范文一：Folin-酚试剂法测蛋白质含量

实验1-3 蛋白质的定量测定（Folin-酚试剂法）

一、实验原理

1921年，Folin 首创Folin-酚试剂法，利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应；1951年，Lowry 对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。Folin-酚试剂法主要包括两步：

第一步 双缩脲反应

在碱性溶液中，双缩脲（H 2NOC －NH －CONH 2）能与Cu 2+作用, 形成紫色或紫红色的络合物，这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键, 因此有双缩脲反应。即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu 2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。

第二步 Folin-酚显色反应

Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此显色反应。即蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。

在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出样品中蛋白质的含量。另外，可以根据预先绘制的标准曲线求出待测样品中蛋白质的含量。

二、实验材料

（一）样品

健康人血清（稀释300倍） （二）试剂

1．牛血清白蛋白标准液（200 g/ml）

准确称取牛血清白蛋白粉末50.0mg ，用0.1mol/L NaOH溶液润湿溶解，加蒸馏水到250ml 。 2．碱性硫酸铜溶液

①碱溶液：Na 2CO 3 2g 溶于100ml 0.1mol/L NaOH中。

②硫酸铜溶液：CuSO4?5H2O 0.5g溶于100ml 35mmol/L(1%)酒石酸钾钠中。 使用前将①与②按50:1混合即成碱性硫酸铜溶液。使用时新鲜配制。 3．Folin-酚试剂

在2L 磨口回流装置内加钨酸钠（Na 2WO 4?2H 2O ）100g ，钼酸钠（Na 2MoO 4?2H 2O ）25g ，

蒸馏水700ml ，14.68mol/L（85%）磷酸50ml ，浓盐酸100ml ，充分混合后用小火回流10h 。冷却后，再加硫酸锂（Li 2SO 4?H 2O ）150g ，水50ml ，数滴（2~3滴）液体溴（也可用30%H2O 2 6~8滴代替），然后开口沸腾15min ，驱除过量的溴（因溴气甚毒，这一步应在通风橱中进行），冷却后加水至1000ml ，过滤，溶液呈黄色（如带绿色则不能用），保存于棕色瓶中置冷暗处备用（如配制时间较长，试剂转呈绿色），可再加液体溴数滴，煮沸15min ，若能恢复原有的黄色或金黄色仍可继续使用）。

（三）仪器及器材 1．V-1100分光光度计 2．恒温水浴箱 3．试管6支、试管架 4．加样枪、加样枪架 5．坐标纸

三、实验步骤

（一）操作步骤

1．反应取6支试管编号，按下表加入试剂，混匀。 体系设置

↓

试剂（ml ） 牛血清白蛋白标准液

样品液 蒸馏水

空白管 1 — — 1.0

2 0.2 — 0.8

标准管 3 0.4 — 0.6

4 0.6 — 0.4

5 0.8 — 0.2

样品管 6 — 0.5 0.5

2．双缩向各管内分别加入碱性硫酸铜溶液2ml ，混匀，室温放置10min 。 脲反应

3．Folin-再加入Folin-酚试剂0.20ml, 2s 内迅速混a. 酚反应

↓

当Folin-酚试剂加到碱性的铜

匀a ！40℃水浴10min 后，冷却至室温。 -蛋白质溶液中后，必须立即混匀

（加一管混匀一管），使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。

4．比色以500nm 波长比色，用1号管作空白，b. 每管重复测三次A 500值，求平测定

读取各管吸光度值A 500b 。

均值用于绘标准曲线。

（二）注意事项

1．干扰物质

此法是在Folin-酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH 2,-CH 2-NH 2,-CS-NH 2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris 缓冲剂以及蔗糖，硫酸铵，巯基化合物均可干扰Folin-酚反应。此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。而浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。若所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠—氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较高，也需提高碳酸钠—氢氧化钠浓度1—2倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。

2．控制时间

因Lowry 反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。即第1支试管加入2.0ml 碱性硫酸铜试剂后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入2.0ml 碱性硫酸铜试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则第1支试管可立即加入0.20ml Folin-酚试剂，1分钟后第2支试管加入0.20ml Folin-酚试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。40℃水浴10min ，冷却后，每一分钟测定一管吸光值。

四、结果与讨论

（一）结果 1．数据记录

按照下表记录各管在500nm 波长测得的吸光度值。 测定次数

1 2 3

各管平均值A 500

2．绘制标准曲线 （1）选择合适的坐标纸

（2）画坐标轴：以A 500值为纵坐标，牛血清清蛋白标准液浓度为横坐标。 （3）根据测得的数据描点

（4）连线：根据所描点的分布情况，作过原点的直线或光滑连续的曲线，该线表示实验

各管吸光度值A 500

2

3

4

5

6

点的平均变动情况，因此该线不需全部通过各点，但应尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲线或直线两侧。

（5） 求实验结果 3．结果计算

根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。然后乘以稀释倍数（300），得出每毫升未稀释血清含蛋白质的微克数，即每毫升血清中蛋白质的微克数(μg/ml)。

血清蛋白浓度(μg/ml) = 样品蛋白质浓度×2×300 参考：正常人血清蛋白浓度范围为60~80 g/L。 4．常见问题及处理

问 题

解 析

加入Folin-酚试剂后没有及时混匀或加入的量不准确，偏多

Folin-酚试剂在反应前已被破坏，原因是加入Folin-酚试剂后没有及时混匀，或水浴时间过长。

（1） 加入Folin-酚试剂后

溶液呈现黄绿色 （2） 水浴后溶液呈无色

范文二：Folin-酚试剂法测蛋白质含量

实实蛋白实的定量实定;酚实实法,1-3 Folin-

一、实实原理

年～首实酚氨氨残酚酚实实法～利用蛋白实分子中酪酸和色酸基;基,实原实1921Folin Folin-

实;实酸磷磷实酸,起实色反实～年～实此法实行了改实～先于实本中加性实实实～再碱与-1951Lowry

酚灵实实反实～提高了敏度。酚两实实法主要包括步,Folin-

第一步 实实反实双

2+在性溶液中～实实;碱双,,,能与作用形成紫色或紫实色的实合物HCu,NOCNHCONH22

实反实叫做实实反实。由于蛋白实分子中含有实实实相似的多实实实个双与双构个因此有实实反实。在双即碱,

2+2+性溶液中～蛋白实分子中的实实性实实实中的与碱作用生成紫实色的蛋白实实合物。Cu- Cu

第二步 酚实色反实Folin-

酚碱条极磷实实在性件下不实定～其实酸实磷酚实酸实易被实化合物实原而呈实色反实;实实和Folin--

2+实实的混合物,。由于蛋白实中含有实实基的酪酸酚氨～故有此实色反实。蛋白实即实合物( Tyr ) - Cu中所含的酪酸或色酸基实原实实中的实酸和实酸～生　成实色的化合物。氨氨残酚磷磷

在一定实度范实～实色的深度蛋白实实度呈实性实系～故同实实理的蛋白实实准液比色内浅与与即

可求出实品中蛋白实的含量。外～可以根据实先实制的实准曲实求出待实实品中蛋白实的含量。另

二、实实材料

;一,实品

健康人血;稀实清倍,300

;二,实实

,牛血白蛋白实准液;清,1200g/mlμ

准取牛血白蛋白粉末确称清～用溶液实溶解～加蒸实水到湿50.0mg0.1mol/L NaOH

。250ml

,性硫酸实溶液碱2

　?溶液,碱溶于中。NaCO 2g 100ml 0.1mol/L NaOH23

?硫酸实溶液,溶于酒石酸实实中。CuSO4?5HO 0.5g100ml 35mmol/L(1%)2

使用前??按将与混合成性硫酸实溶液。使用实新实配制。即碱50:1

,酚实实3Folin-

在磨口回流置加实酸实;装内,～实酸实;,～蒸实2LNaWO?2HO100gNaMoO?2HO25g242242水～;,酸磷～实实酸～充分混合后用小火回流。冷却后～700ml14.68mol/L85%50ml100ml10h再加硫酸实;,～水～滴;数滴,液实;也可用体滴代LiSO?HO150g50ml2~330%HO6~824222

替,～然后实口沸实～实除实量的实;因实甚毒～实一步实在通实中实行,～冷却后加水至气橱15min

～实实～溶液呈色;如实实色实不能用,～保存于棕色中置冷暗实实用;如配制实实实实～实黄瓶1000ml

实实呈实色,～可再加液实实滴～煮沸体数～若能恢实原有的　色或金色仍可实实使用,。黄黄15min

;三,实器及器材

,分光光度实1V-1100

,恒水浴箱温2

,实管支、实管架36

,加实实、加实实架4

,坐实实5

三、实实步实

;一,操作步实

1,反实取6支实管实～按下表加入实实～混。号匀

体系实置空白管实准管实品管实实;ml,

123456?牛血清白蛋白实准液——0.20.40.60.8

实品液—————0.5

蒸实水1.00.80.60.40.20.52,实实双向各管分实加入性硫酸实溶液内碱2ml～混～室放置匀温10min。 反实

3,Folin再加入Folin-酚实实0.20ml, 2s内匀迅速混a. 当Folin-酚碱实实加到性的实-蛋

a白实溶液中后～必实立混即匀;加-酚反实,40?水浴10min后～冷却至室。温

一管混一管,～使实原反实实生匀?

在实酸磷-磷坏实酸实实被破之前。4,比色以500nm波实比色～用1号管作空白～实实～求平均实b. 每管重实实三次A500

b用于实实准曲实。实定取各管吸光度实A。500

;二,注意事实

,干实物实1

此法是在酚双双法的基实上引入实实实实～因此凡干实实实反实的基实～如　Folin--CO-NH,-CH-22

以及在性实上是基酸或实的实实～如氨冲实实以及蔗糖～硫酸实～实基化合物均冲NH,-CS-NHTris22

可干实酚酚檬反实。此外～所实的蛋白实实品中～若含有实及实酸～均实此反实有干实作用。而实度Folin-

实低的尿素;实左右,～;胍左右,～硫酸实;,～硝酸实;,～三实乙酸0.5%0.5%1%1%

;,～乙醇;,～乙实;,～丙实;,实实色无影～实些物实在所实实品中含量实响0.5%5%5%0.5%

高实～实需做校正曲实。若所实的实品中含硫酸实～实需增加酸实实化实实度实可实色实定。若实品酸碳—氧即度实高～也需提高酸实实实化实实度碳—氧倍～实实可实正实色后色的弊病。即浅1—2

,控制实实2

因反实的实色实实不加深～因此各实操作必实精控制实实。第随断确即支实管加入Lowry12.0ml

碱性硫酸实实实后～实始实实～分实后～第支实管加入碱性硫酸实实实～分实后加第支实管～122.0ml23以此实推。全部实管加完性硫酸实实实后若已到碱分实～实第支实管可立加入即酚实1010.20ml Folin-

实～分实后第支实管加入酚实实～分　实后加第支实管～以此实推。水浴120.20ml Folin-2340?

～冷却后～每一分实实定一管吸光实。10min

四、实果实实与

;一,实果

,据实实数1

按照下表实实各管在波实实得的吸光度实。500nm

实定次数各管吸光度实A500

23456

1

2

3

各管平均实A500

,实制实准曲实2

;,实实合适的坐实实1

;,坐实实,以画实实实坐实～牛血蛋白实准液实度实坐实。清清横2A500

;,根据实得的据描点数3

;,实实,根据所描点的分布情～作实原点的直实或光滑实实的曲实～实实表示实实点的平均实实况4

情～因此实实不需全部通实各点～但实量使未实实实上的实实点均分布在曲实或直实实。况尽匀两

　;, 求实实实果5

,实果实算3

根据未知实品溶液的吸光度实～在实制好的实准曲实实中实出实品溶液中的蛋白实含量。然后乘以

稀实倍;数,～得出每毫升未稀实血含蛋白实的微清数即清数克～每毫升血中蛋白实的微克300

。(g/ml)μ

血蛋白实度清实品蛋白实实度(g/ml) = ×2×300μ

参清考,正常人血蛋白实度范实实。60~80 g/L

,常实实实及实理4

实 实解 析;1加入Folin-酚实实后溶加入Folin-酚没匀确实实后有及实混或加入的量不准～,液呈实实色黄偏多

水浴后溶液呈无色;2Folin-酚坏实实在反实前已被破～原因是加入Folin-酚实,实后有及实混～或水浴实实实实。没匀

范文三：[教学]Folin-酚试剂法测蛋白质含量

实验1-3 蛋白质的定量测定,Folin-酚试剂法,

一、实验原理

1921年～Folin 首创Folin-酚试剂法～利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基,酚基,还原酚试剂,磷钨酸-磷钼酸,起蓝色反应,1951年～Lowry对此法进行了改进～先于标本中加碱性铜试剂～再与酚试剂反应～提高了灵敏度。Folin-酚试剂法主要包括两步:

第一步 双缩脲反应

2+在碱性溶液中～双缩脲,HNOC,NH,CONH,能与Cu作用,形成紫色或紫红色的络22

合物～这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键, 因

2+此有双缩脲反应。即在碱性溶液中～蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu作用生成紫

2+红色的蛋白质- Cu复合物。

第二步 Folin-酚显色反应

Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定～其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应,钼蓝和钨蓝的混合物,。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸( Tyr ) ～故有此显色反

2+应。即蛋白质- Cu复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸～生成蓝色的化合物。

在一定浓度范围内～蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系～故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出样品中蛋白质的含量。另外～可以根据预先绘制的标准曲线求出待测样品中蛋白质的含量。

二、实验材料

,一,样品

健康人血清,稀释300倍,

,二,试剂

1(牛血清白蛋白标准液,200,g/ml,

准确称取牛血清白蛋白粉末50.0mg～用0.1mol/L NaOH溶液润湿溶解～加蒸馏水到250ml。

2(碱性硫酸铜溶液

?碱溶液:NaCO 2g 溶于100ml 0.1mol/L NaOH中。 23

?硫酸铜溶液:CuSO4?5HO 0.5g溶于100ml 35mmol/L(1%)酒石酸钾钠中。2

使用前将?与?按50:1混合即成碱性硫酸铜溶液。使用时新鲜配制。

3(Folin-酚试剂

在2L磨口回流装置内加钨酸钠,NaWO?2HO,100g～钼酸钠,NaMoO?2HO,25g～242242蒸馏水700ml～14.68mol/L,85%,磷酸50ml～浓盐酸100ml～充分混合后用小火回流10h。冷却后～再加硫酸锂,LiSO?HO,150g～水50ml～数滴,2~3滴,液体溴,也可用30%HO24222 6~8滴代替,～然后开口沸腾15min～驱除过量的溴,因溴气甚毒～这一步应在通风橱中进行,～冷却后加水至1000ml～过滤～溶液呈黄色,如带绿色则不能用,～保存于棕色瓶中置冷暗处备用,如配制时间较长～试剂转呈绿色,～可再加液体溴数滴～煮沸15min～若能恢复原有的黄色或金黄色仍可继续使用,。

,三,仪器及器材

1(V-1100分光光度计

2(恒温水浴箱

3(试管6支、试管架

4(加样枪、加样枪架

5(坐标纸

三、实验步骤

,一,操作步骤

1(反应取6支试管编号～按下表加入试剂～混匀。

体系设空白管 标准管 样品管

试剂,ml,

置 1 2 3 4 5 6

? 牛血清白蛋白标准液 — 0.2 0.4 0.6 0.8 —

样品液 — — — — — 0.5

蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.5

2(双缩向各管内分别加入碱性硫酸铜溶液2ml～混匀～室温放置10min。 脲反应

3(Folin-再加入Folin-酚试剂0.20ml, 2s内迅速混a. 当Folin-酚试剂加到碱性的铜

a酚反应 匀:40?水浴10min后～冷却至室温。 -蛋白质溶液中后～必须立即混匀

,加一管混匀一管,～使还原反应?

发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏

之前。

4(比色以500nm波长比色～用1号管作空白～值～求平b. 每管重复测三次A500

b测定 读取各管吸光度值A。 均值用于绘标准曲线。 500

,二,注意事项

1(干扰物质

此法是在Folin-酚法的基础上引入双缩脲试剂～因此凡干扰双缩脲反应的基团～如-CO-NH,-CH-NH,-CS-NH以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂～如Tris缓冲剂以及蔗糖～2222

硫酸铵～巯基化合物均可干扰Folin-酚反应。此外～所测的蛋白质样品中～若含有酚类及柠檬酸～均对此反应有干扰作用。而浓度较低的尿素,约0.5%左右,～胍,0.5%左右,～硫酸钠,1%,～硝酸钠,1%,～三氯乙酸,0.5%,～乙醇,5%,～乙醚,5%,～丙酮,0.5%,对显色无影响～这些物质在所测样品中含量较高时～则需做校正曲线。若所测的样品中含硫酸铵～则需增加碳酸钠—氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较高～也需提高碳酸钠—氢氧化钠浓度1—2倍～这样即可纠正显色后色浅的弊病。

2(控制时间

因Lowry反应的显色随时间不断加深～因此各项操作必须精确控制时间。即第1支试管加入2.0ml碱性硫酸铜试剂后～开始计时～1分钟后～第2支试管加入2.0ml碱性硫酸铜试剂～2分钟后加第3支试管～以此类推。全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟～则第1支试管可立即加入0.20ml Folin-酚试剂～1分钟后第2支试管加入0.20ml Folin-酚试剂～2分

水浴10min～冷却后～每一分钟测定一管吸光值。钟后加第3支试管～以此类推。40?

四、结果与讨论

,一,结果

1(数据记录

按照下表记录各管在500nm波长测得的吸光度值。

各管吸光度值A 500

测定次数

2 3 4 5 6

1

2

3

A各管平均值 500

2(绘制标准曲线

,1,选择合适的坐标纸

,2,画坐标轴:以A值为纵坐标～牛血清清蛋白标准液浓度为横坐标。500

,3,根据测得的数据描点

,4,连线:根据所描点的分布情况～作过原点的直线或光滑连续的曲线～该线表示实验点的平均变动情况～因此该线不需全部通过各点～但应尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲线或直线两侧。

,5, 求实验结果

3(结果计算

根据未知样品溶液的吸光度值～在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。然后乘以稀释倍数,300,～得出每毫升未稀释血清含蛋白质的微克数～即每毫升血清中蛋白质的微克数(,g/ml)。

血清蛋白浓度(,g/ml) = 样品蛋白质浓度×2×300

参考:正常人血清蛋白浓度范围为60~80 g/L。

4(常见问题及处理

问 题 解 析

,1, 加入Folin-酚试剂后加入Folin-酚试剂后没有及时混匀或加入的量不准

溶液呈现黄绿色 确～偏多

,2, 水浴后溶液呈无色 Folin-酚试剂在反应前已被破坏～原因是加入Folin-

酚试剂后没有及时混匀～或水浴时间过长。

范文四：Folin-酚试剂法测蛋白质含量测定实验报告

生物化学实验报告

姓 名：

学 号：

专业年级：

组 别：

生物化学与分子生物学实验教学中心

格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New

Roman ；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出

现多行、多页空白现象。 一、实验目的

1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。

2、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法 。

二、实验原理

Folin-酚反应是利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应。为了提高该反应的敏感度，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应。

1、双缩脲反应：在碱性溶液中, 双缩脲(H2NOC－NH －CONH2) 能与Cu 2+作用, 形成紫色或紫红色的络合物, 这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键, 因此有双缩脲反应。即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu 2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu 2+复合物。

2、Folin-酚显色反应：蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。

在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白

质的含量。

三、材料与方法：以流程图示意

1、材料：①样品：健康人的血清（稀释300倍）②试剂：牛血清蛋白标准液（200μg/ml）、碱性的硫酸铜溶液、蒸馏水、Folin-酚试剂③仪器及器材：V-1100型分光光度计、恒温水浴箱、试管6只、试管架、加样枪、加样枪架、加样枪头

2① 取6支试管编号1~6，按下表依次加入试剂并混匀，室温放置10min 。 试剂（ml ） 牛血清蛋白标准液 样品液（稀释300倍）

蒸馏水 碱性硫酸铜溶液 蛋白质的含量（μg/ml）

1 - - 1.0 2.0 0

2 0.2 - 0.8 2.0 40

3 0.4 - 0.6 2.0 80

4 0.6 - 0.4 2.0 120

5 0.8 - 0.2 2.0 160

6 - 0.5 0.5 2.0 待测

表格 1 Folin-酚试剂定量蛋白质实验步骤

② 往6支试管中分别加入Folin-酚试剂0.20ml ，在2s 内立即混匀。40℃水浴加热10min 后，冷却至室温。

③ 用V-1100型分光光度计以500nm 波长比色，用1号管做空白，测量各管吸光度值并记录，每管测量3次。

④ 数据处理，绘制标准曲线，计算实验结果。

四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。 1、结果

① 实验现象：

1) 加入蒸馏水、蛋白样品和碱性硫酸铜溶液后，溶液均呈无色。 2) 加入Folin-酚试剂后，溶液均呈黄色。

图1 水浴前各试管溶液颜色

3) 水浴后，1号试管溶液呈无色。2号试管到5号试管溶液呈蓝色，且颜色逐渐加深。

6号试管溶液颜色介于4号与5号之间，更接近于5号。

图2 水浴后各试管溶液颜色

② 实验数据记录与分析

各管A 值

测定次数

2

1 2 3 各管平均值

0.050 0.049 0.047 0.049

3 0.088 0.085 0.084 0.086

4 0.128 0.125 0.124 0.126

5 0.144 0.144 0.143 0.144

6 0.142 0.142 0.142 0.142

表格2 500nm 波长吸光度值记录

C （μg/ml） A （吸光度）

1 0 0

2 40 0.049

3 80 0.086

4 120 0.126

5 160 0.144

表格 3 绘制标准曲线数据表

标准曲线图

③ 实验结果计算：由标准曲线图可得，标准曲线方程为y=0.001x。由实验测得样品管（6号试管）的吸光度为0.142，即y 6=0.142，代入标准曲线方程中可求得C 6’=0.142/0.001=142μg/ml。即样品管中的蛋白质浓度为142μg/ml。由于血清被稀释了300倍，在实验中根据化学定量原则再稀释2倍。因此，健康人血清中蛋白质浓度C 6=142*300*2=85200ug/ml=85.200g/L。最终通过实验测得健康人血清中蛋白质浓度为85.200g/L。 2、分析

① 最终实验结果超出正常范围（正常人血清蛋白浓度范围为60~80g/L）。可能的原因有：

1）酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris 缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用, 导致蛋白质偏高。

2）实验操作不当。

3）从标准曲线图来看，前四个点基本在一条直线上，第五个点偏差较大。由此猜测第五支试管的吸光度误差较大，导致实验结果偏大。

4）第五、六支试管与前四支试管所使用的分光光度计不是同一台，而分光光度计是一种精密仪器，更换仪器会导致吸光度测量上有较大误差。

5）显色时间控制存在误差，各个样品的比色时间也无法完全一致。

6）取用蛋白质溶液可能不完全均匀，对结果造成影响。

7）试管可能未完全干燥，使标准液浓度不准确。

② 由标准曲线图可知，在一定的浓度范围内，吸光度值和蛋白质的浓度呈现正

比例的关系。即在一定的范围内，蛋白质浓度越高，蓝色越深，吸光度值越大。通过这种正比例的关系，可以采用比色分析法，即通过测量待测液的吸光度值来获得蛋白质的浓度。

③ Folin-酚试剂法的优点有：1）灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10～20倍，双缩脲法灵敏100倍。2）操作简单快速，不需要复杂的仪器设备。

④ Folin-酚试剂在酸性条件下较稳定，而试管中加入碱性硫酸铜试剂后导致溶液呈碱性，Folin-酚试剂不稳定。因此，Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，应该立即混匀，使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。

⑤ 从正常人血清蛋白浓度范围来看，样品管中的蛋白质浓度大约在100~133.33μg/ml，因此颜色深度大概在三号试管与五号试管之间。

⑥ 本次实验采用浓度梯度法，反应体系设置了一支空白管，四支标准管（蛋白质浓度以40μg/ml为梯度递增），每支试管测量三次取平均值。由此得到的五个数据能减少标准曲线图的误差。

⑦ 因Lowry 反应的显色随时间不断加深，如果没有严格控制时间，就会对最后吸光度值得测量产生误差。因此各项操作必须精确控制时间。

⑧ 部分物质会对双缩脲反应造成干扰作用，如Tris 缓冲剂、蔗糖、硫酸铵等在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂。若所测样品中尿素、硫酸钠、硝酸钠等物质含量较高，需做校正曲线。若所测样品中含硫酸铵，需增加碳酸钠-氢氧化钠浓度。若所测样品酸度较高，需提高碳酸钠-氢氧化钠浓度1~2倍，即可纠正显色后色浅的弊病。

范文五：[南方医科大学生化课件]实验1Folin-酚试剂法测蛋白质含量（可编辑）

Lowry’s法(Folin-酚试剂法)测定蛋白质含量 Determination of protein content by Lowry‘s method 怎样测定血清中蛋白质的含量 蛋白质含量测定的常用方法比较 选择测定方法时应考虑 1、实验对测定所要求的灵敏度和精确度; 2、蛋白质的性质; 3、溶液中存在的干扰物质; 4、测定所花费的时间等。 Lowry’s法(Folin-酚试剂法)测定蛋白质含量 Determination of protein content by Lowry‘s method 实验目的 1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理 及其实验操作技术。 2、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线 求样品溶液中待测定物质含量的方法 。 原理 1921年，Folin 首创，利用蛋白质分子中酪氨酸 和色氨酸残基(酚基)还原酚试剂(磷钨酸-磷钼酸)起蓝色反应。 1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。 原理 第一步:双缩脲反应 在碱性溶液中,双缩脲 H2NOC,NH,CONH2 能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键, 因此有双缩脲反应。

即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。 原理 第二步:Folin-酚显色反应 Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈

蓝色反应 钼蓝和钨蓝的混合物 。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸 Tyr ，故有此显色反应。 即蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。 原理

在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋

白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。 即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。 样品 健康人血清 正常人血清蛋白质含量:60~80g/L 试剂 1、牛血清白蛋白标准液(200μg/ml) 2、碱性硫酸铜溶液(当日有效) 3、Folin-酚试剂 仪器和器材 1、V-1100分光光度计 2、恒温水浴箱 3、试管6支、试管架 4、加样枪、加样枪架 5、坐标纸 操作 注意事项 Folin-酚试剂在酸性条件下较稳定，而碱性硫酸铜试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。 故当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中后，必须立即混匀(加一管混匀一管)，使还原反应发生在磷钼酸-磷钨

酸试剂被破坏之前。

注意事项 因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。 即第1支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。 全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则第1支试管可立即加入0.20mL Folin-酚试剂，1分钟后第2支试管加入0.20mL Folin-酚试剂，2分钟后加第3

支试管，以此类推。 水浴10min，冷却后，每一分钟测一管。 数据处理

绘制标准曲线步骤 1、选择合适的坐标纸 2、画坐标轴 3、根据测得的数据描点 4、连线 5、求实验结果 绘制标准曲线 以A500值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度为横坐标，用铅笔绘制标准曲线。 绘制标准曲线 根据所描点的分布情况，作直线或光滑连续的曲线，该线表示实验点的平均变动情况，因此该线不需全部通过各点，但应尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲线或直线两侧。 计算 根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。 然后乘以稀释倍数(300)，得出每毫升未稀释血清含蛋白质的微克数，

即每毫升血清中蛋白质的微克数 μg/ml 。 血清蛋白浓度 μg/ml 样品蛋白质浓度×2×300 本方法的特点: 优点:1.灵敏度高，比双缩脲法灵敏约100倍。 2.操作简单，不需特殊仪器设备。 缺点:1.费时间较长，

要精确控制操作时间 2.标准曲线也不是严格的直线形式

3.专一性较差，干扰物质较多。 复习思考题 1、试述Folin-酚试

剂法的优点, 2、应用本方法有哪些干扰作用,为什么,应如何注意,

请将答案附在实验报告上～ 值日生工作 请按值日生规则(在讲台上)整理实验室。 清洁完毕，请在值日生登记本上签名。 回收试剂:血清、Folin-酚试剂、牛血清白蛋白标准液。(每天最后实验的专业负责回收放至准备室冰箱)。 碱性硫酸酮试剂(每天最后实验的专业负责倾倒并清洗干净，回收至准备室)。 V-1100分光光度计操作步骤 开机，预热30分钟 转动波长旋钮，调所需波长。

按 键切换到T档 将黑体放入光路中，合上盖，按

键校零 开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯架上，合上盖，按 键切换到A档 拉动比色架拉杆，将空白液放入光路中，合上盖，按 键校零 拉动拉杆，将标准、待测液依次放入光路中 ，即可读取其吸光度A 读数后，将黑体推回光路中，开盖取出比色杯 将参比液倒回原试管中，清洗比色杯并晾干 关机，盖上防尘盖，登记仪器使用登记本。 * * 1、Lowry法是较早发展的一种灵敏的检测法方法，最低灵敏度为5μg，通常测定范围20~250μg。优点是灵敏度高，缺点是费时较长，要精确控制操作时间，标准曲线不是严格的直线形式，且专一性差，干干扰物质较多。 2、考马斯亮蓝法是灵敏度最高的一种方法，优点有:灵敏度高，比Lowry法高4倍左右，最低检测达成1~5μg;测定快速、简便，染色稳定;干扰物少。缺点

是用于不同蛋白质测定时有较大的偏差;SDS、去污剂、TritonX-100有干扰等;标准曲线有轻微的非线性。 3、紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后样品仍能回收利用。缺点是准确度较差，干扰物质多，用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。 4、双缩脲法操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。 5、凯氏定氮法操作比较复杂，使用较少，但较准确，以凯氏定氮法测定的蛋白质作为其他定量方法的标准蛋白质。 此法是在Folin―酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗糖，硫酸铵，巯基化合物均可干扰Folin―酚反应。此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。而浓度较低的尿素(约0.5%左右)，胍(0.5%左右)，硫酸钠(1%)，硝酸钠(1%)，三氯乙酸(0.5%)，乙醇(5%)，乙醚(5%)，丙酮(0.5%)对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。若所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠―氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较高，也需提高碳酸钠―氢氧化钠浓度1―2倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。 根据所描点的分布情况，作直线或光滑连续的曲线，该线表示实验点的平均变动情况，因此该线不需全部通过各点，但应尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲线或直线两侧。 不同蛋白质测定时有较大的偏差 灵敏、简便、快速 1,5ug 考马斯亮蓝法 (Bradford)法 灵敏度低 干扰相对少，较快 1,20mg 双缩脲法 灵敏度低 干扰物较多 快速简便 无损样品 50,100mg 紫外吸收法 干扰物质多、费时、操作严格计时 灵敏度高 20,250ug Lowry法 操作复杂，费时 干扰少，准确 0.2~ 1.0mg氮 凯

氏定氮法 缺点 优点 灵敏度 方 法 - 0.50 0.50 2.0 0.80 - 0.20 2.0 0.60 - 0.40 2.0 0.40 - 0.60 2.0 0.20 - 0.80 2.0 - - 1.0 2.0 牛血清白蛋

白标液 样品液(稀释300倍) 蒸馏水 碱性硫酸铜 6 5 4 3 2 1 试剂(ml 各

管混匀，室温放置10min。 向各管内加入Folin-酚试剂0.20mL, 2s内迅速混

匀～ 40?放置10min。 冷却至室温后，以500nm波长比色，用1号管作空白，

读取各管吸光度。 蛋白质浓度(μg/ml) 0 40 80 120 160 未知 蛋白样品 碱

性铜试剂 混匀， 放10min 加酚试剂 2s混匀 水浴10min 放至室温 比色 2 3 4 5 测定次数 1 2 3 6 各管平均A值 各 管 A 值 吸光度A 蛋白质浓度C(μ

g/ml) 0.2 0.4 0.6 . . . . 40 80 120 160 MODE 0% T MODE 0Abs/100%T * 1、

Lowry法是较早发展的一种灵敏的检测法方法，最低灵敏度为5μg，通常测定范

围20~250μg。优点是灵敏度高，缺点是费时较长，要精确控制操作时间，标准

曲线不是严格的直线形式，且专一性差，干干扰物质较多。 2、考马斯亮蓝法是

灵敏度最高的一种方法，优点有:灵敏度高，比Low

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