郝天源大少爷
范文一：对大肠杆菌DAPI 染色方法的改进
http://www.paper.edu.cn - 1 - 中国科技论文在线对大肠杆菌DAPI染色方法的改进
杨丽 作者简介杨丽1985-女硕士研究生主要研究DNA的重组修复方向. E-mail:
yangli_bityahoo.com.cn 北京理工大学生命学院北京 100081 摘要目的改进以大肠
杆菌为代表的细菌类DAPI染色方法方法用传统染色方法和我们摸索出来的染色方
法对两种大肠杆菌细胞进行染色并进行激光共聚焦显微镜观察。结果改进后的方法
使大肠杆菌的染色效果得到明显优化结论尽管该方法相对复杂但是适合于对大肠杆
菌进行DAPI染色从而定位核区在菌体内的位置。 关键词 DAPI大肠杆菌染色 中图
分类号Q503/Q934 Improvement of E.coli DAPI staining method Yang Li School of Life
Science Beijing Institute of Technology Beijing 100081 Abstract: Purpose: Improve the
method for DAPI staining in different kinds of bacteria with E.coli as a represent Method:
Stain two types of E. coli cells using conventional method and developed method and
compare the results of these two stain method by confocal microscope. Result: The
improved method is optimized Conclusion: Although the method is complex E.coli
nuclear could be seen clearly with this staining method. Keywords: DAPI E.coli Staining
1 引言 DAPI是一种针对活细胞染色的DNA蓝色荧光染料和双链DNA结合后不改
变细胞基因的超微结构。荧光染料DAPI中文名称46-联脒-2-苯基吲哚能识别双链
DNA小沟特别是AT碱基。当它与双链DNA结合时荧光强度增强20倍而与单链DNA
结合则无荧光增强现象没有结合DNA的DAPI荧光也很弱结合?蟮淖畲蠹し?ǔ
の?64nm可用紫外光源进行激发特异性较溴化乙啶更高。DAPI优点是标记技术简单
并且标记效率很高被标记的细胞能清楚的观察到。缺点是细胞分裂将导致DAPI淬灭
仅适于短期分析。 DAPI染色较常用于细胞凋亡的检测染色后利用DAPI的蓝色荧光
使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪来进行检测。并且也可以将DAPI用于各种细胞
和菌体的细胞核或核区染色。如果将DAPI用于普通细胞核染色比较容易达到较为理
想的染色效果。但是如果对细菌类的进行染色则较容易产生一些问题例如染色不均
匀或菌体被通体染色等状况。这是因为由于菌体的个体大小一般为几个微米左右而
普通细胞大小在十几到几十微米之间由于菌体体积较小染料通透性相对较差所以核
区不容易被染料着色或者染色后出现菌体通体被染料包裹的情况发生影响观察效
果。 对于大肠杆菌这类革兰氏阴性菌的DAPI染色方法目前没有比较固定与系统的
染色方法只是在许多已经发表的论文上会涉及到比较粗略的染色过程但是没有比较
详细的染色步骤。针对以上情况的发生我们利用大肠杆菌为模型对细菌类的DAPI
染色方法与技巧进行讨论与分析以期达到较为理想的染色效果。
http://www.paper.edu.cn - 2 - 中国科技论文在线2 材料和方法 2.1 实验材料 E.coli
JM83由英国爱丁堡大学D. Leach教授惠赠E.coli ΔrecG265::CmR突变菌由法国CNRS
B. Michel教授惠赠。DAPI购自Sigma公司多聚甲醛、Triton-X100购自北京拜尔迪生
物技术有限公司载玻片与盖玻片购自北京凯诺春天科技有限公司。成像系统为德国
徕卡显微系统有限公司的Leica激光共聚焦显微镜。 2.2 传统大肠杆菌DAPI染色方
法 一般情况下常用的方法是依据细胞的染色方法进行简单的染色处理并且不同的
实验室可能有不同的操作方法。在此举出一种简单常用的染色方法。将适量0.1μg/mL
的DAPI直接滴加在菌液上避光染色处理12小时1-5。 2.3 改进的大肠杆菌DAPI染色
方法 2.3.1 培养合适浓度的大肠杆菌菌液 对需要染色的菌种分别从-4?冰箱平板
上挑取单菌落加入适量的相应抗生素接种于10mL LB液体培养基中于37?下振荡培
养过夜该过程大约为12小时将过夜培养菌液按1:100体积比例转接于10mL LB液体
培养基中37?下振荡培养23小时至菌液OD600值为0.40.6范围内即菌体此时处于对数生长期末。 2.3.2 大肠杆菌的菌体通透性处理 取1mL处于对数生长期末的菌液置于灭过菌的离心管中4?条件下8000rpm离心3min弃去上清液收集菌体沉淀加入1mL PBS pH7.4溶液洗涤沉淀4?条件下8000rpm离心3min弃去洗涤液上清收集沉淀加入0.8ml Triton-X100至终浓度0.02冰上放置10min使菌体被Triton-X100缓慢温和地穿孔4?条件下8000rpm离心3min弃去含有Triton-X100的上清收集沉淀。 2.3.3 大肠杆菌菌体的固定 加入0.2mL多聚甲醛至终浓度4室温放置10min使菌体逐渐被固定4?条件下8000rpm离心3min弃去含有多聚甲醛的上清收集沉淀加入1mL PBS溶液洗涤沉淀以便洗去残留的多聚甲醛4?条件下8000rpm离心3min弃去上清收集沉淀。 2.3.3 大肠杆菌的DAPI染色 加入0.8mL含DAPI至终浓度0.01μg/mL的PBS溶液6避光放置10min4?条件下8000rpm离心3min弃去上清收集沉淀加入1mL PBS溶液洗去多余的DAPI染料弃去上清收集沉淀加入0.2mL PBS溶液重悬菌体将3μL样品滴加在载玻片中央用枪头涂抹均匀后盖上盖玻片注意不要出现气泡将制好的片子倒置于激光共聚焦显微镜下在合适的波长范围内观察。 http://www.paper.edu.cn - 3 - 中国科技论文在线3 结果 3.1 普通DAPI染色方法处理的大肠杆菌结果 用传统方法染色的大肠杆菌从下图1和2可以看出DAPI染料结合在菌体表面或过多地进入到大肠杆菌的菌体内部从而没有特异性地与核区DNA结合导致在激光共聚焦显微镜下观察时菌体全部为荧光蓝色影响观察效果。 图1 传统方法DAPI染色的野生型大肠杆菌 Fig. 1 Conventional DAPI staining method of wilde-type E.coli 图2 普通方法DAPI染色的突变型大肠杆菌 Fig. 2 Conventional DAPI staining method of mutant E.coli 3.2
改进后的DAPI染色方法处理的大肠杆菌结果 通过对染色的方法进行改进染色处理的结果得到了比较明显的改善效果。如下图3中箭头所指菌体所示许多大肠杆菌个体可以看到比较明显的集中的核区。并且由于有些突变型大肠杆菌出现纤维化生长状态菌体因为不能正常分裂而拉长菌体内存在多个核区使用DAPI染色容易观察到这些分散开的核区如图4中所示。 http://www.paper.edu.cn - 4 - 中国科技论文在线 图3 改进方法后DAPI染色的野生型大肠杆菌 Fig. 3 Improved DAPI staining method of
wilde-type E.coli 图4 改进方法后DAPI染色的突变型大肠杆菌 Fig. 4 Improved DAPI staining method of mutant E.coli 4 讨论 这两种染色方法最主要的区别在于见下表1 表1 改进前后大肠杆菌DAPI染色方法的区别 Tab. 1 The differences between
conventional and improved method of E.coli DAPI staining 比较项目 改进前方法 改进后方法 染色处理步骤 简单 复杂 染色效果 DAPI浓度 DAPI染色时间 模糊 较高 较长 清晰 较低 较短 通过对改进前后两种方法染色后图片的观察效果来看尽管改进后的方法操作步骤较为复杂但该方法可以较为精确地定位大肠杆菌的核区位置为细胞核的荧光观察提供了有利的工具。例如若在大肠杆菌中加入荧光蛋白示踪时便可清晰地显示出荧光蛋白在菌体内的位置显示出在核区或者是菌体间质区据此来判断与荧光蛋白偶联的功能型蛋白的作用7-8。 5 致谢 本工作是在北京理工大学自然科学基金的支持下完成的。感谢爱丁堡大学D Leach教授提供了JM83菌株法国CNRS的M Bichara博士提供了ΔrecG265::CmR突变体。感谢潘学
http://www.paper.edu.cn - 5 - 中国科技论文在线峰老师对实验的指导危金普同学在实验过程中的帮助。同时对北京理工大学应用生物化学与分子生物学实验室的其他同学在此一并致以诚挚的谢意。 参考文献 1 T Nicolai Siegel Doeke R Hekstra et al.
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定位及染色体荧光分带J. 遗传2006282:184188. 4 刘伯轩刘师伟王建华等. DAPI标
记的骨髓间充斥干细胞体内外示踪实验研究J. 中国药物与临床200998:703705. 5 叶
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2010 321137140. 6 廖玲妮. 一种新型recG解旋酶突变株的构建及其功能的体内活性
表征D. 北京北京理工大学2009. 7 Qiu J F Pan X F. Visalization of protein RecR in
Escherichia coli by fluorescent labelingJ. Prog Natual Sci 2009 197: 15451551. 8 Martin A White J K Eykelenboom et al. Non-random segregation of sister chromosomes in Escherichia coliJ. Nature 2008 455: 12481250.
范文二：对大肠杆菌 DAPI 染色方法的改进
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对大肠杆菌 DAPI 染色方法的改进
杨丽
(北京理工大学生命学院，北京 100081)
摘要:目的，改进以大肠杆菌为代表的细菌类 DAPI 染色方法;方法，用传统染色方法和我们摸索出来的染色方法对两种大肠杆菌细胞进行染色，并进行激光共聚焦显微镜观察。结果， 改进后的方法使大肠杆菌的染色效果得到明显优化;结论，尽管该方法相对复杂，但是适合 于对大肠杆菌进行 DAPI 染色，从而定位核区在菌体内的位置。
关键词: DAPI;大肠杆菌;染色
中图分类号:Q503/Q934
Improvement of E.coli DAPI staining method
Yang Li
(School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081)
Abstract: Purpose: Improve the method for DAPI staining in different kinds of bacteria with E.coli as
a represent; Method: Stain two types of E. coli cells using conventional method and developed method,
and compare the results of these two stain method by confocal microscope. Result: The improved
method is optimized; Conclusion: Although the method is complex, E.coli nuclear could be seen
clearly with this staining method. Keywords: DAPI; E.coli; Staining
1 引言
DAPI 是一种针对活细胞染色的 DNA 蓝色荧光染料，和双链 DNA 结合后不改变细胞基 因的超微结构。荧光染料 DAPI，中文名称 4，6-联脒-2-苯基吲哚，能识别双链 DNA 小沟， 特别是 AT 碱基。当它与双链 DNA 结合时，荧光强度增强 20 倍，而与单链 DNA 结合则无 荧光增强现象，没有结合 DNA 的 DAPI 荧光也很弱，结合后的最大激发波长为 364nm，可 用紫外光源进行激发，特异性较溴化乙啶更高。DAPI 优点是标记技术简单，并且标记效率 很高，被标记的细胞能清楚的观察到。缺点是细胞分裂将导致 DAPI 淬灭，仅适于短期分析。
DAPI 染色较常用于细胞凋亡的检测，染色后利用 DAPI 的蓝色荧光使用激光共聚焦显 微镜或流式细胞仪来进行检测。并且也可以将 DAPI 用于各种细胞和菌体的细胞核或核区染 色。如果将 DAPI 用于普通细胞核染色，比较容易达到较为理想的染色效果。但是如果对细 菌类的进行染色，则较容易产生一些问题，例如染色不均匀或菌体被通体染色等状况。这是 因为由于菌体的个体大小一般为几个微米左右，而普通细胞大小在十几到几十微米之间， 由于菌体体积较小，染料通透性相对较差，所以核区不容易被染料着色，或者染色后出现菌 体通体被染料包裹的情况发生，影响观察效果。
对于大肠杆菌这类革兰氏阴性菌的 DAPI 染色方法，目前没有比较固定与系统的染色方 法，只是在许多已经发表的论文上，会涉及到比较粗略的染色过程，但是没有比较详细的染 色步骤。针对以上情况的发生，我们利用大肠杆菌为模型，对细菌类的 DAPI 染色方法与技 巧进行讨论与分析，以期达到较为理想的染色效果。
作者简介:杨丽(1985-),女，硕士研究生，主要研究 DNA 的重组修复方向. E-mail: yangli_bit@yahoo.com.cn
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如果您需要更多论文可以到www.docin.com/week114进行免费查阅。
2 材料和方法
2.1 实验材料
R E.coli JM83 由英国爱丁堡大学 D. Leach 教授惠赠，E.coli ΔrecG265::Cm突变菌由法国 CNRS B. Michel 教授惠赠。DAPI 购自 Sigma 公司，多聚甲醛、Triton-X100 购自北京拜尔迪 生物技术有限公司，载玻片与盖玻片购自北京凯诺春天科技有限公司。成像系统为德国徕 卡显微系统有限公司的 Leica 激光共聚焦显微镜。
2.2 传统大肠杆菌 DAPI 染色方法
一般情况下，常用的方法是依据细胞的染色方法，进行简单的染色处理，并且不同的实 验室可能有不同的操作方法。在此举出一种简单常用的染色方法。将适量 0.1μg/mL 的 DAPI
[1-5]直接滴加在菌液上，避光染色处理 1~2 小时。
2.3 改进的大肠杆菌 DAPI 染色方法
2.3.1 培养合适浓度的大肠杆菌菌液
对需要染色的菌种分别从-4?冰箱平板上挑取单菌落，加入适量的相应抗生素，接种于 10mL LB 液体培养基中，于 37?下振荡培养过夜，该过程大约为 12 小时;将过夜培养菌液 按 1:100 体积比例转接于 10mL LB 液体培养基中，37?下振荡培养 2~3 小时，至菌液 OD600 值为 0.4~0.6 范围内，即菌体此时处于对数生长期末。
2.3.2 大肠杆菌的菌体通透性处理
取 1mL 处于对数生长期末的菌液置于灭过菌的离心管中，4?条件下，8000rpm 离心 3min;弃去上清液，收集菌体沉淀;加入 1mL PBS (pH7.4)溶液洗涤沉淀;4?条件下，8000rpm 离心 3min，弃去洗涤液上清，收集沉淀;加入 0.8ml Triton-X100(至终浓度 0.02%)，冰上 放置 10min，使菌体被 Triton-X100 缓慢温和地穿孔;4?条件下，8000rpm 离心 3min，弃去 含有 Triton-X100 的上清，收集沉淀。
2.3.3 大肠杆菌菌体的固定
加入 0.2mL 多聚甲醛(至终浓度 4%)，室温放置 10min，使菌体逐渐被固定;4?条件 下，8000rpm 离心 3min，弃去含有多聚甲醛的上清，收集沉淀;加入 1mL PBS 溶液洗涤沉 淀，以便洗去残留的多聚甲醛;4?条件下，8000rpm 离心 3min，弃去上清，收集沉淀。
2.3.3 大肠杆菌的 DAPI 染色
[6]加入 0.8mL 含 DAPI(至终浓度 0.01μg/mL)的 PBS 溶液，避光放置 10min;4?条件
rpm 离心 3min，弃去上清，收集沉淀;加入 1mL PBS 溶液洗去多余的 DAPI 染料， 下，8000
弃去上清，收集沉淀;加入 0.2mL PBS 溶液重悬菌体;将 3μL 样品滴加在载玻片中央，用 枪头涂抹均匀后，盖上盖玻片，注意不要出现气泡;将制好的片子倒置于激光共聚焦显微镜 下在合适的波长范围内观察。
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范文三：大肠杆菌革兰氏染色影响因素分析
大肠杆菌革兰氏染色影响因素分析
第11卷第4期
2003
安徽建筑工业学院(自然科学版)
JournalofAnhuiInstituteofArchitecture&Industry
Vo1.11NO.4
2003
大肠杆菌革兰氏染色影响因素分析
凌琪,王敏
(安徽建筑工业学院环境工程系,合肥230022)
摘要:通过大量实验室工作,研究了菌龄,涂片厚薄均匀度,媒染时间,乙醇脱色程度等因素对大肠杆菌革兰氏
染色结果的影响.试验结果显示,在对大肠杆菌进行革兰氏染色时,细菌在伊红美蓝培养基上培养的时间不宜
超过24h;涂片时应为均匀薄片;革氏碘液媒染时间以30s60s为宜;乙醇脱色程度是革兰氏染色的关键.脱色时
间应严格控制在30s,60s.
关键词:大肠杆菌;革兰氏染色;影响因素
中图分类号:X835
无论在饮用水质量管理,还是在环境质量评价中,大肠菌群都是一项
很重要的指标.在对大肠菌群
测定过程中,革兰氏染色是很重要的一个鉴定步骤,革兰氏染色的正确性直接关系到能否正确判断该菌
落是不是大肠菌群,故其是环境微生物实验中最常用的染色法之一,也是细菌学中最重要的鉴定染色方
法之一.在革兰氏染色的整个操作过程中,有很多因素对染色结果有影响.现通过对大肠杆菌革兰氏染
色影响因素试验研究工作,以求得到一些有益的结论.
1材料
(1)菌种:大肠杆菌.大肠杆菌是大肠菌群中很重要也很有代表性的一种.在对新鲜粪便污染水中
大肠菌群测定过程中,选取伊红美蓝琼脂培养基上不同的典型菌落,按照方心芳着的<应用微生物学实验
法>中大肠菌群细菌分离法得到具有甲基红试验阳性,发酵柠檬酸盐阴性,V.P试验阴性,脲酸试验阴性
等特征的一株大肠杆菌.
(2)染液:草酸铵结晶紫,革氏碘液,95%乙醇,蕃红染液.
2影响因素对革兰氏染色结果的影响
2.1菌种菌龄对染色结果的影响
革兰氏染色要求菌种被染色时处于活跃生长期.此时菌体的细胞壁的成分和结构最为典型,经革兰
氏染液染色处理后,能典型正确地反映染色的结果.若菌体细胞未成
熟或已老化,染色结果可能会出现
完全相反的情况.大肠杆菌的活跃生长期为24h左右,故选择从18h32h的范围,分10个时间段进行
涂片染色,每个时间段涂片20张.试验结果见表1.
表1结果显示,在对大肠杆菌测定时,细菌在伊红美蓝培养基上培养时间不宜超过24h,以免阳性菌
呈现假阴性,干扰革兰氏染色的正确性.
收穑日期:2003—05—12
第4期凌琪,王敏:大肠杆菌革兰氏染色影响因素分析63
表1不同培养时间大肠杆菌的染色结果
菌种培养时间(h)G,玻片数涂片染色正确率(%)菌种培养时间(h)G一玻片数涂片染色正确率(%)
1814702520100
201575261470
221890281470
2320100301155
2420100321050
2.2涂片菌膜厚薄对染色结果的影响
用直径3ram的接种环分别挑起培养24h
的大肠杆菌满环,半环和用接种针挑起更少量
大肠杆菌进行涂片,使细菌在一滴生理盐水或
无菌水中和匀后涂成片状,直径为12,
15ram,作革兰氏染色观察.每种情况涂片20
张.试验结果见表2.
表2涂片菌膜厚薄对染色结果的影响
表2结果显示,涂片菌膜浓厚时,因大肠杆菌密集成堆不易脱色或脱色不完全而常常呈G反应;涂
片菌膜薄且均匀时均能得到正确结果.
2.3媒染时间对染色结果的影响
将培养24h的大肠杆菌革兰氏染色,用革
氏碘液作媒染剂,覆盖时间分别为30s,60s,
90s,120s.每个覆盖时间涂片20张,试验结
果见表3.
表3结果显示,对于G一菌而言,媒染时间
过长,容易使阴性菌呈假阳性,可能与媒染时
表3媒染时间对染色结果的影响
间过长使初染液结晶紫与细胞的结合过分牢固有关,因而造成阴性菌呈阳性.媒染时间应控制在30s--
60s为宜.
24乙醇脱色时间对染色结果的影响
G一菌细胞壁疏松,脂类含量高,肽聚糖含量很低.因此用乙醇脱色时,G一菌的脂类物质易被酒精溶
解,致使细胞壁通透性影响,细胞内的结晶紫一碘复合物易被乙醇溶
解而脱出,使菌体出现无色.如果脱
色时间太短,G一菌细胞壁内所形成的结晶紫一碘复合物不易脱出,故往往被染成紫色造成假阳性.
将培养24h的大肠杆菌革兰氏染色,试验选择5s--90s的脱色时间范围,分7个时间段进行试验,每
个时间段制片20张.试验结果见表4.
脱色时间(s)G一玻片数涂片染色正确率(%)脱色时间(s)G一玻片数涂片染色正确率(%)
515754520100
1016806020100
2019959020100
3020100
表4结果显示,乙醇脱色时间不够,阴性菌可能被染为阳性菌.虽然只差10s.20s,但染色结果相差
较大.因此,革兰氏染色要严格控制乙醇脱色时间,一般以30s,60s为宜.
安徽建筑工业学院(自然科学版)第11卷
3试验结果分析
(1)菌龄对革兰氏染色的结果有较大影响,且与活跃生长期的时间差距越大,影响也越大;革兰氏阴
性菌菌龄提前与菌龄推迟相比,对染色结果的影响要小得多.在对大
肠杆菌测定时,细菌在伊红美蓝培
养基上培养时间不宜超过24h;
(2)涂片菌膜厚薄对染色结果有影响,涂片的菌膜薄且均匀时均能得到正确结果.在对大肠杆菌测
定时,只需用接种针挑起很少量大肠杆菌即可;
(3)媒染时间对染色结果有影响,控制在30s60s为宜;
(4)乙醇脱色程度是大肠菌群革兰氏染色的关键,一般控制在30s,60s之间,延长脱色时间对大肠
杆菌染色结果的影响较大,但继续延长则影响不大.
参考文献
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RELATEDFACTORSOFGRAM’S
DYEOFCOLIFORM
LINGQi.WANGMin
(DepartmentofEnvironmentalEngineering.AnhuiInstituteofArchitecture
&Industry,Hefei,230022,China)
Abstract:Inthepaper,theinfluencesofbacteriumage,theeventhicknessofsmear,mordantagenttime,the
degreeofethanoldecolourationandotherrelatedfactorsontheresultofGram’sdyeofColiformaredis—
cuSSed.TheresuItofexperimentsshowsthatduringColiformGram’sdyethe
timeofculturingbacteriumin
EMBmediumiswithin24h;smearshouldbeevenandthin;thetimeofmordantagentisappropriatebetween
30sand60s:thedegreeofethanoldecolourationiskeytoexperimentandthetimeofdecolourationisstrictly
controlledbetween30sand60s.
Keywords:Coliform;Gram’sdye;relatedfactors
范文四：大肠杆菌染色体基因组的结构和功能
大肠杆菌染色体基因组的结构和功能
大肠杆菌染色体基因组是研究最清楚的基因组。估计大肠杆菌基因组含有3500个基因，已被定位的有900个左右。在这900个基因中，有260个基因已查明具有操纵子结构，定位于75个操纵子中。在已知的基因中8％的序列具有调控作用。大肠杆菌染色体基因组中已知的基因多是编码一些酶类的基因，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、脂肪酸和维生素合成代谢的一些酶类的基因，以及大多数碳、氮化合物分解代谢的酶类的基因。另外，核糖体大小亚基中50多种蛋白质的基因也已经鉴定了。
除了有些具有相关功能的基因在一个操纵子内由一个启动子转录外，大多数基因的相对位置可以说是随机分布的。如控制小分子合成和分解代谢的基因，大分子合成和组装的基因分布在大肠杆菌基因组的许多部位，而不是集中在一起。再如，有关糖酵解的酶类的基因分布在染色体基因组的各个部位。进一步发现，大肠杆菌和与其分类关系上相近的其他肠道菌如志贺氏杆菌属（Shigella ）、沙门氏菌属（Salmonella ）等具有相似的基因组结构。伤寒沙门氏杆菌（Salmonellatyphimurium ）几乎与大肠杆菌的基因组结构相同，虽然有10％的基因组序列和大肠杆菌相比发生颠倒，但是其基因的功能仍正常。这更进一步说明染色体上的基因似乎没有固定的格局，相对位置的改变不会影响其功能。
在已知转录方向的50个操纵子中，27个操纵子按顺时针方向转录，23个操纵子按反时针方向转录，即DNA 两条链作为模板指导mRNA 合成的机率差不多相等。在大肠杆菌染色体基因组中，差不多所有的基因都是单拷贝基因，因为多拷贝基因在同一条染色体上很不稳定，极易通过同源重组的方式丢失重复的基因序列。另外，由于大肠杆菌细胞分裂极快，可以在20分钟内完成一次分裂，因此，携带多拷贝基因的大肠杆菌并不比单拷贝基因的大肠杆菌更为有利；相反，由于多拷贝基因的存在，使E.coli 的整个基因组增大，复制时间延长，因而更为不利，除非在某种环境下，需要有多拷贝基因用来编码大量的基因产物，例如，在有极少量乳糖或乳糖衍生物的培养基上，乳糖操纵子的多拷贝化可以使大肠杆菌充分利用的乳糖分子。但是，一旦这种选择压力消失，如将大肠杆菌移到有丰富的乳糖培养基上，多拷贝的乳糖操纵子便没有存在的必要，相反，由于需要较长的复制时间，这种重复的多拷贝基因会重新丢失。
大肠杆菌染色体基因组中，大多数rRNA 基因集中于基因组的复制起点oriC 的位置附近。这种位置有利于rRNA 基因在早期复制后马上作为模板进行rRNA 的合成以便进行核糖体组装和蛋白质的合成。从这一点上看，大肠杆菌基因组上的各个基因的位置与其功能的重要性可能有一定的联系。
范文五：发酵五碳糖和六碳糖产乙醇染色体整合大肠杆菌的构建
发酵五碳糖和六碳糖产乙醇染色体整合大
肠杆菌的构建
第25卷第2期
2007年4月
可再生能塬
RenewableEnergyResources
Vo1.25No.2
Apr.2007
发酵五碳糖和六碳糖产乙醇染色体
整合大肠杆菌的构建
高文,田沈,张晶,刘继开,张亚珍,杨秀山
(首都师范大学生命科学学院,北京100037)
摘要:为了保证外源基因表达的稳定性,减少发酵副产物的生成,根据同源重组原理,将大肠杆菌丙酮酸甲
酸裂解酶pn基因两侧的基因片段作为同源片断,构建了带有运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因pdc和乙醇脱
氢酶基因adhB的整合重组质粒PA—pn,用化学法转人大肠杆菌TOP10的感受态细胞,将经过氨苄青霉素筛选
得到的重组子进行PCR扩增,证明pdc和adhB基因整合到了大肠杆菌的染色体基因组丙酮酸甲酸裂解酶基
因pn位点上.乙醇发酵结果表明,重组菌E.coliTOP10一pfl不但能稳定地利用葡萄糖产乙醇,也能稳定地利用
木糖产乙醇.在大肠杆菌中建立了一条新的代谢糖生成乙醇的途径. 关键词:大肠杆菌:整合质粒;同源重组:葡萄糖和木糖的乙醇发酵 中图分类号:TK6;Q784文献标志码:A文章编号:1671—5292(2007)02—0021—05 Construction"stable一'd,,scherichiacolionstrucu0n0I-abioengineereescnerlcnlaco11I"OrcI
convertingpentoseandhexosetoethanol
GAOWen,TIANShen,ZHANGJing,LIUJi-kai,ZHANGYa—zhen,YANGXiu—shan
(CollegeofLifeScience,CapitalNormalUniversity,Beijing100037,China) Abstract:InordertoimprovethestabilityofrecombinantplasmidinthebioengineeredEs—
cherichiacoliandreducetheby-productsduringtheethanolfermentation,integrativeplasmid
PA——
pflcarryingZymomonasmobilisbiofunctionalpyruvatedecarboxylaseandalcoholdehydroge—
naseIIgeneswasconstructedbasingontwopyruvateformatelyasefragmentsandtransferredinto
E.coliTOPIO.Transformantsconferringampicillinresistancewereanalyzed,PCRamplificationre—
vealedthatthefermentativegenes(pdcandadhB)wereintegratedintotheE.colichromosome withinthepyruvateformatelyasegenebyhomologousrecombination.Andtheresultfromthefer—
mentationofglucoseandxylosebyE.coliTOP10-pflindicatedthatitcanstablyconvertbothglu—
coseandxylosetoethano1.Thisresearchsuccessfullyintroducethenovelpathwayforfermenting
glucosetoethanolinE.coli.
Keywords:escheirchiacoli;integrativeplasmid;homologousrecombination;ethanolfermenta—
tionofglucoseandxylose
木质纤维素是一种可再生资源,用木质纤维
素生产燃料乙醇替代石油燃料,对社会经济的可
持续发展具有重要的意义.高效代谢木糖和葡萄
收稿日期:
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作者简介:
通讯作者:
糖产乙醇的菌种是以木质纤维素为原料生产乙醇 的研究热点之--[1.
由于传统酿酒酵母和运动发酵单胞菌
2006—11-29.
国家"863"课题资助项目(2002AA514010). 高文(1983一),女,硕士研究生,研究方向为酶与发酵工程. 杨秀山(1946一),男,教授,博士生导师,主要从事微生物学和生物质能开发利用的
研究.E-mail:cnu—xsyang@263.net
22可再生能源
(Z.mobilis)只能利用六碳糖产乙醇,所以构建 代谢木糖和葡萄糖产乙醇的基因重组菌是提高 木糖和葡萄糖利用率和乙醇产率的重要途径. 由于大肠杆菌(E.coli)繁殖快,代谢强,染色体 上具有代谢木糖的所有基因,所以近年来成为 代谢木糖和葡萄糖产乙醇重组菌的研究热点. Ingram成功构建了产乙醇重组大肠杆菌KOI1. 但需要加入氯霉素保持稳定表达;Dien将质粒 pL01297转入乳酸脱氢酶LDH和丙酮酸甲酸裂 解酶PFL的活性受到抑制的E.coliFMJ39中. 经分离和驯化得到了菌株FBR3:Bruce将质粒 pL01297转入ldh和pn基因活性受到抑制的 E.coliDC1368和NZNIll中.构建了2株新的 E.coli重组菌FBR4和FBR5.虽然FBR3/4/5不 需加抗生素.但过量表达要消耗大量的碳源,氮 源,对宿主细胞造成沉重的代谢负担,造成遗传 不稳定.本实验室成功构建了带有Z.mobilis丙
酮酸脱羧酶pdc和乙醇脱氢酶adhB基因的质 粒,并转化到E.coli,得到了重组大肠杆菌 TOP10(pLPA),乙醇产量有了明显提高.此类质 粒虽然具有较高的拷贝数,但不能稳定遗传,尤 其在非选择性培养条件下质粒易丢失.另外,大 肠杆菌在糖酵解时生成的丙酮酸除了发酵生成 乙醇外,还通过其他途径生成副产物(如甲酸, 乳酸等).这些副产物降低了糖转化成乙醇的效 率.同时对乙醇的产生有着不同程度的毒性抑 制作用.
外源基因的染色体整合.可使新导人基因 稳定遗传.外源基因可通过插入序列,转座子 和同源重组的方法整合到宿主细胞的染色体 上.其中同源重组能按照人们所预期的基因位 置甚至碱基序列位置进行染色体整合【2J,并可 定向灭活靶基因.丙酮酸甲酸裂解酶pn基因 和乳酸脱氢酶ldhA基因是大肠杆菌发酵过程 中催化产生副产物的关键酶基因.在大肠杆菌 内具有非常高的表达水平【3_.I4].在无氧条件下, 编码的pfl,ldh将丙酮酸转化为甲酸和乳酸,代 表了与乙醇发酵竞争机制的代谢途径【5_.将这 2个基因所在的位置作为整合位点既可以增 强外源基因的表达效果,又可以遏制乙醇发酵 副产物的生成
本研究构建了可整合在E.coli染色体丙酮 酸甲酸裂解酶pn上且不需抗生素便可稳定表 达pdc和adhB基因的载体.将外源基因引入 E.coli染色体丙酮酸甲酸裂解酶pn基因的读码 框架.希望通过PDC和ADHB蛋白的表达和
PFL蛋白的失活来降低生产成本.提高乙醇产 量.
1试验内容
1.1试验材料
1.1.1菌种,质粒及培养基
菌种和质粒:大肠杆菌E.coliTOP10由本实 验室保存,质粒PA由本实验室构建,质粒pGM—T EASY购自北京天为时代科技有限公司. LB培养基:每升培养基中含l0g胰蛋白胨, l0g氯化钠,5g酵母膏,pH值为7.2,固体培养基 加20g琼脂;在LB培养基中加2%葡萄糖(质量 分数,下同)用于培养或增殖E.coliTOP10, E.colipGM—T—PI,E.colipGM-T—P2,E.coliTOP10
(pLPA),E.coliTOP10一pfl;在LB培养基中加5% 葡萄糖用于E.coli同源重组时培养.
1.1.2试剂和酶
X—Gal,TaqDNA聚合酶.DNA纯化回收试剂 盒均购自北京鼎国生物技术有限责任公司:T4 DNA连接酶,质粒提取试剂盒购自北京天为时代 科技有限公司;各种限制性内切酶购自
PROMEGA公司:细菌DNA提取试剂盒购自上海 华舜生物工程有限公司:其它试剂和酶购自北京 天为时代科技有限公司和北京鼎国生物技术有限 责任公司;引物合成和基因测序由上海生工生物 工程技术服务有限公司完成
1.1.3引物设计及PCR反应
根据GeneBank中检索到的E.coliTOP10一pfl
基因全序列设计插在pdc基因前和插在adhB基因后的引物,插在pdc基因前的pn基因片断Pl
的两引物5端均设计NaeI限制性位点:插在 adhB基因后的pn基因片断P2的两引物5端均 设计SacI限制性位点.
以E.coliTOP10基因组DNA为模版.用普通 TaqDNAPolymerase进行PCR扩增反应.两段基 因反应程序分别为Pl片段:95?预变性5min. 94?变性30s,57oC退火45s.72oC延伸60s,35 个循环:1'2片段:95?预变性5min.94oC变性30 s,58oC退火45s,72oC延伸60s,35个循环.反应
高文.等发酵五碳糖和六碳糖产乙醇染色体整合大肠杆菌的构建23
体系均为5OL,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电 泳检测.
1.1.4捕在pdc基前和adhB摹L大|后的Dn基 片段与T载体的连接
将PCR产物纯化回收后,Pl,P2在T4连接 酶的作用下与载体pGM—TEASY连接,分别称为 pGM—T—P1和pGM-T—P2,连接产物分别转化 TOP10感受态细胞,将转化的感受态细胞均匀涂 布于含60p~g/mLAmp和X—gal的LB固体平板 上,在37?下培养l2,16h.
1.1.5重组子的筛选,鉴定
挑选白色菌落接种于20mLLB液体培养基 中摇菌(37?)过夜,进行菌落PCR和提取质粒, 用EcoRI进行酶切鉴定.能够切下目的基因的质 粒为重组质粒.
1.1.6带有pd(.和adhB基因的整合载体的构建 用NaeI酶切pGM—T—P1质粒得到目的片段 P1后,将片段P1与经过NaeI酶切的PA质粒
(此质粒为本实验室已经构建好的带有pdc基因 和adhB基因的pGM_TEASY质粒)相连,将P1 基因定向插入在PA质粒上的pdc基因前:再用 SacI酶切pGM—T—P2质粒得到目的片段P2后, 将片段P2与经过SacI酶切的PA—P1质粒相连, 将P2基因定向插入在PA—P1质粒上的adhB基 因后.
1.1.7染色体整合
整合质粒转化大肠杆菌TOP10的感受态细 胞,加人60tLg/mL氨苄抗生素,在30,35,37?下 分别以12h为一代,在加入了5%葡萄糖的LB培 养基中进行三代传代培养.由于在失去抗性选择 压力的环境下质粒会丢失,再在加入了5%葡萄 糖的LB培养基中以1:100,1:500,1:1000,
1:4000,1:10000的比例进行五代不加抗生素的传 代培养,使质粒上的pdc基因和adhB基因整合到 大肠杆菌染色体中.
1.1.8染色体整合菌株的鉴定
根据GeneBank中检索到的E.coliTOP10ad— hB和pn基因的全序列设计检测引物,以 E.coliTOP10变异菌株的基因组DNA为模版, 用普通TaqDNAPolymerase进行PCR扩增反 应,反应程序:95?预变性5min,94oC变性 30S,58oC退火45S,72oC延伸90S,35个循 环.反应体系为5OL,对PCR产物进行琼脂 糖凝胶电泳检测.
1.1.9重组菌E.coliTOP10一pfl的发酵试验 分别接种2mLOD值为0.6的E.coli TOPIO—pfl,TOPIO和TOPIO(pLPA)增殖菌液于
不同糖含量(5%G,5%X,3%G+2%X)的发酵培养 基中,将E.coliTOP10一pfl置于35oC.TOP10 (pLPA)置于37?.转速均为8Or/min的摇床上培 养:将E.coliTOP10置于37?培养箱中培养.每 隔12h取样,取样时用5mol/LNaOH调节pH值 至7.0~0.2.用气相色谱仪测定乙醇产量. 2结果
2.1同源重组片段的制备
以菌株E.coliTOP10总DNA为模板,经PCR 扩增成功得到P1(pn基因从375bp到1092bp 的片段,长为719bp)及P2(p玎基因从1502bp 到2124bp的片断,长为622bp).电泳检测结果 见图1.将两片断连接到pGM—TEASY载体上, 经EcoRI酶切后.电泳验证能够成功切下P1,P2 目的基因,电泳检测结果见图2.
1'
一图1PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig.1AgaroseelectrophoresisforPCRproducts
1-DNA分子量标准r,2一P1.3一P2
l23
图2pGM—T—PI/2EcoRI酶切电泳图
Fig.2AgaroseelectrophoresisforEcoRIdigestedpGM—T— P1/2
1-DNA分子量标准,2一Pl,3一P2
2.2整合质粒的构建
P1片段按NaeI位点定向插入本实验室已 构建好的带有pdc基因和adhB基因的重组质粒 PA的pdc基因前,用BamHI单酶切验证P1基
24可再生能源
因的连接结果(图3).P2片段按SacI位点定向 l23
729bp.?_.
1IIIl冒图3HaeI酶切验证P2连接正反 Fig.3VerificaionofP2'SligationdirectionbyHaeIdigestion
1-DNA分子量标准,2一l:5,3一l:7,l—Maker 插入在PA质粒的adhB基因后得到PA—pn,用 HaeI单酶切验证P2基因的连接结果(图4).此 图4BamltI酶切验证Pl连接正反
Fi昏4VerificationofP1'sligationdirectionbyBamHIdigestion
1-DNA分子量标准.2一P1,3-P2 质粒已具备了与大肠杆菌进行染色体整合的功 能.构建整合质粒的技术路线见图5. PCR
?l?
zz
肠杆菌染色体上原有基因的片段.整合质粒转 化大肠杆菌TOP10的感受态细胞后,经过三代 加入抗生素和五代不加入抗生素的培养,提取 变异菌株的基因组DNA做PCR,得到的目的 片段包括原PA质粒上adhB基因从778bp以 后的全序列,整合质粒上插在adhB基因后的 P2片段的全序列以及大肠杆菌染色体上Dn 基因从2124bp~i]2233bp的片段,电泳检测 和基因测序证明同源重组成功.电泳检测结果 见图6.
124
1208bp
图6PCR产物的琼脂糖凝股电泳
Fig.6AgaroseelectrophoresisforPCRproducts
1-DNA分子量标准,2—30oC,3—35oC,4—37? 2.4重组菌E.coliTOP10一pfl的发酵试验 E.coliTOP10一pfl在含木糖和葡萄糖的培养 ?
基上培养时,能稳定地利用葡萄糖和木糖产乙 醇.乙醇体积含量比E.coliTOP10有了一定的提 高,但是与E.coliTOP10(pLPA)相比还有较大的 差距.重组菌E.coliTOP10一pfl在发酵5%葡萄糖 时.发酵72h后乙醇体积分数为0.2%:发酵5% 木糖时,发酵72h后乙醇体积分数为0.14%.木 糖发酵的乙醇含量低于葡萄糖发酵的乙醇含量. 这可能是因为该菌的木糖代谢速率比较慢.该 ,
菌在发酵混合糖(含葡萄糖3%和木糖2%)时, 发酵72h后乙醇体积分数为0.9%,比不含外 源基因的原始菌株E.coliTOP10提高了约6倍 (图7).
图5整合质粒构建的技术路线图
Fig.5Constructionoftheintegrativevector
2.3大肠杆菌TOP10染色体变异株的鉴定 若pdc和adhB基因成功地整合人大肠杆 菌的染色体中,则以变异菌株的DNA为模板 做PCR.应能得到既包括这2段基因又包括大 3
橐1.5
l
磕0.5
0
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t,h
图73%G+2%X自由细胞发酵试验乙醇产量 Fig.7Ethanolyieldfrom30/0glucoseandxylosebyfreecells
3分析讨论
试验构建了能插入丙酮酸甲酸裂解酶Dn
高文.等发酵五碳糖和六碳糖产乙醇染色体整合大肠杆菌的构建25
基因序列的染色体整合质粒,并以此将丙酮酸 脱羧酶pdc和乙醇脱氢酶adhB基因整合到了 大肠杆菌染色体上.得到了大肠杆菌TOP10的 变异株TOP10一pfl.同源重组将基因片段整合入 染色体有2种形式,一种是单交换.一种是双交 换.我们构建的染色体整合质粒是一种双交换 整合质粒.双交换质粒较单交换质粒有更高的 整合效率【6l'1f71.一般来说,在同源重组中,同源 片段越长.整合频率越高f61.同源重组获得整合 的重要条件之一就是在宿主细胞基因组DNA 和质粒DNA上有大于600bp高度同源的片段 [71
,整合载体上同源片断Pl,P2的选择保证了同 源重组的成功
本试验特点:?将运动发酵单胞菌丙酮酸脱 羧酶pdc和乙醇脱氢酶adhB基因插入大肠杆菌 的染色体中,提高了这2个基因的稳定性;?使用 不带抗生素抗性标记的整合载体将外源基因整合 在染色体上后.通过提高筛选量将整合重组子筛 选出来.这样获得的重组子就不含有任何抗生素 抗性基因.为工程菌在环境中的安全释放提供了
保障.这无疑是一条简便有效的构建无抗生素基 因工程菌途径;?使丙酮酸甲酸裂解酶结构基因 失活.切断了一条与发酵产乙醇相竞争的途径.减 少了副产物的生成.
乙醇发酵试验表明.菌株TOP10一pfl能稳 定地利用葡萄糖和木糖产乙醇,在大肠杆菌中 建立一条新的代谢糖产乙醇的途径.但是该菌 与E.coliTOP10(pLPA)相比表达量较低,这主要 是由于整合在染色体上pdc和adhB基因的表达 受染色体组拷贝数的限制.虽然其表达量比质粒 表达量少.但却可以稳定地传代.故较质粒表达有 一
定的优越性.
为了减少副产物产量,提高乙醇产量和增 加丙酮酸脱羧酶pdc和乙醇脱氢酶adhB基因 的表达量.本实验室正在构建另一个带有运动 发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc和乙醇脱氢酶 adhB基因的整合质粒,将其插入在大肠杆菌 的乳酸脱氢酶ldhA的核酸序列中.彻底改变 大肠杆菌的代谢途径.使大肠杆菌在厌氧条件 下只能通过表达PDC和ADHB蛋白进行发 酵.以此来提高木糖和葡萄糖发酵生产乙醇的 能力.
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1985,J63(1):1】l—i20.
;英国BP首次在中国投资;
;替代能源项目:
+据有关人士透露.中国石油总公司计划与英国石十
油(BP)公司联合入股广西新天德能源公司,这将是英:
国石油公司第一次在中国投资替代能源项目.i
;目前3家公司正在磋商具体细节.包括合作筹组j
j合资公司,拓展内地可再生能源业务.:
目前中国的政策鼓励清洁能源的使用,相信市场
;也会越来越大.而且目前中国不允许用高粱等粮食作;
物来制造燃料乙醇.所以木薯是最主要的乙醇生产原! 料.:
:新天德能源公司现在拥有中国南方最大的乙醇: 厂,每年可生产木薯乙醇达l0万t,其母公司为广西天? :昌投资公司.英国石油公司日前宣布,将在替代能源和 i可再生能源领域增加1倍的投资,计划未来10a内发i +展为年收入达60亿美元的业务.(晓风)+ ..
++..斗"+,+?+,++…+一一..十,一.++…一?.
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