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范文一：碱裂解法原理

质粒抽提经典中的经典--从质粒抽提谈起

2007-4-10 22:22:32 信息来源：来源网络

质粒抽提经典中的经典--从质粒抽提谈起

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复旦大学生化与分子生物学实验室教授撰写

碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可以我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老师”也是这个状态。这就不得不让人感到悲哀了。我想这恐怕和我们的文化有点关系。中国人崇尚读书，“学而优则仕”的观念深入人心。经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的“八股学”。生命科学是实验科学，它讲究动手。如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？

可是光动手不思考，不就成了一个工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己。一个杰出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善于应用的“艺术家”。

每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望。为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I ，50 mM 葡萄糖/ 25 mM Tri s-Cl / 10 mM EDTA ，pH 8.0；溶液II ，0.2 N NaOH / 1% SDS ；溶液III ，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。

让我们先来看看溶液I 的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的p H ，因此用适当浓度的和适当pH 值的Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。那么50 mM 葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I 中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I 中葡萄糖是可缺的。那么EDTA 呢？大家知道EDTA 是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，

配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase 的活性，和抑制微生物生长。在溶液I 中加入高达10 mM 的EDTA ，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA ，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA 会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE 缓冲液中有EDTA. 如果哪天你手上正好缺了溶液I ，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB 培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。

轮到溶液II 了。这是用新鲜的0.4 N 的NaOH 和2％的SDS 等体积混合后使用的。要新从浓NaOH 稀释制备0.4N 的NaOH ，无非是为了保证NaOH 没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS ，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结构向micelle （微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH ，即便是有SDS 也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS 当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS 也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH 的作用误以为是为了让基因组DNA 变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA 变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH 溶解的细胞，那为什么要加SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA 片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA 也会断裂。基因组DNA 的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。

每个人都知道，溶液III 加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS 碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的SDS 溶液中加如2M 的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS 的加入有关系。如果在溶液II 中不加SDS 会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS 不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS 溶液中慢慢加入5 N 的NaCl ，你会发现SDS 在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS 的沉淀。但如果你加入的不是NaCl 而是KCl ，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate ）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potas sium dodecylsulfate ，PDS ），而PDS 是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III 加入后

的沉淀实际上是钾离子置换了SDS 中的纳离子形成了不溶性的PDS ，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS 专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS 分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DN A 也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA 太长了，长长的DNA 自然容易被PDS 给共沉淀了，尽管SDS 并不与DNA 分子结合。那么2 M 的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH ，因为长时间的碱性条件会打断DNA ，所以要中和之。基因组DNA 一旦发生断裂，只要是50－100 kb 大小的片断，就没有办法再被PDS 共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA 混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA 条带。很多人误认为是溶液III 加入后基因组DNA 无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA 分子在中性溶液中都是溶解的。Na OH 本来是为了溶解细胞而用的，DNA 分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液III 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS 沉淀更充分一点。

不要以为PDS 沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA ，不然时间一长就会因为混入的DNase 而发生降解。这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。酚（Phenol ）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M 的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），应此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。

回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA 沉淀出来。这时候如果放到－20℃，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA 酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子，因此D NA 分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip 将沉淀打碎，就能得到好的样品。得到的质粒样品一般

用含RNase （50 ug/ml）的TE 缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA 会干扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA 时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA ，不信的话你用EcoRI 来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA 的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II 加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb 的大肠杆菌基因组DNA 的片断。

非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA 序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。这里暂不深究。

想说的，终于说完了。谢谢你的耐心。留下一个思考题，为什么真核生物的基因组DNA 不能用碱法抽提？

范文二：碱裂解法原理

碱裂解法原理

在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

电泳检测:质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型

DNA提取过程中各种试剂的作用及原理 1(溶液I—溶菌液:

溶菌酶:它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖:增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。 EDTA:(1)螯合Mg2，、Ca2，等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用(DNase作用时需要一定的金属离子作辅基);(2)EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。 2(溶液II,NaOH,SDS液:

NaOH:核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。

但当pH,12或pH,3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1,L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。

SDS:SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有:

(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。 (2)解聚细胞中的核蛋白。

(3)SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R，-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中(用RNase去除RNA时)受到干扰。

3. 溶液III--3mol,L NaAc(pH4.8)溶液:

NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol,L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS,蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

4(为什么用无水乙醇沉淀DNA,

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67,左右。

因而也可改用95,乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95,乙醇昂贵)。但是加95,的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95,乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15,30分钟即可。

5(在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1,0.25mol/L,

在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

6(加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理, 加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。 7(为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液, 在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统(pKa,7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2，产生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl(pKa=8.0)的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定。

范文三：SDS-碱裂解法原理

碱裂解法质粒提取的原理

碱裂解法从大肠杆菌制备质粒,是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。下面是该法的提取原理 :

碱法质粒抽提用到三种溶液:

溶液 I , 50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA, pH 8.0;

溶液 II , 0.2 N NaOH / 1% SDS;

溶液 III , 3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。

溶液 I 的作用

任何生物化学反应,首先要控制好溶液的 pH ,因此用适当浓度的和适当 pH 值的 Tris-Cl 溶液,是再自然不过的了。那么 50 mM葡萄糖是干什么的呢?说起来不可思议,加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此, 如果溶液 I 中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言, 几乎没有任何影响。所以说溶液 I 中葡萄糖是可缺的。那么 EDTA 呢?大家知道 EDTA 是 Ca2+和 Mg2+等二价金属离子的螯合剂,配在分子生物学试剂中的主要作用是:抑制 DNase 的活性,和抑制微生物生长。在溶液 I 中加入高达 10 mM 的 EDTA , 无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加 EDTA , 其实也没什么大不了的, 只要不磨洋工, 只要是在不太长的时间里完成质粒抽提, 就不用怕 DNA 会迅速被降解,因为最终溶解质粒的 TE 缓冲液中有 EDTA 。如果哪天你手上正好缺了溶液 I ,可不可以抽提质粒呢?实话告诉你,只要用等体积的水,或 LB 培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是,菌体一定要悬浮均匀,不能有结块。

溶液 II 的作用

这是用新鲜的 0.4 N的 NaOH 和 2%的 SDS 等体积混合后使用的。要新从浓 NaOH 稀释制备 0.4N 的 NaOH , 无非是为了保证 NaOH 没有吸收空气中的 CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱,而不是 SDS ,所以才叫碱法抽提。事实上 NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂, 不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞, 碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解, 这是由于细胞膜发生了从 bilayer (双层膜)结构向 micelle (微囊)结构的相变化所导致。用了不新鲜的 0.4 N NaOH,即便是有 SDS 也无法有效溶解大肠杆菌,自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用 SDS 当然也能抽提得到少量质粒, 因为 SDS 也是碱性的, 只是弱了点而已。很多人对 NaOH 的作用误以为是为了让基因组 DNA 变性,以便沉淀,这是由于没有正确理解一些书上的有关 DNA 变性复性的描述所导致。有人不禁要问,既然是 NaOH 溶解的细胞,那为什么要加 SDS 呢?那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点:第一, 时间不能过长, 因为在这样的碱性条件下基因组 DNA 片断会慢慢断裂; 第二, 必须温柔混合, 不然基因组 DNA 也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带来麻烦。

溶液 III 的作用

溶液 III 加入后就会有大量的沉淀,但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是,当 SDS 碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑,往 1%的 SDS 溶液中加如 2M 的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现,显然与 SDS 的加入有关系。如果在溶液 II 中不加 SDS 会怎样呢,也会有少量的沉淀,但量上要少得多,显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然 SDS 不是遇酸发生的沉淀,那会不会是遇盐发生的沉淀呢? 在 1%的 SDS 溶液中慢慢加入 5 N的 NaCl ,你会发现 SDS 在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了 SDS 的沉淀。但如果你加入的不是 NaCl 而是 KCl ,你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate)遇到钾离子后变成了十二

烷基硫酸钾(potassium dodecylsulfate, PDS ) ,而 PDS 是水不溶的,因此发生了沉淀。如此看来, 溶液 III 加入后的沉淀实际上是钾离子置换了 SDS 中的钠离子形成了不溶性的 PDS , 而高浓度的盐,使得沉淀更完全。大家知道 SDS 专门喜欢和蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了, 让人高兴的是大肠杆菌的基因组 DNA 也一起被共沉淀了。这个过程不难想象,因为基因组 DNA 太长了,长长的 DNA 自然容易被 PDS 给共沉淀了,尽管 SDS 并不与 DNA 分子结合。那么 2 M的醋酸又是为什么而加的呢?是为了中和 NaOH ,因为长时间的碱性条件会打断 DNA ,所以要中和之。基因组 DNA 一旦发生断裂,只要是 50-100 kb 大小的片断, 就没有办法再被 PDS 共沉淀了。所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡,不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组 DNA 混入, 琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总 DNA 条带。很多人误认为是溶液 III 加入后基因组 DNA 无法快速复性就被沉淀了,这是天大的误会, 因为变性的也好复性的也好, DNA 分子在中性溶液中都是溶解的。 NaOH 本来是为了溶解细胞而用的, DNA 分子的变性其实是个副产物,与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液 III 加入并混合均匀后在冰上放置,目的是为了 PDS 沉淀更充分一点。

酚 /氯仿纯化

不要以为 PDS 沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了, 其实还有很多蛋白质不能被沉淀,因此要用酚 /氯仿 /异戊醇进行抽提,然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒 DNA , 不然时间一长就会因为混入的 DNase 而发生降解。这里用 25/24/1的酚 /氯仿 /异戊醇是有很多道理的,这里做个全面的介绍。酚(Phenol )对蛋白质的变性作用远大于氯仿,按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉, 但是水饱和酚的比重略比水重, 碰到高浓度的盐溶液 (比如 4M 的异硫氰酸胍) ,离心后酚相会跑到上层,不利于含质粒的水相的回收;但加入氯仿后可以增加比重,使得酚 /氯仿始终在下层,方便水相的回收;还有一点,酚与水有很大的互溶性, 如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中, 而酚会抑制很多酶反应 (比如限制性酶切反应) ,因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除, 而用酚 /氯仿的混合液进行抽提,跑到水相中的酚则少得多,微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加, 其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰,也方便了水相的回收。

回收后的水相含有足够多的盐,因此只要加入 2倍体积的乙醇,在室温放置几分钟后离心就可以将质粒 DNA 沉淀出来。这时候如果放到-20℃,时间一长反而会导致大量盐的沉淀,这点不同于普通的 DNA 酒精沉淀回收,所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子,因此 DNA 分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀, 就用 70%的乙醇多洗几次, 每次在室温放置一个小时以上, 并用 tip 将沉淀打碎, 就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含 RNase (50 ug/ml)的 TE 缓冲液进行溶解,不然大量未降解的 RNA 会干扰电泳结果的。

质粒检测

琼脂糖电泳进行鉴定质粒 DNA 时,多数情况下你能看到三条带,但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性 DNA ,不信的话你用 EcoRI 来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳,就会看到线性质粒 DNA 的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序, 分别是超螺旋、开环和复制中间体 (即没有复制完全的两个质粒连在了一起) 。如果你不小心在溶液 II 加入后过度振荡,会有第四条带,这条带泳动得较慢,远离这三条带,是 20-100kb 的大肠杆菌基因组 DNA 的片断。非常偶然的是,有时候抽提到的质粒会有 7-10条带,这是由于特殊的 DNA 序列导致了不同程度的超螺旋(超螺旋的圈数不同)所致。

范文四：sds碱裂解法制备质粒dna提取和纯化doc

SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化[适用对象] 生物工程专业 [实验学时] 8学时

一、实验目的

使学生掌握从大肠杆菌中制备质粒DNA的方法，提供实验所需载体。

二、实验原理

质粒细菌染色体外的DNA分子，其范围大小在1kb至200kb以上不等。它独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒在基因工程中是最常用的载体。提取质粒DNA也是基因工程中最常见的实验操作。提取质粒首先进行大肠杆菌细胞的制备，制备后用碱裂解液进行细胞裂解，使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。而裂解过程中，细菌蛋白、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA，最后用聚乙二醇沉淀法进行质粒的纯化。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

三、仪器设备

培养皿摇床天平高速离心机(×12000g) 微量移液器(2,20μl、20,200μl、200,1000μl)、电泳仪、微波炉。

四、相关知识点

本课程知识点综合:涉及到质粒DNA提取过程、质粒纯化过程和琼脂糖凝胶电泳技术。

多课程知识点的综合:微生物学细菌的培养和质粒抽提技术。

五、实验步骤

细胞培养

接种培养

挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB(含相应抗生素)液体培养基中，37?、250g振荡培养过夜(约12-14hr)。

离心

取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

细胞的裂解

悬浮细菌沉淀

将细菌沉淀重悬于100μl预冷的碱裂解溶液?中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。(为确保细菌沉淀在碱裂解溶液?中完全分散，将两个微量离心管的管底互相接触同时涡旋振荡，可以提高细菌沉淀重悬的速度和效率。)

裂解细菌悬液

加200μl新鲜配制的溶液?，颠倒数次混匀(不要剧烈振荡)，并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解(溶液?为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)。

沉淀染色体和蛋白质

加入150μl预冷的溶液?，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液?为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。

沉淀多余的蛋白质

μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4?离心12000g × 加入450

10min。小心移出上清于一新微量离心管中。

质粒DNA的回收

沉淀核酸

加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4?离心12000g×15min。

洗涤沉淀

1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4?离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。

溶解质粒DNA

沉淀溶于20μl TE(含RNase A 20μg/ml)，37?水浴30min以降解RNA分子，-20?保存备用。

质粒DNA电泳检测

制胶

用封边封住塑料托盘开放的两边，形成一个模具，置于一个水平支架上。加上梳子。称取琼脂糖0.5g，加0.5×TBE的电泳缓冲液100ml，用微波炉加热至琼脂糖熔化，待熔化的凝胶稍冷后加入溴化乙锭，使终浓度为0.5μg/ml。混匀凝胶。将凝胶浇灌到模具中。室温下30,40min。

上样电泳

向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm。混合DNA样品和0.2倍体积6×载样缓冲液，用微量移液器将其移至加样孔内。关上电泳槽盖，接好电极进行电泳。

紫外灯下观察电泳结果，记录。六、实验报告要求

1、写明报告日期、地点、条件。

2、实验报告的目的和要求。

3、实验过程。

4、描绘实验结果。

5、分析结果并讨论。

6、回答思考题。

七、思考题

溶液?、溶液?、溶液?中的主要试剂是什么,在质粒提取过程中分别起到了什么作用,

八、实验成绩评定办法

范文五：sds碱裂解法制备质粒dna提取和纯化doc^

http://www.yixuew.cn/ SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化[适用对象] 生物工程专业 [实验学时] 8学时