a凉夜
范文一：人类辅助生殖技术
第一章 配子的发生-张颖
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? 第一章 配子的发生 未分化性腺的发生
第4周，原始生殖细胞（PGC）主要存在于卵黄囊靠近尿囊部
第5周，双侧中肾嵴内侧的表面上皮细胞增殖，形成一对纵行的生殖腺嵴，逐渐增厚并向上皮下的间充质内以条索状方式增殖
PGC沿后肠的背肠系膜伸入条索内进入生殖腺嵴，与上皮细胞一起形成初级性索 此期的生殖腺为未分化性腺(indifferent gonad)
性别决定----Y染色体上的睾丸决定因子： Y染色体的一部分对起始睾丸发育是必需的，未分化性腺分化为睾丸依赖于上皮性索细胞中Y染色体基因的表达
睾丸决定因子（testis determining factor, TDF）位于Y染色体短臂上
SRY基因(sex-determining region on the Y chromosome)为睾丸决定因子基因，位于Y染色体短臂上的性别决定区
SRY基因仅在睾丸分化前的生殖腺嵴中表达，如果发生突变或失活，将会导致46，XY个体成为性腺发育不全的女性个体
两条正常X染色体是女性遗传表现型发育所必须，也是卵巢分化和卵泡发育必不可少的
X染色体与两性的分化发育有关，也与体格特征有关
Xq21-Xq27是女性生殖腺发育关键区域，如果该区域发生断裂、异位、缺失或其他任何异常都会导致性腺发育不良，临床表现为身材矮小、闭经和不孕
? 卵子发生
性腺原基有向卵巢方向分化的自然趋势
卵子的发生始于PGC的形成
妊娠5周，卵巢形成，卵巢中的PGC发育成为卵原细胞
妊娠8周，卵原细胞持续有丝分裂，并逐渐获得减数分裂及闭锁的能力
妊娠20周，卵原细胞数达6-7×106，至此数量不再增加。其中2/3的生殖细胞处于第一次减数分裂即形成初级卵母细胞，伴随周围的颗粒细胞生长，形成始基卵泡
? 妊娠7月后，卵原细胞有丝分裂完全停止，未发生减数分裂的卵原细胞发生闭
锁
? 女婴出生时卵巢中已不存在卵原细胞
? 为什么初级卵母细胞停滞在第一次减数分裂的前期—双线期？
与颗粒细胞分泌的某些物质抑制卵母细胞减数分裂的进行有关，如卵子成熟抑制因子、次黄嘌呤、环磷酸腺苷（cAMP）
? 双线期的卵子以生殖泡（GV）的形成为特征
? GV即停滞于第1次减速分裂前期双线期的初级卵母细胞细胞核
? 卵母细胞的核相分为：待成熟受抑制状态的GV期，进入成熟状态的生殖泡破裂
（GVBD）和之后的减速分裂期（M期）（分为MⅠ期和MⅡ期）
? GV持续存在直至排卵前消失
? 始基卵泡从卵泡池中迁移首先表现为卵子直径的增大，是卵泡被募集的最早表
现
? 窦前卵泡中的卵母细胞尚不具备恢复减数分裂的能力 ? ? ? ? ?
?
? 窦卵泡期生殖泡裂解(GVBD)，卵子获得继续减数分裂的能力 排卵前卵子完成第一次减数分裂，成为次级卵母细胞，并停留在第二次减数分
裂中期，等待受精。精子进入卵细胞内才完成第二次减数分裂
? 卵子成熟
卵子成熟是卵子发生的最后阶段
成熟卵泡时，月经中期的LH峰或注射hCG启动卵子的成熟
卵子成熟包括：核的成熟、胞浆的成熟和膜的成熟
卵子成熟—核的成熟
? GV直径增大，核膜上有许多小孔，完成核与胞浆的物质和信息交换
? GV在蛋白激酶和微管复合体的调控下向卵子皮质区迁移
? GV的染色质在核仁周围凝集并靠近核膜， 随之LH峰出现
? 染色质凝集20-24h后发生GVBD，形成减数分裂纺锤体
? 在肌动蛋白、微丝和微管的共同作用下，纺锤体移到卵子表面，即减数分裂中
期Ⅰ(MⅠ）
? MⅠ持续数小时，然后依次进入分裂后期和末期，LH峰或注射hCG 36h后排出
第一极体，卵子迅速进入减数分裂中期Ⅱ(MⅡ)
? 蛋白质的合成和水解可能是诱使卵母细胞GVBD的两个必要的连续的步骤 ? 蛋白质的磷酸化和去磷酸化是影响卵母细胞减数分裂的重要因素
? 染色体凝集和GVBD两个恢复减数分裂的主要特征性事件均与蛋白质磷酸化相
关
? 核成熟的调控（缝隙连接）
? 核成熟的促进因子包括：
钙离子、促性腺激素、成熟促进因子（MPF）和上皮生长因子等
? 核成熟的抑制因子包括：
cAMP、卵子成熟抑制因子、次黄嘌呤和其他能提高cAMP水平的物质
? (1)钙离子
? 细胞内钙离子释放是减数分裂启动的最早标志之一
? (2)细胞静止因子(cytostatic factor, CSF)
? 使卵子停留在减数分裂中期Ⅱ
? (3)环磷酸腺苷（cAMP）
? cAMP对核成熟有抑制和促进的双重作用
? 抑制作用：cAMP维持蛋白激酶A（PKA）的活性状态，而抑制MPF的活性或降
解MPF的亚单位，因此PKA的活化和随后特异蛋白的磷酸化是减数分裂调控的重要步骤
? cAMP水平短暂升高后的降低可导致卵子减数分裂的重新启动
? (4)卵泡液
? 脂肪酸中的主要成分亚油酸，可在体外培养时维持卵子的减数分裂停滞状态 ? 次黄嘌呤抑制磷酸二酯酶，阻止核成熟，防止卵子过早进行减数分裂导致发育
潜能的降低
? 类固醇中雌二醇和睾酮起抑制作用，而黄体酮起促进作用；黄体酮与雌二醇比
例的改变可能影响卵子的减数分裂 ? ? ?
? 卵子成熟—胞浆的成熟
? 卵子成熟后，除皮质颗粒外，其他细胞器向卵子中央迁移
? 通常卵细胞浆的成熟是伴随着核成熟的
1．细胞器的成熟
（1）线粒体
? 随着卵子的发育线粒体的数目也逐渐增多，其结构发生变化
? 随着年龄增加线粒体DNA发生突变的几率也随之升高。线粒体DNA突变的累积
可能导致ATP的合成受影响，从而使减数分裂时发生染色体不分离，产生非整倍体的卵子
（2）高尔基体
? 粗面内质网中形成皮质泡阻止多个精子侵入卵子，皮质泡在增大的高尔基体中
包装并运输到卵细胞膜下面的表层胞质中
? 加工组成透明带的糖蛋白
? 卵子接近成熟时，高尔基体活性消失
（3）内质网
? 在卵子发育过程中持续存在，卵子成熟时粗面内质网消失，滑面内质网增多。
滑面内质网与线粒体联系密切
（4）核糖体
? 成熟卵子中聚集大量的核糖体
（5）皮质颗粒
? 是由膜包围的一种小泡状细胞器
? 存在于卵子皮质区，是卵浆成熟的重要指标之一
? GV期卵子中皮质颗粒存在于细胞中央。随着卵子的成熟，皮质颗粒数量增多，
并逐渐迁移到卵细胞膜下
? 卵子受精时，细胞内钙离子浓度升高，导致皮质颗粒内容物释放入卵周间隙，
修饰透明带，尤其是透明带糖蛋白ZP2和ZP3，从而阻止多精受精
2．蛋白质合成和基因表达
? RNA、蛋白质和印迹基因在卵子生长过程中积聚在卵浆，以维持在胚胎基因组激
活前胚胎的早期发育
? 排卵前，卵子的代谢主要是活跃的转录和翻译；排卵时转录停止
? 卵子及胚胎的发育主要依赖于排卵前累积的mRNA和蛋白质
? 卵子提供胚胎开始分裂必须的蛋白质，并参与调节受精后父源基因的表达 ? 卵浆不成熟将不能促进雄原核形成，并增加受精后染色体异常的几率
? 卵子通过累积必须的物质、经历基因组修饰准备受精和胚胎发育，最后的准备
在GVBD到MⅡ的成熟过程中完成
? 卵子成熟—膜的成熟
1．卵细胞膜
? 发育早期的卵子卵细胞膜相对较光滑，在发育过程中卵膜表面的皱褶逐渐增多 ? 卵细胞膜表面的微绒毛分布均匀并深入透明带内，与颗粒细胞形成桥粒连接从
而交换信息
? 卵膜可能在特定部位才能结合精子
? 卵子膜成熟需要特定的卵泡内孕酮环境，孕酮能使已获能及未获能的精子立即
产生钙浓度升高，也参与了卵膜钙离子释放系统的发育
?
? 2．透明带 通过其表面的糖蛋白ZPl, ZP2和ZP3介导种属特异性的精卵结合 卵子受精后，皮质颗粒的释放使透明带的糖蛋白立体结构发生改变，导致透明
带变硬和穿透性降低
? 精子发生
? 在睾丸的曲细精管里进行
? 分为三个阶段：
①增殖阶段：精原细胞增殖,产生精母细胞
②减数分裂阶段：精母细胞经过两次减数分裂产生单倍染色体的精子细胞 ③精子形成阶段：精子细胞变态成为成熟精子
? 精子发生过程中有丝分裂及减数分裂发生错误引起不育，且是胎儿染色体异常
的原因之一，临床结局为流产、先天畸形，出生后发育智力障碍、行为异常等 ? 睾丸发育（成人睾丸体积约15-30ml，重约12g）
（一）胎儿期的发育
? Y染色体上的TDF基因决定性别分化
? TDF基因的产物为Y-组织相容性抗原，即H-Y抗原
? 有Y染色体的胚胎细胞膜上有H-Y抗原，当PGC迁移到生殖腺嵴时，通过相互
识别作用使原始性腺向睾丸方向发育
? 胚胎的性别在受精时就已确定
? 胚胎发育第7周时才有原始性腺的分化
? 原始性腺包括三个成分：
①PGC演化为精原细胞
②生殖腺细胞分化为睾丸曲细精管中的Sertoli细胞
③实质中的间充质细胞分化为睾丸间质及Leydig细胞
惟支持细胞综合征（Sertoli cell only syndrome）
? 男性的未分化性腺未得到PGC，会导致一种先天性畸形，患者睾丸生精小管上皮
仅有Sertoli细胞而没有生精细胞，将来必将导致无精症和不育
? 8-14周，hCG刺激Gn分泌，胎儿Sertoli细胞及生精细胞快速有丝分裂，细胞数
目急剧增长
? Sertoli细胞分泌抗Müller管激素（MIS），调节男性内生殖器分化
? 8-14周，hCG及LH刺激Leydig细胞快速增殖并分泌睾酮
? 14周时，人胚胎血清睾酮的水平达到峰值（达到成人水平），促进男性内、外生
殖器分化
（二）新生儿及青春期前的发育
? 青春期前血清Gn处于低水平，Sertoli细胞和生精细胞的数目显著增加，生精细
胞发育成为精原细胞
? 胎儿期的Sertoli细胞和精原细胞的数目在很大程度上将决定成人后睾丸的产生
精子的最大能力
（三）青春期的发育
? 青春期，下丘脑分泌GnRH刺激垂体分泌Gn (FSH、LH），睾丸的精子发生开始启
动
? Leydig细胞在LH刺激下分泌睾酮逐渐增多。睾酮在精子发生及第二性征发育中
起重要作用
?
?
?
睾丸
?
? 睾丸体积显著增大是青春期的一个最早的身体变化，青春期早期（12-15岁）曲细精管即能释放精子 睾丸体积的大小主要在于曲细精管长度和数量的差异，与睾丸产生的精子数量密切相关 睾丸体积明显减小者往往为少精症或无精症患者 睾丸被膜包括鞘膜脏层、白膜、血管膜三部分 睾丸实质被分成200-300个睾丸小叶，每个小叶包含有1-4条高度盘曲的曲细精
管。曲细精管汇合成直细精管，进入睾丸纵隔，形成睾丸网与附睾相通
? 曲细精管间为间质，除一般结缔组织成分外，还有间质细胞、曲细精管，曲细
精管由界膜围绕，管壁上皮为特殊的生精上皮，由生精细胞和Sertoli细胞组成 ? Sertoli细胞之间形成紧密连接，其间镶嵌着各级生精细胞，紧密连接将曲细精管
分成基底小室和管腔小室两部分，基底小室内有精原细胞和前细线期精母细胞管腔小室内有正在发育的精母细胞和精子细胞
? Sertoli细胞间的紧密连接形成血睾屏障
血睾屏障：
? 防止细胞毒性物质进入曲细精管
? 精子进入血流，免疫系统会作出针对性自身免疫反应，产生抗精子抗体结合精
子表面的不同抗原位点：结合在头部，精子使卵细胞受精的能力被削弱；结合在尾部，精子的活力被削弱
睾丸间质
? Leydig细胞分泌类固醇激素，主要产生雄激素，也能产生少量的雌激素；其滑面
内质网的丰富程度反映了Leydig细胞合成胆固醇的能力，间接反映合成雄激素的功能状态
? 曲细精管周围的管周肌样细胞有收缩作用，促使精子及液体向附睾方向输送；
介导睾酮和其他激素、生长因子对Sertoli细胞和生精细胞的作用
? 巨噬细胞分泌细胞因子及吞噬细胞碎片调节Sertoli细胞的功能和精子发生过程 精子发生阶段：
? （一）精原细胞及其增殖
? 根据形态结构特点，将精原细胞分为三种类型
暗型精原细胞（Ad) 亮型精原细胞（Ap) B型精原细胞（B)
精原细胞的不对称分裂
? Ad型精原细胞是生精细胞的干细胞
? Ad型精原细胞周期很长，分裂很慢，对外界影响精子发生的刺激因素如放射线
等有相对的不敏感性
? 睾丸受损害后，Ad型精原细胞可通过有丝分裂补充受影响的精原细胞。如Ad
型精原细胞完全被损害（如接触超大剂量X射线）将永久性丧失精子生成能力 ? Ap型精原细胞属于中间型细胞
? B型精原细胞是放射敏感性生精细胞，易受外界放射线的影响
? B型精原细胞经过有丝分裂产生初级精母细胞（又称前细线期精母细胞），随即
进入减数分裂过程（人类约24天）
精子形成
? 鞭毛（尾部）形成使精子具备了活动能力
? 形成顶体（包含有精子受精时需要的酶）
核蛋白及染色体的凝聚形成精子头部
去除精子细胞多余胞浆
成熟精子释放至曲细精管管腔
以上有些变化是同步进行的，分为四个时期：高尔基期、顶帽期、顶体期和成熟期
? 分为6种类型：Sa，Sb1,Sb2，Sc，Sd1，Sd2
成熟精子
? 是一种高度分化的细胞
? 不合成RNA及蛋白质
? 大部分细胞器消失，剩余细胞器是含有丰富的与精子钻透有关的酶的顶体、与
遗传有关的核、与精子运动有关的线粒体、鞭毛、致密纤维、纤维鞘等
? 分为头、颈、尾三部，长50-60μm，外形似蝌蚪形
成熟精子头部
? 顶体酶能溶解卵子周围的放射冠和透明带，使精子能穿入卵子并与之结合形成
受精卵
? 受精过程中与后顶体鞘相应的精子膜能识别卵细胞膜并与之融合，缺乏后顶体
鞘可导致不育
成熟精子尾部
? 分中段、主段及末段
? 轴丝的微管是与精子运动有关的重要结构
? 线粒体鞘是精子的供能中心
? 终环是中段与主段分界的标志，防止精子在运动时线粒体向尾端移动
生精细胞退化
? 在成长的各个时期（胎儿期、新生儿期、青春期前及青春期）以及精子发生的
各个阶段都有发生
? 常见于减数分裂的最后阶段
? 限制和调节生精细胞的数量
? 可以避免不正常的精子生成
精子发生周期：曲细精管局部某一特定的细胞组合开始到下一次再出现同一细胞组合之所经历的时间，在人类约历时16±1天
? 人精子发生的整个过程约需经历4.6个周期，约为74±4天
? 在附睾的运行时间为12天
? 因此睾丸受损导致的精子数目减少要在损害发生后数月才表现出来；男性接受
大剂量雄激素作为避孕药的试验使精子产生受抑制要在3-4个月后才表现出来 精子发生的内分泌调控
? LH、FSH和睾酮是主要调节激素
? FSH与曲细精管的Sertoli细胞膜上的特异受体结合而调节精子发生
? LH与睾丸间质的Leydig细胞上的受体结合，刺激睾酮的产生，而睾酮又结合于
Sertoli细胞和曲细精管管周肌样细胞内的受体而调节精子发生
（一）精子发生的启动
? 胎儿期及新生儿期促性腺激素尤其是FSH对调控Sertoli细胞的数量起重要作用 ? 青春期精子发生的启动需要FSH和LH的共同作用
? 青春期前低促性腺激素性性腺发育不良的患者，启动精子发生需要LH和FSH ? 低促性腺激素性性腺发育不良合并睾丸异常的患者，促性腺激素治疗无效 ? ? ? ?
青春期前低促性腺激素性性腺发育不良的治疗
? 促性腺激素治疗：通常开始用LH（hCG）数月，以刺激Leydig细胞产生睾酮，
促使第二性征包括附属性腺和外生殖器的发育
? 仅用LH（hCG）的情况下可启动精子的生成，但数量往往不正常
? FSH对睾丸的精子发生的启动是需要的，但正常水平的FSH并不是必须的。开始
仅用FSH（HMG）治疗，则不能启动精子发生过程
? 联合使用LH和FSH（用hCG和HMG）可以刺激Leydig细胞和Sertoli细胞的完
全成熟，完成第二次减数分裂和精子细胞的成熟
（二）精子发生的再启动
? 成人继发性低促性腺激素性性腺功能减退患者，仅用LH（hCG）可以重新激发
精子发生
（三） 精子发生的维持
? 正常水平FSH在精子发生过程中不是必需，维持正常数量的精子产生
? LH作用下刺激睾丸产生睾酮，低水平的睾酮不能维持正常数目的精子生成 ? 男性避孕药方面仅侧重于选择性抑制FSH（如抑制素）不能完全抑制精子发生 Sertoli细胞的功能：
? 维持曲细精管的结构
? 形成血睾屏障
? 发育中的生精细胞的移动
? 吞噬和胞饮作用
? 精子释放作用
? 分泌曲细精管液 ：受FSH的调控
? 为生精细胞转运营养物质
? 分泌蛋白及其他物质
Sertoli细胞功能的调节
1．激素调节
? FSH和LH是调节Sertoli细胞功能的主要激素
? FSH与Sertoli细胞膜上特异受体结合，刺激Sertoli细胞的增殖，调节Sertoli细
胞的分泌功能而调节精子的生成
? LH刺激Leydig细胞产生睾酮，与Sertoli细胞核雄激素受体结合，调节Sertoli细
胞分泌功能
2．旁分泌调节
? Leydig细胞、管周细胞、生精细胞分泌的局部旁分泌因子也调节Sertoli细胞的功
能和精子发生
? 旁分泌调节异常是不育症中占40%-80%不明原因性少精和无精的原因，表现为
正常或升高的促性腺激素水平，用促性腺激素治疗常常不能增加精子的生成
3. Leydig细胞对Sertoli细胞的调节
? Leydig细胞产生?内啡肽（抑制Sertoli细胞的增殖和功能）、ɑ黑素细胞刺激素（ɑ
MSH)、促肾上腺皮质激素（刺激Sertoli细胞的增殖和功能）
? Sertoli细胞产生一些因子调节Leydig细胞的甾体激素分泌功能
4．管周细胞对Sertoli细胞的调节
? 分泌细胞外基质成分，调节Sertoli细胞形态和功能
? Sertoli细胞也分泌一些旁分泌调节因子作用于管周细胞
5．生精细胞对Sertoli细胞的调节
? Sertoli细胞的功能明显地与和它相近的生精细胞的相关
知识点回顾
性别决定：
? 生殖腺嵴是卵巢、睾丸发生的原基
? 原始生殖细胞的发生和迁移
? 生殖腺分化的决定因素
? SRY基因如果发生突变或失活，将会导致46，XY个体成为性腺发育不全的女性
个体
? Xq21-Xq27是女性生殖腺发育关键区域，如果该区域异常会导致性腺发育不良，
临床表现为身材矮小、闭经和不孕
卵子发生：
? 卵子发育的过程
? 卵子成熟包括核成熟、胞浆成熟和膜成熟
? 线粒体DNA突变的累积可能导致ATP的合成受影响，从而使减数分裂时发生染
色体不分离，产生非整倍体的卵子
? 粗面内质网中形成皮质泡并在高尔基体中包装并运输，阻止多个精子侵入卵子 ? 高尔基体加工组成透明带的糖蛋白
? 皮质颗粒是卵浆成熟的重要指标之一，卵子受精时皮质颗粒内容物释放入卵周
间隙，修饰透明带，阻止多精受精
? 卵浆不成熟将不能促进雄原核形成，并增加受精后染色体异常的几率
? 卵膜可能在特定部位才能结合精子
? 透明带介导种属特异性的精卵结合
精子发生
? 惟支持细胞综合征（Sertoli cell only syndrome）
? 精子发生过程中有丝分裂及减数分裂发生错误引起不育，且是胎儿染色体异常
的原因之一，临床结局为流产、先天畸形，出生后发育智力障碍、行为异常等 不同时期的睾丸发育
? 胎儿期
? 新生儿及青春期前
? 青春期
? 成人
? 胎儿期的Sertoli细胞和精原细胞的数目在很大程度上将决定成人后睾丸的产生
精子的最大能力
? 睾丸体积明显减小者往往为少精症或无精症患者
? 血睾屏障损坏，产生抗精子抗体结合精子表面的不同抗原位点：结合在头部，
精子使卵细胞受精的能力被削弱；结合在尾部，精子的活力被削弱
精子发生的阶段
? 精原细胞及其增殖阶段
? 减数分裂阶段
? 精子形成阶段
? Ad型精原细胞完全被损害（如接触超大剂量X射线）将永久性丧失精子生成
能力
? B型精原细胞是放射敏感性生精细胞，易受外界放射线的影响
? 精子顶体酶能溶解卵子周围的放射冠和透明带，使精子能穿入卵子并与之结合
形成受精卵
? 精子缺乏后顶体鞘可导致不育
? 睾丸受损导致的精子数目减少要在损害发生后数月才表现出来；男性接受大剂
量雄激素作为避孕药的试验使精子产生受抑制要在3-4个月后才表现出来
精子发生的内分泌调控
? 精子发生的启动
? 精子发生的再启动
? 精子发生的维持
? 青春期前低促性腺激素性性腺发育不良的治疗联合使用LH和FSH（用hCG和
HMG）
? 继发性低促性腺激素性性腺功能减退患者，仅用LH（hCG）可以重新激发精子
发生
? 低水平的睾酮不能维持正常数目的精子生成
? 男性避孕药方面仅侧重于选择性抑制FSH（如抑制素）不能完全抑制精子发生 Sertoli细胞的功能和调节
? 旁分泌调节异常是不育症中占40%-80%不明原因性少精和无精的原因，表现为
正常或升高的促性腺激素水平，用促性腺激素治疗常常不能增加精子的生成
第二章 受精与胚胎植入
人的自然生殖过程：性交→输卵管受精→胚胎植入子宫→子宫内妊娠→分娩
第一节 受 精
受精（fertilization）是精子与卵子融合形成双倍体合子的过程
受精是有性生殖动物个体发育的起始点，受精过程来源于细菌，蓝藻等原核生物的DNA修复机制，是遗传进化
真核生物细胞在其生命周期中经历单倍体和双倍体的交替过程
减数分裂：
DNA修复
基因重组
成熟的卵子和精子是受精必要条件
配子的形态和结构：
人类的卵子为圆球形，正常成熟卵子的直径一般为110-120um，加透明带直径为140-150um，为精子体积的1万倍以上；类精子由头部、颈部和尾部组成，长50-60um，顶体含有多种顶体酶，如水解酶、透明质酸酶、酸性磷酸酶、唾液酸酶、蛋白溶酶等 精子的穿透障碍
第一道：女性生殖道 第二道：卵丘细胞（颗粒细胞） 第三道：透明带 第四道：卵膜 第一道障碍：女性生殖道
人的精子穿越宫颈开始获能，精子尾部超激活运动-鞭打样运动
没有获能的精子不能和卵子结合受精：
不能穿过放射冠细胞间隙
不能穿过透明带
不能进入卵细胞
精子采集和体外获能：
采集：体外射精法
优化：上游法和梯度离心法
获能：培养液上游
第二道障碍：卵丘细胞
卵丘细胞分散在凝胶样的透明质酸中，精子释放透明质酸酶，降解透明质酸
精子通过顶体反应释放透明质酸酶和放射冠穿透酶溶解卵丘细胞和放射冠细胞间的基质，使精子穿越放射冠与透明带接触
第三道障碍：透明带
人类成熟卵子的透明带厚约15-20um
透明带具有种属特异性，结构异常会导致受精异常或不受精
顶体反应，释放水解酶，溶解卵丘细胞外基质，放射冠解体，暴露透明带，尚未发生顶体反应的精子与透明带识别结合，产生顶体反应，水解局部透明带
第四道障碍：卵膜
精子头部的受体必须与卵膜表面的互补受体相接触，结合后卵膜发生变化，细胞内Ca2+释放导致皮质颗粒的释放，改变透明带的结构特点，透明带变得对精子不能穿透，有助于防止多精受精
当第一个精子进入后，先发生皮质反应，皮质颗粒内容物释放，作用包膜和透明带，发生质膜阻断（卵黄膜反应）和透明带反应（刻意制造两道屏障），从而阻止其他精子穿越透明带
原 核
原核形成：
精子细胞核进入次级卵母细胞解体，染色质解聚形成雄原核
次级卵母细胞染色体也解聚形成雌原核
两原核靠拢、融合形成二倍体细胞核，完成受精
原核迁移：在精子中段中心粒的性状微管和微丝的作用下，雌雄原核同时向卵子中央移动 合 子：
雌雄原核核膜破裂，核融合，染色质聚合成染色体，合子进入第一次分裂阶段：在合子中观察不到真正的二倍体核，两细胞期才可看见，正常的两原核合子不一定就是双倍体 不正常受精结局：
单原核：发生率约3%-6%
原因：卵子中含不发育的精子头；雌雄原核已融合；孤雌激活
多原核：三原核发生率5%-10%
原因：90%是2条精子同时进入卵子，10%是卵子第二次减数分裂过程中第二极体未排出
IVF中精子质量下降，卵子透明带或卵膜异常会导致受精率下降
受精液中精子浓度过高，卵子不成熟或卵子过熟会提高多精受精的发生
细胞分裂
卵裂：合子通过有丝分裂方式发育成许多小的卵裂球，只有DNA的复制和细胞的分离而无细胞的生长
不同进化阶段胚胎的分裂方式有所不同
胚胎发育Alikani分类法：
碎片少于5%，并局限于某个部位
大多数的碎片局限在某个部位，碎片数量大于5% 碎片分散各处，碎片体积较小，且大小相近 碎片分散各处，碎片体积较大，且大小不均 碎片分散各处，呈现变性坏死外观 胚胎质量与IVF结局关系：
与种植率呈直接正相关性，第一、第二种胚胎种植率最高 与胎儿畸形无明显相关性 胚胎自我修复功能
第二节 胚胎的植入
植入过程包括：囊胚孵出后的定位、粘附和外滋养层细胞侵入直至整个胚胎包埋在子宫内膜基质中，是胚胎-母体相互识别、相互融合的复杂过程
时间：受精后5-6天，自然周期第20-24天，或LH峰第5-8天 植入涉及母体和胚泡在时间和空间上的同步发育和相互协同作用，胚泡植入关键，胚泡的侵入能力和子宫内膜容受性 体外受精胚胎移植
a) 取卵后第三天，移植分裂期胚胎，6-8细胞 b) 取卵后第五天，移植囊胚
c) 冷冻胚胎，子宫内膜准备充分后解冻移植
腺上皮细胞表面出现较长的微绒毛或局部突起，称吞饮泡，是子宫内膜容受性的标记物 评价种植窗子宫内膜功能：
黄体中期内膜活检，早、晚期检测诊断复合率仅62% 胚胎移植前当日取少许内膜检测预测内膜容受性 调节子宫内膜的相关因素： 类固醇激素的调节作用 促黄体生成素的调节作用 催乳素、松弛素的作用 局部因子的影响
类固醇激素的调节作用 雌、孕激素：
改变上皮细胞Na+通道和Cl-通道，调节子宫腔内液体构成、含量及宫腔表面电荷 与上皮生长因子协调作用，增加或抑制激素依赖性蛋白合成，促进上皮和基质细胞增生和分化，促进内膜螺旋小动脉生成和子宫内膜血管化 孕酮：
孕酮是维持早期妊娠最重要的类固醇激素，刺激生长因子、结合蛋白和粘连蛋白合成，增加腺体细胞数目，诱导吞饮泡生成和分化，调节毛细血管舒缩活动，降低免疫调节介质 促黄体生成素的调节作用：
LH在排卵前出现峰值，LHR在内膜上皮细胞表达为主，分泌期较增殖期多，种植窗时期子宫内膜和着床前胚胎、胎盘滋养层细胞存在LHmRNA
人类LH基因突变表现为胞膜吞饮作用降低、黄体功能缺陷、子宫内膜增殖症 催乳素、松弛素的作用：
分泌期子宫内膜产生催乳素蛋白和mRNA，松弛素与黄体酮协同作用刺激基质细胞分化 局部因子的影响：
类胰岛素生长因子系统
IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、受体、结合蛋白，调节滋养层细胞侵入程度 上皮生长因子家族
EGF、HB-EGF、TGF-α、HB-EGF可促进囊胚生长、透明带孵出和滋养层细胞外延生长 整合素家族
ανβ3 是子宫内膜种植窗的一个分子指标 白血病抑制因子 子宫内膜蜕膜化：
胚泡植入后血液供应更丰富，腺体分泌更旺盛，基质细胞变得十分肥大，富含糖原和脂滴，内膜进一步增厚，子宫内膜的这一系列变化称蜕膜反应
胚胎是半同种移植物，存在HLA-Ⅰ类抗原，蜕膜NK细胞有杀伤胚胎的可能，必须有一种免疫保护机制保证植入完成和妊娠维持 母胎界面的免疫机制：
滋养层细胞外面覆盖唾液酸蛋白，遮盖细胞表面的HLA抗原，使滋养层细胞带负电荷，淋巴细胞表面也带负电荷，构成电化学屏障
滋养层细胞不断进入母体，诱导母体产生免疫耐受 种植前胚胎的着床信号：
胚泡和子宫内膜分别表达不同的分子，这些分子间可以相互识别及作用，通过交流启动一系列信号转导过程
子宫内膜容受性是体外受精胚胎移植技术中主要的影响因素，不同促排卵方案的内膜容受性 标准长方案最高、短方案次之、微刺激方案最低
器官水平
子宫内膜厚度：10-14mm
子宫内膜反应性，受衰老、手术、疾病影响 子宫内膜类型：A型 细胞水平
子宫内膜上皮细胞出现胞饮突，细胞内大量糖原沉积，含丰富的溶酶体和线粒体 间质细胞蜕膜化 分子水平
前列腺素、细胞因子及糖复合物等呈时序性表达，共同作用 IVF中改善子宫内膜容受性： 去除子宫病因 调节免疫
选用适当的方案
思考题
1.精子、卵子减数分裂发生过程是怎样的？ 2.精子受精之前需克服那些障碍？
3.类固醇激素怎样对子宫内膜起调节作用？
第三章 诱发排卵和超排技术
诱发排卵： 超排卵：
第一节 诱发排卵和超排卵的药物 ? 卵巢激素类药物 ：雌激素、孕激素 ? 多巴胺受体激动剂 ：溴隐亭 、诺果宁
? 非固醇类雌激素类似物 ：氯米芬 、他莫昔芬
? 促性腺激素 ：卵泡刺激素 、黄体生成素 、人绒毛膜促性腺激素 ? 促性腺激素释放激素类似物 ：GnRHa ? 生长激素 ? 糖皮质激素
? 其他：卵巢楔形切除术 、腹腔镜下手术
第二节 促排卵的治疗方案
促进卵泡的募集、生长发育和成熟：FSH 诱发卵母细胞的最后成熟和触发排卵 ：HCG
调整卵泡期的LH水平和抑制早发的LH峰:GnRHa和GnRHant 超排卵前的处理 ：OC、二甲双胍 黄体期的支持 ：HCG与黄体酮 常用促超排卵方案及其调整
第六章 冻融胚胎移植 冷冻的原理与方法
如果要求6周以上的保存期，则样品宜在液氮中（-196℃）保存。 冰晶的形成是冻融过程细胞损伤的突出因素。
冷冻前和冷冻过程中去除细胞内的部分水分可以减少细胞内冰晶的形成，这可以通过添加人溶液中特殊溶质-冷冻保护剂来实现。
冷冻保护剂：细胞膜不可渗透性冷冻保护剂（cryoprotectant, CPA)和细胞膜可渗透性冷冻保护剂。
冷冻保存和解冻的基本步骤和要求
1．获取、评估、选择有活力的标本； 2．使用适宜的冷冻保护剂处理标本；
3．采用（理想的降温设备和）适宜的降温速率，使标本制冷； 4．在低温环境中保存；
5．采用适宜的复温方法和升温速度，使标本解冻； 6．用适宜的方法去除标本中的冷冻保护剂； 7．将标本放入适宜的环境以保持其功能； 8．重新评估标本的活力。
? 常见的冷冻方法 （一）程序化慢速冷冻法 （二）玻璃化冷冻
温度休克（thermal shock)是指某些细胞在降温过快时受到损伤，甚至在冷冻过程中被破坏的一种表现。其特点是与温度变化速率有关，常发生在15℃~-5℃降温过程之间。
程序化慢速冷冻法 植冰（seeding)：用预冷至-70℃，或更低温度的金属棒在标本溶液冰点以下2~3℃时，瞬间地接触样品容器，可以带走大量水在液相转化为固相的潜伏热，这样可以激发和协助溶液中许多小冰晶的形成。辅助生殖中常采用的植冰温度是-6℃~-8℃。 植冰后的冷冻速率非常重要。
玻璃化冷冻
玻璃化冷冻是指高浓度、极其粘稠的冷冻保护剂溶液在快速冷冻过程中由液态直接冻结为无结构的极其粘稠的玻璃状态或无冰晶结构的固态。
实现玻璃化的两条途径：极其快速的冷冻速率或极其高浓度的溶质。
标本载体：塑料麦管、塑料小瓶、玻璃化冷冻载体（毛细管、尼龙冷冻环、铜或金的电镜网、尼龙网栅、冷冻薄膜等）。
解冻
理想的复温速度取决于冷冻的过程和方法。 复温速率快慢应根据冷冻速率来决定。复温速度还应考虑投入液氮前的温度。 胚胎冷冻的意义和进展
IVF-ET治疗周期有剩余的胚胎；
有发生严重的卵巢过度刺激综合征倾向者； 胚胎移植时插管入宫腔非常困难者； 胚胎活检后等待诊断结果； 须排除供配子者HIV感染；
其他特殊原因不能来进行新鲜胚胎移植。
卵母细胞冷冻的意义、进展及方案
冷冻卵母细胞的意义
与胚胎冷冻相比较，卵母细胞冷冻的特点 卵母细胞冷冻的进展
精子及睾丸组织冷冻的意义及方法 射出精子冷冻：分为慢速冷冻法和快速冷冻法。临床上应用最多的是慢速冷法。 附睾精、睾丸精的冻存 睾丸组织／精原干细胞冻存
卵巢组织冷冻的意义及进展
采用目前的卵巢组织的冷冻保存方案，可使至少70％ ~90％以上的组织细胞得以保存。
理论上讲有三种方法有希望用于临床来保存生育力：自体移植、异种移植、体外成熟。
第七章 人类辅助生殖实验室技术终板
思考题：
? 完整的精液分析包括哪些？
完整的精液分析包括以下四项： 1.精液的收集：时间、方法、容器等
2.生理指标：颜色、量、液化、凝集等 3.定性、定量分析：密度，活力等
4生物化学指标：顶体，弹性硬蛋白酶… 预测受精能力，提前做特殊处理。 ? 密度梯度离心的原理？
密度梯度离心法：是样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法 ? 卵子成熟度是如何分级的(卵冠丘复合体)？
OCCC的形态可初步评估卵母细胞的成熟度，卵细胞分级为：
Ⅰ级：卵细胞呈深色，放射冠安全没有分散开，卵丘细胞紧密排列在一 起，颜色偏深或卵丘细胞团很小。这级卵子通常为不成熟卵或退化的卵子，有的是异常卵子。
Ⅱ级：卵细胞外观颜色变浅，放射冠已呈不同程度的分散，卵丘细胞排列变稀松，颜色变浅。这级卵子通常为接近成熟的卵子。
Ⅲ级：卵细胞外观颜色很淡，形状为规则的圆形，放射冠呈完全分散状，卵丘细胞团通常较大、排列松散、颜色很淡。这级卵子通常为成熟卵
Ⅳ级：卵细胞颜色变深，放射冠分散，但外周的卵丘细胞团很小或缺失。这级卵子通常为过熟卵子
卵母细胞成熟的标志有哪些？
卵母细胞成熟主要包括细胞核成熟和细胞质成熟。核成熟的标志：卵细胞与透明带间出现间隙，第一极体形成。
描述卵母细胞成熟度MI、MII、GV分别是什么意思？ 脱颗粒后根据卵细胞结构判断卵母细胞成熟度：
MII：细胞核的结构消失，第一极体已排出。此时胞浆中看不到细胞核的结构，在卵黄间隙中可见第一极体。
MI：细胞核的结构消失，但第一极体尚未排出。在此阶段的卵子中既看不到细胞核也看不到第一极体。
GV：细胞核的结构尚未消失,在此阶段的卵子胞浆中可看见圆圆的核结构。 异常受精的原因有哪些? 原因：
1. 2个精子进入
2. 第一极体或第二极体的染色体滞留
3. 一个 双倍 体精子进入；这样的精子占 0.5%。
4. 双倍体卵母细胞： ICSI 3PN的主要来源；因卵母细胞老化或培养条件差所
致。
异常精液参数的受精策略有哪些？ 几种主要的显微受精技术： (1)透明带钻孔（ZD）：破坏透明带，使精子由破损处进入卵子并受精的方法。 (2)透明带带下注射（ SUZI） 用微注射器将精子直接注入透明带下的卵周隙内。主要解决少精或精子严重畸型例症。 (3)卵细胞浆内单精子显微受精技术（ICSI）：是将整个精子或精子头直接注射到卵细胞质内，使卵子受精。受精率高达50%至70%上。 (4)从睾丸和附睾取精（TESE）：与ICSI结合(TESE-ICSI)，解决无精子排出患者生育问
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题。
? 卵裂期优质胚胎形态学标志有哪些?
卵裂球分裂同步，大小均匀，每个卵裂球仅1个核，无细胞碎片
第八章 植入前遗传学诊断-彭海英
? 胚胎植入前遗传学诊断
胚胎种植前遗传学诊断：是指在体外受精过程中，对具有遗传风险患者的胚胎进行种植前活检和遗传学分析，以选择无遗传疾病的胚胎植入宫腔，从而获得正常胎儿诊断方法，可有效地防止有遗传疾病患儿的出生。 ? 意义：
对高龄孕妇和高危妇女进行PGD可以有效地避免遗传病患儿的出生。
可以有效地避免传统的产前诊断技术，对异常胚胎进行治疗性流产，避免中期妊娠遗传诊断及终止妊娠所致的危险及痛苦。
ＰＧＤ技术的产生与完善可以排除遗传病携带者胚胎，阻断致病基因的纵向传递，从而降低人类遗传负荷。 ? 适应症：
单基因遗传病
三联体重复序列异常 染色体数目、结构异常 不明原因的不良孕产史
? 主要检测技术 --—选择精子：
X精子的长度、周长、头部体积、颈部区域的长度以及尾部均比Y精子大，即X精子不仅比Y精子大，而且比Y精子长
另一已经证实的差异是X精子的DNA含量比Y精子多2.8 % ? ——精子分离方法：
? 白蛋白柱分离法 X、Y 精子在白蛋白溶液中运动速度不同,其中Y 精子穿透
白蛋白溶液的能力比X精子强 Y精子更容易去激活 ? 梯度离心法（Percoll法），X和Y精子的比例几乎是1:1 ? 流式细胞仪分选法 在动物中运用较为成功，人类并不适用 ? 精子筛选的安全性：
筛选过程对精子活动力的影响会否降低治疗结局，各种化学物质的细胞毒性，遗传的影响
? 极体 优点：
可以使用第一极体或第二极体，它们在胚胎发育和合子形成中是非必须的，因而不影响卵子受精和正常发育，且不会引起伦理学上的争议
极体活检比胚胎活检对胚胎的创伤性小，且不为染色体的嵌合性所影响，可以间接地反映母源性遗传缺陷。 ? 缺点：
不能检测父源性非整倍体核型
不能检测发生于受精期间及受精后的其它异常 只能取到一个细胞核进行分析，结果的可靠性有限
? 每一活检的卵子准备一个活检皿，皿中作4个15ul的培养液液滴，其中一滴为加有
0. 1M蔗糖的培养液，以使卵子胞浆皱缩，卵周隙增大，避免活检时损伤卵胞膜 ? 卵裂球细胞
体外受精3天后6～10细胞期进行，取出1～2卵裂细胞进行诊断，其它细胞留待诊断后决定取舍
胚胎活检可以用于检测母体的非整倍体核型以及父源的非整倍体核型、多倍体、单倍体和广泛的嵌合性，诊断的准确性较高 ? 活检成功的标准：
从胚胎获得的细胞物质适合于PCR或FISH的遗传学诊断，即细胞要保持完整，而且有单个清晰可见的细胞核
活检过程不影响胚胎的进一步发育。
卵裂球活检的优势在于可以同时诊断父方和母方染色体异常或单基因疾病
其缺点在于胚胎存在嵌合型以及胚胎可供诊断的物质有限，这些将影响PGD的准确性。
? 囊胚滋养层细胞 ：
所能获取的细胞数目相对多些(10～30个)，减少嵌合现象干扰 此阶段的胚胎基因表达更为完全，增加了诊断的可靠性
活检只取将来发育成胎盘的部分细胞，而不涉及将来发育成胎儿的内细胞团部分，从而避免了活检过程对胎儿发育的任何不利的影响
受精后仅有40％可发育到囊胚，从而限制了可供PGD诊断的胚胎的数目
而滋养外胚层细胞与内细胞团细胞的遗传性物质存在的差异，囊胚存在嵌合现象，均将影响PGD准确性
囊胚期活检，使得诊断的时间受到严格的控制，如没有时间进行第二次FISH或处理PCR过程中或后出现的技术问题 ? 活检后面对的问题：
经过PGD诊断的正常的、移植后剩余的胚胎需要冷冻保存
透明带上活检孔径的大小与冻融后胚胎的损伤呈明显的相关性 ? 遗传学诊断方法----—单细胞PCR方法
目前单基因疾病PGD所用的方法主要是基于PCR技术通过检测单细胞靶基因的数目及结构有无异常加以诊断
单细胞PCR无需抽提DNA，经过变性前处理步骤后，即进行PCR循环反应
但由于单细胞PCR的模板量极低，仅1～2拷贝，故PCR体系必须具备下列条件：①对模板扩增的忠实性好；②方法稳定；③无非特异性扩增；④扩增的灵敏度高 ? 巢式PCR、 ? 多重PCR ? 荧光PCR
指荧光标记的寡核昔酸引物。PCR产物用激光分析系统进行分析 无须后续的电泳等分析
? 荧光定量PCR
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧
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光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 原位PCR 免疫PCR
原理是将目的基因的扩增产物用生物素标记，检测突变的特异性探针用地高辛标记，二者经变性退火处理后加到含抗生物素的酶标板内，通过显色来鉴定突变是否存在。根据显色深浅可做定量分析。该法已用于囊性纤维病基因突变的检测。 等位基因特异性扩增
1. 在设计引物时，根据已知突变位点的特征，在引物3’端或中间设计一错配碱
基，使之仅能与突变型或野生型基因互补，而只扩增相对应的突变型或野生型基因。
2. 主要用于点突变导致的遗传病的检测 3. 在相互竞争的突变型和野生型引物中，分别采用不同荧光染料标记扩增的DNA，
可直接对扩增产物进行判读
4. 另外使用具有特定酶切位点的内嵌引物，也可提高产物特异性和产量，DNA扩
增后用酶切割，由酶切产物可明确是否有基因突变，该法已应用于单个精子的DNA分析 全基因组扩增技术 微卫星DNA的PCR
微卫星DNA (microsatellite DNA）又称简单重复序列（simple repeated sequence, SRS)，能参与遗传物质的结构改变、基因调控，是基因重组和基因变异之源 多基因遗传病和先天畸形的易感基因研究常用的遗传标记是微卫星标记
脆性X染色体综合征、强直性肌营养不良、脊髓小脑共济失调等遗传性疾病都与之有关
微卫星DNA多态性的特点可以用来分析单细胞DNA扩增产物的来源及纯度 RT-PCR
如果已知某种与遗传病有关的基因在体外培养期间确实已开始表达，那么将致病基因表达的mRNA反转录成cDNA,对cDNA进行扩增，来检测目的基因，所需的底物拷贝数相对较多，有可能解决单个DNA拷贝对植入前诊断发展的限制 扩增产物的鉴定与诊断:
根据特异性扩增带做出诊断 限制性酶谱直接分析法
限制性片段长度多态连锁分析法 寡核苷酸探针—斑点杂交检测法 单链构象多态性（SSCP)
变性梯度凝胶电泳（DGGE） 基因芯片（DNA chip, gene chip） 单细胞处理方法:
① 纯水法：②冻融法：③碱法：④蛋白酶K法：
前次PCR过程的产物对本次实验的污染是最为严重的问题 ——单向、洁净 精子及卵丘细胞是外源DNA污染的重要来源
卵丘细胞必须要拆除干净，所有的胚胎必须在倒置显微镜下检查 用ICSI避免其他精子的污染
活检细胞必须在无菌PBS中洗涤或在移植入PCR管中之前在无菌介质中进行细胞培
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能够减少污染，增加特异性的方法是巢式PCR。 单细胞分析
原理是含有互补序列（探针）的被标记的单链DNA或RNA片段在适当的条件下与细胞的DNA或RNA杂交形成稳定的杂交体
荧光原位杂交（fluorescence in- situ hybridization, FISH）就是用荧光素标记的探针与组织细胞的DNA杂交 注意事项
杂交反应进行时，探针和靶核酸都必须是单链的，因此在杂交前必须进行变性。一般变性的温度控制在73℃士1℃，温度太低达不到变性的效果，而温度太高时间太
长容易损伤核的质量。标本和探针变性后立即分别用冰冻酒精和冰水水浴，处理的目的是维持变性的单链状态，防止温度降低而重新复性。
? 杂交反应的时间可能随着探针浓度的增加而缩短，但在一个相当大的范围内，杂交
反应应在4-6小时内完成。杂交反应的时间不要超过24小时。反应时间过长，形成的杂交体会自动解链，杂交信号反而会减弱。 ? 单细胞FISH在植入前遗传学诊断的应用 ：
性连锁疾病诊断
其他染色体疾病的诊断
? 检测高龄妇女的非整倍体染色体异常
? 染色体结构异常尤其是染色体易位携带者的PGD的研究 ? FISH存在的问题：
? 难以区分正常和平衡的胚胎，如要区分则需针对不同易位设计跨越断裂点的探针 ? 嵌合体和无序分裂（chaotic divide）的存在可使误诊产生
无序分裂的胚胎表现为细胞与细胞之间染色体构成随机变化，原始合子的情况往往不能明确
? 体外生长胚胎的嵌合型和其他异常 （一） 嵌合型的影响因素
①卵子培养和操作时温度的改变
②母亲年龄
③培养时氧浓度 ④超排卵方案
⑤胚胎的形态及发育 ⑥有无多核细胞
⑦检测染色体的数目和号数。 ? 嵌合型的发生机理：
有丝分裂时发生错误染色体不分离或一至二个细胞极性改变可形成嵌合型胚胎 ? 胚胎嵌合型对lVF的影响：
染色体嵌合型对植入前遗传学诊断的影响 ? 影响PGD成功率：
活检或诊断技术（FISH或PCR）的失败而导致误诊或不能诊断 另一个重要影响因素为胚胎存在嵌合现象
? 用核移植技术进行染色体易位胚胎的植入前遗传学诊断
? 核移植技术可以获得分裂中期的单卵裂球或第二极体，即用分裂间期的卵裂球与去
核的成熟卵子（MⅡ卵子）或合子融合后获得分裂中期的染色体然后再用染色体涂染探针进行FISH的方法 基因芯片
基因芯片（DNA chip, Gene chip）又称为生物芯片（biological chip), DNA微阵列（DNA Microarray）等。它是以DNA碱基配对、序列互补原理为基础分辨单个核苷酸，实现DNA序列的分析
植入前遗传学诊断新的适应证
用于人类肿瘤易感综合征的易感性分析及一些迟发性疾病的基因预测
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? 生物医学工程学院考试命题双向细目表（ A卷）
? 课程名称：人类辅助生殖技术 授课对象： 2012生科
范文二：人类辅助生殖技术
人类辅助生殖技术
【关键词】人类辅助生殖技术，人工授精，体外受精，代孕母亲，伦理问题，伦理原则，对传统法律的冲击
生殖是生命的基本特征之一，是生物繁殖后代，延续种系的重要生命活动。人类的生殖由男女两性共同构成，是一个复杂的过程。[1]不孕不育是人类繁衍发展中久远的世界性问题，各国科学家为此做出了不懈的努力。随着科学文明发展，18世纪英国医生首次人工授精获得成功，19世纪末正式进入医学科学单位进行规范性生殖辅助技术的应用和研究。历经100多年发展，已从人工授精发展到试管婴儿，特别是试管婴儿及其衍生技术的发展，使助孕技术进入一个新时代，由体内授精妊娠转为体外受精、胚胎培养、移植的新时代，是人类生殖工程的重大里程碑。它的成功不仅给治疗不孕不育患者带来福音，同时奠定了医学基础、临床医学和社会科学相结合的重大发展方向，对促进基因、遗传工程发展起了积极推动作用。[2]
人类辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology，ART)，是指运用医学技术和方法对配子、合子、胚胎进行人工操作，以达到受孕目的的技术方法，分为人工授精(Artificial Insemination，AI)和体外受精一胚胎移植
(InVitroFertilizationandEmbryoTransfer，IVF— ET)及其衍生技术两大类。[3]
一、辅助生殖技术的概念
（一）人工授精技术
人工授精，是指用人工方式将精液注入女性体内以取代性交途径使其妊娠的一种方法。[3]实际上是代替自然生殖过程的性交这一步骤，他是治疗男性不孕症的简单而有效的方法。人工授精根据精液来源不同分为两种：用授精者丈的精液进行人工授精的称“丈夫精液人工授精”(Artificial Insemination by Husband Semen,)简称AIH，也叫做同源人工授精。AIH适用于丈夫精液中精子数量少、反向射精、由于心理或生理的困难导致性功能异常不能进行正常性交者；用他人提供的精液进
行人工授精的叫“供精人工授精”(Artificial Insemination by Donor Semen,)。简称AID，又称为异源人工授精，适用于丈夫精液中午精子、丈夫患有染色体显性遗传病或男女双方均为同一常染色体隐性杂合体以及男女双发Rh血型不合、RH不相容等情况。[4]
（二）体外受精
体外授精-胚胎移植及其各种衍生技术：是指从女性体内取出卵子，在器皿内培养后，加入经技术处理的精子，待卵子受精后继续培养到形成早早胚胎时，再转移到子宫内着床、发育成胎儿直至分娩的技术（又称试管婴儿）。[3]体外受精也可用来解决男子精子缺少和不孕症。1978年7月25日早英国剑桥诞生的第一个“试管婴儿”路伊丝·布朗。这一震惊世界的“试管婴儿”，是由英国胚胎学者爱德华兹和一位妇科医师斯特普托伊合作，为治疗异位由于输卵管严重损伤，结婚9年没有生育的不孕症女性患者而获得的成功。2006年12月，路伊丝·布朗已生育了一个健康的后代。[4]
（三）代孕母亲
代孕母亲，是指代人妊娠的妇女。其方法是将他人的受精卵植入子宫或用人工授精方法使该妇女怀孕妊娠，，分娩后婴儿由委托人收养，并支付一定的报酬。[3]代孕技术可以帮助那些卵巢发育正常并有正常排卵，但因各种原因失去了子宫或者子宫发育异常，或盆腔广泛粘连使得受孕后无法生长而多次流产等疾病的患者。代孕技术在个别国家也用于同性恋、未婚女子等。[4]
二、辅助生殖技术的伦理问题
人工授精的开展作为一门高新技术应用于临床，给不孕夫妇带来了福音。但人工授精技术的应用对于人类传统的道德观念发生了挑战。人工辅助授精生殖技术应用产生了一些全球共同的和中国特殊的伦理问题。[4]
（一）人工授精、体外授精与胚胎移植及衍生技术的伦理问题：第一，人工授精的开展作为一门高新技术应用于临床，给不孕夫妇带来了福音。但人工授精技术的应用对于人类传统的道德观念发生了挑战。第二，胚胎的命运可以随着捐赠者的意愿而改变。第三，是否单身女性、同性恋者及任何年龄的妇女都可以要求做人工授精、
体外受精？[4]
（二）人类精子库的伦理问题：第一，基因与血缘。第二，促进优生学。第三，促进卵子和精子商业化。[4]
（三）代孕母亲的伦理问题：第一，家庭关系的复杂与弱化。第二，代孕母亲与商业化。第三，代孕母亲与契约的履行。第四，对代母最严重的一个反对是剥削和不平等。[4]
三、人类辅助生殖技术的伦理原则
1．知情同意的原则：医务人员对要求实施辅助生殖技术且符合适应症的夫妇，须让其了解实施该技术的主要医师和实施程序、成功率、费用、可能发生的并发症、接受随访的必要性以及对出生有缺陷的孩子负有抚养责任等事宜，在夫妇双方自愿同意后，再签署知情同意书。[4]
2．维护供受双方和后代利益的原则：捐赠精子、卵子、胚胎者对出生的后代既没有任何权利，也不承担任何义务。遵照我国抚养—教育的原则，利用捐赠的精子、卵子和胚胎出生的子代，其受方父母作为法定的父母，承担孩子的抚养和教育。
[4]
3．互盲和保密的原则：凡是使用捐赠精子、卵子、胚胎实施的辅助生殖技术，捐赠者与受方夫妇、出生的子代均须保持互盲；人类精子库提供给辅助生殖机构的精子应匿名，以使供精人工授精操作的医务人员与捐精者也保持互盲。[4]
4．维护社会公益的原则：为了维护社会公益，医务人员不得实施下列辅助生殖技术；单身妇女的人工授精、近亲间人工授精和体外授精与胚胎移植、非医学需要的性别选择、代孕技术、克隆人以及异种精子、卵子和胚胎用于人。另外，一个提供配子或提供胚胎者最多只能给5名妇女受孕。[4]
5．防止商品化原则：医疗机构和医务人员对要求实施辅助生殖技术的夫妇，要严格掌握适应症，不能受利益驱动对有可能自然生殖的夫妇实施辅助生殖技术。
[4]
6．医学伦理委员会应由医学伦理、社会学、法学和医学等有关专家和群众代表组成，并依据上述原则对医疗机构实施的辅助生殖技术进行监督，每半年进行一
次检查，并对实施中遇到的伦理问题进行审查、论证和提出建议。[4]
四、人类辅助生殖技术对传统法律的冲击
现代生殖技术的问世和应用，既给不孕夫妇带来福音，使患有遗传性疾病或者遗传性家族史的夫妇杜绝了其后代再患此疾病的危险，同时也给人类带来了许多法律问题。诸如：提供精液或卵子的人是否是婴儿的父亲或母亲，他们去世后婴儿是否有权继承其遗产，受精卵和胚胎的生命权与法律地位，代孕母亲与婴儿的关系，等等。人工生殖技术的推广，成千上万的人工生殖人口来到人世，打破了一些自然法则，使目前的亲子身份和户籍管理无所适从。那么，如何确定孩子的法律地位，传统的法律在新生殖技术的冲击下已收到动摇。[3]
【参考文献】
[1]魏莎莉，马青年，等. 生殖医学基础.第二版.重庆大学出版社,2006.9
[2]张辛乐，何咏乐，生殖健康与保健，人民军医出版社，2006.10
[3]赵同刚，人民卫生出版社，2008.6
[4]伍天章，北京高等教育出版社，2008.5
范文三：辅助生殖技术
人类辅助生殖技术的临床研究进展
作者：
作者单位：
出处：
摘要： 张寅; 伍琼芳 (1)南昌大学研究生院医学部,南昌330006; (2)江西省妇幼保健院辅助生殖中心 国际生殖健康/计划生育杂志 2012; 31(2) : 108-114 不孕不育是一个高度遍及全球的生殖健康问题,近年来不孕症患者呈逐年增长趋势。该病已
成为影响人类发展与健康的一个全球性医学和社会学问题。自从1978年世界上首例“试管
婴儿”-英国的Louise Brown经体外受精(IVF)而诞生,辅助生殖技术(ART)逐渐成为不孕夫
妇的重要治疗手段。ART包括人工授精(hi)、体外受精与胚胎移植(IVF-ET)、胞浆内单精
子注射(ICSI)、生殖细胞及胚胎冷冻技术等。而其他ART也在快速改革发展,包括一些建立
在辅助生殖与人类基因组之间的桥梁。一系列辅助生殖相关技术,如未成熟卵母细胞体外培
养成熟(WM)、移植前遗传学诊断(PGD)、单胚胎移植以及冷冻技术等获得了较大的发展,
为降低常规IVF-ET的费用、风险等提供了可能。综述当前临床及实验性ART技术的相娑
研容讲屐.
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提高辅助生殖技术的成功率
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摘要： 乔杰; 李红真 北京大学第三医院妇产科生殖医学中心,北京 100083 国际生殖健康/计划生育杂志 2013; 32(1) : 1-2 在世界范围内,约10%－15%的育龄夫妇受到不孕症的困扰。自1978年首例试管婴儿诞生
以来,辅助生殖技术(ART)呈蓬勃发展之势,并由此引发相关领域在临床医学和分子生物学、
分子遗传学等方面的快速进展。但至今,ART的成功率并不理想,且进步缓慢。探讨影响A
RT成功率的因素,并予以相应的改进,以改善ART成功率是临床医生和科研工作者不断追
求的目标和努力的方向。选择适宜的促排卵方案、深人研究导致不孕症的病因、降低ART
的并发症,将有助于ART的发展,更好地服务于患者。
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范文四：辅助生殖技术
辅助生殖技术
辅助生殖技术是人类辅助生殖技术(Assisted Reproduct
ive Technology，ART)的简称，指采用医疗辅助手段使不育夫妇妊娠的技术，包括人工授精(Artificial Insemination，AI)和体外受精-胚胎移植(In Vitro Fertilization and Emb
ryo Transfer，IVF-ET)及其衍生技术两大类。试管婴儿就是使用该技术的体外受精———胚胎移植方法生育的婴儿。世界首例试管婴儿的诞生被誉为继心脏移植成功后20世纪医学界的又一奇迹，激发了全球许多国家研究这一高新技术的热潮。
临床意义
据世界卫生组织(WHO)评估，每7对夫妇中约有1对夫妇存在生殖障碍。我国近期调查，国内不孕症者占已婚夫妇人数的10%，比1984年调查的4.8%增加一倍多，发病率呈上升趋势。我国更受传宗接代观念影响，多数家庭盼子心切，使不育夫妇承受着极大的心理压力，甚至引发离异、婚外恋之类家庭乃至社会的问题。ART的直接效应是使不育夫妇实现妊娠生子的愿望，由不育引发的相关问题自然会随之得到解决。临床统计，不育患者中约20%的夫妇，不借助ART就根本无法生儿育女 。
但是，也有人认为ART违背计划生育少生的要求，因而
持否定态度。其实只要坚持只对准生的夫妇才给ART治疗，就不会引发超生的负面效应，相反，还有利于控制人口增长工作的顺利进行。因为ART能帮助做过绝育手术的夫妇恢复生育能力，具有生殖保险作用，这就使那些该做绝育手术，但又担心术后如遇子女夭折时无法再生孩子的夫妇，打消顾虑，自愿接受手术。ART的生殖保险作用自然也适用于参战士兵、从事高危职业、长期接触放射线或有毒物质的男性及需要进行睾丸、附睾手术或放疗、化疗的患者，可事先将他们的精子冷冻存储，以备一旦身亡或生精功能受损，需生殖时使用。
计划生育不仅要求少生，还要求优生，保证国家人口素质的提高。目前已发现人类遗传病约4000种，人群中约1/3的人存在这样或那样的遗传缺陷 。我国先天残疾人口高达几千万，每年还要新生有遗传缺陷人口20多万，实行优生势在必行。而ART在临床中正好能遏止遗传病的传递，是实现优生的重要手段。有遗传缺陷的育龄夫妇，不论是否不育，都可采用ART的供精、供卵、供胚或胚胎移植前遗传学诊断(PGD)等方法，切断导致遗传病发生的有缺陷基因与异常染色体和后代传递，保证生育健康婴儿。另外，ART还是人类生殖过程、遗传病机制、干细胞定向分化等研究课题的基础，ART的临床应用，会为这些课题的深入研究积累经验，
创造发展条件，推动医学及生命科学的不断发展进步。
一、人工授精
人工授精(AI) 是以非性交方式将精子置入女性生殖道内，使精子与卵子自然结合，实现受孕的方法。人类最早一例成功的AI治疗是John Hunter于1790年为严重尿道下裂患者的妻子进行的配偶间人工受精。至今虽已200多年，但仍是常用的有效助孕技术。由于精液来源不同，AI分夫精人工授精(AIH)和供精(非配偶)人工授精(AID)。两者适应症不同，AIH治疗:(1)性交障碍;(2)精子在女性生殖道内运行障碍;(3)少、弱症。AID治疗:(1)无精症;(2)男方有遗传疾病;(3)夫妻间特殊性血型或免疫不相容。实施AID治疗时，供精者须选择身体健康，智力发育好，无遗传病家族史的青壮年。还须排除染色体变异、乙肝、丙肝、淋病、梅毒，尤其是艾滋病(HIV)。血型要与受者丈夫相同。供精精子应冷冻6个月，复查HIV阴性方可使用 。因HIV的感染有6个月左右的潜伏期，此时诊断不易确定，所以供精精子一般应从精子库获取。
不论实施AIH还是AID治疗，受精前精子都须进行优选诱导获能处理，这对宫腔内授精或体外授精，更是一项重要的常规技术。其作用是去除含有抑制与影响受精成分的精浆，激活诱导精子获能。自然受精中，精子是在穿过宫颈粘液及在输卵管内停留等候卵子的过程中实现上述变化的。临床处理，则采用离子洗涤与用成分相似于输卵管液的授精培养液培养相结合的方法完成，具体有精子上游法和Percoll梯度离心法。前法较简单，但精子回收率低，少、弱精者宜用后法。授精时间应根据术前对女方的排卵监测、选在排卵前48h至排卵后12h之间进行。授精部位目前常用的是将精子注入宫颈，或在严格无菌措施下注入宫腔。
二、体外受精-胚胎移植(IVF-ET)
该技术是将从母体取出的卵子置于培养皿内，加入经优选诱导获能处理的精子，使精卵在体外受精，并发育成前期胚胎后移植回母体子宫内，经妊娠后分娩婴儿。由于胚胎最初
2天在试管内发育，所以又叫试管婴儿技术。
2.1 IVF-ET的建立 这得先从美籍华人科学家张明觉的开拓性研究说起。张明觉早年受教国内，1945年开始在美国做兔子体外授精实验，历经5年未获得成功。但他把从兔子子宫内回收到的受精卵移植进别的兔子子宫内，却能借腹怀胎生下幼兔。经过刻苦的深入研究，张明觉推测，在体内受
精的精子，一定是在输卵管内等候卵子的过程中，完成了激活自身的某种生理变化，所以能使卵子受精。并用实验证实了上述推测。同年澳大利亚学者Austis也在实验中发现相同现象，称之为精子获能(sperm capacitation)。国际生物学界将二人的研究成果命名为“张?奥斯汀”原理。张明觉认为，20世纪50年代以前，体外授精不能成功的原因是采用的精子都未经激活获能。于是他认真研究了使精子在体外活化获能的方法后，在1959年与科学家Pincus合作研究中，果然成功地实现了兔子的体外受精和胚胎移植，为人类IVF-ET的建立奠定了基础。1970年，英国胚胎学家罗伯特?爱德华兹(Edwards)与妇产科医生Steptoe合作，开始了人类的体外受精与胚胎移植研究。1977年，他们取出因输卵管阻塞不育的患者Lesley的卵子与丈夫的精子行体外授精后，将发育的胚胎移植回Lesley的子宫内。1978年7月25日，Lesley终于分娩了世界上第一例试管婴儿叫路易丝?博朗(Louise Brown)。至此人类IVF-ET技术正式建立。由此，罗伯特?爱德华兹获得了“试管婴儿之父”的美誉。
但直到2010年，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会才宣布，英国剑桥大学的罗伯特?爱德华兹教授荣获今年的诺贝尔生理学或医学奖。授予他诺奖的理由是“他使试管受精技术用于治疗不孕成为可能，为占总人口比例超过10%的不孕夫妇带来了福音。”这是一个迟到的诺贝尔奖。根据惯例，早在十几年前，他就应该得到。可他所带来的技术，不啻于向人类社会投下了一颗重磅炸弹——为伦理、**、社会管理带来了重重挑战。人类不得不用更长时间来审视它、接纳它。它就是试管婴儿。
2007年，长大成人的路易丝?博朗又诞下一名健康男婴，用事实证明了试管受精技术的安全性。如今，全球已有约4百万个人类生命，拜试管受精技术所赐，才得以来到人间。
在经历了30多年的漫长等待后，“试管婴儿之父”罗伯特?爱德华兹终于接到了诺贝尔奖委员会的获奖通知。
“试管婴儿”的诞生，对罗伯特?爱德华兹而言，是多年坚持
研究的结果。早在上世纪50年代，他就感觉到试管受精将会是治疗不孕的一个重要途径，于是就开始系统地研究人类受精的过程。
尽管动物的试管受精、胚胎移植技术早就有成功先例，但人类卵子的生命周期与兔子、牛完全不同。人类卵子如何成熟、不同荷尔蒙如何促使卵子成熟，乃至何时适合授精、哪种精子更易被接受，爱德华兹将谜底一一揭开。
当时，他与许多合作者一起，不断探索如何安全地取到成熟卵子，不断尝试各种试剂配方使受精卵发育起来。“配药水就像在调配咖啡”——这种摸索的艰难，现在已经很难想象，因为在各大医院的试管婴儿实验室里，从病人服用的药物到实验室操作的试剂，都已有了成熟的工业产品。
路易丝?博朗的诞生震惊了世界。这个通过试管受精形成的生命，给人类社会带来了巨大的挑战:最巨大的压力来自**，人类的繁衍是上帝控制的，怎可由人来操纵,其次来自伦理，提供精子和卵子的、提供子宫代孕的、最终养育孩子的，谁算孩子真正的父母,这可能造就更多隐性的同父异母、同母异父的“兄弟姐妹”。
就在伦理学家为“试管婴儿”争论不休的同时，试管婴儿的技术却在不断成熟、不断发展，越来越被人们所接受。爱德华兹的第一例试管婴儿，卵子来自自然排卵，后来技术的发展可谓超乎想象。
细胞生物学专家、中科院上海生科院生化细胞所研究员郭礼和介绍说，以前卵子无法储存，必须现取现用，如今不仅可以储存精子，还能储存卵子，甚至将整个卵巢储存起来。而现在科学家还能用干细胞分化出卵母细胞和精子，体外构建出了人造卵巢。“如今，整个人类的生殖工程科学研究领域已初具雏形，而罗伯特?爱德华兹是当仁不让的创始人——他开创了医学史上的一个奇迹。”
1985年4月和1986年12月，我国台湾、香港先后诞生了两地的首例试管婴儿。1988年3月10日，大陆的首例试管婴儿也在北京医科大学第三医院张丽珠教授领导的生殖中心诞生。当今国际上采用的助孕新技术多数是从IVF-ET衍生出来的。
2.2 适应证 (1)输卵管堵塞;(2)子宫内膜异位伴盆腔内粘连或输卵管异常，使精子在盆腔内被巨嗜细胞吞噬;(3)男性轻度少精、弱精症;(4)免疫性不育、抗精子抗体阳性;(5)原因不明的不育。
2.3 控制性超排卵与卵泡监测 按自然周期取卵，一次周期只能得到一个卵。为了提高妊娠率，目前在IVF-ET技术中，多采用控制性超排卵法，即选用人类促性腺激素，增强与改善卵巢功能，使一次周期能有多个卵泡发育，回收多个卵供受精。以获得较多供移植的胚胎。但促超排卵法有时会有卵泡早熟、质量差的情况。1991年，中山医大第一附属
医院用下丘脑促性腺激素激动剂(GnRH-a)的喷鼻剂Buserelin进行降调节，联合应用促性腺激素，使优势卵泡数明显增加 。在实施促超排卵过程中，须用阴道B超扫描监测卵泡发育数目、大小，同时监测尿LH及血内激素变化，以便适时调整用药、正确估算取卵时间，并尽量使黄体与内膜功能、妊娠发生及妊娠维持相适应。
2.4 取卵 一般用B超引导经阴道穿刺取卵术取卵。此法不需麻醉切口，也不经过膀胱，避免了尿液对精子的伤害，优于用腹腔镜或B超引导经腹取卵的方法。
2.5 体外授精 将取到的卵泡液注入培养皿，肉眼快速辨认含卵细胞及其外周的透明带、放射冠的卵冠丘复合物。在解剖镜下确认有卵细胞存在后，置入CO 2 培养箱培养4,8h，再根据复合物的形态变化判断选择成熟卵细胞，按每卵配10,20万个精子的比例，投入经过洗涤优选已诱导获能的精子，授精后16,18h观察情况，将受精卵移入培养试管
/皿内培养。
2.6 胚胎移植 于取卵后48h，胚胎发育成2,8个细胞阶段或在取卵后72h胚胎发育至8,16个细胞时植入子宫。后者较符合自然受精胚胎进入子宫的时间，且在传统体外培养条件下，只有最健康的胚胎才能活到3天，故移植成功率高。有报道，应用共培养术，可使胚胎培养至囊胚期再移植，妊娠率高达50%。一次移植的胚胎数以2,3枚为宜。因为增加胚胎移植数，妊娠率虽呈不按比例的增加，但多胎率也会随之增加，经对几组移植1,6胎资料的比较，其中以移植3个胚胎的妊娠率相对较高，而多胎率相对较低。
2.7 胚胎冻融 不仅AID治疗的精子需要冻融，在IVF-ET中由于促超排卵的应用，一次周期回收的卵泡，经受精发育的胚胎，移植后会有剩余也需要冷冻储存，如移植失败，就可在下个自然周期或HRT周期移植，以提高一次取卵的妊娠率。另外遇到患者因促超排卵引发的卵巢刺激综合征，为了防止妊娠加重病情，也可将胚胎冻存，留待以后移植用。胚胎冻存的机制是，超低温可抑制细胞的新陈代谢，使生命进入休眠状态而保存下来。保存温度为 -196?，保存装置为以液氮作致冷源的液氮罐，但在胚胎的冷冻和升温复苏过程中，当经过0?,60?这一温区时，如降温过快，细胞内液中的水分又会很快结冰，因为体积膨胀而涨破细胞膜，造成细胞死亡;如降温过慢，细胞外液中的水分会先结成细小冰
晶，使外液的渗透压升高，导致细胞内液中的水分向外渗透，溶质浓度相对升高，从而引起细胞蛋白质的分解变性，细胞一样难逃死亡厄运。因此在胚胎的冻融中，必须选择合适的降温与升温速度，并借助于某些具有既能减少细胞内的冰晶形成，又能延缓细胞外液中溶质浓度升高的冷冻保护剂的作用，才能使胚胎安全地实现冻存或复苏。目前常采用的方法是慢速冻快速复温法。精子冻藏的机制和冻融的原理一如上述。
2.8 胚胎移植后监测 移植后14天验晨尿HCG阳性为生化妊娠，显示胚胎植入和发育正常。移植4,6周腹部B超查到胎囊、胚胎和心管搏动为临床妊娠。
2.9 胚胎移植合并症 主要有流产、宫外孕、多胎妊娠、卵巢过度刺激综合征(OHSS)。
2.10 妊娠率 目前为25%,35%。随着对影响妊娠成功因素的深入研究和相应技术环节的改进，预期IVF-ET妊娠率还会提高。
卵泡浆内单精子显微注射(ICSI)
这一技术是在针对男性精子数量不足，功能异常导致受精障碍所采取的体外受精的微滴法、透明带部分切除法及透明带下授精等方法基础上发展起来的。1992年Palerme等报道了用该技术授精的首例试管婴儿诞生。该技术又称第二代试管婴儿，其操作方法是，不用进行精子的诱导获能处理，
只须选择一个形态正常，缓慢运动的精子先予以制动。方法用注射针挤压精子尾部，稍微擦破细胞质膜，诱导精子从擦破点释放精子细胞质体因子激活卵细胞，卵细胞的激活对ICSI的正常受精至关重要 ，接着按尾先头后的顺序吸精子放入注射针，再通过显微操作，将精子注入卵胞浆内，即完成受精。其他技术环节同于常规IVF-ET。对精道不通的患者可进行附睾穿刺，如吸出物中无精子，则从睾丸取活组织分离精子，或取精细胞激活后使用。适应证为:严重少、弱畸精症、输精管阻塞、先天性双侧输精管缺如以及输精管结扎后子女伤亡，吻合输精管失败或无法吻合者。ICSI是治疗男性不育的有效方法，但目前研究揭示，严重少、弱精症是由染色体镶嵌型异常引起，先天性双侧输精管缺如则常与囊性纤维膜传导基因突变有关，两者都是遗传病 ，对这两种患者治疗前应告知遗传风险，妊娠后需进行详细产前诊断，有异常须终止妊娠，或在胚胎移植前进行遗传学诊断(PGD)，筛选优质胚胎移植。
胚胎植入前遗传学诊断(PGD)
此法也称第三代试管婴儿，指在IVF-ET的胚胎移植前，取胚胎的遗传物质进行分析，诊断是否有异常，筛选健康胚胎移植，防止遗传病传递的方法。检测物质取4,8个细胞期胚胎的1个细胞或受精前后的卵第一、二极体。取样不影响胚胎发育。检测用单细胞DNA分析法，一是聚合酶链反
应(PCR)，检测男女性别和单基因遗传病;另一种是荧光原位杂交(FISH)，检测性别和染色体病。早在1964年Edwards就提出了PGD的思想。1989年Handyside AH首先将PGD成功应用于临床，用PCR技术行Y染色体特异基因体外扩增，将诊断为女性的胚胎移植入子宫获妊娠成功。开初的PGD都是用PCR或FISH检测性别，选女性胚胎移植，帮助有风险生育血友病A、进行性肌营养不良等X连锁遗传病后代的夫妇妊娠分娩出一正常女婴。但按遗传规律，此法无疑否定健康男孩的出生，而允许携带者女孩繁衍，并不能切断致病基因的传递。1992年，美国首先报道用PCR检测囊性纤维成功，并通过胚胎筛选，诞生了健康婴儿。之后，α-1-抗胰岛素缺乏症、家庭黑?性痴呆、色素沉着视网膜炎等多种单基因遗传病的PGD检测方法建立，PGD进入对单基因遗传病的检测预防阶级。1993年以后，由于晚婚晚育使大龄产妇人数增多，而45岁以上的妇女染色体异常率高、自然妊娠容易分娩18-3体和21-3体愚型儿，于是PGD的工作热点转向了对染色体病的检测预防，检测用FISH。由于取样多用第一极体，筛选出的为未授精卵，须进行单精子胞浆内注射，待培养发育成胚胎后移植。据统计，中途停止发育的胚胎，其染色体异常率达70% ，所以选择染色体正常的胚胎移植，还能提高IVF-ET的成功率 。从理论上讲，凡能诊断的遗传病，应该都能通过PGD防止其传递，但限
于目前的技术条件，PGD的适应证还有一定的局限。优生是世界共同关注的问题，随着分子生物技术的发展和更多遗传病基因被确定，相信一些准确、安全的遗传诊断技术会不断出现，PGD技术会日趋完善，更好的造福人类。
赠卵IVF-ET
该技术最早由Trounson等于1983年报道首例妊娠成功。适应证为:(1)卵巢功能衰竭或无卵巢;(2)女方有遗传性疾病或染色体异常。对赠卵人的选择应符合:(1)年龄小于35岁，曾生过一胎;(2)无家族遗传病史、精神病，排除乙肝、丙肝及性传播疾病，特别是HIV阳性者;(3)智力、外貌良好;(4)血型与受者相符。与常规IVF-ET相比，技术上供卵IVF-ET要增加两个重要环节:(1)须将受者和供者的月经周期调整同步，方法是，对无卵巢功能的患者，于供者预计月经来潮前3,5天先进行类固醇激素替代治疗(HRT)，促进患者子宫内膜产生周期变化，具备接受胚胎着床能力，并诱导内源性LH峰和子宫内膜雌激素受体的产生、改善机体内分泌环境;对有卵巢功能的患者，先用促性腺激素释放激素类似物或增强剂GnRH-A降调节后再用HRT治疗;在HRT治疗周期中，须进行血清激素测定、子宫内膜活检、B超多普勒监测、了解子宫内膜容受性，以调整给药量，使子宫内膜具有良好容受性;(2)维持妊娠，赠卵与患者丈夫的精子进行体外授精发育和胚胎移植后患者后，须
渐增HRT给药。以维持妊娠，直至受者自身胎盘功能建立为止。赠卵IVF-ET妊娠率较高，有的资料报道达44.9%。除了治疗适应证患者外，还能为研究胚胎、子宫内膜、类固醇激素的相互作用提供人类模型，临床应用前景广阔。
代孕
用于子宫切除术后或子宫破裂及子宫严重粘连患者。代孕技术原理与供卵IVF-ET相同，但供卵者为患者，受者为代孕者。因观念意识原因、国内目前对此技术尚未认同。
范文五：类辅助生殖技术
人 类 辅 助 生 殖 技 术
申请单位 主管部门 申请日期
申 请 书
浙江省利民医院 浙江省卫生厅 2006 年12 月 20 日
卫生部科技教育司
二○○一年五月
填 写 说 明
一、 申请机构在填写申请书之前，应仔细阅读《人类辅助生殖技术 管理办法》和《人类辅助生殖技术规范》。
二、 申请书各项内容，必须实事求是，逐项认真填写，表达要明确、
严谨，字迹要清晰易辨。对填写不符合要求、资料不完备的申 请书将予以退回，重新填写申报。经审查，若填写内容不真实， 则取消申请资格。
三、 本申请书一式15份，复印时请用A4复印纸，并于左侧装订成册。 四、 本申请书应附如下资料： 1、可行性报告
2、医疗机构执业许可证（复印件）
3、医疗机构基本情况说明（包括床位数、科室设置情况、人员 情况、设备和技术条件情况等）
4、医疗机构伦理委员会成员名单（包括成员姓名、工作单位、 专业、职务、职称等情况）
5、开展人类辅助生殖技术场所的建筑设计平面图 6、与人类精子库的供精意向书
7、辅助生殖技术操作手册及各项规章制度（包括分工责任制度、 材料管理制度、仪器管理制度、特殊药品管理制度、保密制 度、档案管理制度、病员随访制度、自查制度、工作人员行 为准则等）
