大漠孤狼赵某某
范文一：酶活力测定方法
蛋白酶活力测定: 参照中华人民共和国专业标准 SB/ T10317-1999蛋白酶活力测定方法( Asha 等, 2007)。
纤维素酶DNS酶活力测定方法
DNS, 活力, 纤维素酶, 测定 1 定义
1g固体酶粉在40℃和pH值4.2条件下，每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位，以u/g表示。 2 原理
纤维素酶分解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量，表示酶的活力。 3.试剂和溶液
3.1 1％葡萄糖标准溶液（同β－葡聚糖酶酶活测定） 3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液
取1g羧甲基纤维素钠（粘度300～600厘泊）,加入pH4.2的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤，此溶液在4℃冰箱贮存，有效期3天。取滤液100ml， 20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮冰箱备用。
3.3 DNS 试剂（同β－葡聚糖酶酶活测定） 4仪器和设备
4.1恒温水浴锅(40℃±0.2℃) 4.2分光光度计
含10mm比色皿，可在550nm处测量吸光度。 5测定步骤
5.1 标准曲线绘制
分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中，加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml，于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。冷却后，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。 5.2待测酶液的制备（同β－葡聚糖酶酶活测定） 5.3 比色测定
精确吸取经待测稀释酶液0.5ml，40℃预热5min，加入经40℃预热的CMC液1.5ml（每个样品同时作3支平行试管），于40℃水浴精确反应10min，立即加入DNS试剂3.0ml终止反应，以后按标准曲线制作步骤测定样品吸光度。
同时进行空白对照测定，取稀释酶液0.5ml，先加入DNS试剂3.0ml，再加入CMC液1.5ml，其余步骤同于样品测定。
6.计算
X=cn/(0.5*10)
式中：X－样品的酶活力，u/g；
c－由样品的平均吸光度从标准曲线或回归方程求得的相对应的葡萄糖的量，mg；
n－样品的稀释倍数(制备成的酶液ml数/2g酶粉)，ml/g； 0.5－参与反应的酶液量，ml； 10—反应时间，min。
空白对照液的配制：
(1)精确加入0.2ml稀释酶液。 (2)精确加入1.8 ml pH = 4.8醋酸缓冲溶液。 (3)放入新华1号滤纸一条。
(4)精确加入3ml DNS试剂。
(5)随同对照样，放入沸水浴中反应15min(注意：参见操作步骤6)。 (6)冷却后加入蒸馏水定容到25ml。
9．以空白对照液调零点，在λmax = 550nm下，用分光光度计测量吸光度值。
滤纸酶活力 = A × 5 × 200 × 1000 / 60 （u/g） A 吸光度值在标准曲线上对应的葡萄糖量（mg）。
CMC酶（Cx）活力测定方法
用pH = 4.8醋酸缓冲溶液配制1%CMC溶液。
准确称取1g酶粉，用蒸馏水定容到2000ml，配制0.5g/L的稀释酶溶液。 在有标准刻度线的试管中加入1.8ml1%CMC溶液。 再加入0.2ml稀释酶液。
在50±1℃水浴中保温反应30min后，立即加入3ml DNS试剂。 空白对照液用1.8ml1%CMC溶液加入3ml DNS试剂，再加入0.2ml稀释酶液。 同时在沸水浴中反应10min，加入蒸馏水定容到25ml。
以空白对照液调零点，在λmax = 550nm下，用分光光度计测量吸光度值。
Cx酶活力 = A × 5 × 2000 × 1000 / 30（u/g）
全活性：取4支15ml试管，每支试管中加入1.5 mL.39℃预热的2%羧甲基纤维素钠（内含0.1 mg/mL硫柳汞），其中1号试管为试剂空白，加入0.01 M，pH6.8磷酸钠缓冲液1 ml； 2号试管为酶样空白，什么也不加；3,4号试管为酶样平行样，各加入1 ml酶液，4支试管同时放入39℃水浴回旋震荡培养60 min。培养后4支试管立即加入3 mL DNS（3,5-一硝基水杨酸溶液），再在2号试管中加入1 ml预先制备好的酶液，用旋涡震荡仪混匀后在开水浴中煮沸5 min，取出后用水冷却5min。以1号试管为空白，在紫外分光光度计上560 nm处进行比色。
以D-葡萄糖作为标样，葡萄糖标准曲线的绘制：称取无水葡萄糖1.00g，溶于100 mL容量瓶中，制成浓度为10 mg/mL葡萄糖溶液，再从中依次吸收1，2，3，4，5，6 ml各溶于100 mL容量瓶中，制成浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL溶液，吸取1.0 mL葡萄糖溶液加入3 mL DNS，煮沸5 min，冷却5 min于560 nm处比色，绘制标准曲线。
Folin酚法测定蛋白酶活力
一、原理
采用福林-酚试剂法。福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。 二、 试剂 1) 福林-酚试剂
向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO2?2H2O)、25g钼酸钠及700mL的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以小火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴液溴，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。 2) 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液
精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。 3) 0.4mo1/L碳酸钠溶液
精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。 4) pH值3～6醋酸缓冲液
精确取NaAc?3H2O16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合，用去离子水稀释定容至1000mL。 5) 2%酪蛋白底物缓冲液 a) 测试酸性蛋白酶缓冲液
精确称取酪蛋白20g，加入0.1mol/L氢氧化钠20mL(用去离子水配制)，在水浴中加热溶解，然后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL。当日配用或置于冰箱中保存。 b) 测试中性蛋白酶缓冲液
精确称取酪蛋白20g，置于1000mL三角瓶中,加入0.2mol/L Na2HPO4溶液(去离子水配制)610mL，在沸水浴中搅拌使其溶解，冷却后过滤，加入0.2mol/L Na2HPO4溶液(去离子水配制)390mL，用去离子水定容至1000mL，即成pH7.0、2%酪蛋白溶液。当天配用或置于冰箱中保存。
6) 100μg/mL酪氨酸溶液
精确称取100mg酪氨酸，逐步加入0.lmol/L盐酸溶解后，用去离于水定容至100mL放入冰箱中保存，临用时用去离子水稀释10倍。
三、操作步骤
1. 酪氨酸标准曲线的绘制
取18支试管分成6组(每组3支，平行样)，编号，按表1分别加入标准酪氨酸、去离子水、0.4mol/L的碳酸钠和福林-酚试剂，混匀后，放入40℃水浴保温20min，然后在721型分光光度计上进行比色测定(波长660nm)，以浓度为0μg/mL酪氨酸溶液做空白对照。
2. 样品酶活的测定
酶液适当稀释。取4支试管编号(1号为空白对照)，分别加入酶液1mL,1号管立即加入
0.4mol/L TCA溶液2mL，使酶失活，另3支样品加入lmL pH 7.0、浓度为2%酪蛋白底物缓冲液(如测酸性蛋白酶活力加pH3.6、2%酪蛋白底物缓冲液)，迅速混匀，并立即放入40℃恒温水浴准确计时，保温10min后，立即加入0.4mol/LTCA溶液2mL，终止反应，同时向1号空白管中加入1mL2%酪蛋白底物缓冲液，摇匀，继续置于水浴中保温20min，取出离心或过滤除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各试管滤液1mL，分别移入另4支试管中，再加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL和己稀释的福林-酚试剂1mL，摇匀，保温显色20min后，进行比色测定(波长660nm)。对照标准曲线，计算酪氨酸含量。 四、蛋白酶活力计算
蛋白酶活性定义:在一定pH值(pH3.6或7.0)和40℃温度条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。
1.3.2 淀粉酶活性测定 1.3.2.1 标准曲线的绘制
分别吸取1.0％葡萄糖标准溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每毫升含葡萄糖200、400、600、800、1000、1200ug的标准溶液，按表A1的操作步骤一起反应。以葡萄糖含量为纵坐标（0.5ml以上稀释液葡萄糖含量分别为：100、200、300、400、500、600μg），以吸光值为横坐标，绘制标准曲线，列出直线回归方程（Y=KX+B）。
1.3.2.2 样品测定
将各峰收集的样品经一定稀释后按下表所示步骤操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支管中加入试剂的时间间隔要绝对一致：
表A1
反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4,000rpm离心10min，上清液以标准空白调零，在分光光度计540nm波长处测定样品空白（A0）和样品溶液（A）的吸光值，A－A0为实测吸光值。用直线回归方程计算样品淀粉酶的活性。
1.3.2.3 活性计算
酶活力单位定义：在60℃、PH6.0条件下，每小时从1％的可溶性淀粉溶液中释放出1微摩尔葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位（U）
淀粉酶活性U按下式计算：
K×（A－A0） S×（30÷60）×180
其中：U——样品淀粉酶活性，U/ml； K——标准曲线斜率；
F——样品溶液反应前的总量，ml； S——样品测试量；表1中S＝0.5ml； 60——1小时为60min； 30——反应时间，min。 180——葡萄糖的分子量。
两个平行样品的测定结果用算术平均值表示，保留整数。
范文二：酶活力测定方法的研究
实验二 酶活力测定方法的研究（1）
——淀粉酶活性的测定
一、 研究背景
酶Enzyme，指具有生物催化功能的高分子物质。酶通过降低化学反应的活化能来加快反应速率，因而具有高效性，同时酶具有高度的专一性。酶的催化活性可以受其他分子影响：抑制剂是可以降低酶活性的分子；激活剂则是可以增加酶活性的分子。酶的活性还可以被温度、化学环境（如pH值）、底物浓度以及电磁波（如微波）等许多因素所影响。酶在工业和人们的日常生活中的应用也非常广泛。例如，药厂用特定的合成酶来合成抗生素；加酶洗衣粉通过分解蛋白质和脂肪来帮助除去衣物上的污渍和油渍。
淀粉酶是一类水解淀粉的糖苷键的总称，按照其水解淀粉的方式，可以分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶是一种内切葡萄糖苷酶，催化水解α-1,4-糖苷键，生成α-麦芽糖和少量葡萄糖。β-淀粉酶从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1,4-葡聚糖链。对于象直链淀粉能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α-1,6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。
二、 研究目标
1. 掌握酶活力的测定方法
2. 进一步学会设计实验方案
3. 测定α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性
三、 研究策略
酶的活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数。
实验的总体思路是测定每分钟内催化生成的麦芽糖的量。
1. 酶的获取
淀粉酶广泛存在于禾谷物类的种子中α-淀粉酶是在萌发的过程中产生的。所以取萌发的种子浸提获取酶溶液。
2. 反应过程
β-淀粉酶不耐热，在高温下容易钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下发生钝化。尽管在种子的萌发过程中，提取液中同时含有两种淀粉酶，可利用这两种淀粉酶的不同特性加以处理，钝化其一，即可测定另外一种酶的活力。
3.产物的检测
淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用还原糖的3,5-二硝基水杨酸法测定。
四、 研究方案及可行性分析
研究方案：
α-淀粉酶耐高温，而β-淀粉酶在高温下易失活。可以在适当的高温下水浴，使β-淀粉酶失去活性，而α-淀粉酶的活性不受很大的影响，这样分解的淀粉可以认为是α-淀粉酶催化的产物。同时可以测量α-淀粉酶和β-淀粉酶的总活力，从而推出β-淀粉酶的活力。
可行性分析：
温度可以通过恒温水浴来实现。试剂等都是实验室常见的，仪器实验室也有。
五、 具体实验设计
1、所用相关试剂：
1%淀粉溶液，pH5.6的柠檬缓冲液，3,5-二硝基水杨酸，麦芽糖标准液，0.4M NaOH
2、相关仪器：
分光光度计，水浴锅，离心机
3、实验步骤：
（1） 酶液的制备
称取2g萌发的小麦种子；研磨成匀浆；转移到50ml容量瓶中至40ml左右，室温浸提15-20min后定容；混匀后3500rpm/min，离心20min，取上清液备用
（3） α-淀粉酶及β-淀粉酶总活性的测定
（4） 麦芽糖的测定
α-淀粉酶活性[(mg/g)/(g/min)]=[(A-A’)*样品稀释总体积]/[(样品重g)*5] (α-+β-)淀粉酶总活性[(mg/g)/(g/min)] =[(B-B’)*样品稀释总体积]/[(样品重g)*5]
A——α-淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度
A’——α-淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度
B——(α-+β-)淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度
B’——(α-+β-)淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度
六、 质疑及相关思考
酶的活力主要体现在初速度上，应该如何控制反应时间，从而得出的结果为酶促反应的初速度。
高温条件下β-淀粉酶的活性是否被完全抑制，同时α-淀粉酶的活性是否没有改变。
七、 思考题
1.酶活力测定实验的总体思路你认为应该是什么？
酶的活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数。
实验的总体思路是测定每分钟内催化生成的麦芽糖的量。而且酶促反应的初速度才是反应酶活的指标。
2.由上述总体思路你认为酶活力测定实验中最关键的设计应该是什么？为什么？在该项设计中要注意什么？
影响酶活力的因素很多，要测定酶的活力就需要创造合适的条件。材料中有两种淀粉酶，本实验的关键是如何抑制一种酶的活性，而另一种酶的活性没有太大改变。
在实验的过程中，水浴的时间一定要到位，如果干扰酶的活性没有被完全抑制，则会严重影响实验结果。
3.淀粉酶和转氨酶的作用各自有何特点？在设计其酶活力测定的具体实验方案时，你认为主要应该有哪些针对性的考虑？
淀粉酶和转氨酶属于不同类型的酶。淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶，转氨酶是催化?-酮酸和?-氨基酸之间转氨作用的酶，它们产物不同，最适条件不同。
保证在最适温度，pH等条件下测定其酶活力。
4．酶促反应的特点？规定酶活力单位的作用？酶活力单位想表征的内涵是什么？其规定有什么特点？
酶具有高效性和专一性，同时要求温和的反应条件。
规定酶活力单位可定量表示酶的催化效率。一个酶活力单位，是指在最适条件下（25?C，最适pH，充足底物），每分钟内能催化1 ?mol底物所需要的酶量。酶活力单位可以用于衡量酶的活性，从而在生产上起指导作用。
5. 所有酶活力测定方法中都有所谓的“对照管”的设计，为什么？其作用是什么？在对它的设计上有何特点？
最主要的作用是控制变量，对照管的设计是用于排除变量以外的其他变量对于体系的影响，尽可能的消除实验的误差。在测定α-淀粉酶的实验中，对照组先加NaOH的作用是使酶失活，从而结果中可以反映酶失活后没有产物生成，得出酶对于反应的进行十分重要。对照组除了要研究得变量意外其他的和实验组一样。
6. 以你们对相关知识的理解，试着分析一下禾谷类种子（如：小麦）萌发过程中的主要代谢特点及可能的代谢途径。
禾谷类种子萌发过程中，种子吸水，内部代谢增强。β-淀粉酶主要预存在胚乳中，α-淀粉酶的产生则与GA的诱导有关。盾片和胚芽鞘产生GA，转运到糊粉层，GA诱导糊粉层合成α-淀粉酶，α-淀粉酶合成后分泌到胚乳。胚乳水解产生的可溶性糖输送到胚的生长部位，作为营养利用。
7．众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均采取钝化?-淀粉酶的活力而测?-淀粉酶和测总酶活力的策略，为何不采取钝化?-淀粉酶活力去测?-淀粉酶活力呢？这种设计思路说明什麽？
温度变量更好控制，高温对于?-淀粉酶的活力没有多大影响，而对于β-淀粉酶则有很好的抑制作用。强酸或强碱的条件下也能催化淀粉的水解，同时在体系中引入了其他的离子，这对于实验的准确性是不利的。
8．有人认为本实验中可以用对照管调分光光度计的100%T 从而获知测定管的OD值，你的观点呢？为什麽？你认为本实验中设计的对照管与比色法测定物质含量实验中设计的空白管有何异同？
不可以，因为空白管是用于得出标准曲线中的麦芽糖含量，而对照管中可能含有少量的麦芽糖所以不能用对照管作为0基准。
空白管的作用是用来调节0点和透光率100%的，而对照管的目的是为了排除因为在种子萌发的过程中造成的少量的麦芽糖生成的影响。但两者从原理上都是为了消除部分影响因素对于光吸收的干扰。
范文三：滤纸酶活力测定方法
滤纸酶活力测定方法
1 试剂
(1) 1 M柠檬酸缓冲液:
称取柠檬酸(CHO?HO)210 g，加蒸馏水750 mL，再加氢氧化钠78 g，6872
充分溶解并冷却后测pH值约为4.2，最后补水定容至1000 mL，得到1 mol/L的柠檬酸缓冲液，其pH值约为4.45。
(2) 0.05 M柠檬酸缓冲液:
将1 M的柠檬酸缓冲液稀释20倍即可。量取1 M的柠檬酸缓冲液50 mL，加水定容至1000 mL，得到0.05 mol/L的柠檬酸缓冲液，其pH值为4.8。
(3) 10 mg/mL标准葡萄糖母液(pH 4.8):
精确称量1.000 g无水葡萄糖(分析纯)，或1.1009 g一水合葡萄糖(分析纯)，用0.05 M的柠檬缓冲溶液(pH 4.8)定容至100 mL。得到10 mg/mL、pH 4.8的标准葡萄糖溶液，分装小试剂瓶，置于–20 ?冰冻保存。用时按一定比例稀释成不同的浓度系列。
2 葡萄糖标准曲线
(1) 将10 mg/mL的标准葡萄糖溶液用0.05 M的柠檬酸缓冲液稀释成一系列浓度
梯度的糖液，分别为:0.20、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60 mg/mL。 (2) 上述不同浓度的糖液各取1.5 mL，置于已编号的10 mL具塞刻度试管中，空
白对照为1.5 mL的0.05 M的柠檬酸缓冲液。
(3) 每管中均加入2 mL DNS试剂并混匀，在沸水浴中保温5 min(注意:水沸腾
时开始计时)，迅速冷却，加水稀释至10 mL并充分摇匀。 (4) 利用分光光度仪在540 nm波长下测定各管的吸光值，用空白管调零点。 (5) 以吸光值为横坐标，葡萄糖含量(mg)为纵坐标，绘制标准曲线，并拟合回
归方程:Y=A+B*X。
3 测定步骤
(1) 在10 mL具塞刻度试管中，放入50 mg的Whatman No. 1滤纸条(1×6 cm)，
注意要先将滤纸条卷起并折叠。
(2) 将待测定的酶液适当稀释，用微量进样器精确吸取50 ,l，小心地置于滤纸卷
上;再加入1.45 mL的柠檬酸缓冲液(0.05 M，pH 4.8)，将滤纸条充分浸没。
整个反应体系的总体积为1.5 mL。
(3) 盖紧塞子，在往复式水浴恒温振荡器中，于50 ?、80次/分的条件下反应
30 min(预热3 min)。
(4) 立即往刻度试管中加入2 mL的DNS试剂，在沸水中保温5 min(水沸时开
始计时)，冷却后加水稀释至10 mL，充分摇匀。
(5) 空白对照用50 ,l已灭活的酶液代替，其余步骤同前。或者先不加酶液，加
完DNS并煮沸后再加入50 ,l酶液，稀释至10 mL后作为空白对照。 (6) 用空白调零，在540 nm下测定样液的吸光值，根据回归方程得出葡萄糖含
量，并计算滤纸酶活力。
(7) 一个滤纸酶活力国际单位(FPIU)定义为:酶水解反应中每分钟生成1.0 ,mol
葡萄糖(以还原糖表示)的酶量。按下式计算:
范文四：酶活力测定方法.doc
蛋白酶活力测定: 参照中华人民共和国专业标准 SB/ T10317-1999蛋白酶活力测定方法( Asha 等, 2007)。
纤维素酶DNS酶活力测定方法
DNS, 活力, 纤维素酶, 测定
1 定义
1g固体酶粉在40?和pH值4.2条件下，每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位，以u/g表示。
2 原理
纤维素酶分解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量，表示酶的活力。
3.试剂和溶液
3.1 1,葡萄糖标准溶液(同β,葡聚糖酶酶活测定)
3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液
取1g羧甲基纤维素钠(粘度300,600厘泊),加入pH4.2的磷酸氢二钠,柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤，此溶液在4?冰箱贮存，有效期3天。取滤液100ml， 20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮冰箱备用。
3.3 DNS 试剂(同β,葡聚糖酶酶活测定)
4仪器和设备
4.1恒温水浴锅(40??0.2?)
4.2分光光度计
含10mm比色皿，可在550nm处测量吸光度。
5测定步骤
5.1 标准曲线绘制
分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中，加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml，于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。冷却后，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。
5.2待测酶液的制备(同β,葡聚糖酶酶活测定) 5.3 比色测定
精确吸取经待测稀释酶液0.5ml，40?预热5min，加入经40?预热的CMC液1.5ml(每个样品同时作3支平行试管)，于40?水浴精确反应10min，立即加入DNS试剂3.0ml终止反应，以后按标准曲线制作步骤测定样品吸光度。
同时进行空白对照测定，取稀释酶液0.5ml，先加入DNS试剂3.0ml，再加入CMC液1.5ml，其余步骤同于样品测定。
6.计算
X=cn/(0.5*10)
式中:X,样品的酶活力，u/g;
c,由样品的平均吸光度从标准曲线或回归方程求得的相对应的葡萄糖的量，mg;
n,样品的稀释倍数(制备成的酶液ml数/2g酶粉)，ml/g;
0.5,参与反应的酶液量，ml;
10—反应时间，min。
空白对照液的配制:
(1)精确加入0.2ml稀释酶液。 (2)精确加入1.8 ml pH = 4.8醋酸缓冲溶液。 (3)放入新华1号滤纸一条。
(4)精确加入3ml DNS试剂。
(5)随同对照样，放入沸水浴中反应15min(注意:参见操作步骤6)。 (6)冷却后加入蒸馏水定容到25ml。
9(以空白对照液调零点，在λmax = 550nm下，用分光光度计测量吸光度值。
滤纸酶活力 = A × 5 × 200 × 1000 / 60 (u/g)
A 吸光度值在标准曲线上对应的葡萄糖量(mg)。
CMC酶(Cx)活力测定方法
用pH = 4.8醋酸缓冲溶液配制1%CMC溶液。
准确称取1g酶粉，用蒸馏水定容到2000ml，配制0.5g/L的稀释酶溶液。 在有标准刻度线的试管中加入1.8ml1%CMC溶液。
再加入0.2ml稀释酶液。
在50?1?水浴中保温反应30min后，立即加入3ml DNS试剂。 空白对照液用1.8ml1%CMC溶液加入3ml DNS试剂，再加入0.2ml稀释酶液。 同时在沸水浴中反应10min，加入蒸馏水定容到25ml。
以空白对照液调零点，在λmax = 550nm下，用分光光度计测量吸光度值。
Cx酶活力 = A × 5 × 2000 × 1000 / 30(u/g)
全活性:取4支15ml试管，每支试管中加入1.5 mL.39?预热的2%羧甲基纤维素钠(内含0.1 mg/mL硫柳汞)，其中1号试管为试剂空白，加入0.01 M，pH6.8磷酸钠缓冲液1 ml; 2号试管为酶样空白，什么也不加;3,4号试管为酶样平行样，各加入1 ml酶液，4支试管同时放入39?水浴回旋震荡培养60 min。培养后4支试管立即加入3 mL DNS(3,5-一硝基水杨酸溶液)，再在2号试管中加入1 ml预先制备好的酶液，用旋涡震荡仪混匀后在开水浴中煮沸5 min，取出后用水冷却5min。以1号试管为空白，在紫外分光光度计上560 nm处进行比色。
以D-葡萄糖作为标样，葡萄糖标准曲线的绘制:称取无水葡萄糖1.00g，溶于100 mL容量瓶中，制成浓度为10 mg/mL葡萄糖溶液，再从中依次吸收1，2，3，4，5，6 ml各溶于100 mL容量瓶中，制成浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL溶液，吸取1.0 mL葡萄糖溶液加入3 mL DNS，煮沸5 min，冷却5 min于560 nm处比色，绘制标准曲线。 Folin酚法测定蛋白酶活力
一、原理
采用福林-酚试剂法。福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混
，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解合物)
产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。 二、 试剂
1) 福林-酚试剂
向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(NaWO?2HO)、25g钼酸钠及700mL的去离子水，222
再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以小火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴液溴，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。
2) 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液
精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。
3) 0.4mo1/L碳酸钠溶液
精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。
4) pH值3,6醋酸缓冲液
精确取NaAc?3HO16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合，用去离子水稀释定容至1000mL。 2
5) 2%酪蛋白底物缓冲液
a) 测试酸性蛋白酶缓冲液
精确称取酪蛋白20g，加入0.1mol/L氢氧化钠20mL(用去离子水配制)，在水浴中加热溶解，然后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL。当日配用或置于冰箱中保存。 b) 测试中性蛋白酶缓冲液
精确称取酪蛋白20g，置于1000mL三角瓶中,加入0.2mol/L Na2HPO4溶液(去离子水配制)610mL，在沸水浴中搅拌使其溶解，冷却后过滤，加入0.2mol/L Na2HPO4溶液(去离子水配制)390mL，用去离子水定容至1000mL，即成pH7.0、2%酪蛋白溶液。当天配用或置于冰箱中保存。
6) 100μg/mL酪氨酸溶液
精确称取100mg酪氨酸，逐步加入0.lmol/L盐酸溶解后，用去离于水定容至100mL放入冰箱中保存，临用时用去离子水稀释10倍。
三、操作步骤
1. 酪氨酸标准曲线的绘制
取18支试管分成6组(每组3支，平行样)，编号，按表1分别加入标准酪氨酸、去离子水、
酚试剂，混匀后，放入40?水浴保温20min，然后在721型分光光0.4mol/L的碳酸钠和福林-
度计上进行比色测定(波长660nm)，以浓度为0μg/mL酪氨酸溶液做空白对照。 管号 标准酪氨酸 去离子水 福林一酚试剂 酪氨酸含量 Na2CO3
(100μg/mL) (mL) (mL) (mL) (μg/mL) 1 0 1.0 5 1 0 2 0.2 0.8 5 1 20 3 0.4 0.6 5 1 40 4 0.6 0.4 5 1 60 5 0.8 0.2 5 1 80 6 1.0 0 5 1 100
2. 样品酶活的测定
酶液适当稀释。取4支试管编号(1号为空白对照)，分别加入酶液1mL,1号管立即加入0.4mol/L TCA溶液2mL，使酶失活，另3支样品加入lmL pH 7.0、浓度为2%酪蛋白底物缓冲液(如测酸性蛋白酶活力加pH3.6、2%酪蛋白底物缓冲液)，迅速混匀，并立即放入40?恒温水浴准确计时，保温10min后，立即加入0.4mol/LTCA溶液2mL，终止反应，同时向1号空白管中加入1mL2%酪蛋白底物缓冲液，摇匀，继续置于水浴中保温20min，取出离心或过滤除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各试管滤液1mL，分别移入另4支试管中，再加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL和己稀释的福林-酚试剂1mL，摇匀，保温显色20min后，进行比色测定(波长660nm)。对照标准曲线，计算酪氨酸含量。
四、蛋白酶活力计算
蛋白酶活性定义:在一定pH值(pH3.6或7.0)和40?温度条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。
1.3.2 淀粉酶活性测定
1.3.2.1 标准曲线的绘制
分别吸取1.0,葡萄糖标准溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每毫升含葡萄糖200、400、600、800、1000、1200ug的标准溶液，按表A1的操作步骤一起反应。以葡萄糖含量为纵坐标(0.5ml以上稀释液葡萄糖含量分别为:100、200、300、400、500、600μg)，以吸光值为横坐标，绘制标准曲线，列出直线回归方程(Y=KX+B)。
1.3.2.2 样品测定
将各峰收集的样品经一定稀释后按下表所示步骤操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支管中加入试剂的时间间隔要绝对一致:
表A1
反应顺序 样品，标准 样品空白 标准空白
样品稀释液(ml) 0.5 0.5 —
蒸馏水(ml) — — 0.5
50?预热5min ? ? ? 依次加入淀粉溶液(ml) 1.5 1.5(第二步) 1.5(第二步)
混合 ? ? ?
50?保温30min ? ― ― 依次加入DNS试剂(ml) 3.0 3.0(第一步) 3.0(第一步)
混合 ? ? ?
100?煮沸7min ? ?(第一步) ?
冷却 ? ? ?
蒸馏水(ml) 10 10 10
混合均匀 ? ? ?
总体积(ml) 15.0 15.0 15.0
反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4,000rpm离心10min，
上清液以标准空白调零，在分光光度计540nm波长处测定样品空白(A)和样品溶液(A)的0
吸光值，A,A为实测吸光值。用直线回归方程计算样品淀粉酶的活性。 0
1.3.2.3 活性计算
酶活力单位定义:在60?、PH6.0条件下，每小时从1,的可溶性淀粉溶液中释放出1微
摩尔葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位(U)
淀粉酶活性U按下式计算:
K×(A,A) 0
S×(30?60)×180
其中:U——样品淀粉酶活性，U/ml;
K——标准曲线斜率;
F——样品溶液反应前的总量，ml;
S——样品测试量;表1中S,0.5ml;
60——1小时为60min;
30——反应时间，min。
180——葡萄糖的分子量。
两个平行样品的测定结果用算术平均值表示，保留整数。
范文五：酶活力的测定方法
酶活力的测定方法
摘要:
关键词:
1.引言
2.概述
2.1 酶
指一类具有催化功能的生物大分子，一般为蛋白质，也包含少数具有催化功能的RNA。
2.2 酶活力
酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
2.3测定酶活力的原理
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。
3. 测定方法
3.1 终止反应法:
是在恒温反应系统中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，加入强酸强碱或者SDS溶液，以及加热等方法使反应立即停止，然后用化学法、放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成量或底物的消耗量。这种方法是最经典的测定酶活力的方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。 3.1.1 还原法
酶与底物在特定的条件(如温度、PH值、底物浓度等)下反应，酶可以促使底物释放出具有还原性的基团，而当向这些反应体系中添加化学试剂，酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应，既而生成有颜色的物质。之后通过在特定的波长下比色，即可求出还原产物的含量，从而及时出酶活力的大小。 3.1.1.1 DNS法
我们经常用的试剂主要为DNS溶液(3,5-二硝基水杨酸)。在果胶酶活力(主要为外切-多聚半乳糖醛酸酶)的测定中，因该类酶以果胶酸为底物，可使其完全分解为D-半乳糖醛酸，这一产物为醛糖的一种，故可与DNS溶液共热产生棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和含有呈色氨基化合物的反应液颜色深浅成正比的原理，在540nm下测其吸光度值，从而就算出果胶酶的酶活力。
3.1.1.2 MBTH法
该法是利用MBTH(3-甲基-2-苯丙噻唑酮腙)与酶液中的还原端基反应生成
3+嗪，过量的MBTH被Fe氧化成阳离子，再与嗪反应生成青蓝色化合物，在一定范围内，还原端基的量和反应液的颜色强度呈正比，测定波长为630nm或者650nm。该法的灵敏度极高，比DNS法高很多。
3.1.2 粘度法
该法是通过测酶对底物粘度的降解率来衡量酶的活性高低。底物粘度可以通过测流量的粘度计以及振动旋转粘度计等现代电子设备，引起的电阻变化被转化为酶活力单位。虽然此法比较灵敏，但是操作复杂繁琐且重复性比较差，并不太常使用。
3.1.3 HPLC法(高压液相色谱法)
酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取一定量的溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰
从而换算出酶活力的数值。这种方高和半峰高后,计算出酶促反应生成物的含量,
法精确度比较高。
3.1.4 免疫学方法
主要与免疫电泳法和免疫凝胶扩散法，这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应，通过待测酶和标准酶进行比较厚，最终确定酶活力，这种方法也非灵敏，但缺点则是不同厂家生产的酶产品需要有不同的抗体发生反应，增加了测定成本。
3.1.5琼脂凝胶扩散法
该法的理论基础是刚果红与多糖的显色反应。将酶作用的底物与琼脂融合熔融后，倒入培养皿中或载玻片上制成琼脂平板。再用打孔器在琼脂平面上打出一个小孔。之后再小孔内点加酶，并培养24小时候，用染色剂显色或用展开剂展开显示出水解区，利用水解直径和酶活力的关系测定酶活力。但是该法占用时间长，且精确度比较低，
3.1.6酶联吸附分析法
3.1.7底物染色法
该方法主要是对底物进行化学修饰后使其带有特定的荧光物质或者染料，在待测酶的催化下释放染料或者荧光物质，通过是防御乙醇中的染料或荧光物质的多少来反映酶活的大小。可用的染料主要有雷马氏亮蓝、刚果红等。在测木糖酶的酶活力时可以采用这种方法。此法操作简单，但由于底物制备的特殊性，提高了测定成本，此外该法对温度、离子强度、乙醇浓度及影响染色片段溶解度的因素非常敏感。
3.1.8酸碱滴定法
在测定脂肪酶活力时，可采用这种方法，
3.2 连续反应法:
无须终止反应，而是在酶反应过程中用光化学仪器或电化学仪器等来监测反应的进行情况，对记录结果进行分析，然后计算出酶活力。
4. 测定实例
5. 结语
6. 参考文献
