物多；⑤水温低；⑥有重金属等毒物流入；⑦流入废水的悬浮固体低。

控制污泥膨胀方法：①沉淀污泥与消化污泥混合；②投加5－50mg/L 的FeCl3， 10 －100mg/L的铝盐，40－200mg/L 的H2O2；③降低溶解氧；④降低BOD负荷；⑤改为推流式；⑥对回流污泥再曝气。

生物转盘法是利用在圆盘表面上生长的生物膜处理废水。盘片直径一般1－3m，最大 5m。盘片间的距离一般 30mm 。因为进水BOD5浓度越高，生物膜也将越厚，如采用多级转盘，则前级的盘间距为25－35mm，后级为10－20mm 。为了减轻盘片的重量，大多采用塑料或玻璃钢。转盘的转速一般为0.8-3rpm，线速度一般为10-20m/min。

（三）、生物转盘法

（四）、生物接触氧化法：生物接触氧化法是将滤料（常称做填料）完全淹没在废水中，并需曝气的生物膜处理废水的方法，也称淹没式生物膜法或生物接触曝气法。该法对冲击负荷有很强的适应能力，氧化池中的溶解氧含量一般维持在2.5－3.5mg/L，气水比约为（15－20）:1。

硬性填料如聚氯乙烯塑料、聚丙烯塑料、环氧玻璃钢、环氧纸蜂窝等主要制成蜂窝状。

软性填料一般用尼龙、维纶、涤纶、腈纶等化学纤维材料编结成束，呈绳状连接，又称为软性纤维填料。

（五）、生物流化床法：用细小（0.5－1.5mm）的砂粒、陶粒、焦炭、硬质塑料作为生物载体投放在废水中，用强大的水流或气流使载体不断滚动呈流化态，要求高溶解氧浓度。该法比表面积为2000－3000/m，远比生物转盘（50/m ）和生物滤池（25/m ）大，净化效率高，耐冲击能力强，设备占地小。缺点是动力消耗较大，处理水量少，大型废水处理厂较难适用。

（六）、氧化塘法：根据氧化塘内溶解氧和在净化中起主要作用的微生物种类，可把氧化塘主要分为好氧塘、厌氧塘、兼性塘和曝气塘四种。氧化塘处理废水的效率较低，占地面积较大，但运转费用少、操作简单、投资少，适合偏远地区使用。

（七）、封闭厌氧处理法：厌氧条件下非好氧微生物将有机物分解并可产生甲烷，可用于污泥消化和高浓度有机废水处理。

经历3个步骤：1、水解和发酵细菌将有机物分解转化成有机酸、醇、二氧化碳、氨气、水。

2、产氢产乙酸细菌将有机酸和醇进一步分解为乙酸、氢气和二氧化碳，同型产乙酸细菌将二氧化碳和氢气合成乙酸。

3、产甲烷细菌将乙酸分解成甲烷和水，利用二氧化碳和氢气合成甲烷。

普通厌氧消化池、厌氧接触消化池、升流式厌氧污泥床（UASB）反应器、厌氧生物滤池、其它厌氧处理方法。 在自然界有机物质中，除矿物油和木质素外，一般均可作为沼气发酵的原料。

二、微生物脱氮与除磷

（一）、微生物脱氮：微生物脱氮先将氨态氮转变为硝态氮，再将硝态氮还原为分子态氮。

范文四：应用微生物学1

应用微生物学 习题解答

第一章

1. 解释名词：

(a) spontaneous generation: 自然发生说。此概念乃系『生物生自无生物』，相似

词为abiogenesis （偶然发生说）。

(b) biogenesis: 生源论。此概念乃系『生物生自生物』。

(c) generation time: 世代时间。菌细胞分裂增殖一倍细胞数所需时间。相似词

为mass doubling time（倍增时间）、doubling time（倍加时间）。

(d) agar: 洋菜胶或琼脂。系为萃取自红藻类海草之复合多糖，主要由agarose （琼脂糖）及agaropectin （琼脂胶）这两种多糖所组成。

2. 科霍假说。

3. 有害人体之细菌：(a) Vibrio parahemolyticus (肠炎弧菌) ，引起胃肠炎之致病原；(b)Legionella pneumophila（嗜肺退伍军人协会杆菌），引起退伍军人症之致病原。

有害人体之真菌：(a) Aspergillus flavus（黄曲菌），黄曲毒素（aflatoxin ）生产菌；(b) Candida albicans（白色念珠菌），引起念珠菌病（candidiasis ）之致病原。

4. 有益人体之细菌：(a) Lactobacillus bulgaricus (保加利亚乳酸杆菌) ，可用来制作酸奶；(b)Bacillus natto（纳豆菌），可用来制作纳豆。

有益人体之真菌：(a) Saccharomyces cerevisiae（啤酒酿母菌），可用来酿制啤酒；(b) Aspergillus oryzae（米曲菌），可用来生产曲酸、酱油、味噌等。

5. 微生物六大优点如下：体积小表面积大、培养简单、繁殖迅速、于温和条件下进行、菌株育种容易、种类多。

6. 显微镜（microscopes ）主要分为光学显微镜（light microscopes）及电子显微镜（electron microscopes）。显微镜法（microscopy ）则有明视野显微镜法（bright field microscopy）、暗视野显微镜法（dark-field microscopy）、荧光显微镜法（fluorescence microscopy）、位相差显微镜法（phase-contrast microscopy）、电子显微镜法（electron microscopy）。

7. 革兰氏染色之操作顺序（请参考page68）：利用结晶紫（crystal violet）染色、利用酒精脱色、利用番红（safranin ）再染色。

革兰氏染色之原理（请参考page68）：革兰氏染色法系依细菌细胞壁构造差异，所造成对染色剂（结晶紫）之不同保留力，而得以将革兰氏阳性菌染成紫色（保留结晶紫）；被酒精脱色（失去结晶紫）之革兰氏阴性菌，则经番红染成红色。

８. 巴斯德（Pasteur ）：以鹅颈瓶实验证明微生物生源论；科霍（Koch ）：发明纯培养法，提出科霍假说，发现诸多病原菌；瓦克斯曼（Waksman ）：发现链霉素。

9. 所谓的氮循环（nitrogen cycle），乃系氮与含氮化合物全程变化之一系列反应。 至于碳循环（carbon cycle），二氧化碳与其他碳化合物之生化转换，亦可将之视如氮循环一样的环状序列反应。

10. 筛选微生物必须用对培养条件（例如培养基的组成或酸碱值、培养温度、通气量）；选择能迅速观察或分析结果的方法；尽可能选用廉价培养基。

11. 例如，藉由突变增加目的物质的生产量；减少其他非目的物质的生产以利后续之目的物质的纯化分离；改变目的物质的性质。

12.PCR 命名自Polymerase Chain Reaction（聚合酉每链反应）之前缀，系种能够于试管中增加特定基因DNA 之技术。

13. 微生物灾害（biodeterioration ，亦称microbial deterioration），意指经由微生物生长作用，所造成材料之变形或腐蚀。

14. 引起植物生病的微生物，以霉菌发生例最多，其次依序为病毒及细菌。例如Fusarium oxysporum（尖胞梭霉菌）这种植物病原性霉菌，可引起西红柿之枯萎病（萎凋病）、包心菜之黄萎病。

15. 引起日常用品受损的微生物，例如引起木材腐朽的Trichoderma viride；导致浴室瓷砖黑渍的Aureobasidium pullulans 及 Cladosporium cladosporiodes。

16. 所谓的bioremediation （生物复育法），乃系藉由人为方式来改变或控制环境，使得遭污染区成为生物活化区，藉由提升污染物分解菌之分解活性，进而达到将污染物予以分解、破坏或去毒之效。

第二章

1. 解释名词：

(a) chemotaxis: 趋化性。例如存于土壤中的植物病原菌，因受植物根部所分泌

化学物质之引诱，而向植物根部方向伸长的这种性状。

(b) phototaxis: 趋旋光性。受到光的刺激所引起之趋向性。例如光合成细菌经由光强度的变化而进行方向转换，结果造成细菌的集结于明亮领域。

(c) aerotaxis: 趋氧性。受到氧气的刺激所引起之趋向性。例如好气菌会趋向培养瓶上层的空气接触面。

(d) magnetotaxis: 趋磁性。

(e) thallus：丝状体。霉菌（molds ）虽与酵母菌（yeasts ）同属真菌（fungi ，单数为fungus ），然而却与单细胞生物的酵母菌不同，系属多细胞生物。以光学显微镜可观察到霉菌状如细丝，因而又称霉菌为丝状真菌（filamentous fungi ）。霉菌之丝状体（thallus ，复数为thalli ）包括菌丝团（mycelia ，单数为mycelium ）及孢子（spores ）。菌丝团（mycelia ）系由菌丝（hyphae ，单数为hypha ）所组成，菌丝系由多数细胞所连结而成。编者注：一般系依植物取向的将thallus 译成叶状体，意指未经分化成根、茎、叶之植物体。

(f) peptidoglycan: 胜糖层。peptiglycan = mucopeptide = glycosaminopeptide = murein ，乃细菌细胞壁之基本构造，为具有独特化学组成与分子构造之异聚合物（heteropolymer ）。

(g) teichoic acid: 台口酸。发现自革兰氏阳性菌之细胞壁酸性成分，原系依照希腊语意为壁的teichos 来取名，其后亦有自细胞膜发现台口酸的存在。台口酸之构造，依菌种及所存在位置而有所差异，可概分为存于细胞膜的第一类及存于细胞壁的第二类台口酸。

(h) glycocalyx: 腊梅糖。细菌之荚膜或多糖体荚膜。

(i) facultative anaerobes: 兼性厌气菌。

(j) hyphae: 菌丝（请参考 1(e) thallus 的解释名词）。

(k) mycelium: 菌丝团（请参考 1(e) thallus 的解释名词）。

(l) bacteriophage: 噬菌体。

(m) starter: 菌酉元。

(n) bioassay: 生物检定，亦称生物定量法。同biological assay。

(o) bifid bacteria: 双叉杆菌，亦称比菲斯菌。

(p) simple staining: 简单染色法，亦称单染法。

(q) differential staining: 鉴别染色法。

(r) gram staining:革兰氏染色。

(s) acid-fast staining: 抗酸染色法。

2. 所谓微生物数值分类法（numerical taxonomy），乃系依微生物特性差异而加以分类、分群，亦即，将微生物之形态、生理、生化以及遗传等特性予以数据化，并且利用计算机来算出微生物间的相似度（或相异度），系为能够迅速而便利的研究出微生物间的类缘关系或演化过程之一种分类法。详见60页。

3. binominal nomenclature（二名法，亦称the binary system of nomenclature），系将微生物之『属名』与『种名』并记。详见62页。

4. 书写微生物属名与种名之际，所需注意事项，例如属名与种名均须以斜体自印刷体来表示，；属名前缀必须大写。详见62页。

5. (a) ATCC: American Type Culture Collection（美国菌种保存中心）; (b) NRRL: Agricultural Research Service Culture Collection（农业研究服务菌种） ; (c) JFCC: Japan Federation of Culture Collection（日本微生物株保存连盟） ; (d) CCRC: Culture Collection and Research Center（菌种保存中心），现已改称Bioresource Collection and Research Center (生物资源保存中心，简称 BCRC) 。详见42页。

6. 微生物之命名依据包括形态、生理性质、来源、色素生成、病原性、发现者等。详见63页。

7. 细菌依性状不同，可分为球菌、杆菌、螺旋形细菌。

8. (a) 曲霉：例如Aspergillus oryzae；(b) 酒精酵母：Saccharomyces cerevisiae；(c)枯草菌：Bacillus subtilis；(d) 乳酸菌：例如Lactobacillus bulgaricus；(e) 醋酸菌：例如Acetobacter aceti；(f) 大肠菌：Escherichia coli。

9. 好气菌（aerobes ；又称好氧菌、嗜氧菌、喜氧菌）、厌气菌（anaerobes ，又称厌氧菌）、兼性厌气菌（facultative anaerobes，又称兼性厌氧菌）。

10. 革兰氏阳性菌与阴性菌之细胞表层构造差异，例如（1）阳性菌最外层为胜糖层，而阴性菌最外层则系外膜然后才系胜糖层；（2）阳性菌之胜糖层较阴性菌的厚；（3）阳性菌细胞壁含有台口酸，而阴性菌则无。详见82页。

11. 单球菌（例如Micrococcus lysodeikticus）、双联球菌（例如Diplococcus

pneumoniae ）、四联球菌（例如Pediococcus cerevisiae）、八联球菌（例如Sarcina ventriculi ）、链球菌（例如Streptococcus faecalis）、葡萄球菌（例如Staphylococcus aureus ）。详见71页。

12. Bacillus 属、Clostridium 属。详见73页。

13. 无鞭毛（atrichous ）、一端有单鞭毛（monotrichous ）、一端有束鞭毛

（lophotrichous ）、二端有鞭毛（amphitrichous ）、周身有鞭毛（peritrichous ）。详见76页。

14. 糖类经由乳酸菌发酵生成乳酸，可分为正常乳酸发酵、异型乳酸发酵。详见96页。

15. 酒精经由醋酸菌发酵而氧化成醋酸。详见99页。

16. 例如大肠杆菌（E. coli）可用来作为水质判定之依据。详见100页。

17. 细菌荚膜之组成，例如Bacillus anthraxis的为聚胜月太；Leuconostoc

mesenteroides 的为聚葡萄糖；Streptococcus pneumoniae的为复合多糖。详见91页。

18. 例如性线毛较一般线毛长且粗，性线毛仅存于雄性细菌（F +），不会超过10条。详见93页。

19. 革兰氏阳性菌：Bacillus subtilis; Clostridium tetani; Micrococcus lysodeikticus; Staphylococcus aureus。革兰氏阴性菌：Escherichia coli; Pseudomonas aeruginosa; Salmonella typhi; Serratia marcescens。

20. 轴丝（filament ）、弯钩（hook ）、基体（basal body）。

21. 无横隔（nonseptate ）或称无横隔多核细胞（coenocytic ）、具有横隔之单核细胞（septate with uninucleate cells）、具有横隔之多核细胞（septate with multinucleate cells）。详见104页。

22. 营养菌丝（vegetative hyphae）或称基中菌丝（submerged hyphae）、生殖菌丝（reproductive hyphae）或称气生菌丝（aerial hyphae）。详见105页。

23. 子囊孢子（ascospores ）、担子孢子（basidiospores ）、接合孢子（zygospores ）、卵孢子（oospores ）。详见105页。

24. 分生孢子（conidiospores 或称conidia ）、孢子囊孢子（sporangiospores ）、关节孢子（oidia 或称arthrospores ）、厚膜孢子（chlamydospores ）、游动孢子（zoospores ）。详见105页。

25. 卵菌类（oomycetes ）、接合菌类（zygomycetes ）、子囊菌类（ascomycetes ）、担子菌类（basidiomycetes ）、不完全菌类（deuteromycetes 或称imperfect fungi）。前两类（卵菌类、接合菌类）属于藻状菌类（phycomycetes ）。

26. （a ）根霉属（Rhizopus ）：Rhizopus japonicus（酿酒）、Rhizopus nigricans（生产反丁烯二酸）；（b ）毛霉属（Mucor ）：Mucor mucedo（制造豆腐乳或生产凝乳酉每）、Mucor pusillus（生产凝乳酉每）；（c ）曲菌属（Aspergillus ）：Aspergillus niger（生产有机酸或酵素）、Aspergillus oryzae（制造酱油、味噌）；（d ）青霉菌属（Penicillium ）：Penicillium camemberti（制造奶酪）、Penicillium chrysogenum（生产青霉素）。

27.amylo process：阿米诺法；amylo mold：阿米诺菌。详见116页。

28. 所谓产膜酵母（film forming yeast, film yeast, pellicle formation yeast）系指于进行液态培养时，会形成一层盘登于培养器壁面之干薄膜。例如Saccharomyces rouxii var. halomenbranis , Pichia membranaefaciens, Hasenula anomala 等。

29. 充当水域食物链之初级生产者；平衡生态与净化环境；水质污染度之指标。

详见121页。

30. 充当海洋食物链之初级制造者；光合作用所产氧气能有益于环境净化；稳定及改善土壤物性、作为肥料、磨剂、隔热物、滤器等。详见126页。

31. 单虫界（monera ）、原生生物界（protista ）、真菌界（fungi ）、动物界（animalia ）、植物界（plantae ）。

32. 原生生物界（protista ）、动物界（animalia ）、植物界（plantae ）。

33. 例如碘液（iodine solution）于革兰氏染色之际，可用来帮助染料（结晶紫）固定于菌细胞内。详见69页。

34. 细菌学鉴定手册。详见93页。

35. 有用霉菌：Monascus purpureus（红曲色素、降胆固醇药剂）、Penicillium roqueforti （制造奶酪）；有害霉菌：Aspergillus flavus（黄曲毒素生产菌）、Fusarium oxysporum （植物病原菌）。

36. 有用酵母菌：Saccharomyces cerevisiae（酿酒）、Saccharomyces rouxii（酿造味噌）；有害酵母菌：Cryptococcus neoformans（造成隐球菌病）、Candida albicans（造成念珠菌病）。

37.lytic phage：溶解性噬菌体，亦称毒力噬菌体（virulent phage），能让寄主细菌发生溶解之噬菌体；lysogenic phage：潜溶性噬菌体，亦称温和噬菌体（temperate phage ）。

38. 详见109-112页。

39. 例如属于绝对寄生性微生物；主要成分为核酸及蛋白质等。详见133页。

40. 主要为核酸（核心成分）及蛋白质（外壳成分）。详见134页。

41. 二十面体（icosahedron ）或螺旋状（helical ）。详见137页。

42. 附着（attachment ）、穿入（penetration ）、熟成（maturation ）、释出（release ）。详见144页。

第三章

1. 解释名词：

(a) cardinal temperature: 主要温度。包括最高、最适、最低温度。详见164页。 (b) stenothermal: 狭温域菌。系指生长温度范围较窄之微生物。详见166页。 (c) eurythermal: 广温域性菌。系指生长温度范围较广之微生物。详见166页。 (d) psychrotroph: 低温菌。亦称psychrotrophic microorganism或psychrophiles 。

详见167页。

(e) mesophile: 中温菌。详见168页。

(f) thermophile: 高温菌。详见168页。

(g) halophile: 好盐菌。详见174页。

(h) barophile: 好压菌。详见175页。

(i) prototroph: 原营菌。系属一种变种，重获生长于原先不含生长因素培养基

之能力。auxotroph （营养变异菌）乃其相对语。

(j) auxotroph: 营养变异菌。原营菌（prototroph ）若因发生变异而失去合成某

种生长因素之能力则成营养变异菌。基于此故，于培养营养变异菌时，须添加其所无法合成之因素于培养基。

(k) osmotolerant: 耐渗透菌。详见173页。

(l) heterotroph: 有机营养微生物（亦称异营性细菌）。通常无法利用二氧化碳作

为唯一碳源，而系须由有机化合物获取碳元素之微生物称之。autotroph （无机营养微生物，亦称自营菌）乃其相对语。

2. 可分为诱导期（lag phase）、对数增殖期（log phase或exponential phase）、定常期（stationary phase）、死灭期（death phase或decline phase）。详见155页。

3. 物理性环境因素：温度、压力、光线、放射线等；化学性环境因素：氧气、水分、氢离子浓度、营养物质、抗微生物性物质等；生物性环境因素：共生、偏利共生、拮抗等。详见156页。

4. 光自营菌（photoautotroph ）、光异营菌（photoheterotroph ）、化学自营菌（chemoautotroph ）、化学异营菌（chemoheterotroph ）。详见179页。

5. 细菌主要以分裂法；酵母菌主要以出芽法；放线菌主要以分裂法或菌丝伸长；霉菌以分裂法或菌丝伸长。详见149页。

6. 总菌计数法、活菌计数法、分光学法、菌体重量法。详见151页。

7. 厌气操作箱、厌气培养瓶。

8. acidophile：好酸菌，亦称嗜酸菌；neutrophile ：好中菌，亦称嗜中菌；alkalophile ：好碱菌，亦称嗜碱菌。详见１６９页。

9. 霉菌：微酸性（pH 4 - 6）；酵母菌：中性 – 微酸性（pH 5 - 7）；细菌：中性 – 微碱性（pH 7 - 8）。

10.minimal medium：最小培养基；synthetic medium：合成培养基；complex medium ：复合培养基；selective medium：选择培养基；differential medium：鉴别培养基。

11.synchronous culture：同步培养。

12.aerobe ：好气菌；anaerobe ：厌气菌；facultative anaerobe：兼性厌气菌；obligate aerobe ：绝对好气菌。详见157页。

13.pure culture：纯培养；streak culture：划线培养；pour culture：倾注培养；slant culture ：斜面培养。

14.parasitism ：寄生；saprophytism ：腐生。

15. 洋菜胶斜面（或平板）培养保存、孢子悬浮液保存、液态氮保存。

16. 于影响生长的所谓温度效应里，酵素催化反应被认为系属最重要之因素。详见163页。

17.osmotic effect：渗透效应。详见172页。

18. 因UV 会造成DNA 里的胸腺口密口定（thymine ）形成二聚物。详见176页。

19. 脱氧核糖核酸：deoxyribonucleic acid，简称DNA ；脱氧核糖核甘：deoxyribonucleoside ；脱氧核糖：deoxyribose 。详见181页。

20. 详见181 – 182页。

第四章

1. 解释名词：

(1) sterilization: 灭菌。杀死或除去所有微生物之繁殖体与芽孢，使物体或溶液

内外皆呈无菌状态。

(2) disinfection: 消毒。使病原菌数减少至不会有造成疾病之威胁的程度。

(3) tyndallization: 间歇灭菌法。

(4) lyophilization: 冷冻干燥。

(5) autoclave: 高压蒸气灭菌器。

(6) chemotherapeutic agents: 化学疗剂。

(7) plasmolysis:质壁分离。详见１９３页。

(8) cold sterilization: 冷灭菌。利用辐射灭菌。

(9) phenol coefficient: 酚系数。详见２０１页。

(10)mycotoxin: 霉菌毒素。

2. 作用于蛋白质之反应；作用于细胞膜之反应；作用于其他细胞成分之反应；作用于病毒之反应。

3. 对微生物具毒性；对人及其他家畜动物无毒性；安定性；溶解性；均质性；透过力；杀菌力不因有机物的存在而受影响；于室温就具杀菌力；无腐蚀性、无着色性、无臭味、不损坏包装容器等；无令人不舒服之味道；去污力；可用性。

4. 酚（phenols ）、醇类（alcohols ）、卤素（halogens ）、重金属（heavy metals）。

5. 灭菌时间须依灭菌物之性质、容量等因素来考虑，不适于诸如油脂或试管之类的物质之灭菌。

6. 物理法：低温处理（冷藏、冰藏、冻藏）、加热处理（低温加热处理、高温杀菌）、降低水活性（干燥、盐渍、糖渍）、除氧（真空包装、更换气体包装、添加脱氧剂）；生物法：可食菌发酵；化学法：熏烟法、食品添加物（保存剂、杀菌剂）。详见２１５页。

7. 免疫（immunity ）：可分为先天免疫（innate immunity）及后天免疫（acquired immunity ）；抗体（antibody ）：动物受抗原刺激所产生之一种特异性物质；疫苗（vaccines ）：致死或弱毒化或无毒之微生物或其产物之一种制剂，用来产生自动免疫。详见２０４-206页。

第五章

1. 解释名词：

(a) zymases: 多种酵素混合在一起的复合发酵酵素之总称。详见220页。 (b)α-amylase: 液化淀粉分解酉每，属于内切型淀粉分解酉每（endo-type amylase）。

详见229页。

(c) debrancing amylase: 切枝型淀粉分解酉每。glucoamylase 、pullulanase 即属之。 (d) constitutive enzyme: 体质酉每，亦称构成性酵素。详见２３０页。

(e) inducible enzyme: 诱导酉每，亦称适应酉每（adaptive enzyme）。详见２３０页。 (f)β-amylase: 糖化淀粉分解酉每，属于外切型淀粉分解酉每（exo-type amylase）。

详见２２９页。

(g) extracellular enzyme: 细胞外酵素，或称外酵素（exo-enzyme ）。详见230页。 (h) intracellular enzyme: 细胞内酵素，或称内酵素（endo-enzyme ）。详见230

页。

(i) substrate specificity: 基质特异性，或称受质特异性、基质专一性、受质专一

性。详见２３３页。

(j) apoenzyme、holoenzyme:单纯蛋白质型酵素、复合蛋白质型酵素。详见238

页。

(k) operon theory: 操纵子学说。详见244-246页。

(l) chymogen: 潜在酵素，或称前驱体酵素（precursor enzyme）。详见249页。

2. 反应条件温和、强的催化作用、所需反应时间短、受质特异性等。

3. bromelain（菠萝酵素）、papain （木瓜酵素）、cathepsin （组织蛋白酉每）、pepsin （胃蛋白酉每）、rennin （凝乳酉每）；amylase （淀粉分解酉每）、cellulase （纤维素分解酉每）、chitinase （几丁质分解酉每）、pectinase （果胶分解酉每）、蛋白质分解酉每（proteinase ）。详见225页。

4. 氧化还原酉每（oxidoreductase ）、转移酉每（transferase ）、水解酉每（hydrolase ）、脱离酉每（lyases ）、异构酉每（isomerase ）、结合酉每（ligase ）。详见227页 。

5. 酵素浓度、基质浓度、温度、酸碱值、活化剂、抑制剂。详见234页。

6. prothetic group：补助基。与辅酉每同属辅因子，为其结合力较辅酉每的紧。详见239页。

7. feedback inhibition: 回馈抑制。详见246页。

8. allosteric enzyme: 异化酉每。除了具有活性位置（active site）之外，尚具异化位置（allosteric site）。详见247页。

9. 担体键结法（carrier binding method）、交联法（cross-linking method）、包埋法（entrapping method）。详见251-252页。

10. 例如反应可连续进行、反应时间可缩短、反应条件较易控制等。详见253页。

11. 例如酵素活性之固定化率、酵素活性之安定性、杂菌污染之防止、附着物之去除等。

12. 蛋白质分解酉每、淀粉加工相关酵素、凝乳酉每。详见255页。

13.active site: 活性位置；allosteric site: 异化位置。详见235-236页。

14.competitive inhibitor: 竞争型抑制剂；noncompetitive inhibitor: 菲竞争型抑制剂。详见235-236页。

15.catabolite repression: 异化代谢产物抑制。详见246页。

第六章

1. UV法、Folin 法、Biuret 法、Lowry 法、Kjeldahl 法。详见261-263页。

2. 化学法：溶菌酉每、界面活性剂；物理法：音波、均质、玻璃珠磨碎。详见266-267页。

3. 繁殖速度快、繁殖条件容易控制、供给量容易控制、可依菌种不同而选择能大量生产所要酵素之菌种、可经人为变异提升菌种之酵素生产能。详见268-269页。

4. 生长速度快（培养时间短）、培养基便宜、酵素生产量高、容易回收（纯化分离）目标酵素、具安定性、具安全性、所生废液容易处理。详见272页。

5. 希望能藉由人工变异而筛选到生产率较高之突变菌；希望能藉由减少其他不必要之酵素或代谢物的产生，而有利于后续之目标物质的纯化分离。详见273页。

6. meat extract: 肉萃取物；pepton (peptone, polypeptone): 蛋白月东；casamino acids: 酪蛋白酸解物；vitamin deficient casamino acids: 缺维生素酪蛋白酸解物。详见277页。

7. corn steep liquor (CSL): 玉米萃取物。详见278页。

8. 依序加入培养基之组成物；避免因受热而发生沉淀反应等。详见278页。

9. 例如沉淀法、干燥法、蒸发法、超过率与逆渗透法。详见279-281页。

10. 沉淀法、层析法。详见281-291页。

11.salting in: 盐溶作用；salting out: 盐析作用。详见283-284页。

12. 精蛋白、链霉素、聚乙烯酰胺、锰离子、核酸分解酉每。详见283页。

13. （1）利用蛋白质分子本身的荷电性质差异来达成分离之目的；（2）若目的蛋白质之等电点高于pH 7，原则上系选用阳离子交换树脂（例如CM-Sephadex ），若系等电点低于pH 7，则系选用阴离子交换树脂（例如DEAE-Sephadex ）。详见288-290页。

14.affinity chromatography: 亲合性层析法。详见290页。

15. 酵素之specific activity（比活性）系由酵素活性单位（U ）除以酵素重量（例如g ）所得数值，于纯化过程当中，比活性之数值通常都会愈来愈高，亦即，所得酵素愈来愈纯（所含非目的之蛋白质愈来愈少）。

第七章

1. anabolism: 合成性代谢，亦称同化反应（assimilation ）；catabolism （分解性代谢），亦称异化反应（dissimilation ）。详见293-294页。

2. 好气性脱氢反应（aerobic dehydrogenation）；厌气性脱氢反应（anaerobic dehydrogenation ）、发酵（fermentation ）。详见294页。

3. 于进行分解时，有氧参与的反应称之为呼吸（respiration ），若系仅有酵素作用而无氧气参与的反应则称发酵（fermentation ）。详见296页。

4. TCA循环（TCA cycle）。详见298页。

第八章

1. transcription: 转录；translation: 转译。详见304-305页。

2.central dogma: 中心信息。详见305页。

3. coding strand: 指令链；noncoding strand: 非指令链。详见305页。

4. retrovirus: 逆转录病毒。详见307页。

5. polycistronic mRNA: 复遗传单位mRNA 。详见309页。

6. intron: 间隔区；exon: 表现区。详见313页。

7. site mutation: 点变异。详见315页。

8. splicing: 接合。详见313页。

9. restriction enzyme: 限制酵素。详见316页。

10.recombinant DNA: 重组DNA 。详见316页。

第九章

1. 单发酵（single frementation）：直接利用糖分进行酒精发酵者；单行式复发酵（single step complex fermentation）：糖化（saccharification ）与发酵

（fermentation ）个别进行；并行式复发酵（parallel step complex fermentation）：糖化（saccharification ）与发酵（fermentation ）于同一容器内同时进行。详见326页。

2. 菌种好坏影响所酿酒类质量甚巨，因而所拟改良之性质包括糖化酵素强、耐机械剪力（以利发酵槽发酵）、提高酒精生产能、减低危险成分之生产等。详见331页。

3. 利用微生物（例如Bacillus stearothermophilus）所生产乳糖分解酉每（lactase ，或称β-galactosidase ）分解牛乳所含乳糖。详见335页。

4. 细菌菌酉元：Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Lactobacillus bulgaricus,

Lactobacillus casei 等；霉菌菌酉元：Penicillium camemberti, Penicillium roqueforti 等。详见338页。

5. 例如利用微生物所生产酵素来分解酵母RNA ；利用微生物发酵生产核甘酸。详见342-345页。

6. 果寡糖（fructooligosaccharides ）、巴拉金糖（palatinose ）、偶合糖（coupling sugar ）。详见344-348页。

7. fructooligosaccharides：果寡糖、coupling sugars：偶合糖、cyclodextrin ：环状糊精。

8. 灵芝：多糖体及三帖类；冬虫夏草：虫草酸、虫草素等。详见354-358页。

9. 可分为机能性乳酸菌型、素材添加型。详见358页。

第十章

1. 所谓的GMO 食品就是由基因改造生物（genetically modified organisms，简称GMO ）为原料所制造的食品。

2. Ti 质体系为又发肿瘤之主体，其T-DNA 里存有指令生产生长激素之基因，遭农杆菌感染之植物细胞因而形成王冠瘿瘤。详见369页。

3. 藉由农杆菌将所拟导入之外源基因（有用基因）嵌入其他生物（例如农作物），因而得以育种出能生产有用物质之基因重组生物。详见370页。

4. 例如加拿大农长青公司利用放线菌Streptomyces viridochromogenes 生产除草剂，并且利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）将源自Streptomyces viridochromogenes 之PAT 基因（解药）送入所拟基因改造之农作物，因而育种出耐该除草剂之农作物。详见373-375页。

5. 例如耐保存西红柿、耐除草剂大豆、抗虫害玉蜀黍等。详见367页。

第十一章

1. 蛋白质分解酉每（protease ）、淀粉分解酉每（amylase ）、脂质分解酉每（lipase ）、纤维素分解酉每（cellulase ）。详见381页。

2. 耐碱性、耐界面活性剂等。

3. 例如源自Saccharomyces cerevisiae的alcohol dehydrogenase可用来测量乙醇；源自Pseudomonas fluorescens的cholesterol esterase可用来测量胆固醇等。详见385页。

4. α-amylase: 液化淀粉分解酉每，属于内切型淀粉分解酉每（endo-type amylase）；β-amylase: 糖化淀粉分解酉每，属于外切型淀粉分解酉每（exo-type amylase）；glucoamylase: 葡萄糖生成型淀粉分解酉每。详见389页。

5. α-amylase （液化淀粉分解酉每）；β-amylase （糖化淀粉分解酉每）；glucoamylase （葡萄糖生成型淀粉分解酉每）；pullulanase （茁霉多糖酉每）；isoamylase （支链淀粉分解酉每）。

6. debranching enzyme（切枝酉每）：例如debrancing amylase即属之。详见389页。

7. naringinase（柚甘分解酉每）：柑橘果汁苦味去除；hesperidinase （柑果甘分解酉每）：柑橘果汁或罐头之沉淀去除。详见392页。

8. glucose oxidase（葡萄糖氧化酉每）可用来除去食品里之氧气。详见393页。

9. 例如glutamic acid可用来生产味精（sodium glutamate）、methionine 及lysine 添加于饲料以增加饲料之营养价值等。详见397-398页。

10. optical resolution（光学分割）：例如胺基酸之光学分割即系利用固定化酵素于左旋L 型及D 型胺基酸之分离。详见399-400页。

11. 几丁类物质（chitinous materials）包括几丁质（chitin ）、几丁聚醣（chitosan ）等。详见405-406页。

12. 藉由蛋白质工程（protein engineering）或基因重组（genetic recombination）相关技术，改进源自生物之天然酵素，使其更符合需求目的（例如耐热、耐界面活性剂等）。详见384页。

第十二章

1. 抗生素（antibiotics ）微生物所生产会抑制其他微生物生长之物质。详见415-417页。

2. β-lactam antibiotic（内酰胺抗生素）：系指以青霉素（penicillin ）为始的那些具有内酰胺（β-lactam ）构造，且此构造为主要作用基之抗生素总称。详见417页。

3. semisynthetic antibiotic：半合成抗生素。例如semisynthetic penicillin（半合成

青霉素）或semisynthetic cephalosporin（半合成雪华鲁思波林）。详见419页。

4. 利用penicillin acylase（青霉素酰胺酉每）于碱性条件下进行分解反应，生产青霉素母核化合物（6-aminopenicillanic acid；简称6-APA ），然后再利用该酵素于酸性条件下进行合成反应（导入各种官能基于6-APA ），而合成出各种不同青霉素（属于半合成型）。详见421-423页。

5. 活体疫苗（live vaccines）、死体疫苗（dead vaccines）、类毒素（toxoids ）、重组疫苗（recombinant vaccines）。详见428-430页。

6. 例如可利用微生物生产抗体片段；利用基因重组酵母菌生产B 型肝炎疫苗。详见431-434页。

7. gibberellin：吉贝素。详见435页。

8. 详见441-442页。

9. 详见442-443页。

10. 详见444-448页。

11. 详见448-453页。

第十三章

1. 以养鸡场之土壤为微生物筛选源；所用培养基以鸡粪为主要碳氮源。

2. 详见458-460页。

3. 详见460-461页。

4. active sludge：活性污泥。

5. 详见461-462页。

6. 详见462-463页。

7. 详见463页。

8. 详见463-464页。

9. cellulase （纤维素分解酉每）、xylanase （聚木醣分解酉每）、ligninase （木质素分解酉每）。

10. 物理性处理、化学性处理、生物性处理。详见472页。

11. 糖化及发酵。详见473-475页。

12. 以含纤维素粉末之洋菜胶培养基，进行纤维素分解酉每生产菌之筛选。若系纤维素分解酉每生产菌，该菌落周遭将因纤维素粉末的被分解，而呈现透明斑。

13. bioplastic：生物塑料。详见477页。

14. 例如降低酵素成本。

15. 可利用虾蟹壳作为碳氮源，生产例如酵素之类的有用物质。亦可利用蛋白酉每生产菌发酵虾蟹壳，进行虾蟹壳去蛋白而得以制得几丁质。

16. 以含几丁质粉末之洋菜胶培养基，进行几丁质分解酉每生产菌之筛选。若系几丁质分解酉每生产菌，该菌落周遭将因几丁质粉末的被分解，而呈现透明斑。

17. 详见84、406页。

18. 以含PE 塑料粉末之洋菜胶培养基，进行PE 分解酉每生产菌之筛选。若系PE 分解酉每生产菌，该菌落周遭将因PE 粉末的被分解，而呈现透明斑。

19. 细菌沥滤。详见478页。

20. 详见480-481页。

21. 详见482-484页。

22. 生物界面活性剂。

23. 苏力菌（Bacillus thuringiensis）、黑殭菌（Metarhizium anisopliae）、核多角体病毒（nuclear polyhedrosis virus）。

24. 详见487页。

25. 详见488页。

26. 详见491页。

27. 详见488-489页。

28. 详见480-499页。

范文五：应用微生物学

应用微生物学

生命科学学院 陈敏

一．课程内容简介

本课程主要阐述应用微生物学的基础原理及产品开发，内容共分四讲： 第一讲 微生物的多样性及应用（主要描述目前在应用微生物中一些重要的细菌类群和重要真菌类群）。

第二讲 重组疫苗与合成疫苗（介绍利用生物技术生产新型的基因工程疫苗，重点概述了艾滋病疫苗的研究进展）。

第三讲 微生物在环境中的应用（重点描述微生物在处理废水、回收矿物以及环境修复中的重要作用）。

第四讲 微生物发酵工业及产品（讨论长久以来认为对人类社会福利非常重要的微生物产品，包括食品和饮料、抗生素和其他微生物药物、氨基酸、有机酸、醇、维生素、核苷酸、激素、酶制剂等）。

二．学习目标

了解微生物在工、农、医、环境等各个领域的应用情况；重点掌握基因工程疫苗、废水处理、矿物回收以及各种发酵制品生产的微生物学原理。

三．考核目标和方案

根据课程内容，选择某一感兴趣的专题，撰写一篇4000字左右的综述或调查报告。

四．主要参考资料

1．瞿礼嘉等。现代生物技术导论。高等教育出版社，1998。

2．孔繁翔等。环境生物学。高等教育出版社，2000。

3．沈萍主编。微生物学。高等教育出版社，2000。

第一讲 微生物的多样性及其应用

微生物主要分五大类群：细菌、真菌、病毒、藻类和原生动物。应用微生物学的主要研究对象：细菌和真菌。

1原核微生物

1.1古细菌(Archaea)

包括三种典型类群（均发现于极端环境中）：

1）产甲烷细菌：仅生长在厌氧环境中。

2）极端嗜盐菌：生长需要非常高的盐离子浓度。

3）极端嗜热菌：生长于80℃ ~100℃的温泉、海洋火山口。

因为古细菌是由适应异常和极端条件演化而来，所以它们是一类独特的具有生物技术加工开发潜力的有机体和生物大分子资源。

1.2真细菌(Bacteria)

引人注目的是，对生物技术尤其重要的真细菌类群，除了栖热菌属（Thermus ) 外，大多数来源于11个分支中的两种：紫细菌和革蓝氏阳性菌。

1.2.1紫色细菌

亦称为蛋白细菌（proteobacteria ），被分为四个亚门：α、β、γ、δγ门

（1）大肠杆菌

能在成分确定的简单培养基上迅速生长，且充分获得了大肠杆菌有关遗传、生化和生理方面的大量知识，大肠杆菌已成为应用重组DNA 技术生产外源蛋白的合适受菌体。主要应用实例：人类胰岛素和生长激素。

（2）产荧光假单胞菌类

传统分类上属于假单胞菌属（Pseudomonas ），种间差异极大。产荧光类主要包括铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、丁香假单胞菌。

产荧光假单胞菌类群中许多种能降解诸如樟脑、甲苯和辛烷以及其他人工合成的物质，如卤代芳香化合物。因此，天然的和通过实验室改造产生的产荧光假单胞菌菌株已成为用于降解高浓度有机毒性物质污染驯化场所的侯选菌株。（3）黄单胞菌属(Xanthomonas )

可产生典型的黄色染料，故名。黄单胞菌可分泌脂多糖到培养基。野油菜黄单胞菌(X.campestris ) 分泌的多糖在食品工业及石油开采中广为采用。

β门

硫杆菌属（Thiobacillus ）

化能自养型细菌，代谢产生硫酸，许多菌株在强酸（pH1.5~2.5）条件下生长良好。硫杆菌是工业上用于铜或铀矿提取的重要细菌。α门

（1）土壤杆菌属（Agrobacterium ）

带有Ti 质粒，质粒DNA 的一小部分即T-DNA 能转移到植物细胞，并整合到植物染色体DNA 上，引起宿主产生瘿冠瘤。这种现象对生物技术具有极大的潜在意义，利用Ti 质粒将外源基因转入谷物中，用于人工生产储藏蛋白；或用Ti 质粒转入固氮基因、抗病或除草剂的基因到植物中。

（2）根瘤菌属（Rhizobium ）生长于土壤中，与豆科植物共生形成根瘤，并在根瘤中固氮。根瘤菌是生物固氮的主要成员，估计每年约合成3000万吨氮素肥料，大部分供植物生长需要。（3）发酵单胞菌属（Zymomonas ）发酵糖类（ED 途径）产生唯一的终产物：乙醇。工业上用于大规模发酵生产酒精。（4）葡萄糖杆菌属（Gluconobacter ）

化能异养菌，氧化乙醇为乙酸，不能进一步氧化乙酸。在制醋业中非常有用。也可以将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，而葡萄糖酸是一种具重要商业价值的产品。

1.2.2革蓝氏阳性菌（1）梭菌属（Clostridium ）严格厌氧，发酵能产生有用的终产物：乙醇、丁醇、丙酮，第一次世界大战的爆发导致梭菌发酵走向实际应用。1916年，丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)的发酵成为产生丙酮的主要途径，从100吨糖浆中能生产出12吨丙酮。（2）乳杆菌属(Lactobacillus ) 、明串珠菌属(Leuconostoc ) 、片球菌属(Pediococcus ) 、链球菌属(Streptococcus )

通常称为乳酸细菌。能发酵葡萄糖产乳酸，耐酸性好。其中一些菌株常用于生产奶酪和发酵乳制品，全世界年产量2000万吨，产值达500亿美元。（3）芽孢杆菌属(Bacillus )

与梭菌不同，能在有氧时生长，是土壤的优势菌。许多芽孢杆菌能产生胞外水解酶，降解蛋白、核酸、多糖和脂类。其中有些酶已大批量生产用于商业：蛋白酶可用于洗涤剂；多糖水解酶可用于降解淀粉。

有些芽孢杆菌是昆虫致病菌，其中苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis ) 已被大规模开发用作杀虫剂。

一些芽孢杆菌合成的抗生素在生产上已具有一定商业规模，如来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis ) 的杆菌肽和来自多粘芽孢杆菌(B.polymysa ) 的多粘菌素。

（4）纤维单胞菌属(Cellulomonoas )

此属最显著特点为能降解纤维素。利用纤维单胞菌产生的纤维素降解酶可将富含纤维素的植物原料转变成酒精和蛋白质。

（5）棒状杆菌属(Corynebacterium )

本属中的一个种，即谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum ) 是著名的味精生产菌，它能将原料中的大部分物质转换为谷氨酸，且将其分泌到培养基中。（6）链霉菌属(Streptomyces )

链霉菌以分支菌丝生长，孢子繁殖，与真菌特征相似，却为原核生物。灰色链霉菌(S.griseus ) 能产生高效抗菌物质——链霉素。在其他链霉菌中还相继发现了多种抗生素，包括四环素、红霉素、新霉素和庆大霉素等。

（7）栖热菌属（Thermus ）

此类微生物首次发现于温泉中，为真细菌中目前所知的最嗜热细菌，最适生长温度70℃~72℃。水生栖热菌（Thermus aquaticus ）是热稳定DNA 聚合酶（Taq 聚合酶）的主要来源，此酶在PCR 扩增基因时很有价值。Taq 聚合酶基因已在大肠杆菌中得到克隆和表达，可以大规模生产。

2 真菌

估计真菌的总数约为10万~25万，可分成五个亚门。

（1）鞭毛菌亚门（Mastigomycotina ）

产生具鞭毛的无性孢子，以单细胞个体或具无横隔的菌丝存在。典型代表为致病疫霉(Phytophora infestans ) ，可引起马铃薯晚疫病。另一代表Rhizophlyctis rosea 为土壤中常见纤维素分解菌。（2）接合菌亚门（Zygomycotina ）

能产生不游动的无性孢子（接合孢子）；菌丝无隔膜。重要代表菌为土壤中的腐

生菌，如毛霉(Mucor ) 、根霉(Rhizopus ) 。黑根霉(R.nigrocans ) 长期以来用于柠檬酸的生产。

（3）子囊菌亚门（Ascomycotina ）

真菌中最大的一个亚门，大约有1.5万种。营养体除酵母菌为单细胞外，大多数具发达的菌丝体，菌丝体有横隔。产生有性孢子（子囊孢子）。其中的脉孢菌属(Neurospora)和酵母菌属(Saccharomyces ) 为遗传学家特别熟悉。酵母菌是迄今为止应用最广的真菌。酿酒酵母(S. cerevisiae ) 广泛用于啤酒和葡萄酒的发酵生产，也用于面包制作等方面。（4）担子菌亚门（Basidiomycotina ）

营养体为单细胞或有隔菌丝，产生有性孢子（担孢子）。著名的食用菌（mushroom ）大多属于担子菌，能在有机复合肥上进行商品化生产。

（5）半知菌亚门(Deuteromycotina)

由于只了解其生活周期的一半，故名。营养体结构为单细胞或有隔菌丝，以分生孢子进行无性繁殖。此亚门中的某些属具可观的经济价值，如青霉属(Penicillium ) 和曲霉属(Aspergillus ) 。

黑曲霉(A. niger) 用于生产柠檬酸和葡萄糖酸。米曲霉(A. oryzae) 在食品工业中通过发酵大米和黄豆来生产淀粉水解酶和蛋白水解酶。

点青霉(P .notatum ) 是用于生产青霉素的第一个菌株；灰黄青霉(P .griseo-fuluvum ) 为灰黄霉素的生产菌，主要用于治疗被真菌感染的皮肤或指甲疾病。

第二讲 重组疫苗与合成疫苗疫苗是目前医学上最有潜力的防御物质。在发展中国家，传染病死亡率占总死亡人数的30% ~ 50%，疫苗成为对付传染病的重要工具。在发达国家，传染病死亡率占总死亡人数的4% ~ 8%，但这并不意味着疫苗在这些国家不重要，传染病的低发率正是得益于疫苗的广泛使用。除众所周知的天花疫苗成功消灭了天花疾病以外，其他疫苗的使用也大大降低了许多重要传染病的发生率，如大众免疫计划的实施，使美国的白喉发病率降低了1000多倍，脊髓灰质炎发病率下降了4000多倍。

疫苗广泛应用的第二个原因是效益，现在抗生素和化学治疗药物非常昂贵，免疫接种较患病后再去治疗要经济得多。

2．1传统疫苗存在的问题传统疫苗包括活疫苗和灭活疫苗两种。许多传统疫苗都非常有效，但开发新疫苗和疫苗生产新技术仍然十分必要，因为传统疫苗还存在一些问题：1）活疫苗存在毒力返强的危险；2）灭活疫苗往往引起机体严重的反应；3）许多重要传染病还缺乏疫苗。2．2生物技术对疫苗发展的影响

生物技术发展使生产全新的疫苗成为可能。

所谓新型疫苗是由已经证实是安全的生物来生产。如用大肠杆菌或酵母菌生产病原微生物的某种组分或保护性抗原。利用这一技术，即使很难培养或不能培养的病原体也可以生产出相应的疫苗。

新型疫苗有的是用来预防新的疾病，有的只是较传统疫苗更有效，生产的副作用更小。

在过去的几十年中，疫苗的研究工作主要是针对体液免疫。20世纪90年代开始，人们开始注意到细胞免疫对癌症、艾滋病等疾病治疗的重要性。因此，新一代疫苗的设计思想：1）尽可能同时调动细胞免疫和体液免疫两个系统；2）删除致病基因，保留病原物质引起免疫反应的能力。

2．3基因工程疫苗

是指用基因工程的方法表达出病原物的一段基因序列，将表达产物（多数无毒性、无感染能力、但具有较强的免疫原性）用作疫苗。2．3．1. 亚基疫苗（subunit vaccine）

利用病原物的某一部分制得的疫苗。

优点：1）避免了直接使用病原物可能致病的危险；

2）利用纯化蛋白质作为免疫源，避免了外源蛋白、核酸混杂而造成的种种副作用，使疫苗更安全；

3）有时单独使用特异蛋白能增强疫苗的效果。

局限性：1）表达可能很低；

2）蛋白质构象折叠可能不正确；

3）免疫力弱且持续时间短。2．3．2肽疫苗(peptide vaccine)

将只与抗原决定簇相对应的小肽连接在大分子载体蛋白上，制成的疫苗称为肽疫苗。优点：1）最突出的是可以用化学合成的方法合成肽，省去了以重组DNA 为

基础的亚单位疫苗产品的纯化步骤；

2）肽疫苗只用抗原蛋白的一部分，不会产生该蛋白其他部分引起的不必要的免疫反应。

实例：口蹄疫疫苗

传统的口蹄疫疫苗是一种灭活病毒疫苗：1）需冷冻状态保存；2）具有危险性；

3）生产花费巨。2．4DNA 免疫DNA 免疫又称基因免疫（genetic immunity）或核酸免疫。

1993年，Wolff 等人意外地发现，将DNA 直接注射小鼠骨骼肌细胞后可引起特异性的免疫反应，并可持续2个月以上。

DNA 免疫的优越性：

1）DNA 比蛋白质更稳定，保存的时间较长；

2）DNA 的提取和纯化比蛋白质容易得多；

3）任何DNA 片段都可以插入质粒中制成疫苗；

4）对目前难以用常规疫苗防治的疾病的预防和治疗有重要意义。

但DNA 疫苗普遍存在免疫效率较低的问题。2．5艾滋病（AIDS ）疫苗2．5．1AIDS 的定义获得性免疫缺陷综合症（AIDS ）：即HIV 检测阳性的个体。

1） 全血的CD4T 细胞数小于200个/mm3（正常值600~1000个/mm3），或CD4T 细胞占整个淋巴细胞数不到14%；

2） CD4T 细胞数等于或大于200个/mm3，但伴有最常见的与AIDS 相关的机会性感染，包括：细菌病：肺结核和其它分枝杆菌属感染，或复发性沙门氏菌败血症。 真菌病：假丝酵母病、球孢子菌病、隐球酵母病、肺囊虫属肺炎等。

病毒性疾病：巨细胞病毒感染、与HIV 相关的脑病、单纯疱疹病毒引起的慢性溃疡和支气管炎等。恶性肿瘤：Kaposi 肉瘤、温袭性子宫颈癌、脑原始淋巴瘤等。2．5．2人类免疫缺陷病毒（HIV ）

2．5．3HIV 病毒的致病机理及患者的感染进程HIV 病毒一旦进入细胞，就可在细胞内大量繁殖，从而导致感染细胞的破裂，这称为直接杀伤。最易受到HIV 病毒侵染的细胞是辅助T 细胞，即CD4T 淋巴细胞，它是免疫系统的支柱细胞之一，因而HIV 病毒感染后的主要症状是免疫能力低下，CD4T 淋巴细胞数量急剧降低。

2．5．4HIV 的生活史及治疗药物

1）逆转录酶抑制剂

抑制逆转录酶，从而阻止基因整合。包括应用最广的第一代抗HIV 药物AZT （叠氮胸苷）。2）HIV 蛋白水解酶抑制剂

阻断HIV 蛋白质活性，防止其进行剪切产生新的HIV 蛋白质。有可能成为第二代有效的HIV 化疗药物。3）混合疗法

解决耐药性问题，采用多种药物联合作用的办法。（1996，美国何大一博士首创鸡尾酒疗法（cocktail therapy），被评为当年“时代周刊”风云人物）混合疗法是目前化学治疗的首选方法。2．5．5AIDS 疫苗HIV 基因的多样性阻碍了AIDS 疫苗的研究进展。目前，AIDS 疫苗的研制包括

1）亚基疫苗：将编码多种HIV 外膜蛋白的基因，用基因工程的方法合成病毒疫苗。亚基疫苗的临床实验目前仍在进行。2）灭活的完整HIV 作为疫苗：只限于感染HIV 的患者使用。

3）活的减毒疫苗：被HIV-1（一种相关病毒，只引起温和的AIDS ）感染的个体可以保护不被HIV-2（引起严重AIDS ）感染。

4）其他：HIVgp160疫苗、CD4受体疫苗等。

到目前为止，还没有获得有效的AIDS 疫苗。而且，AIDS 疫苗在治疗患者时，并不十分有用，因为他们的免疫系统已衰弱，不能对疫苗产生反应！尽管我们对HIV 分子水平的了解和对AIDS 的临床研究已取得了相当的进展，但对抗AIDS 的主要手段，目前仍是以加强社会教育和避免危险的行为为主。

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三讲 微生物在环境中的应用

3.1微生物在生态系统中的地位和作用3.1.1微生物是有机物的主要分解者微生物最大的价值也在于其分解功能。它们分解生物圈内存在的动物和植物残体等复杂有机物质，并最后将其转化成最简单的无机物，再供初级生产者使用。

3.1.2微生物是物质循环中的重要成员微生物参与所有的物质循环，大部分元素及其化合物都受到微生物的作用。在一些物质的循环中，微生物是主要的成员，起主要作用；而一些过程只有微生物才能进行，起独特作用；而有的是循环中的关键过程，起关键作用。

3.1.3微生物是生态系统中的初级生产者光能营养和化能营养微生物是生态系统的初级生产者，它们具有初级生产者所具有的二个明显特征，即可直接利用太阳能、无机物的化学能作为能量来源，另一方面其积累下来的能量又可以在食物链、食物网中流动。3.1.4微生物是物质和能量的贮存者微生物和动物、植物一样也是由物质组成和由能量维持的生命有机体。在土壤、水体中有大量的微生物生物量，贮存着大量的物质和能量。3.1.5微生物在地球生物演化中的作用微生物是最早出现的生物体，并进化成后来的动、植物。藻类的产氧作用，改变大气圈中的化学组成，为后来动、植物出现打下基础。

3.2污水的微生物处理3.2.1污水的工厂处理过程

污水处理一般是一个多步的过程，其中包括物理和生物的处理步骤。

一级处理：仅是物理分离。进入污水处理厂的污水经一系列的筛子，去除大块物体，然后这些水静止数小时，使其中悬浮的固体颗粒沉淀下来。

二级处理：目的使污水中有机物含量减少到可排放至自然水域的程度，与微生物过程紧密联系。

三级处理：是一个物理化学过程。利用沉淀、过滤和加氯消毒法很快地降低最后污水中的无机营养物水平，特别是磷酸盐和硝酸盐。

3.2.2微生物处理的主要方法

3.2.2.1好氧生物处理

活性污泥法(activated sludge process)

是利用悬浮生长的微生物絮体（活性污泥）处理有机废水的一类好氧生物处理方法。最早于1914年由英国人Ardern 和Lockett 创建，在废水处理技术中取得了巨大的成功，成为目前最成熟且仍在继续发展的废水生物处理技术之一。

生物膜法（biofilm ）是利用微生物在固体表面的附着生长对废水进行生物处理的技术。主要用于固定床生物处理技术和流化床生物处理技术中，如生物滤池、生物转盘等工艺。这一类方法的共同特征是通过废水与生物膜的相对运动，使废水与生物膜接触，进行固液两相的物质交换，并在膜内进行有机物的生物氧化与降解，使废水得到净化。

生物滤池：又称洒滴池，主要包括以下几部分:

1）滤床：一般采用碎石、卵石或炉渣铺成滤床，生物膜便长在滤料上；

2）配水与布水装置：其作用是使污水均匀洒向滤床；3）排水装置：在滤层底部汇集经滤床处理的水，通过二沉池排出。3.2.2.2厌氧生物处理

当废水中有机物浓度较高时，就不宜采用好氧处理，而应该采用厌氧处理方法。厌氧生物处理是在厌氧条件下，形成了厌氧微生物生长所需的营养条件和环境条件，利用这类微生物分解废水中的有机物，并产生甲烷和二氧化碳的过程，又称厌氧发酵。与好氧生物处理过程的根本区别在于不以分子态氧为受氢体，而以化合态盐等为受氢体。

3.2.3生态工程与污水处理系统生态工程（ecological engineering ）：一般是指应用生态系统中物种共生与物质循环再生的原理，结合系统工程的最优化方法设计的分层多级利用物质的生产工艺系统。生物氧化塘（oxidation pond）：又称稳定塘，是利用藻类和细菌两类生物间功能上的协同作用处理污水的一种生态系统。

3.3微生物沥滤

由嗜酸细菌产生的酸和金属溶解作用在采矿中起着有益的作用。如果矿石中的金属浓度很低，用传统的开采方法是很不经济的。这种情况下通常采用微生物沥滤法，该法特别适合于铜矿。

细菌沥滤的原理：

（1） 溶矿：通过浸矿剂的作用，产生大量的CuSO 4。

（2） 置换：一般采用Fe 置换“海绵铜“，待进一步加工。

（3） 再生浸矿剂

3.4环境污染的微生物修复生物修复（bioremediation ）：利用生物将土壤、地表及地下水或海洋中的危险性污染物现场去除或降解的工程技术系统。

生物修复与生物处理是一致的，两者的区别在于生物修复几乎专指已被污染的土壤、地下水和海洋中有毒有害污染物的原位生物处理，旨在这些地方恢复“清洁”，而生物处理一般具有更广泛的涵义。

可用作生物修复的微生物类型：1）土著微生物；2）外来微生物；3）基因工程菌。

3.4.1土壤生物修复的原位处理方式

这种方法是在受污染地区直接采用生物修复技术，不需要将土壤挖出和运输。其基本方法是在修复区钻井，一组是注水井，用来将接种的微生物、水、营养物和电子受体等物质注入土壤中；另一组是抽水井，通过抽取地下水，造成地下水在地层中流动，促进微生物的分布及营养物质的运输。例：生物通风系统

有机污染物会降低土壤中的氧气浓度，增加二氧化碳浓度，进而抑制污染物进一步生物降解的条件。因此，生物通风系统向土壤中补充氧气来提高土壤中的污染物降解效果。第四讲 微生物工业和产品

工业化规模培养微生物生产商业性产品，称为微生物工业。微生物工业中菌种的选择和培育是生产之本；代谢调控是生产的关键；规模生产的设备和产物的各项处理是生产的重要组成；所涉及的学科除微生物学、生物化学、分子生物学、化工外，还涉及机械、工程、计算机、经营管理等。

4.1工业发酵的菌种要求和发酵特征

4.1.1生产菌种的要求

1）菌种能在较短时间的发酵过程中高产有价值的发酵产品；

2）菌种的发酵培养应加工低廉，来源充足，被转化产品的效率高；

3）菌种对人、动物、植物和环境不应造成危害；

4）菌种发酵后，所产生不需要的代谢产物少，产品相对容易地与不需要的物质分离；

5）菌种的遗传物质特性稳定，而且易于进行基因操作。

4.1.2工业发酵的特征

一般认为是规模大，即所用的设备庞大, 占用场地大，人力、物力投入的规模大；消耗的原料、能源多；菌种符合生产菌种的要求，其生长代谢特性与大规模生产发酵相适应；需进行成本核算等。

4.2好氧发酵罐的结构和工艺监控

发酵罐是一个大的圆柱体，顶部和底部密封，内部安装了各种管子和阀门。发酵罐一个重要部分是通气系统，一种通气装置称为喷雾器，另一种搅拌的装置称为叶轮。

发酵罐的仔细监控非常重要。大多数情况下，不仅要检测菌体生长和产物合成的情况，而且随着过程的进行，要改变环境参数来控制发酵过程，通常检测的环境因素包括温度、氧浓度、PH 、细胞量和产物浓度。

计算机在发酵罐工艺控制中起重要作用。

4.3发酵的逐级放大一般通俗地将逐级放大称为小试（小型试验）、中试（中型试验）、大试（大规模工业性试验）三个阶段。各阶段不是设备的简单放大，每个阶段都有预期的目标和要求。4.3.1小试：一般指采用实验室的小型设备，包括三角瓶、1~50L发酵罐。

目标：初步评估出所发酵的产物是否具有效益和生产的可能性。

4.3.2中试：指采用试验工厂或车间的小规模设备，如100~5000L发酵罐。

中试的目标：基本确定发酵产物能否进行工业性大规模生产，初步确定生产该产品的必要性和可能性。

4.3.3大试：也称为试验性生产，是指用工业性大规模设备，包括大型发酵罐。大试的目标：确定发酵产物能否进行工业性大规模生产，生产该产品的必要性和可能性。

4.4工业发酵的方式

通常按发酵中某一方面的情况，人为地分类为如下几种方式：1）按对氧需要或不需要：好氧发酵和厌氧发酵2）按培养基是液态还是固态：液态发酵和固态发酵3）按发酵是在培养基的表面或深层进行：表面发酵和深层发酵

4）按发酵是间歇性或连续进行：分批发酵和连续发酵5）按菌种是否被固定在载体上：游离发酵和固定化发酵

6）按菌种是单一还是混合的菌种：单一纯种发酵和混合发酵现代发酵工业大多数是好氧、液体、深层、分批、游离、单一纯种发酵方式结合进行。4.5发酵的主要产品4.5.1食品和饮料4.5.2抗生素和其他微生物药物及生物制品4.5.3氨基酸、有机酸、醇、维生素、核苷酸、激素

4.5.4酶制剂4.5.5微生物农药、肥料和饲料

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