革兰氏染色的一般步骤

范文一：革兰氏染色的一般步骤

革兰氏染色的一般步骤

革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram 创立。未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。

革兰氏染色属复染法，即将标本固定后，先用结晶紫染色1分钟后水洗，然后加革兰碘液媒染一分钟后用酒精脱色，再用稀释石炭酸复红复染。染色后除可以看到细菌形态外，还可将细菌分为两大类，即不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G ）。被酒精脱色复染成红色者为革兰氏阴性菌（Gˉ）。

革兰氏染色原理尚不肯定，可能与细菌所带核糖核酸、细菌壁结构通透性、等电点等因素有关。致病菌如金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等属革兰氏染色阳性菌。百日咳杆菌、大肠杆菌（大肠埃希菌）、铜绿假单胞菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、沙门菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等均属革兰氏阴性菌。所以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

1）涂片固定。

2）草酸铵结晶紫染1分钟。

3）纯化水冲洗。

4）加碘液覆盖涂面染1分钟。

5）水洗，用吸水纸吸去水分。

6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。

7）番红染色液（稀）染10秒钟后，纯化水冲洗。干燥，镜检。＋

染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。

实验三细菌的革兰氏染色法

一、目的要求

了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。

二、基本原理

革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram 创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant ）；脱色剂（decoorising agent）和复染液（counterstain ）。

碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crysta vioet ）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine ）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethano ）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。

三、器材

大肠杆菌，金黄色葡萄球菌；

草酸铵结晶紫，番红水溶液，碘液，95%乙醇，载玻片，显微镜等。

四、操作步骤

1．涂片

将培养24小时的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），自然干燥、固定。固定时通过火焰1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2．染色

（1）初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）一滴，染色1-2min ，倾斜后缓慢冲洗，用吸水纸吸干。

（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，倾斜后缓慢冲洗，吸水纸吸干。

（3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，倾斜玻片，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即用水冲净酒精。

（4）复染：用番红液染1～2分钟，水洗。

（5）镜检：自然干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合制片，作革兰氏染色对比。注意：革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。

五、实验结果与讨论

微生物染色液的配制

一、吕氏(Loeffler)碱性美蓝染液

A液：美蓝(methylene blue) 0．6g

95%酒精 30ml

B液：KOH 0．01g

蒸馏水 100ml

分别配制A 液和B 液，配好后混合即可。

二、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液

A液：碱性复红(basic fuchsin) 0．3g

95%酒精 10ml

B液：石炭酸 5．0g

蒸馏水 95ml

将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解，配成A 液。将石炭酸溶解于水中，配成B 液。

混合A 液及B 液即成。通常可将此混合液稀释5—10倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜多配。

三、革兰氏(Gram)染色液

1．草酸铵结晶紫染液

A液：结晶紫(crystal violet) 2g

95%酒精 20ml

B液：草酸铵(ammonium oxalate) 0．8g

蒸馏水 80ml

混合A 、B 二液，静置48小时后使用。

2．卢戈氏(Lugol)碘液

碘片 1．0g

碘化钾 2．0g

蒸馏水 300ml

先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。

3．95%的酒精溶液(脱色用) 。

4．番红复染液

番红(safranine O) 2．5g

95%酒精 100ml

取上述配好的番红酒精溶液10ml 与80ml 蒸馏水混匀即成。

四、芽孢染色液

1．孔雀绿染液

孔雀绿(malachite green) 5g

蒸馏水 100ml

2．番红水溶液

番红 0．5g

蒸馏水 100ml

3．苯酚品红溶液

碱性品红 11g

无水酒精 100ml

制法取上述溶液10ml 与100ml5%的苯酚溶液混合，过滤备用。

4．黑色素(nigrosin)溶液

水溶性黑色素 10g

蒸馏水 100ml

称取10g 黑色素溶于100ml 蒸馏水中，置沸水浴中30分钟后，滤纸过滤二次，补加水到100ml ，加0．5ml 甲醛，备用。

五、荚膜染色液

1．黑色素水溶液

黑色素 5g

蒸馏水 100ml

福尔马林(40%甲醛) 0．5ml

将黑色素在蒸馏水中煮沸5分钟，然后加入福尔马林作防腐剂。

2．番红染液

与革兰氏染液中番红复染液相同。

六、鞭毛染色液

A液：单宁酸 5g

FeCl3 1．5g

蒸馏水 100ml

福尔马林(15%) 2．0ml

NaOH(1%) 1．0ml

配好后，当日使用，次日效果差，第三日则不宜使用。

B液：AgNO3 2g

蒸馏水 100ml

待AgNO3溶解后，取出10ml 备用，向其余的90mlAgNO3中滴入浓NH4ON ，使之成为很浓厚的悬浮液，再继续滴加NH4OH ，直到新形成的沉淀又重新刚刚溶解为止。再将备用的10mlAgNO3慢慢滴入，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状沉淀又消失，再滴入AgNO3，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。如所呈雾不重，此染剂可使用一周，如雾重，则银盐沉淀出，不宜使用。

七、富尔根氏核染色液

1．席夫氏(Schiff)试剂

将1g 碱性复红加入200ml 煮沸的蒸馏水中，振荡5分钟，冷至50℃左右过滤，再加入1mol/LHC120ml，摇匀。待冷至25℃时，加Na2S2O5(偏重亚硫酸钠)3g ，摇匀后装在棕色瓶中，

用黑纸包好，放置暗处过夜，此时试剂应为淡黄色(如为粉红色则不能用) ，再加中性活性炭过滤，滤液振荡1分钟后，再过滤，将此滤液置冷暗处备用(注意：过滤需在避光条件下进行) 。在整个操作过程中所用的一切器皿都需十分洁净、干燥，以消除还原性物质。

2．Schandium 固定液

A液：饱和升汞水溶液

50ml升汞水溶液加95%酒精25ml 混合即得。

B液：冰醋酸

取A 液9毫升+B液1毫升，混匀后加热至60℃。

3．亚硫酸水溶液

10%偏重亚硫酸钠水溶液5ml ，1mol/LHCl5ml，加蒸馏水100ml 混合即得。

八、Bouin 氏固定液

苦味酸饱和水溶液 75ml

福尔马林(40%甲醛) 25ml

冰醋酸 5ml

1g苦味酸可制成75ml 饱和水溶液。

先将苦味酸溶解成水溶液，然后再加入福尔马林和冰醋酸摇匀即成。

九、乳酸石炭酸棉蓝染色液

石炭酸 10g

乳酸(比重1．21) 10ml

甘油 20ml

蒸馏水 10ml

棉蓝(cottonblue) 0．02g

将石炭酸加在蒸馏水中加热溶解，然后加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，使其溶解即成。

十、瑞氏(Wright)染色液

瑞氏染料粉末 0．3g

甘油 3ml

甲醇 97ml

将染料粉末置于干燥的乳缽内研磨，先加甘油，后加甲醇，放玻璃瓶中过夜，过滤即可。

十一、美蓝(Levowitz-Weber)染液

在52ml95%酒精和44ml 四氯乙烷的三角烧瓶中，慢慢加入0．6g 氯化美蓝(met hylene blue chloride)，旋摇三角烧瓶，使其溶解。放5—10℃下，12—24小时，然后加入4ml 冰醋酸。用质量好的滤纸如WhatmanNo ．42或与之同质量的滤纸过滤。贮存于清洁的密闭容器内。

图片-铜绿假单胞菌

金黄色葡萄球菌-显微图片

破伤风梭菌

大肠杆菌

志贺菌革兰染色

伤寒沙门菌革兰染色

念球菌病直接镜检结核分枝杆菌

肉毒杆菌

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范文二：革兰氏染色的步骤及结果对照

革兰氏染色的步骤及结果对照 1. 涂片。首先在载玻片上滴一小滴蒸馏水,用灼烧过的接种针挑取少量细菌,置载玻片的水滴中不水混合并涂抹开,注意涂抹要均匀平坦,涂抹后直径约为1 cm的薄层。

2. 固定。将载玻片在火焰上方快速来回通过一两次,以载玻片的加热面接触手背皮肤,不觉过烫为佳,待冷却后再在火焰上方来回通过一两次,再冷却,这样重复操作直到薄层干了为止。

3. 染色。在制好的片上滴一滴草酸铵结晶紫,染色1 min后用水洗,注意水流不要直接对准薄层。

4. 媒染。加路哥式碘液大概一滴,作用1 min后用水冲洗,注意流水不要直接往薄层上冲,用过滤纸吸干。

5. 脱色。用95%乙醇脱色,一般脱色时间大概为30 s。这一步是革兰氏染色的关键,必须严格掌握好,如果脱色时间过长则会把阳性菌误认为阴性菌;如果脱色不够则容易被误认为是阳性菌。

6. 水洗后用过滤纸吸干。复染。

滴加0.5%的番红染色一滴,液染色10～30 s后,用自来水冲洗。 7. 观察。干燥后,用油镜镜检观察,并做好记录。

过程示意图如下:

范文三：革兰氏染色法的步骤

详细阐叙革兰氏染色法的步骤

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最佳答案

革兰氏染色

一、目的：在细胞发放之前，利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测，判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。

二、原理：

通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

三、实验用品准备：

灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器

四、操作：

1 涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。 2 干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。 3 固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。

4 初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

5 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

6 媒染：用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

7 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

8 脱色：斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。

9 复染：在涂片薄膜上滴加沙黄染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 10 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

11 干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌

范文四：革兰氏染色的机理和步骤

1.革兰氏染色的机理和步骤

机理:G+、G-主要由其CW化学成分的差异而引起对乙醇的通透性，抗脱色能力的差异。主要有肽聚糖的厚度和结构所决定。

G+的CW:肽聚糖层厚，脂质含量低。乙醇脱色时CW脱水，孔径减少，透性降低，不易脱色，呈初染得蓝紫色。

G-的CW:肽聚糖层薄，脂质含量高。乙醇脱色时，类脂被乙醇溶解，透性升高，细胞被复染显红色。

步骤:?涂片:在干净的载玻片上滴一滴水，用接种环挑取菌体均匀涂布于水中。

?固定:将玻片靠近酒精灯火焰，蒸干水分，但不要烤焦。

?初染:用碱性颜料结晶紫对菌液涂片进行初染。

?媒染: 以碘液媒染1min，水洗，吸干水分。(细胞内形成结晶紫与碘的复合物，增强相互作用)

?脱色(关键步骤):以95%的乙醇脱色30s，应适当振荡均匀，是乙醇脱色完全。

?水洗，吸干。

?复染:??(第2张)复染30s，水洗吸干。

?干燥镜检。

2、用渗透皮层膨胀学说解说芽孢耐热机制。

芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差，以及皮层的离子强度很高，这就使皮层产生了极高的渗透压去夺取芽孢核心中水分，其结果造成皮层的充分膨胀和核心的高度失水，正是这种

失水的核心才赋予芽孢极强的耐热性。

3、引起微生物培养过程中PH变化的几种可能反应，并说明如何能够维持微培PH稳定。

答:培养过程中，由于营养物质被分解利用，代谢产物的形成与积累，会导致PH变化。

(第2张中的图)

还与培养基的C/N比有关，C/N高，经培养基后PH显著下降，C/N低，经培养基后PH明显上升。

PH调节:?加入缓冲剂--------常用:一氢二氢磷酸盐，K2HPO4 呈碱性，KH2PO4 酸性，只在一定的PH范围内调节(6.4--7.2)

?大量产酸的菌株，加CaCO3调节，CaCO3难溶于水，不会使培养液的PH过度增加，但可不断中和微生物产的酸。

?培养液中存在天然的缓冲系统，如AA，肽，Pr均属两性电解质，也起缓冲的作用。

?过酸:治标------加NaOH、Na2CO3中和，治本-----加适量氮源:NaNO3、Pr、NH3H2O;增加通风量。

?过碱:治标-----H2SO4、HCl中和，治本----加适量碳源:G类，脂类;减小通风量。

3、抗生素法和菌丝过滤法为何能浓缩营养缺陷型突变株,

抗生素法(青霉素法):适用于细菌。原理:青霉素抑制肽聚糖链间的交联，组织了合成完整的CW，野生型B处于正常生长繁殖，所以对青霉素敏感，可被抑制或杀死;营缺B在基本培养基上休眠状态

存活下来，从而达到浓缩营缺型目的。制霉菌素法适用于真菌，其可与cm上,(第1张)醇作用，引起cm损伤，因为它只能杀死生长繁殖着的真菌，所以......

菌丝过滤法:基本培上，野生型霉菌，,菌的孢子能萌发并长成菌丝，而缺型孢子一般不萌发，或不能长成菌丝，因此培养一段时间后，用灭菌脱脂棉或滤纸滤去菌丝，收集滤液，重复数遍后可除去大部分野生型，从而??

4、生产蛋白酶的枯草芽孢杆菌发生遗传变异，使得产量性状下降，你如何解决,写出具体实验方案。

答:将一定量的枯草芽孢杆菌培养液，做一定浓度的稀释，涂布在含有酪素蛋白质的基本培养基上，37?C培养一段时间后，取出培养基，观察单菌落形成的透明圈大小，取透明圈直径与菌落直径之比较大的菌落，挑取培养做进一步的鉴

定，即可得到高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌。

5、以磺胺为例，说明化学治疗机的作用机制。

答:机理:磺胺是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物，(磺胺类药物取代对氨基苯甲酸，干扰叶酸的合成，抑制了转甲基反应，导致代谢紊乱，从而抑制B生长)，磺胺的抑菌作用是因为许多细菌需要自己合成叶酸而生长，磺胺对人体细胞无毒性，因为人体缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶-----二氢叶酸合成酶，不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行合成叶酸，而必须直接利用叶酸为生长因子进行生长。(磺胺类----与正常代谢产物竞争酶的活性中心，干扰了酶的功能，

从而干扰代谢的正常进行)。

6、画出生长曲线。(第1张)

1、微生物的共性,哪个最基本?

答:?体积小，面积大(最基本)?吸收多，转化快?生长旺，繁殖快思适应性强，易变异?分布广，种类多。

2、比较G+，G- B在CW结构，组成，对溶菌酶，青霉素的敏感性4方面的异同点。

3、表型延迟现象,如何克服,

答:表型延迟:表型的改变落后于,(第四张)改变的现象，分为 ?分离性延迟;突变的,经DNA复制和细胞分裂

后变成纯合状态，表型才能表现出来。?生理性延迟;杂合状态?纯合状态，仍不能表现出来，(如营缺型)通过中间培养(CM，培养过夜)，可使突变,稳定下来，克服表型延迟。

4、培养B常用的斜面培养基是什么,简述配制程序。

答:牛肉膏蛋白胨培养基

?称量;按配方依次准确称量?融化:取少量水于烧杯中，加1%的蛋白胨，加热溶解，加0.5%的牛肉膏，加热溶解，加0.5%的NaCl,热熔，加水补充到所需体积。?调PH至7.6左右。?加琼脂固体2%，热熔。 ?分装入试管，加塞，包扎，高压灭菌?搁置斜面(斜面长度不超过试管一半)?无菌检查:将灭菌的培养基放入37?C的温室中培养24-28h，以检查灭菌是否彻底。

5、啤酒酵母在分批发酵中的生长曲线分哪几个时期,在菌种扩培时，哪个时期做种子,为什么,

答:延滞期，对数生长期，稳定期，衰退期。对数期做种子。利于缩短延滞期。

6、菌种衰退的根本原因,防治措施,

答:,的自发突变。

措施:?减少传代次数?创造良好的培养条件?采用不易衰退的菌种传代?采取良好的菌种保藏措施

4、菌种衰退的根本原因，防止措施。如何区分衰退和饰变,

答:根本原因:,的自发突变。(?传代次数的影响，是负突变株比例占优势，?培养条件)

防止措施见上题。

区分:衰退:指随着菌体的不断生长，负突变菌株的数量占整个菌体数量的比例增大，最终导致菌株的生产性能大幅下降的现象。

?原有形态性状不典型，?生长速率下降?代谢产物生产力下降?对

宿主侵袭力下降?抵抗力下降

饰变:遗传物质结构不发生变化，而只在转录与转译水平上的表型变化，可以同一条件继续培养，观察子代的情况。

饰变特点:暂时性，不可遗传性，表现为全部个体的行为。变异:遗传性，群体中极少数个体的行为。

5、gone,突变的特点,

答:?自发性?非对应性?稀有性(突变率10-6~10-9)?独立性?可诱发性(升高10~10 倍)?稳定性?可逆性(原养型突变型)

6、v(第三张)的特点。

答:?形体微小，能通过细胞滤器(0.22um)，电子显微镜下才能看见?不具有细胞机构，主要成分NA，Pr?V只含有一种核酸，DNA或RNA?无核糖体，即无产能酶系，也无Pr,NA合成酶系，专性活细胞内寄生?无个体生长，也

不进行二分裂，以NA,Pr等“元件”装配，实现大量繁殖。?离体下以无生命的生物大分子状态存在?对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。

7、,月元病毒的致病机理。

答:月元病毒是一种Pr侵染颗粒，仅有Pr组成，称作PrP。

细胞型PrP----PrP对蛋白酶敏感，无凝聚能力，而致病型PrP---PrP c对蛋白酶有一定抗性，可凝集成纤维状组织，PrP c进入细胞后，与PrP结合，形成PrP c---PrP复合体，PrP构型发生改变，转化成PrP c，PrP c数量呈指数增加，其潜伏期长，对中枢神经损害严重。

估菌计数法及其特点(笔记P31)

乳糖操纵子(P30)

1、

2、伴孢晶体,它在何种B中产生,

答:伴孢晶体:苏云金芽孢杆菌等少数芽孢杆菌在其形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体(δ肉毒素)称为伴孢晶体。

对约200种昆虫无为鳞翅目幼虫有毒杀作用，可制成B杀虫剂。

3、霉菌菌落的特征,

答:?质地疏松，呈絮状，网状，绒毛状，地毯状。?形

态大，分为局限性生长(青、曲)和蔓延性生长(根毛)?菌落干燥(孢子) ?颜色丰富，正反颜色常不一致，中心与边缘常不一致。?各种霉菌，在一定培养基上，形成的菌落大小，形状，颜色相对稳定，为分类依据之一。

4、利用磷酸盐或碳酸钙如何维持PH稳定性,

答:?磷酸氢二钾略呈碱性，磷酸氢二钾略呈酸性，两物质以等摩尔浓度溶液PH为6.8，其缓冲能力一般在6.4~7.2范围内有效。磷酸氢二钾+H阳离子---->磷酸氢二钾+K阳离子

磷酸二氢钾+K阳离子+OH- ?磷酸氢二钾+H2O

?大量产酸的菌株，加入碳酸钙调节，碳酸钙难溶于水，不会使培养基PH过度升高，但可不断中和微生物产的酸，同时放出二氧化碳，而降培养基PH控制在一定范围。

5、单倍体酵母细胞经??(第5张)诱变后，得到一系列的突变株，欲从中分离筛选出一株(Leu-),请设计合理的试验程序。

答:淘汰型野生型?(制霉菌素法)?检出?鉴定(滤纸片法) 将单倍体酵母细胞突变株，制成菌悬液，均匀涂布于完全培养基上，长成单个菌落之后，以逐个检出的方式接种于完全培养基上，并影印到基本培养基上，在适宜条件下培养一段时间，在完全培养基上生长，而在基本培养基上不生长的，即为营养缺陷型菌株。将此菌株检出离心，水洗之

后制成适当浓度的菌悬液，与基本培养基均匀混合后，倾注于平板中，干燥凝固之后，在板上划分几个区，在区中加入蘸有色AA的滤纸片，经培养后，在纸片周围有浑浊的生长圈的，说明为色AA营养缺陷株。

6、MR,V.P.实验的原理。

答:MR:用来检测由G产生的有机酸，如甲酸，乙酸，乳酸等，细菌代谢糖产酸，PH降低，甲基红指示剂由橙色(PH=6.3)变成红色(PH=4.2)

大肠杆菌---阳性:利用乳糖产生乳酸，培养后PH

大肠杆菌---阴性:早起产有机酸，后转化有机酸?乙醇，丙酮酸。 ?V.P. 用来测定细菌利用G产生非酸性或中性末端产物的能力，如

丙酮酸。丙酮酸经缩合?乙酰甲基甲醇(经碱性、氧化)?二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精AA中胍基作用，生成红色化合物，产气肠杆菌---阳性，大肠杆菌---阴性。

7、什么叫生长曲线,单细胞微生物的典型生长曲线分几期,划分依据,

答:生长曲线:将少量纯种单细胞微生物接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横坐标，以菌数的对数为纵坐标作图，得到一条反应在整个培养期间菌数变化规律的曲线。分为延滞期，对数期，稳定期，衰亡期。

根据生长速率常数划分，即单位时间内分裂次数的不同。

8、为什么诱变时，要制成充分分散的单细胞或单孢子悬液,对放

http://www.wenku1.com/news/75C1FFF1124F810A.html

线菌进行诱变育种时，宜处理其孢子还是菌丝细胞,为什么,

答:使每个细胞均匀接触诱变剂，减少表型延迟现象，并避免长出不纯菌落。多使用单核无性孢子，由于孢子生理上处于休眠状态，单核区基中了大部分的DNA，减少分离表型延迟，提高突变效果。

培养基原则:?目的明确?适宜的营养物质?浓度及配比合适?控制PH条件?控制氧化还原电位?原料来源经济节约?灭菌处理

1、青霉素的作用机制,

答:原理:β-内酰胺环的结构与肽聚糖单体五肽尾末端的D-Ala-D-Ala二肽结构相近，因而可竞争性的抑制转肽酶的活性，抑

制单体间交联，形成缺损的CW。青霉素对生长旺盛的G+有明显的抑制作用，对休眠期的无抑制，对G+的作用比G-强得多。

2、筛选抗代谢结构类似物突变株的意义是什么,

答:在含有较高浓度终代谢结构类似物的培养基中，野生

型细胞不能生长，而遗传性的解除了反馈抑制或反馈阻遇的抗代谢结构类似物突变株则能生长，突变株在终产物累积的情况下仍然可以不断合成这一产物，所以采取一定的方法，筛选到抗代谢结构类似物突变株，即可获得终产物的高产菌株。

3、酿酒酵母生活史。(同P15)

4、烈性噬菌体,生活史包括几个过程,

答:感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并引起宿主细胞迅速裂解的噬菌体。

吸附?侵入?增殖(NA复制，Pr的生物合成)?装配(成熟)?裂解(释放)

5、缩短延滞期的措施

答:?利用遗传学方法改变种的遗传特性，使延滞期缩短，?利用对数生长期的细胞做种子，?尽量使接种前后使用的培养基组成不要相差太大?适当扩大接种量

6、计算代时(G)，繁殖代数(n)，生长速率常数(R)

答:见第七张

7、诱变育种,举例?非电离辐射诱变剂?电离辐射诱变剂?烷化剂?插入诱变剂?间接引起碱基置换的诱变剂

答:诱变育种:指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变率显著提高，然后从中选取少数符合育种目的的突变株的方法。

?紫外线?x射线，γ射线?EMS，NTG?吖啶类颜料，ICR类?碱基类似物(5-BU等)

(直接引起:?亚硝酸G:CA:T,?羟胺:只引起G:CA:T?烷化剂G:CA:T)

8、什么是鉴别培养基,利用EMB培养正常大肠杆菌和沙门氏菌时，菌落现象,为什么,

答;鉴别培养基:用于鉴别不同类型微生物的培养基，在培养集中加入能与目的菌的无色代谢产物发生颜色反应的指示剂，从而用肉眼就能将该种微生物的菌落与外形相似的其他微生物菌落相区分的培养基。

伊红和美蓝在低酸度时结合形成沉淀，起产酸指示剂作用，大肠杆菌强烈分解乳糖而产生大量混合酸，菌落被染成深紫色，还可看到绿色金属闪光。沙门氏菌不能利用乳糖，菌落无色通明。

1、微生物的产能方式有,与食品发酵工业密切相关的微生物的代谢方式有哪几种,

答:微生物产能方式分为:发酵，有氧呼吸，无氧呼吸。

与食品发酵工业密切相关的发酵，实质是底物水平磷酸化，，底物氧化不彻底，产能水平低，为厌氧条件，兼性厌氧菌在有氧的条件下，

从发酵?呼吸作用，对发酵作用抑制(巴氏效应)

2、高压蒸汽灭菌法的操作步骤和注意事项,

答:步骤:?取出内层锅，外层锅加水至与三角搁架相平?放回内层锅，放入带灭菌物品，加盖并将盖上排气软管插入内层锅?打开加热开关，并同时打开排气阀3-5Min?关上排气阀，温度升至121?计时，控制热源119-123? 15-20min?关上开关，断电后压力降0开盖取物?无菌检查

注意;?切勿忘记加水，水量不可过少?三角瓶，试管口不要与桶壁接触?切勿忘记打开排气阀排锅内空气?压力降为0才能打开排气阀，开盖

3、培养基应包括哪几种营养物质,如何控制PH,

答;碳源，氮源，能源，生长因子，无机盐，水

治标过酸----NaOH、NH3H2O,过碱----H2SO4、HCl

治本酸---加氮源，增大通风量，碱----加碱,(第8张)源，减小通风量

加缓冲剂:加碳酸钙

4、如何延长对数生长期,

答;补充营养物质，调整PH，取走代谢产物，改善物化条件，调整营养配比，C/N比4/1时，菌体大量繁殖。

5、简述烈性噬菌体一步生长曲线制作过程，并绘制曲线图。

答:适量噬菌体接种于培养好的高浓度敏感细胞中，?经数min吸附后，将培养物高倍稀释，或加入抗V抗血清，中和给定时间内未吸

附的噬菌体，从而使因吸附噬菌体建立同步感染?适温下继续培养，定时取样，测样品中V的效价。感染T横坐标，V效价纵坐标，绘制定量描述烈性噬菌体生长规律的试验曲线。(曲线见第9张)

6、利用物理化学诱变剂对微生物进行诱变的目的有哪些,中间培养的目的,用简图表示利用EMS对微生物进行诱变育种的过程, 答:诱变育种目的:?获得高产菌株?抗性突变种?营养缺陷型突变株(检致癌物，高产次代产物 )

中间培养为了克服表型延迟现象。

EMS(甲基磺酸乙酯)----烷化剂----直接引起碱基置换

(烷化后的碱基引起碱基配对错误，也能使嘌呤整体直接从DNA链上脱下来，产生一个缺口，在与缺口相对应的位点上，就能配上任何碱基，从而引起转换或颠换)

选择出发菌株?前培养，制作菌悬液?EMS合适剂量诱变处理?中间培养?初筛培养基涂布?划线分离?菌种鉴定

7、简图表示两亲株细胞(A+B-、A-B+)进行原生质体融合的操作示意图，并对主要步骤作简要说明。

答:见第9张

常用培养基:细菌---牛肉膏蛋白胨培养基(PH7-7.5)

放线菌---高氏1号培养基(PH7-7.5)

酵母菌---麦芽汁培养基 (PH4.5-5,5)

霉菌---查氏合成培养基(PH4.5-5,5)

1、放线菌的培养:28?，3-5d，PH=7~7.5 染色:碳酸复红染1min 观察:(链霉菌)菌落干燥紧密，正反颜色不一致，边缘有辐射状皱褶，小不蔓延，不易挑起。

2、酵母菌培养:25~28?，24h，PH=4.5~5.5，染色:美蓝--活体染色观察:(酿酒酵母)菌落较B的大且厚，多为乳白色，表面湿润，粘稠，边缘整齐，易被挑起。

3、霉菌培养:28?，5~7天，PH=4.5~5.5，染色:乳酸碳酸棉签染液。观察:见第10张

4、酵母菌?大小测定:测微尺，酵母培养物制成水漫片，高倍镜测出宽长与目镜测微尺的格数，再乘以目镜微尺每格代表长度。

?计数:血球计数板:死菌+活菌总数，1ml总菌数=5中方格总数/5*中方格数*10 *稀释倍数

平板菌落计数法:只活菌

5、革兰氏染色:机理+步骤(04真题?)

6、MR，V.P.试验(02真题?)

吲哚试验---检验水解色AA，水解色AA(经水解)?丙酮酸+吲哚大肠杆菌---阳性，产气肠杆菌---阴性

柠檬酸盐试验----检测柠檬酸盐是否被利用

大肠杆菌---阴性(绿色)，产气肠杆菌---阳性(蓝色)

硫化氢试验---是否分解含硫有机物

大肠杆菌----阴性，产气肠杆菌----阳性(黑色沉淀)

1、大肠杆菌 Escherichia coli 食品卫生重要指示菌，合成VB，大肠菌

素

2、枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 淀粉酶，蛋白酶

3、苏云金芽孢杆菌 Bacillus thuringiensis δ-肉毒素，生物农药

4、酿酒酵母(真)Sacharomyces cerevisiae 酒类酿造

5、灰色链霉菌(放)Streptomyces griseus 链霉素

6、产黄青霉 Penicillum chrysogenum 青霉素

7、米曲霉 Aspergillus oryzae 酱，酱油

8、黑曲霉 A.niger 淀粉酶，柠檬酸

9、黄曲霉 A.flavus 蛋白酶

10、米根霉 Rhizopus oryzae 制曲酿酒，乳酸

11、总状毛霉 Mucor racemosus 腐乳，豆豉(强蛋白质分解能力) 属名:首字母大写，斜体种名:小写

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范文五：革兰氏染色法的步骤

革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较

细胞壁革兰阳性菌革兰阴性菌强度较坚韧较疏松

厚度厚，20,80nm 薄，10,15nm 肽聚糖层数多，可达50层少，1,2层肽聚糖含量多，占细胞干重50,80, 少，占细胞干重5,20, 糖类含量多，约45, 少，15,20, 脂类含量少，1,4, 多，11,22, 磷壁酸， , 外膜 , ，

革兰染色液

1. 结晶紫染液结晶紫酒精饱和液(95,酒精 100ml，结晶紫 10g)20ml，1,

草酸铵水溶液 80ml 将以上两液分别配制后，按上量混合，以滤纸过滤备用。 2. 碘液碘化钾2g，碘1g，蒸馏水300ml。先用2,5ml蒸馏水将2g碘化钾

溶解，然后再加入碘，待碘完全溶解后，再加蒸馏水至总容量为300ml即成。 3. 稀释石炭酸复红染液取碱性复红10g溶于95,酒精100ml中，制成碱性复

红酒精饱和液取此饱和液10ml与5,石炭酸水溶液95ml混匀，制成石炭酸

复红染液，取石炭酸复红染液10ml加入蒸馏水90ml中混匀，即成稀释石炭

酸复红染液。

革兰氏染色

一、实验目的:

在细胞发放之前，利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测，判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。二、实验原理:

通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色;而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

三、实验用品准备:

四、操作步骤:

细菌涂片标本制作

1 涂片:取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。 2 干燥:将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。 3 固定:固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层较快来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜(不超过60?)，放置待冷后，进行染色。

染色

4 初染:在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

5 水洗:斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

6 媒染:用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

7 水洗:斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

8 脱色:斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。

9 复染:在涂片薄膜上滴加石炭酸复红稀释液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

10 水洗:斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

11 干燥、观察:用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌

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