咕噜旮旯粪
范文一：DLC表面特异性吸附血浆蛋白的机理研究
DLC表面特异性吸附血浆蛋白的机理研究 第36卷增刊2
2007年8月
稀有金属材料与工程
RAREMETALMATERIALSANDENGINEER/NG Vo1.36,Supp1.2
August2007
DLC表面特异性吸附血浆蛋白的机理研究
李伯刚,殷杰,那娟娟,尹光福
(四川大学材料科学与工程学院,四川成都610065)
摘要:为探讨类金刚石薄膜(DLC)与金刚石薄膜(DF),石墨具有不同血浆蛋白吸附特性的内在原因,进行了人血
白蛋白(HSA)和纤维蛋白原(HFG)在3种碳素材料表面吸附前后的红外光谱分析.结果显示:通过-NH基,在DLC
与HAS之间及DF,石墨与HFG之间有氢键形成.有力支持并合理解释了DLC具有较高的HSA吸附活性,DF和石
墨则优先吸附HFG的前期研究结论.
关键词:类金刚石薄膜:血液相容性;蛋白吸附;氢键
中图法分类号:R318.08;R542.5文献标识码:A文章编号:1002—185X(2007)$2—061-04
1前言
类金刚石薄膜(Diamondlikecarbonfilm,DLC) 是极具应用前景的血液相容性材料.前期研究表明,
DLC的血液相容性之所以优于同是碳素材料的金刚石
薄膜(Diamondfilm,DF)和石墨,乃因DLC具有较高
的白蛋白(Humanserumalbumin,HSA)吸附活性,而
DF和石墨则优先吸附纤维蛋白原(Humanserum
fibrinogen.HFG)[".造成3种碳素材料蛋白吸附活性 不同的原因很可能在于蛋白与其表面相互作用的性质 与程度不同,较高的活性应来自较强的相互作用. 与所有吸附现象一样,导致血浆蛋白在材料表面 吸附的相互作用不外乎化学键,氢键和分子间力.由 于碳素材料是惰性材料,与蛋白形成化学键的可能性 小.如是,较强的相互作用很可能来自氢键.蛋白分 子由多种氨基酸组成,含有大量一NH,一COOH等容易 形成氢键的活性基团,而碳素材料表面则有配位不饱 和的悬键,DLC并含有原子H,因此具备形成氢键的 基本条件.
红外光谱是研究氢键的重要手段,按红外光谱学的 观点[2】,氢键x—H—Y的形成将削弱x—H结合,使 其伸缩振动的吸收峰向低波数方向位移.据此,本研究 拟通过HSA和HFG在上述3种碳素材料表面吸附前后 红外光谱的对比分析,追踪氢键形成的蛛丝马迹,寻求 3种碳素材料不同蛋白吸附特性形成的深层次原因. 2材料与方法
2.1材料
2.1.1DLC
采用全方位离子注入离子束增强沉积工艺,在6 mm×6mm×1mm抛光Ti6A14V基片上沉积而成[引. 2.1.2DF
以CH4/H2为原料,采用MPCVD工艺在10mm ×10mm×0.3mm抛光N型单晶硅片上沉积而成. 2.1.3石墨
将等静压成型的q520mm石墨碳棒切割成1mm 薄片,经表面抛光制成.
2.1.4蛋白试剂
HSA,HFG均为Sigma公司产品.
2.2方法
2.2.1蛋白吸附
于0.40mg/ml蛋白溶液中37?浸泡3h. 2.2.2红外光谱检测
将吸附了蛋白的材料试样用傅立叶变换红外光谱 仪(PerkinElmer,USA)做透射红外光谱检测,为消 除来自吸附基材红外吸收的干扰,同时检测未吸附蛋 白基材的红外吸收并予以扣减.再将蛋白纯品做同样 的透射红外检测,并与前者进行对比分析. 2.2.3谱图分析
与其他蛋白质一样,血浆蛋白也是酰胺类化合物, 其红外特征峰主要是氨基和羰基的伸缩振动以及氨基 的弯曲振动吸收.表1列示了其典型的红外特征吸收 峰的性质与位置(y,分别代表伸缩和弯曲振动),以 此作为纯品和吸附蛋白红外谱图的解析依据. 收稿日期:2007—02—28
基金项目:国家自然科学基金(39870232)资助 作者简介:李伯刚,男,1960年生,博士,副教授,四川大学无机材料系,四川成都
610065,电话:13708179994028—85401280
?62?稀有金属材料与工程第36卷
表1蛋白质和多肽中重要基团的强吸收频率. Table1Frequenciesofimportantgroupswithstrongeradsorptionforprotein(7--stretchingvi
bration,J--bendingvibration)
3结果与讨论
.3.1纯品血浆蛋白的红外光谱
图1及图2是HSA及HFG的红外光谱图. Wavenumber/cm'
图1HSA的红外光谱
Fig.1FT-IR-ATRspectraofHAS Wavenumber/cm'
图2HFG的红外光谱
Fig.2FT-IR-ATRspectraofHFG 3.2吸附在3种材料表面上的HSA的红外光谱 图3,图5是吸附在3种材料表面上的HSA红外 光谱,与图1对比发现,差减的红外谱图并未完全消 除基材的吸收干扰.主要原因分析是,直接做红外的 基材和吸附蛋白的基材虽然是同一批沉积的,但处于 沉积台的不同部位,现有的沉积技术难以做到大面积 沉积均匀,这可能会带来二者的组成差异而无法实现 完全扣减.另外,基材本身较低的红外透光率(DF 红外透光率相对较高)也致使许多吸收峰被屏蔽. 尽管如此,3300cm附近的H吸收峰在图4, 图5中依然十分清晰,位置亦与图1的纯品大体相符; 而图3只在2400cm附近出现强吸收峰,同时3300 cm附近的H吸收峰消失了.纯品HSA在这一位置 本无吸收,排除形成新键的可能性,这一吸收峰只可 能是H吸收峰低向位移的结果.说明通过氨基,HSA 与DLC之间的确形成了氢键.这就是为什么DLC会 比DF和石墨具有更高HSA吸附活性的内在原因. Wavenumber/cm'
图3HSA.DLC的红外光谱
Fig,3FT-IR-ATRspectraofHSA-DLC
Wavenumber/cm'
图4HSA.DF的红外光谱
Fig.4FT-IR-ATRspectraofHSA-DF
Wavenumber/cm'
图5HSA.石墨的红外光谱
Fig,5FT-IR-ATRspectraofHSA-graphite
增刊2李伯刚等:DLC表面特异性吸附血浆蛋白的机理研究?63?
3.3吸附在3种材料表面上的HFG的红外光谱 由于严重的屏蔽,HFG--DLC谱图(见图6) 没有出现任何有判属意义的吸收峰.
Wavenumber/cm'
图6HFG.DLC的红外光谱
Fig.6FT-IR-ATRspectraofHFG-DLC
键,其余仍保持原有状态.如此,相对于HSA,石墨 中对HFG还是具有较高吸附活性的,这也与前期研究结 论相符.
运用红外光谱对DLC,DF和石墨的蛋白吸附特 性进行研究,此前尚未见文献报道.虽然基材的固有 缺陷限制了透射红外光谱分析的敏感性,但本项研究 还是获得了氢键存在与否的明确信息,从血浆蛋白与 3种碳素材料表面的相互作用中,寻找到与前期研究 相吻合的重要证据.
与HSA的的情形不同,yNH吸收峰的低向位移这 次是明白无误地出现在HFG--DF的谱图(见图7)中, 成为DF优先吸附HFG的最好注脚.
Wavenumber/cm'
图7HFG.DF的红外光谱
Fig.7FT-IR-ATRspectraofHFG-DF
图8的情况要复杂些,强吸收连绵覆盖了2200 3500cm的整个区域,既依稀可辨正常位置的H吸 收,又有吸收峰低向位移存在的明显迹象.推断 是在石墨表面,HFG中只有部分氨基与石墨形成了氢 Wavenumber/cm'
图8HFG.石墨的红外光谱
Fig.8FT-IR-ATRspectraofHFG-graphite
4结论
通过氨基,HSA与DLC及HFG与DF,石墨之
间确有氢键形成.
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LiBogang,YinJie,NaJuanjuan,YinGuangfu
(CollegeofMaterialsScienceandEngineering,SichuanUniversity,Chengdu610065,China)
Abstract:Toclarifythereasoncausingdifferenceofserumproteinsadsorbabilityondifferentcarbonaceousmaterials,FT-IR-ATRspectra
??加印如?如加mQ4
更
?64?稀有金属材料与工程36卷
ofhumanserumalbumin(HSA)andhumanserumfibrinogen(HFG)beforeandafteradsorbingondiamondlikecarbonfilm(DLC),
diamondfilm(DF1andgraphitewereanalyzed.Ithasbeenshownthattherearehydrogenbondbecauseof_NHontheinterfacesof
HSA-DLC,HFG-DFandHFG-graphite.Basedontheresults,earlierresearchconclusionthattheadsorbabilityofHSAonDLCishigher
thanthatonDFandgraphite,butonDFandgraphitetheadsorptionofHFGtakesprecedenceca
nbeexplainedrationally.
Keywords:diamondlikecarbonfilm;hemocompatibility;proteinadsorption;hydrogenbond
Biography:LiBogang,Ph.D.,DepartmentofInorganicMaterials,SichuanUniversity,Chengdu610065,P.R.China,Tel
0086-28-85403996,E-mail:libg6005@sina.com.
范文二：特异性血管内皮细胞表面蛋白——肿瘤的分子地址
特异性血管内皮细胞表面蛋白——肿瘤的
分子地址
医学肿瘤学分册2005年5月第32卷第5期ForeignMedSciOncolSect.May2005.V0l_32.N0.5
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(收稿日期:2004—11—13修回日期:2004—12—03)
特异性血管内皮细胞表面蛋白
分子地址
李国东综述蔡郑东审校
肿瘤的
摘要近年来,随着亚细胞分离技术,蛋白质质谱分析技术,生物信息学技术的发展和成
熟,人们逐渐认识到血液与肿瘤组织之间的天然屏障——血管内皮细胞膜表面蛋白的表达具有
高度的组织特异性.越来越多的实验表明,这种肿瘤组织特异性蛋白有望成为肿瘤治疗的有效
分子地址.
关键词肿瘤;内皮,血管;蛋白质类
中图分类号R730.5文献标识码A文章编号1000—8225(2005)05—0339—04
肿瘤的靶向治疗是肿瘤治疗基础研究领域中的
一
大热点.人们一直热衷于找到特定肿瘤的分子地
址(molecularaddress),即肿瘤的特异性靶点(specif-
ictarget),以期通过血液途径使抗肿瘤效应物(药
物,抗体,放射性核素及细胞因子等)在肿瘤部位特
异性浓集,从而提高抗肿瘤效率,并减少化疗药物所
带来的全身毒性反应.近些年来,随着亚细胞分离
技术,蛋白质质谱分析技术,生物信息学技术的发展
和成熟,人们对包括肿瘤组织在内的各种组织内皮
室
作者单位:200433上海,第二军医大学附属长海医院外科教研
细胞进行了更深一步的研究?0J.对于内皮细胞的
结构特点,正常及肿瘤组织内皮细胞表面蛋白表达
特异性有了更加深入的理解与认识.大量的研究表
明,肿瘤血管内皮特异性分子标记完全有可能成为
l临床上肿瘤显影与治疗的真正分子地址.
1内皮细胞结构特点及其相关功能
内皮细胞是以稀薄的单层排列形式存在于组织
与血液之间的.作为组织与血液的交界结构,内皮
细胞在组织与血液间物质交换,信号转导等方面发
挥重要作用.内皮细胞膜表面由两个重要的结构一
功能域构成:?构成细胞膜主体平滑的质膜部分;?
caveolae功能域.作为内皮细胞表面的一种特殊结
国外医学肿瘤学分册2005年5月第32卷第5期
ForeignMedSciOncolSect,May2005.Vo1.32.No.5
构,caveolae业已被实验证实与肿瘤细胞的增殖,凋
亡,血管形成,转移等有密切关系.
caveolae(原意为”小洞穴”)是分布在细胞膜表
面的一种直径50,100nm形似烧瓶(或Q形)的内
陷结构.与其他细胞膜表面的内陷结构(如包涵素
包被小囊)不同的是,在电镜下它的囊壁看起来是
平整光滑的,并且在靠胞质面,有细条纹样衣被结构
(striatedcoatings).这种衣被结构是由两种caveo.
1ae衣被蛋白——caveolinl和caveolin2构成.
caveolae广泛存在于大多数正常器官和实体肿瘤
中,特别是脂肪细胞,心肌细胞和一些连续的内皮和
上皮细胞膜表面.作为细胞膜上一种特殊的微结
构-功能域,caveolae的分子构成与大部分细胞膜结
构不同.caveolae中有大量的信号分子聚集,如以
三体形式存在的G蛋白J,非受体型酪氨酸激酶,
血小板源性生长因子受体(PGFR)及内皮一氧化氮
合成酶(eNOS)等.这些信号分子很多都与胞质面
的caveolinl衣被蛋白相互作用,并产生生物学效
应,比如介导物质的机械转运或介导配体-受体信号
转导.事实上,caveolae可以看作是细胞膜上物质
运输与信号转导的中心.它通过内陷这种扩大细胞
膜表面积的方式有效地将大量信号分子集中于其表
面,使信号分子间的相互作用由于临近的空间关系
变得更加高效.通过caveolae,大量胞外信号被特
异性地传导到胞内.
caveolae在介导细胞内吞和胞吞转运的作用已
被证实.与细胞膜表面另一种介导细胞内吞作用的
结构包涵素包被囊泡类似.caveolae也可经胞外选
择性配体.受体的相互作用,通过一些分子元件(如
dynamin,NSF,SNAP,VAMP2等),以出芽,锚定,融
合方式特异性内吞并转运胞外物质.在血管内皮细
胞中,caveolae介导的胞吞转运作用倍受瞩目.因
为在介导胞吞转运过程中,caveolae充当了血液与
组织间隙物质运输的桥梁,克服了内皮细胞与血液
间的天然屏障.有实验证实,caveolae可有效将
血源性大分子物质通过内皮细胞转运到组织问质.
同时,在不同组织内皮细胞caveolae结构域上可能
存在组织特异性受体蛋白,通过特异性结合血液中
的特定载体蛋白满足特定组织的营养需求.MCIn-
tosh等研究证实,在肺组织中血管内皮caveolae
上的确存在这种组织特异性蛋白受体.MCIntosh利
用亚细胞结构分离技术和抗体制备技术成功制备出
一
种特异性结合鼠肺血管内皮细胞caveolae的单克
隆抗体TX3.833.通过与对照抗体的比较,发现
Tx3.833静脉注射后,可以特异性结合到鼠肺血管
内皮细胞caveolae上,并在数分钟内迅速通过其胞
吞转运作用将偶合了金颗粒的TX3.833抗体转运
至肺组织间隙.通过实验,得出下列结论:?特定组
织内皮细胞膜及其caveolae包含有组织特异性蛋白
表达.@)caveolae可以通过介导的胞吞转运作用有
效克服内皮屏障作用,将效应物通过血液途径运输
至特定组织间隙.?将特定组织血管内皮细胞膜及
其caveolae结构域上的特异蛋白质作为靶点,有望
克服以往难以逾越的内皮细胞屏障,有可能对肿瘤
的靶向药物,基因治疗产生深远的影响.
已经有很多实验证据表明,caveolae与肿瘤细
胞的存活,肿瘤新生血管形成和转移有关J.作为
caveolae重要组成结构的caveolinl(以下简称
CAV1)衣被蛋白,最初就是作为病毒SRC蛋白(v-
SRC)的底物在Rous肉瘤病毒转化细胞中发现的.
在一些体外实验中发现,CAV1可以调控细胞生长
并能抑制细胞的恶性转化,甚至有人藉此提出
CAV1可能是一个抑癌基因J.但更多的体内实验
证据并不支持这种假设,3个种系独立的CAV1
基因敲除小鼠与对照组小鼠相比,并没有明显的
肿瘤易患倾向;在一些体内实验中,CAV1在多种
实体肿瘤中被证明是高表达,而且CAV1高表达甚
至与肿瘤细胞的侵袭性,高转移倾向及凋亡抑制
有关;一些体内研究表明CAV!高表达及caveolae
分布密度增高与肿瘤的多药耐药以及对于化疗敏
感度下降有关.体内外实验结果的差异实际上反
映了肿瘤生长发展的阶段性特点,在肿瘤生长增
殖的早期阶段(类似于体外环境),CAV1的下调可
以促进肿瘤细胞的增殖和快速生长;在肿瘤生长
到一定阶段后,面对更加恶劣的生存环境,可能需
要CAV1的上调以使其度过难关.体内环境对
于肿瘤细胞具有类似于进化的选择作用.在这种
选择作用下,那些具有高转移,高侵袭特性的肿瘤
细胞得以生存.
caveolae和CAV1与肿瘤相关.可以发展直接
以CAV1或其他caveolae组分为靶点的定向治疗方
式.通过这种治疗就可以抑制肿瘤的侵袭,并恢复
肿瘤细胞对化疗药物的敏感性.而且,CAV1还可
以作为肿瘤进展的标志物,如检测到CAV1微量表
达预示肿瘤尚处于早期高度增殖阶段,但还未发生
转移;检测到高水平的CAV1则表示肿瘤已处于高
度进展期或濒临进展期,需要更有效的治疗H.
caveolae除了与肿瘤发生,进展,多药耐药等有
国外医学肿瘤学分册2005年5月第32卷第5期
ForeignMedSciOncolSect.May2005,Vo1.32,No.5
关外,还与肿瘤新生血管形成有关.有研究发现,
caveolae至少可以在以下两个方面调节肿瘤新生血
管形成J:?通过CAV1对caveolae上的内皮一氧化
氮合成酶的抑制作用调节肿瘤新生血管形成;?通过
caveolae及CAV1对前列腺素l2的调节作用间接调
节肿瘤血管形成.实验证明,CAV1的表达情况与组
织血管的成熟情况相关,即CAV1的表达水平高则血
管内皮细胞较成熟,反之亦然.这都表明,caveolae
和CAV1与肿瘤新生血管生成及成熟等密切相关,深
入研究它们之间的相互关系,对了解肿瘤血管特性,
并进而研究针对性的治疗措施意义重大.
2组织血管内皮细胞蛋白表达特异性
从粗略的形态角度,内皮细胞就可分成连续,有
孔,不连续3种形态.另外尚可根据一些诸如细胞
大小,形状,浆膜囊泡数量,内皮细胞间连接结构类
型等的微小结构特征区分内皮细胞形态上的多样
性.生理学方面的研究同样发现内皮细胞在不同血
管床背景甚至在同一血管床的不同节段背景下,介
导的生理反应具有多样性特征J.因此,尽管内
皮细胞具有相同的胚胎来源,类似的组织学外观和
主要生理功能,但它们应看作是依具体解剖分布部
位而异的多样性的细胞群体.从最早通过带电示踪
物和凝集素对内皮细胞腔面细胞膜的初步研究,到
通过结合运用原位放射性碘示踪技术和凝集素亲和
技术研究内皮表面糖蛋白的组织特异性,人们逐渐
认识到内皮细胞表面蛋白组成不但具有多样特征,
而且还具有组织器官特异性.
Ghitescu等?运用亚细胞分离技术和蛋白质组
学分析技术发现心,肺,脑等组织内皮细胞表面蛋白
表达差异明显;Jacobson等则利用纯化的大鼠肺组
织内皮细胞膜作为免疫原,获得了高亲和性高组织
特异性的单抗;Schnitzer等通过结合运用上述技术
和单克隆抗体技术找到了一种特异性结合肺内皮
caveolae的抗体TX3.833.
3最新研究
Oh等在Nature杂志上首次报道了综合运用
蛋白质组学,生物信息学和分子显影技术的研究方
法.他们运用这种方法筛选并鉴定了大鼠肺组织及
肺癌组织血管内皮细胞管腔面细胞膜上表达的组织
特异性蛋白质.更重要的是,第一次证明了这些蛋
白质可以作为肿瘤造影以及治疗的有效靶蛋白.
在研究中,Oh等…采用亚细胞分离技术和二维
电泳纯化并分析论证了大鼠脑,心,肺,肝,肾等器官内
皮表面蛋白表达的显着差异.采用?肖减蛋白质组学方
法分析比较活体与体外培养肺组织内皮细胞蛋白表达
差异,并找到37个显着差异蛋白,他们又利用数据库
进行蛋白质结构分析,挑选出其中最可能具有胞外结
构域的11个蛋白.接着Oh等将放射性标记的特异
性抗体——抗APP蛋白(APP蛋白是11个差异蛋白
之一)由血液途径注入大鼠体内,结果发现几乎全部抗
体迅速,特异结合到肺组织.Oh等用同样的方法又筛
选并鉴定了大鼠肺癌内皮细胞特异性靶蛋白—an.
nexinA1,发现annexinA1在多种人类实体肿瘤(前列
腺癌,肝癌,乳腺癌,肺癌)的新生血管内皮细胞上都可
以检测到,而在正常组织器官内皮几乎没有表达.在
大鼠中,用抗annexinA1的放射性标记抗体可以显着
延长荷瘤大鼠的生存期并使肿瘤消退.
4应用前景
传统意义上的抗肿瘤新生血管治疗,目的在于
用各种方法抑制肿瘤新生血管的形成.而肿瘤的内
皮细胞.caveolae靶向治疗则着眼于直接通过抗体
特异性结合肿瘤内皮细胞表面的靶蛋白,使效应物
(化疗药物,放射性核素,细胞因子,造影剂等)迅速
在肿瘤局部浓集,选择性地破坏肿瘤赖以生存的供
养血管.此外,还可通过caveolae的胞吞转运作用
将效应剂运送到肿瘤组织间隙发挥生物学效应,有
着巨大的临床应用前景.
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(收稿13期:2004—11—12修回13期:2004—12—20)
多功能蛋白BAG一1与肿瘤的相关性研究
李莉朱娟综述肖菊香审校
摘要BAG一1蛋白属于共分子伴侣家族成员,它是多功能蛋白,可与多种靶分子相互作用,
参与肿瘤相关性细胞内生化过程.现综述近年来BAG一1蛋白与肿瘤的相关性研究.
关键词蛋白质类;肿瘤;信号传递;脱噬作用
中图分类号R730.231文献标识码A文章编号1000—8225(2005)05—0342—03
1BAG-1蛋白的结构与功能
人的BAG-1基因位于9p12号染色体,由BAG.1
mRNA的不同起始密码开始翻译可得到4种BAG.1
蛋白亚型,即P5{】(BAG-1L),P46(BAG-1M),P
(BAG.1S)和P..BAG-1蛋白在结构上有BAG区
域,核定位信号,泛素样区域和TR(或Q)SEEX重
复区域.BAG区域位于BAG-1蛋白的羧基末端,包
括110,124个氨基酸,由3个反平行的a螺旋构
成.其中13..和13.是与RAF-1相互作用的部位,Q
和Q,是与热休克蛋白70(Hsp70)相互作用的部
位?.BAG-1蛋白的核定位信号(nuclearlocaliza—
tionsignals,NLS)分为单组分NLS和两组分NLS.
BAG-1L的氨基末端有一个单组分NLS,这决定了
它的细胞核定位.所有BAG一1亚型的羧基末端均
有一个两组分NLS.BAG-1M和BAG一1S在一些细
胞型或当细胞处于应激状态时也可以定位于细胞
核,这可能与两组分NLS或其他蛋白的转运功能有
关.BAG一1氨基末端的泛素样区域是BAG一1蛋白
与26s蛋白小体相互作用的部位.BAG-1各亚型的
氨基末端还有数目不等的TR(或Q)SEEX重复区
域,其功能不明.
BAG一1是多功能蛋白,可以和Hsp70,RAF-1,
Bc1.2,核激素受体等多种靶分子相互作用,调节细
胞的生长与存活.BAG.1参与调节的途径在肿瘤
的发生和进展过程中起重要作用,并且决定了肿瘤
对治疗的反应.肿瘤细胞中BAG.1表达与其临床
意义方面的研究已成为目前的研究热点之一.
,
作者单位:710061西安交通大学第一附属医院肿瘤内科
2BAG-1与肿瘤
2.1BAG一1的亚细胞分布与肿瘤
BAG一1高表达于白血病,乳腺癌,前列腺癌和
卵巢癌等多种肿瘤细胞中,提示BAG.1与多种肿瘤
的发生,进展有关J.在转基因动物实验模型中也
发现,BAG-1的过表达可以促进肿瘤的形成.
BAG-1各亚型的亚细胞分布不同.对人乳腺癌
MCF7细胞株研究发现,BAG一1L主要位于细胞核,
BAG-1S主要分布在细胞质,BAG一1M在细胞质和细
胞核中都存在.类似的分布在人前列腺癌267细胞
株和HeLa细胞株中同样可以观察到.在胃癌
MKN74细胞株中,过表达的BAG-1位于细胞角蛋
白和肌动蛋白丝,集中于膜皱襞部位,这可能与
BAG一1蛋白在该系统中增加细胞的迁移性有关.
因此尽管BAG一1S主要分布在细胞质而BAG-1L主
要位于细胞核,但这并不是绝对的.BAG-1的亚细
胞分布是可以调节的.在放疗中的大肠癌细胞,
BAG.1从细胞核移向细胞质,说明BAG-1定位可以
受能量调节.在细胞分化过程中以及过度表达的
BAG.1的不同作用分子也可以使BAG-1的亚细胞
分布发生改变.
一
般认为BAG一1在肿瘤细胞中的过表达与其
临床结果相关,但是过表达的BAG一1的亚细胞分布
与肿瘤预后之间的关系还有争议.一些研究认为肿
瘤胞质中BAG一1的过表达降低了肿瘤患者死亡危
险性,并可以作为临床良好预后指标,但Xie
等研究表明,胞质中BAG一1过表达的舌鳞状细胞
癌患者则生存期缩短.大多数试验表明,肿瘤细胞
核中BAG.1的过表达与临床不良预后相关娟,但
范文三：01聚乙二醇表面改性抑制蛋白质非特异性吸附
第4l卷 2013年3月
分析化学(FENXI HUAXUE)评述与进展
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第3期 445~453 DOI:10.3724/SP.J.1096.2013.20582聚乙二醇表面改性抑制蛋白质非特异性吸附
肖锡峰 江小群 周雷激+
(厦门大学化学化工学院化学系,厦门361005)
摘要聚乙二醇作为一种具有特殊亲水性和电中性的聚合物,被公认为抑制非特异性吸附的重要物质基 础。本文综述了近年来利用聚乙二醇对各种用途的基质进行表面改性地研究,包括聚乙二醇本身的结构特 点、聚乙二醇抵抗吸附的理论解释、在疏水性表面引入聚乙二醇改性的各种策略,并展望了其发展前景。
关键词非特异性吸附;聚乙二醇;表面改性;综述
1引 言
蛋白质的非特异性吸附是一种自然发生的现象,从本质上讲,非特异性吸附是有动力学和热力学共 同控制的复杂过程[1叫]。受到蛋白质变性与结构变化的影响,大部分非特异性吸附都是不可逆过程吲,这也 是这种吸附产生诸多不利影响的根源。非特异性吸附的存在会造成很多问题[6,”。在免疫检测时,非特异 性吸附会使背景增加,而活性位点可能被非特异性吸附的蛋白占据,导致灵敏性降低【8],诸如假阳性、高背 景、低相对强度等情况就会层出不穷。所以,避免非特异性吸附是免疫研究中的一个重要课题【9】。
疏水相互作用和静电场被认为是非特异性吸附的两大起因【10’11】,因此控制疏水相互作用和静电场 作用是抵抗非特异性吸附的物质所应该具有的性质“21。通过合成化学、仿生学和生物化学等途径,研究 者获得了这种物质的具体实例,它们同时具有亲水性和疏水性,并且大多具有较好的生物相容性[1n”】。 这类物质包括以壳聚糖为代表的多糖[1¨18】、聚丙烯酰胺、磷脂层[191,以及聚乙二醇衍生物、甜菜碱衍生 物凹1等。其中,聚乙二醇([CH2CH:O】。,Polyethylene glycol,PEG)脱颖而出,逐渐成为增加基质表面亲 水性和抵抗非特异性吸附的中心物质。本文综述了聚乙二醇的结构特点、对其作用的理论解释与各种 应用策略,并展望了其发展前景。
2聚乙二醇的结构与特点
聚乙二醇是一种由环氧乙烷开环聚合形成的直链或枝状聚醚。由于它的结构与乙二醇缩聚的产物 相同,故而通常称为聚乙二醇(PEG)。PEG虽然是一种大分子聚合物,但是由于具有特殊的线性原子 排列,从而具有其它同系物所没有的一些性质【2l】。它最重要的性质就是强极化性质以及由此带来的亲 水性与水溶性。如果用PEG与结构相似的聚合物进行比较,聚环氧丙烷(Poly propylene glycol,PPG, [C,H,O】。)比PEG在每个链节多了一个亚甲基,可是所带来的影响则是晶体结构和亲疏水性上的巨大 差异;而均聚甲醛(Poly oxy methylene,POM,[CH:O]。)在每个链节比PEG少一个亚甲基,就又变成了 一种高结晶度的树脂聚合物口2】。以上的对比或许能直观地体现出PEG的强极化性质在与其结构相似 的聚合物进行比较时的特殊性。
PEG的亲水性被认为是其具有抵抗非特异性吸附能力的重要原因【23]。既然非特异性吸附是由于 疏水基团相互靠拢而发生的,那么在蛋白质与疏水性基质之间加入一种亲水性的物质,就可以在两者之 间同时产生排斥作用,从而控制非特异性吸附的产生。而PEG正是符合亲水性要求的物质【24】。同时, PEG在广泛pH范围内均为电中性,这种性质可以阻断基质与蛋白质之间的静电场相互作用。对于带 有电荷的基质表面,PEG可以同时将产生非特异性吸附的两种方式阻断,以达到抵抗吸附的作用。而
2012-06-05收稿;2012—10-20接受
本文系国家自然科学基金(No.20835005)、教育部高校博士点基金(No.20070384023)和国家基础科学人才培养基金(No.J1210014) 资助
+E—mail:Ijzhou@xmu.edu.ca
446
分析化学 第41卷 且作为一种长链聚合物,PEG可以提供较大的空间位阻,有利于将产生非特异性吸附的物质阻隔在距 离基质表面较远的位置,进一步控制非特异性吸附的发生㈣。此外,PEG还是一种几乎无毒性的物质, 已经广泛应用于对蛋白质和多肽药物的修饰㈨和药物体内传送吲;它在通常的应用中不会发生自身分 解,稳定性较强吲;不同聚合度的PEG均已经实现工业生产,成本低且选择余地大。以上诸多优势使得 PEG成为公认的构建生物相容性表面的物质基础。
3从理论上解释PEG的作用
PEG特殊的性质很早就引起了化学家的研究兴趣。很多人试图从理论上解释PEG的结构与特殊 性质之间的内在联系∞。51。研究者对PEG的理论研究主要关注PEG在接近发生吸附的界面附近的能 量、构象和静电场等性质,以及当周边条件变化时这些性质的变化情况。
Begum等∞1通过红外光谱分析,描述了短链PEG分子在水中的构象特点。他们认为,由于条件不 同,PEG的刚性构象与柔性构象之间的比例会发生变化。对于c—c键,随着水分子碎片数目的增加 (也就是浓度的降低),刚性构象形成的几率会明显增加,而羟基末端基团的存在会限制刚性构象的形 成。C—C键的构象变化规律为PEG分子与水之间形成的不同种类的氢键提供了依据,体现了PEG 与水形成结合物的过程中,氢键和结构匹配在不同层面上的协同作用。
Wang等【301通过量子力学从头算计算方法,对水分子与PEG之间的相互作用进行了详细研究,并试 图确定水分子团簇的稳定性与密度分布随PEG分子构象变化的函数关系。他们发现PEG只有在一定 的构象下可以表现出亲水性,而此时水分子与其的吸引作用是由静电力驱动的。螺旋态的PEG分子可以 为水分子提供成核作用所需的模板,而直线型的PEG分子无法起到稳定水分子的作用。这一观点也被之 后的实验证明,比如当PEG修饰的硫醇在银表面形成自组装单分子层(SAM)时,由于银表面的晶格相对 密集,致使PEG在其表面伸展时只得选择全反式构象以降低能量,而这种构象的PEG对蛋白质是有强 吸附作用的。
He等pu利用分子模拟手段寻找经过PEG改性的表面对蛋白质的强排阻作用的来源。结果表明, 这种排阻力来自处于PEG与蛋白质之间的界面水分子。进一步的研究证明,界面水分子的偶极分布受 到了PEG末端的强烈影响,并且这层水分子稳定性强,保持时间长,重定向的几率也较低。这一结果证 明PEG与蛋白质之间的水化层在PEG抵抗非特异性吸附的作用发挥上扮演了关键性的角色。
wu等9那利用低场核磁技术研究水分子与PEG链之间的相互结合关系。他们将近场核磁数据与热 分析数据结合分析,建立了水分子与PEG链之间的作用模型。他们指出,水分子与PEG链之间的作用 可以分为三个阶段:当水分子数量远小于PEG链结合位点的数量时,大部分水分子紧密地靠在PEG链 的结合位点周围,很少有自由水分子出现;随着水含量上升,水分子的量逐渐接近PEG链结合位点的数 量,此时PEG链周围形成了完整的水化层,而链本身也具有了一定的柔性;当水含量超过PEG链结合 位点的数量之后,多余的水分子开始对PEG链产生溶胀作用,导致PEG水溶液形成。
4表面PEG固定化的代表性策略
PEG在抵抗非特异性吸附方面具有很多长处。但是,由于大部分基质是疏水性的,PEG与这些基 质的结合能力很差,所以PEG的直接物理吸附效率很低。直接在基质表面进行PEG聚合也被证明不 是一种好的方法【36】。研究者为了解决PEG与基质的结合问题,提出了很多种表面改性的方法。对这些 方法进行归纳,主要有以下3种具有代表性的策略类型。
4.1间接吸附
借助吸附作用实现PEG表面改性是最传统的改性策略。其优点在于操作简单,控制条件较少,实 验门槛比较低。而且,这种方法具有很强的灵活性,研究者可以通过结构设计增强PEG与基质的结合 强度,以及控制改性之后的基质抵抗吸附的能力。Shim等旧7。在单壁碳纳米管上先用利用链霉亲和素/生物素体系考察了蛋白质的非特异性吸附行为,通过表面活性剂与PEG共吸附作用构建的功能化单壁 碳纳米管可以有效地抵抗链霉亲和素的非特异性吸附,结合生物素化与抗蛋白质吸附的聚合物修饰的
第3期 肖锡峰等:聚乙二醇表面改性抑制蛋白质非特异性吸附 447功能化纳米管则可以特异性地结合上链霉亲和素。
更常见的间接吸附策略首先对PEG分子本身进行改造,使得其具有疏水性基团或静电吸附基团, 然后再进行物理吸附∞副或静电吸附∞9l。首先实现实用化与商品化的工作是商品名为Plumnic@的三嵌 段聚合物㈣’41|。这种嵌段聚合物提供了标准的PEG改造方案,聚环氧丙烷(PPG)由于其良好的性能和 较强的疏水性成为改造试剂,共聚后形成的聚合物可用于多种基质,特别是类似于聚苯乙烯之类的惰性 表面的改性‘训。
随后的一些工作借鉴了Pluronic@的AB(A)嵌段聚合结构。Sung等Ⅲ1利用自由基聚合手段,将带 有烷基(或芳环)、PEG、羧基末端的乙烯基类单体聚合成为嵌段聚合物,然后利用这个聚合物对聚苯乙 烯板表面进行物理吸附。嵌段聚合物的3种单体分别具有各自独立的功能:烷基(芳环)末端单体提供 进行物理吸附的位置;PEG抵抗蛋白质吸附;羧基末端作为活性位点,可以继续外接抗体等生物活性 物。根据不同的基质,提供吸附作用的单体还可以更换,提高了这一策略的普适性。Kuhlman等‘4-51使 用了甲基丙烯酸类单体进行聚合,首先合成的单体是带有PEG支链的甲基丙烯酸酯,随后的合成过程 是新单体与甲基丙烯酸的共聚合。甲
a b c 基丙烯酸上的甲基被用在物理吸附当
.叽以. . . 中,而PEG支链不仅抵抗蛋白质吸附, ’\、■々由曲-—’心曲即 黧量言淼鬻馘继 I 一≮袈一≮戛 续进行蛋白固定化反应(图)o这--II土pt、1’工p、11作的突出特点是合成的聚合物被用在
_厢 册7777777隔 册册聊7777777翮 了液相体系中进行物理吸附,在流动性
图I表面制备示意图。表面被PMPI活化的PMMA‘g。PEO旋转涂 强的体系中仍能保持吸附状态,吸附强
覆(a),浸入多肽溶液(b),制备载有多肽的表面(c)Ⅲ1度可以认为是有保证的。
ng?1№he眦ncluu8砸non ot 8urtace preparanon?sudac。8are
8Pm 在静电吸附方面代表性的两种物
cast from p-maleimidophenylisocyana‘e(PMPl)。ac。iV砒ed p01Y(me‘hYl
质是聚赖氨酸一聚乙二醇嵌段聚合物 me山?。ryk引.{PM鼍A.)_g::。?吼hyleni 0xid:‘PEoj,‘i’an叭hen。ex。 (PLL。g‘PEG)与多巴(L-DOPA)衍生化
;c)….:二vIight 2007
Am‘eri。an:h。IⅡi。al soci:tj 。 的PEG分子。聚赖氨酸本身由于其富 一。 有正电荷的结构特点,可以在富有负电荷的表面发生吸附作用,因此已经广泛用于静电吸附表面改性。 而PLL.g—PEG则可以在包括细胞学研究H 5I、微流控
通道L46J、生物芯片构建M刊等方面用于抵抗吸附。尤
其是在金属氧化物表面,PLL-g—PEG可以获得极高的
吸附量,从而把非特异性吸附降低99%以上
(图2)㈣J。多巴衍生物的提出是仿生学在抵抗吸附
应用方面的成功范例,研究者从软体动物河蚌的强
附着力出发,通过分析其足部表面组织组成发现了
多巴胺分子的强吸附能力H 9I。它最大的特点是对于
常见表面都能有很强的吸附能力。因此,很快就有
人将其与PEG结合用于抵抗蛋白吸附∞钊并进一步
用于构建生物芯片峥“。 与普通吸附相同,间接吸附也面临吸附强度不
足的问题。在某些较为剧烈的情形下,PEG可能会
脱离基质表面
附能力,这种方法还是很好的表面改性策略。
4.2表面接枝 Act 《B ---_--_-_-----Negatively charged stirface 图2PLL?g一[(PEGm)l-x(PEG—site)x]聚合物在金属
氧化物表面的结合与界面构建[蚰】 Fig.2Schematic organization of the poly-l-lysine (PLL).g.[(PEGm)l—x(PEG—site)x]interface
011metal oxide surface[“]Copyright 2001
The National Academy of Science8
这种策略的重要前提是基质表面和PEG末端都具有反应活性。至于接枝反应本身的具体原理并 C
'=C 』 ㈣咖郾 阼 儿
448分析化学 第4l卷
没有限制,但是一般来说这些反应应该易于在温和条件下顺利进行,并且具有相对较高的产率。从宏观 上讲,接枝反应的特点在于它的反应物之一是已经成型的长链或枝状分子,反应的结果则是这个大分子 与基质以某种化学键相连【5引。表面接枝的举例事实上就是指出有哪些反应类型可以作为接枝反应进 行应用,而对于不同的基质,所采用的反应类型也各有特点。
对于二氧化硅和其它表面富氧原子的基质而言,硅烷化是非常合适的表面改性方法口4|。高强度的 硅氧键可以使接枝物牢固地连接在基质上,而且即使在很强烈的环境中硅氧键也不易断开。如果将硅 烷化和PEG结合起来,需要合成一段接有硅烷化试剂的PEG分子,这一步常是实验中的难点。 Sharma等【5纠通过XPS与AFM等分析手段,对硅烷化PEG在硅片基质生物传感器上的抵抗吸附能力进 行了研究与评价。他们指出这种方法可以为微纳尺度的生物传感器制备提供稳定有效的抵抗吸附处理 方法,而且反应的可控能力也有利于研究者控制表面PEG的密度,从而调节生物传感器的检测能力。 He等H刮利用末端带有异氰酸酯的硅烷化试剂与普通PEG进行反应,合成了由酰胺键连接的硅烷化 PEG,并将其用于多孑L硅球进行表面改性,在抑制非特异性吸附方面取得了良好的效果(图3)。
H如hr
PEGxk TESPIC (州,6,10,12)
国 Pyridine,Ar70℃
扣。k一 。_又卜嗥H㈣
图3硅烷化的PEG对多孔硅球的表面接枝处理∞副
Fig.3Surface grafting of PEG—silane on porous silicon particles.Reprinted from Biomaterials,
31/6,He Q.et al,The effect of PEGylation of mesoporous silica nanopartieles on nonspecific bind—
ing of senlm proteins and cellular responses,Copyright(2010),with permission from Elsevier
MSNs:Mesoporous silica nanoparticles.
自组装单分子层(SAM)也是一种常用的表面接枝方式。SAM绝大部分是用在了金表面,这也是 SAM在构建电化学检测器过程中的经典应用方式。而且所用的硫醇并不一定带有PEG,PEG(更多的 时候是寡乙二醇OEG,重复链节数只有4~8个)是在硫醇固定在金表面之后再与硫醇的另一端进行反 应∞卜59J。由于SAM反应的定量性质很好,很多时候这种反应被拿来做有关PEG抑制吸附效果的研 究㈣J。当然SAM也可以像硅烷化一样,合成硫醇化的PEG进行应用。Herrwheth等[6¨采用4步反应 合成了硫醇化的PEG,并利用PEG直接将基质金膜改性为羧基表面,然后继续使用。借助SAM体系, 一些其它的反应机理也可以更直接地用于PEG的固定化。例如,在蛋白质和多肽合成研究中被广泛应 用的自然化学连接方法(Native chemical ligation)也被研究者应用为表面接枝途径。Kolb等∞纠采用这 种方法,在经过磷酸取代物SAM处理的钛氧化物表面进行PEG的固定化,并验证了经过接枝改性的表 面对细胞吸附的抵抗作用。
点击化学(Click chemistry)从提出至今还不到20年,却已经是一种具有广阔发展前景和应用范围 的反应类型M 3|。点击化学的最大特点和优势在于此种反应的温和可控的反应条件,以及极高的产率。 它的弱点在于所用的特征试剂或基团难以制备,即为了达到主反应易于成立的目的,需要相当繁琐的前 期合成准备旧J。点击化学应用于PEG体系已有相关文献报道。Gacal等1651利用蒽和马来酰亚胺之间的 点击化学反应,将蒽与聚苯乙烯微粒连接,马来酰亚胺与PEG连接,达到了将PEG连接到聚苯乙烯本体 上的目标。Ostaci等惭。则利用端炔基与叠氮酸盐之间的点击化学反应,将PEG连在二氧化硅表面。 表面接枝策略的优点在于接枝反应的强度较大,适于制备可长期使用的产品,而且被接上的大分子 可以随意选择或合成,故而经过改性的表面性能也可以预先设计好。它受限制的地方仍然是在于基质
第3期 肖锡峰等:聚乙二醇表面改性抑制蛋白质非特异性吸附 449表面,因为接枝的效果更多受到基质表面活性点的位置和密度的限制,在活性点密度较低的前提下,很 难保证表面接枝的密度达到某些要求∞7|。研究者希望通过寻找更具有强度或者更易于操作的结合方 式提高表面接枝反应的效率,但这种过程往往又会在合成相关物质的过程中遇到较大的阻力。
4.3表面聚合
与表面接枝策略相对,这种策略从宏观上看可以理解为将用于表面改性的大分子从基质表面生长 出来,而反应物之一则是用于聚合生成大分子的单体。这种策略所使用的聚合反应主要是表面引发的 自由基聚合,因此在基质表面生成自由基是这种策略的重要环节。具有代表性的几种机理表面自由基 生成方法包括臭氧处理、等离子体处理和紫外光处理等。但最简便的原理是原子转移自由基聚合(AT— RP)∞8|,这种聚合利用过渡金属的卤化物提供自由基的特点使得在平面上进行聚合反应成为了非常方 便的过程,因此得到了广泛应用∞扎72o。
Ma等
I Initiator ’Polyt(OEGMA)
●Protein
CuBr/Bipy ——-言OBvleO I -I l H2H ^● ^
l 、I 、I 、I
Substrate
Si.^=ntP time
Flow protein —’ o.O
◇
I I.■L^J, 图4OEGMA的表面聚合及其迸一步生物应用‘7川
Fig.4Surface polymerization and further bioapplication of OEGMA[73].Copyright 2006A.
merican Chemical Society
Kizhakkedathu等【3刚构建了带有寡乙二醇基团的聚丙烯酸表面。他们并没有使用预先合成好的寡 乙二醇丙烯酸单体,而是先使用单独的丙烯酸在表面进行聚合,同时合成了带有烯丙基的PEG,然后使 烯丙基与聚丙烯酸中残留的双键进行对接,从而令PEG以支链的形式连接到聚丙烯酸主链上。这样做 可以增加整个聚合产物的表面积,有利于增强表面改性效果。
除了ATRP之外,还有几种自由基聚合机理应用在表面聚合中。Harbers等
蓄 溢 溢
450分析化学 第41卷
薏r申su◇lfo-SMCC{)
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麓。b茹能……一,
图5连续两步光引发表面聚合构建交联的聚合物网络l 75J
Fig.5Two successive steps of light-initiated surface polymerization for the construction of interpen-
etrating polymer networks[75].Copyright 2005American Chemical Society.
另一种机理是等离子体诱导表面聚合。这种机理的实现需要表面前处理,使表面出现自由基 (H:等离子体处理)或过氧基(O:等离子体处理或臭氧处理)才能继续聚合反应。Chang等[J761在对聚 四氟乙烯膜的改性过程中,利用H:等离子体处理使表面带有自由基,再以PEGMA为单体,在水中直接 热引发表面聚合过程。Wen等
0H 0PMMA o:P1。。。a
——————+√二I?刍一纠皇 Peroxides /O.--O. UV induced graft
copolymefizafion
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‘’ 。1、:I_、■,’_.———二一,’ o曩o ?1
’■叠誓‘|■皇每口皇毒■匕■誓出 biotin derivative
19LL_。g—PEG。l
图6表面聚合与静电吸附结合实现PEG固定化及其后续应用Ⅲ’
Fig.6Combination of Surface polymerization and electrostatic attraction in PEGylation and fur-
ther application.Reprinted from Journal of Immunological Methods,350/1—2,Wen.et al,Specif-
ic antibody immobilization with biotin-poly r￡-lysine)-g-poly(ethylene glyc01)and protein A Oil
microfluidic chipsM.Copyright(2009),with permission from Elsevier
可逆加成一断裂链转移聚合(RAFT)同ATRP一样,也是属于活性/可控自由基聚合(CRP)。Wang 等
不论采取何种引发原理,表面聚合策略可以提供很高的表面接枝密度,从而将基质表面尽可能地封 闭,因此,可以达到很好的改性效果。另外这种策略的自由度很大,通过选择不同的聚合单体,可以构建不 }
O 0毒 +
O 孓‰ +憋
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第3期 肖锡峰等:聚乙二醇表面改性抑制蛋白质非特异性吸附 45l
同性能和结构的表面邴】。不过这种策略
操作相对复杂,需要精细的操作和条件
控制,而且在聚合完成之后,基质的表面
形态相当于重新构建,很难得到像原来
基质那样的规整表面,对于某些应用场
合可能会有影响。
5结论与展望
聚乙二醇的结构特点使它成为研 究者公认的构建生物相容性表面的物 质基础。为了解决其在应用过程中与 疏水性基质表面结合难度大的问题,研 究者对基质表面进行改性处理,逐步形 成了几种各具特色的改性策略。本文 总结了最近几年聚乙二醇在构建抵抗 非特异性吸附和生物相容性表面等方
CH,-CH-.cHJ
_scHr一◎ 唧湘哪PN础IPA邢A-M譬NPsH忡H挚L,◎
一 6(cH2cH20壮I
P(PEGMA)??B--PNIPAA?-MNPs
图7借助RAFT在磁性粒子表面进行PNIPAA和PEGMA共聚合 的示意图川
Fig.7The processes of surface-induced reversible addition—fragmenta-tion chain.transfer(RAFT)polymerization on I'V[NPsml.Copyright (2011),with permission丘Dm Elsevier.
面所取得的进展。随着新的反应机理出现并应用于PEG相关的合成过程,PEG表面改性的强度与规整 度一直在不断改进和完善的过程中,具有很大的发展潜力。目前,研究者仍在继续努力寻找新的PEG 表面改性机理,以提高聚乙二醇与基质之间的结合强度;另一方面,现有的表面改性策略仍然存在结 合强度与实验合成易用性和实用性不能兼得的矛盾,这两方面将仍然是富有挑战性的研究课题。此外, 跨领域研究也是研究者关注的重点。例如从生理学和仿生学出发的思路指出,某些体内物质的衍生物 是不能与蛋白质产生相互作用的,对于这类物质的研究也将成为PEG表面改性重要的发展方向。
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Science,2∞7,32(1):93—146Surface Modification of Poly Ethylene Glycol to Resist
Nonspecific Adsorption of Proteins
XIAO Xi—Feng,JIANG
Xiao—Qun,ZHOU Lei—Ji+(Department of Chemistry,College of Chemistry and Chemical Engincering,Xiamen University,Xiamen 361005,China) Abstract Poly ethylene glycol(PEG),as
a polymer of unique properties in hydrophilicity and electrical neutrality,is well known
as a significant material to resist protein adsorption.Here we reviewed some develop— ments in recent
years in SUrface modification of PEG on various substrates,including the analysis of PEG structures and characteristics,theoretic interpretation of adsorption resistance,and the strategies of PEG modi—
fieation on hydrophobic surfaces.We also look forward to its development prospects.
Keywords Nonspecific adsorption;Poly ethylene glycol;Surface modification;Review
(Received 5June 2012;accepted 20October 2012)
仉 配配矾酪 酌 卯铝∞ 加 他 乃似乃%
范文四：表面分子印迹聚合物纳米线用于蛋白质的特异性识别
Vol . 26
高 等 学 校 化 学 学 报 No . 92005年 9月
CHE M I CAL JOURNAL OF CH I N ESE UN I V ERSI TI ES 1634~1636
[研究快报 ]
表面分子印迹聚合物纳米线用于
蛋白质的特异性识别
李 永 1, 2, 杨黄浩 1, 庄峙厦 1, 王小如 1
(1. 国家海洋局第一海洋研究所 , 青岛 266061; 2. 温州医学院 , 温州 325000)
关键词 分子印迹聚合物 ; 纳米线 ; 蛋白质识别
中图分类号 O65713 文献标识码 A 文章编号 025120790(203
收稿日期 :2005205231.
基金项目 :国家自然科学基金 (批准号 :20405004) 和国家 “ 八六三 ” 计划项目 (批准号 :2004AA639730) 资助 .
联系人简介 :杨黄浩 (1975年出生 ) , 男 , 博士 , 副研究员 , 从事传感器研究 . E 2mail:hhyang@yanan . x mu . edu . cn
, 迹聚合物 (Molecularly i m p rinted poly I ) , 、 模拟酶和传感器等方面均显 示出广阔的应用前景 [1~4]. , , 而对蛋白质等生物大分子
7, 其主要原因在于 M I Ps 的高度交联结构使印迹蛋白质的洗脱和再结
合都十分困难 . 等 [8]提出了牺牲载体的表面印迹法 :将印迹目标分子固定在载体 (多孔 Si O 2颗粒 ) 上 , 引入功能单体和交联剂 ; 当聚合反应结束后 , 将载体溶解 , 即在印迹材料表面形成识别位 点 . 表面印迹有利于印迹分子的洗脱和目标分子的再结合 .
本文报道了以阳极氧化铝膜 (AAO ) 为载体 , 以蛋白质为印迹分子 , 合成表面印迹纳米线的方法 . 该方法解决了印迹蛋白质难以洗脱的问题 , 同时所合成的表面印迹纳米线表现出对多种蛋白质具有特 异性吸附能力 . 由于纳米线有较高的比表面积 , 使合成的印迹纳米线有较高的蛋白质吸附容量 . 1 实验部分
1. 1 AAO 的修饰 参照文献 [9]方法 , 将 AAO 以 32氨 丙基三甲氧基硅烷 (32Am inop r opyltri m ethoxysi 2lane, APT MOS ) 进行功能化 . 将新制备的氨基化 AAO 加入到含有 012mol/L戊二醛的磷酸缓冲液中 (pH =710) 反应 2h . 将得到的醛基修饰的 AAO 用乙醇漂洗 , 并在 45℃ 下通 N 2气干燥 12h .
1. 2 蛋白质固定化 将经醛基修饰的 AAO 加入到一圆底烧瓶中 , 加入印迹蛋白质溶液 [4mg 蛋白质 、 120mg 丙烯酰胺 (Acryla m ide ) 和 2115mg 甲叉双丙烯酰胺 (N , N ′ 2Methylenebisacryla m ide ) 溶于 1mL 磷 酸缓冲液 ].混合体系于 4℃ 反应 10h, 再于室温下反应 24h . 将经蛋白质修饰的 AAO 装入流通装置 中 , 以磷酸缓冲液 (每毫升含 120mg 丙烯酰胺 、 2115mg 甲叉双丙烯酰胺和 5mg 过硫酸铵 ) 将未固定 的蛋白质洗出 .
1. 3 印迹纳米线的制备 将蛋白质固定后的 AAO 浸入 4mL 的磷酸缓冲液 (含 480mg 丙烯酰胺 、 86mg 甲叉双丙烯酰胺和 20mg 过硫酸铵 ) 中 , 在快速振荡条件下于 35℃ 反应 2h, 再于 45℃反应 2h . 将 AAO 取出 , 以乙醇快速漂洗 , 并在 45℃ 烘箱中继续反应 5h . 将 AAO 先以 1mol/LNa OH, 再 以质量分数为 1%的 HF 溶解 , 将所得的高分子纳米线以质量分数为 10%的乙酸溶液 (含质量分数为 10%的 S DS ) 洗 3次 , 以除去印迹蛋白质 .
2 结果与讨论
2. 1 AAO 的修饰和蛋白质的固定化 AAO 是含有高密度的纳米柱形孔洞的氧化铝膜 . 采用 AAO 模 板法合成纳米结构单元 (包括零维纳米粒子和准一维纳米线 ) 是 20世纪 90年代发展起来的前沿技 术 [9]. 实验中使用的 AAO 从 W hat m an 公司购买 , 孔径约为 100n m. 通过溶胶 2凝 胶反应 , 以 APT MOS
在 AAO 模板孔洞内沉积 Si O 2材料 , 可得到厚度仅几纳米的规则纳米管结构 [10]. 其末端的氨基可以和
双功能试剂戊二醛反应 , 形成自由的醛基末端 . 醛基可以和蛋白质上的氨基反应 , 使蛋白质固定在 AAO 的纳米孔洞中 .
在蛋白质固定化过程中 , 聚合物单体和过硫酸铵并不起具体作用 . 但在实验中发现 , 如果在蛋白 质固定化过程中不预先加入聚合物单体和过硫酸铵 , 则在印迹纳米线的制备中生成的纳米线的量将显 著下降 .
2. 2 印迹纳米线的制备 印迹材料交联度的选择十分重要 . 当交联单体 (甲叉双丙烯酰胺 ) 与功能单 F i g . 1 Scann i n g electron m i crograph(SE M ) of polyacryl am i de nanow i res
体 (丙烯酰胺 ) 的摩尔比低于 1∶ 50时 , 在 AAO 纳米
孔洞中形成的印迹材料无法形成纳米线的结构 . 而
当摩尔比大于 1∶ 5时 , 蛋白质在如此高度交联的结
构中将发生变性 , 从而导致印迹纳米线对蛋白质的
识别能力急剧减弱 . 因此 , 实验选择交联单体与功
能单体的摩尔比为 1∶ 12. SE M 照片 (图 1) 表明 , 在
多孔 AAO 中形成了均匀的纳米线结构 .
2. 3的印迹位点 , 全对应 , 同时印迹位点中的酰胺基团处于准确的位置 . 我们认为 , 当蛋白质分子进入与其相对应的印 迹位点时 , 印迹位点的酰胺基与蛋白质表面的极性基团形成多个氢键 , 这些协同作用的大量氢键导致 印迹位点对蛋白质的亲和性 .
在上述假设的基础上 , 考察了牛血红蛋白 (Bovine he mogl obin ) 印迹的纳米线对牛血红蛋白的结合 能力 . 将印迹纳米线分散在 100μg/mL的牛血红蛋白溶液 (pH =710的磷酸缓冲液 , 含质量分数为 0101%的 T ween 220) 中 , 混合体系在 25℃下反应 3h . 将印迹纳米线离心除去 , 在 405nm 处测定溶液 的吸收 , 确定溶液中牛血红蛋白浓度的变化 .
结果表明 , 印迹纳米线表现出对牛血红蛋白的特异性结合能力 , 当印迹纳米线结合 50%蛋白时
,
F i g . 2 B i n d i n g prof iles of bov i n e prote i n a s a functi on of
the nanow i res concen tra ti on
a . I m p rinted nanowires; b . contr ol nanowires . The points rep resent the mean values of three measure ments . 空白纳米线只结合了 618%的蛋白 (图 2) .
为进一步考察印迹纳米线对蛋白质的特异吸附
能力 , 对两类同源蛋白质进行了印迹 .
表 1中的结果表明 , 牛血红蛋白印迹的纳米线
可以特异吸附牛血红蛋白 , 而不吸附人血红蛋白 ;
而人血红蛋白印迹的纳米线可以特异吸附人血红蛋
白 , 而不吸附牛血红蛋白 , 尽管这两种蛋白质具有
相似的氨基酸序列和三维结构 .
表 1数据还表明 , 牛细胞色素 c 或马细胞色素 c 印迹的纳米线对牛细胞色素 c 和马细胞色素 c 的 识别没有特异性 , 其原因可能是这两种蛋白质的氨 基酸序列过于相似所致 .
Table 1 Spec i f i c ity of the b i n d i n g of ho m ologous prote i n s to M I P nanow i res
3I m p rinted nanowires
Pr otein binding a mounts/μg Bovine Hb Human Hb Bovine cyt ochr ome c Horse cyt ochr ome c
Bovine Hb M I P
2712711Human Hb M I P
6192519Bovine cyt ochr ome c
19171816Horse cyt ochr ome c 18111715 3Experi m ent was conducted by the additi on of 1mg of nanowires in 100μg/mLp r otein s oluti on (1mL, pH =7) at r oom te mperature; n =3.
5361
No . 9 李 永等 :表面分子印迹聚合物纳米线用于蛋白质的特异性识别
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Surface M olecul arly I m pr
iti on
1, 2Y Huang 2Hao 13, ZHUANG Zhi 2Xia 1, WANG Xiao 2Ru 1
(. The First Institute of O ceanography, SOA, Q ingdao 266061, China;
2. W enzhou M edical College, W enzhou 325000, China )
Abstract Molecularly i m p rinted poly mers (M I Ps ) are artificial, te mp late 2made recep t ors with the ability t o recognize and t o s pecially bind the target molecule . The advantage of stability of the poly mer, ease of the p reparati on and l o w cost of these M I Ps have led t o their assess ment as substitutes f or antibodies or enzy mes in che m ical sens ors, catalysis and separati ons . A lthough creating a M I Ps against s mall molecules is straightf or 2 ward now, i m p rinting of large structures, such as p r oteins and other bi omacr omolecules, is still a challenge . The maj or p r oble m ass ociated with the i m p rinting of such large structures lies on the restricted mobility of the m within highly cr oss 2linked poly mer net w orks and the poor efficiency in rebinding . I n this paper, we p resent a technique f or the p reparati on of poly mer nanowires with the p r otein molecule i m p rinted and binding sites on surface . These surface i m p rinting nanowires exhibit highly selective recogniti on f or a variety of te mp late p r o 2 teins, including album in, he mogl obin and cyt ochr ome c . Since the p r otein i m p rinted sites are l ocated on, or cl ose t o, the surface, these i m p rinted nanowires have a good site accessibility t owards the target p r otein mole 2 cules . Further more, the large surface area of the nanowires results in larger p r otein molecules binding capacity of the i m p rinted nanowires compared t o p revi ously report surface i m p rinting M I Ps .
Keywords Molecularly i m p rinted poly mers; Nanowires; Pr otein recogniti on
(Ed . :K, G ) 6361高 等 学 校 化 学 学 报 Vol . 26
范文五：表面分子印迹聚合物纳米线用于蛋白质的特异性识别
[研究快报 ]
表面分子印迹聚合物纳米线用于
蛋白质的特异性识别
1 , 2 1 1 1李永 , 杨黄浩 , 庄峙厦 , 王小如
( )1. 国家海洋局第一海洋研究所 , 青岛 266061; 2. 温州医学院 , 温州 325000
关键词 分子印迹聚合物 ; 纳米线 ; 蛋白质识别
( ) 中图分类号 O65713 文章编号 025120790 200509 21634203 文献标识码 A
分子印迹是制备对特定分子具有专一性结合能力的聚合物的技术 , 所制备的聚合物被称为分子印
() 迹聚合物 Mo lecu la rly imp rin ted po lym e rs, M IP s, 此类聚合物在分离提纯 、模拟酶和传感器等方面均显
[ 1,4 ] 示出广阔的应用前景 . 迄今 , 小分子化合物的印迹技术已经十分成熟 , 而对蛋白质等生物大分子
[ 5,7 ] 进行印迹的成功例子则较少 , 其主要原因在于 M IP s的高度交联结构使印迹蛋白质的洗脱和再结
[ 8 ](合都十分困难 . Mo sbach等 提出了牺牲载体的表面印迹法 : 将印迹目标分子固定在载体 多孔 SiO 2
)颗粒 上 , 引入功能单体和交联剂 ; 当聚合反应结束后 , 将载体溶解 , 即在印迹材料表面形成识别位 点 . 表面印迹有利于印迹分子的洗脱和目标分子的再结合.
()本文报道了以阳极氧化铝膜 AAO 为载体 , 以蛋白质为印迹分子 , 合成表面印迹纳米线的方法 . 该方法解决了印迹蛋白质难以洗脱的问题 , 同时所合成的表面印迹纳米线表现出对多种蛋白质具有特 异性吸附能力 . 由于纳米线有较高的比表面积 , 使合成的印迹纳米线有较高的蛋白质吸附容量 . 1 实验部分
( 1. 1 AAO 的修饰 参照文献 [ 9 ]方法 , 将 AAO 以 3 2氨丙基三甲氧基硅烷 3 2Am inop rop yltrim e thoxysi2
)lane, A PTMO S进行功能化. 将新制备的氨基化 AAO 加入到含有 012 mo l /L 戊二醛的磷酸缓冲液中 ( )pH = 710 反应 2 h. 将得到的醛基修饰的 AAO 用乙醇漂洗 , 并在 45 ?下通 N气干燥 12 h. 2
1. 2 蛋白质固定化 将经醛基修饰的 AAO 加入到一圆底烧瓶中 , 加入印迹蛋白质溶液 [ 4 m g蛋白质 、
()() 120 m g丙烯酰胺 A c rylam ide和 2115 m g甲叉双丙烯酰胺 N , N ′2M e thyleneb isac rylam ide 溶于 1 mL 磷 酸缓冲液 ]. 混合体系于 4 ?反应 10 h, 再于室温下反应 24 h. 将经蛋白质修饰的 AAO 装入流通装置
()中 , 以磷酸缓冲液 每毫升含 120 m g丙烯酰胺 、2115 m g甲叉双丙烯酰胺和 5 m g过硫酸铵 将未固定 的蛋白质洗出 .
(1. 3 印迹纳米线的制备 将蛋白质固定后的 AAO 浸入 4 mL 的磷酸缓冲液 含 480 m g丙烯酰胺 、 86 m g甲叉双丙烯酰胺和 20 m g过硫酸铵 )中 , 在快速振荡条件下于 35 ?反应 2 h, 再于 45 ? 反应
2 h. 将 AAO 取出 , 以乙醇快速漂洗 , 并在 45 ?烘箱中继续反应 5 h. 将 AAO 先以 1 mo l /L N aOH , 再
(以质量分数为 1 %的 H F溶解 , 将所得的高分子纳米线以质量分数为 10 %的乙酸溶液 含质量分数为
)10 %的 SD S洗 3次 , 以除去印迹蛋白质.
2 结果与讨论 2. 1 AAO 的修饰和蛋白质的固定化AAO 是含有高密度的纳米柱形孔洞的氧化铝膜 . 采用 AAO 模
() 板法合成纳米结构单元 包括零维纳米粒子和准一维纳米线 是 20 世纪 90 年代发展起来的前沿技 [ 9 ] 术 . 实验中使用的 AAO 从 W ha tm an公司购买 , 孔径约为 100 nm. 通过溶胶 2凝胶反应 , 以 A PTMO S
收稿日期 : 2005 205 231.
基金项目 : 国家自然科学基金 (批准号 : 20405004 )和国家“八六三 ”计划项目 (批准号 : 2004AA639730 )资助. 联系人简介 : 杨黄浩 ( 1975 年出生 ) , 男 , 博士 , 副研究员 , 从事传感器研究. E2m a il: hhyang@ yanan. xm u. edu. cn
No. 9 1635 李 永等 : 表面分子印迹聚合物纳米线用于蛋白质的特异性识别
[ 10 ] 在 AAO 模板孔洞内沉积 SiO材料 , 可得到厚度仅几纳米的规则纳米管结构 . 其末端的氨基可以和 2
双功能试剂戊二醛反应 , 形成自由的醛基末端 . 醛基可以和蛋白质上的氨基反应 , 使蛋白质固定在 AAO 的纳米孔洞中.
在蛋白质固定化过程中 , 聚合物单体和过硫酸铵并不起具体作用 . 但在实验中发现 , 如果在蛋白 质固定化过程中不预先加入聚合物单体和过硫酸铵 , 则在印迹纳米线的制备中生成的纳米线的量将显 著下降.
()2. 2 印迹纳米线的制备 印迹材料交联度的选择十分重要 . 当交联单体 甲叉双丙烯酰胺 与功能单 体 (丙烯酰胺 )的摩尔比低于 1 ?50时 , 在 AAO 纳米
孔洞中形成的印迹材料无法形成纳米线的结构. 而
当摩尔比大于 1 ?5时 , 蛋白质在如此高度交联的结
构中将发生变性 , 从而导致印迹纳米线对蛋白质的
识别能力急剧减弱. 因此 , 实验选择交联单体与功
()能单体的摩尔比为 1 ?12. SEM 照片 图 1 表明 , 在
多孔 AAO 中形成了均匀的纳米线结构 .
2. 3 印迹纳米线对蛋白质的识别 用乙酸溶液除
去印迹的模板蛋白 , 即在纳米线的表面形成蛋白质 F ig. 1 Scann in g e lec tron m icrogra ph( SEM ) 的印迹位点 , 该位点与印迹蛋白质在物理形态上完 全of po lya cry lam ide nan ow ire s
我们认为 , 当蛋白质分子进入与其相对应的印 对应 , 同时印迹位点中的酰胺基团处于准确的位置 .
迹位点时 , 印迹位点的酰胺基与蛋白质表面的极性基团形成多个氢键 , 这些协同作用的大量氢键导致 印迹位点对蛋白质的亲和性.
()在上述假设的基础上 , 考察了牛血红蛋白 Bovine hemoglob in 印迹的纳米线对牛血红蛋白的结合
μ( 能力. 将印迹纳米线分散在 100 g /mL 的牛血红蛋白溶液 pH = 710 的磷酸缓冲液 , 含质量分数为
)0101 %的 Tween220 中 , 混合体系在 25 ? 下反应 3 h. 将印迹纳米线离心除去 , 在 405 nm 处测定溶液 的吸收 , 确定溶液中牛血红蛋白浓度的变化.
结果表明 , 印迹纳米线表现出对牛血红蛋白的特异性结合能力 , 当印迹纳米线结合 50 %蛋白时 ,
空白纳米线只结合了 618 %的蛋白 (图 2 ) .
为进一步考察印迹纳米线对蛋白质的特异吸附
能力 , 对两类同源蛋白质进行了印迹 .
表 1 中的结果表明 , 牛血红蛋白印迹的纳米线
可以特异吸附牛血红蛋白 , 而不吸附人血红蛋白 ;
而人血红蛋白印迹的纳米线可以特异吸附人血红蛋
白 , 而不吸附牛血红蛋白 , 尽管这两种蛋白质具有
相似的氨基酸序列和三维结构 .
表 1 数据还表明 , 牛细胞色素 c或马细胞色素 F ig. 2 B in d in g prof ile s of bov in e pro te in a s a fun c t ion of
c印迹的纳米线对牛细胞色素 c 和马细胞色素 c 的 the nan ow ire s con cen tra t ion
识别没有特异性 , 其原因可能是这两种蛋白质的氨 The po in ts a. Imp rin ted nanow ires; b. con tro l nanow ire s.
rep re sen t the m ean values of th ree m ea su rem en ts. 基酸序列过于相似所致.
3Ta b le 1 Spec if ic ity of the b in d in g of hom o logou s pro te in s to M IP nan ow ire s
μP ro te in b ind ing amoun ts /g Imp rin ted nanow ire s Bovine H b H um an H b Bovine cytoch rom e c Ho rse cytoch rom e c Bovine H b M IP 2712 11 7 619 2519 H um an H b M IP Bovine cytoch rom e c 1917 1816 Ho rse cytoch rom e c 1811 1715
μ( ) 3 Exp e rim en t wa s conduc ted by the add ition of 1 m g of nanow ires in 100 g /mL p ro tein so lu tion 1 mL , pH = 7 a t room temp e ra tu re; n = 3.
1636 Vo .l 26 高 等 学 校 化 学 学 报
参 考 文 献
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)() ) ) (((高等学校化学学报 Chem. J. Ch ine se U n ive rsitie s LA I J ia2P ing 赖家平 , LU Chun2Yang 卢春阳 , H E X i2W en 何锡文 et a l. . [ 4 ]
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Surfa ce M o lecu la r ly Im pr in ted Po lym er Nan ow ire s
U sed for Pro te in Recogn it ion
1 , 2 1 3 1 1L I Yong, YAN G H uang2H ao, ZHUAN G Zh i2X ia, WAN G X iao2R u
( 1. The F irst Institu te of O ceanog raphy, SOA , Q ingdao 266061, C h ina;
)2. W enzhou M ed ica l College, W enzhou 325000, Ch ina
() A b stra c t Mo lecu la rly imp rin ted po lym e rs M IP sa re a rtific ia l, temp la te2m ade recep to rs w ith the ab ility to recogn ize and to sp ec ia lly b ind the ta rge t mo lecu le. The advan tage of stab ility of the po lym e r, ea se of the p rep a ra tion and low co st of the se M IP s have led to the ir a sse ssm en t a s sub stitu te s fo r an tibod ie s o r enzym e s in chem ica l sen so rs, ca ta lysis and sep a ra tion s. A lthough c rea ting a M IP s aga in st sm a ll mo lecu le s is stra igh tfo r2 wa rd now , imp rin ting of la rge struc tu re s, such a s p ro te in s and o the r b iom ac romo lecu le s, is still a cha llenge. The m a jo r p rob lem a ssoc ia ted w ith the imp rin ting of such la rge struc tu re s lie s on the re stric ted mob ility of them w ith in h igh ly c ro ss2linked po lym e r ne two rk s and the poo r effic iency in reb ind ing. In th is p ap e r, we p re sen t a techn ique fo r the p rep a ra tion of po lym e r nanow ire s w ith the p ro te in mo lecu le imp rin ted and b ind ing site s on su rface. The se su rface imp rin ting nanow ire s exh ib it h igh ly se lec tive recogn ition fo r a va rie ty of temp la te p ro2 te in s, inc lud ing a lbum in, hemoglob in and cytoch rom e c. Since the p ro te in imp rin ted site s a re loca ted on, o r c lo se to, the su rface, the se imp rin ted nanow ire s have a good site acce ssib ility towa rd s the ta rge t p ro te in mo le2 cu le s. Fu rthe rmo re, the la rge su rface a rea of the nanow ire s re su lts in la rge r p ro te in mo lecu le s b ind ing cap ac ity of the imp rin ted nanow ire s comp a red to p reviou sly repo rt su rface imp rin ting M IP s.
Keyword s Mo lecu la rly imp rin ted po lym e rs; N anow ire s; P ro te in recogn ition
( )Ed. : K, G
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