范文一:酶联免疫吸附试验(ELISA)
讨论报告:
酶联免疫吸附试验(ELISA )
一.简介 1. 定义:指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上,进行免疫反应的定性和定量方法。
2. 基本原理:(1)抗原或抗体的固相化(2)抗原或抗体的酶标记(3)加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,由此进行定性或定量分析。
大致流程:
3. 测定类型
3.1酶联免疫吸附试验在酶免疫技术中所处的位置
酶免疫组化
均相酶免疫测定 酶免疫技术
酶免疫测定 固相酶免疫测定 非均相酶免疫测定 液相酶免疫测定
这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定
(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay),简称ELISA 。
3.2 ELISA实际是一种抗原抗体反应和酶催化反应具有以下性质:
3.2.1 可逆性
3.2.2 特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学
结构和空间构型互补关系,具有高度的特异性。因此测定某一特定的物质,
而不需先分离待检物。
3.2.3 存在最适比例
可用左图表示,即抗
原抗体比例高于或低于 某一特定适宜值,二者结 合效果都会降低。
3.2.4 敏感性高 由于酶的催化效率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。
3.3 ELISA的主要测定方法
ELISA 可用于测定抗原,也可用于测定抗体,各种那个测定方法中均有三个
必要试剂:
(1)故乡的抗原或抗体,即“免疫吸附剂”(2)酶标记的抗原或抗体,称“结
合物”(3)酶反应的底物
3.3.1双抗体夹心法
3.3.1.1双抗体夹心法测抗原
此法适用于检验各种蛋 白质
等大分子抗原,例如 HBsAg 、HBeAg 、AFP 等。 只要获得针对受检抗原的特 异性抗体,就可用于包被固相 载体和制备酶结合物而建立 此法。步骤如图:
3.3.1.2双抗体夹心法测抗体
用特异性抗原进行包被和制备酶
结合物。此法中受检标本不需稀释,
可直接用于测定,因此其敏感度相对
高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg
的检测常采用本法。本法关键在于酶
标抗原的制备,应根据抗原结构的不
同,寻找合适的标记方法。
3.3.2 间接法测抗体
多用于传染病的诊断。
间接法的优点是只要变换
包被抗原就可利用同一酶
标抗抗体建立检测相应抗
3.3.3 竞争法
3.3.3.1竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质 不易除去,或不易得到足够的 纯化抗原时,可用此法检测特 异性抗体。
3.3.3.2竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法 进行测定,可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与 固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色 也愈浅。小分子激素、药物等ELISA 测定多用此法。
4. 试剂准备 现市面上易得各大生物技术公司生产的ELISA 试剂盒。所以按试剂盒说明书的
要求准备实验中需用的试剂。ELISA 中用的蒸馏水或去离子水,包括用于洗涤的,
应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH 计测量较正。从冰箱中取出的试验用
试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保
存。
5. 对照设定 阳性对照品(positive control) 和阴性对照品(negative control) 是检验试验有效性的控制 品,同时也作为判断结果的对照。 阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致,多以含蛋白保护剂的缓冲液 为基质。 加入的量应与试剂的敏感度相称; 在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较,可以估计标本物质的量。 阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAg 检测的阴性对照品中不可含 HBsAg ,最好抗HBs 也是阴性。
标本的采取和保存 体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。 6.
以血清标本为例:血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外,其他成份同血清。
血浆和血清可同等应用。
血清标本应避免溶血:红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以
HRP 为标记的ELISA 测定中,可能会增加非特异性显色。
7. 基本操作注意事项
(1)加样:在ELISA 中一般有3次加样步聚,即加标本,加酶结合物,加底物。加
样时应将所加物加在LEISA 板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,
不可产生气泡。
(2)保温:抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)。
ELISA 属固相免疫测定,抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。为什么ELISA
反应总是需要一定时间的温育?
温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃(冰箱温度)等。37℃是实验室
中常用的保温温度,也是大多数抗原抗体结合的合适温度。
保温方式:ELISA 仪器附有特制的电热块,水浴。若用保温箱:ELISA 板放在
湿盒内,在盒底垫湿的纱布,最后将ELISA 板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放,
以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应,操作时的室温应严格限制在规
定的范围内,标准室温温度是指20-25℃,但具体操作时可根据说明书的要求控制
温育。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点,一个人操作时,
一次不宜多于两块板同时测定。
(3)洗涤:洗涤在ELISA 过程中虽不是一个反应步骤,但却也决定着实验的成败。
ELSIA 洗涤:达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游
离的物质,以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是
普遍性的,而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在
ELISA 操作中,洗涤是最主要的关键技术。
洗涤的方式除某些ELISA 仪器配有特殊的自动洗涤仪外,手工操作有流水冲洗
式和浸泡式两种:
A. 流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤,洗涤液为蒸馏水,自来水。洗涤效果
更为彻底,且也简便、快速。已有实验表明,流水冲洗式同样适用于微量滴定板
的洗涤。让水流冲击板孔表面,洗涤效果更佳。
B. 浸泡式 微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋
白质的结合是疏水性的,非离子型洗涤剂既含疏水基团,也含亲水基团,使蛋白
质回复到水溶液状态,从而脱离固相载体。
(4)显色:显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响
显色的因素。在一定时间内,阴性孔可保持无色,而阳性孔则随时间的延长而呈
色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。
TMB 受光照的影响不大,可在室温中置于操作台上,边反应观察结果。但为保证
实验结果的稳定性,宜在规定的适当时间阅读结果。TMB 经HRP 作用后,约40
分钟显色达顶峰,随即逐渐减弱,至2小时后即可完全消退至无色。
(5)比色:拭干板底附着的液体,然后将板正确放入酶标比色仪中。
以蒸馏水校零点,测读底物孔(未经任何反应仅加底物液的孔)和空白孔(以
生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔),以记录本次试验的试剂状况。其后可
用空白孔以蒸馏水校零点,以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度,然后进行
计算。
结果以光密度(oplical density,OD ),现按规定用吸光度(absorbence ,A ),两
者含义相同。通常的表示方法是,将吸收波长写于A 字母的右下角,如OPD 的吸
收波长为492nm ,表示方法为"A492nm" 或"OD492nm" 。
使用酶标比色仪比色时,操作时室温宜在15-30℃,使用前先预热仪器15-30分
钟,测读结果更稳定。测读A 值时,要选用产物的敏感吸收峰,如OPD 用492nm
波长。有的酶标仪可用双波长式测读。各种酶标仪性能有所不同,使用中应详细
阅读说明书。
8. 结果判定
8.1定性测定
定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答,分别用“阳性”、“阴性”表示。
在这种半定量测定中,将标本作一系列稀释后进行试验,呈阳性反应的最高稀释度即
为滴度。根据滴度的高低,可以判断标本反应性的强弱,这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。
在间接法和夹心法ELSIA 中,阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA 中则相
反,阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同。
8.2 定量测定
ELSIA 操作步骤复杂,影响反应因素较多,特别是固相载体的包被难达到各个
体之间的一致,因此在定量测定中,每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在
相同的条件下制作标准曲线。
测定大分子量物质的夹心法ELISA ,标准曲线的范围一般较宽,曲线的值逐点
连接,所得曲线一般呈S 形,其头、尾部曲线趋于平坦,中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。
9.ELISA 的操作要点
严谨的设计,优质的试剂,正确的操作和良好的仪器是保证ELISA 必要条件。 严格遵照规定操作,必能得出准确的结果。
10. 临床应用
由于各种抗原成份,包括小分子的半抗原,均可用以制备特异性的抗血清或单克隆
抗体,利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原,因此免疫测定的应用范围极广。
二.讨论
问题:怎样才能使ELISA 试验所得结果准确性提高?通过哪些可控制因素可以做到?
ELISA 试验涉及步骤多,影响因素较多,操作过程中每个环节都会对试验结果产生影响,可能出现错误的结果。但如果我们控制了这些因素,就可以把其不良影响降到最低。可以从以下几方面着手
1. 试剂因素
(1)试剂的选择:试剂的选择是保证血液检测质量的关键要素。现ELISA 试剂均由生物技术公司出售,但不同厂家的试剂在使用效果上存在差异。所以要选购知名度相对高的品牌,不要用无批号的试剂,最好选用与仪器配套的试剂。更不要使用过期的试剂和混用不同批号的试剂。
(2)试剂的准备:ELISA 反应涉及酶促反应,需要有适宜的温度。因此临床试验时,将试剂从冰箱中拿出来即用的做法有可能导致对一些弱阳性标本的检测出现假阴性的后果。所以在ELISA 测定中试剂的准备最为关键的是,将试剂盒先从冰箱中拿出来,在室温下放置20~30 min 后,再进行测定,使试剂盒在使用前与室温平衡,这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度,以满足后面的测定需求。
2. 样本因素
(1)内源性干扰因素
临床ELISA 试验的样本多是直接采集患者血清,因此血清中包含多种杂质,其中目前我们大二学到的物质有补体。
补体:在固相酶免疫测定中,来自哺乳动物的固相抗体和酶标二抗均有激活人补体系统的功能。一方面,固相抗体和酶标二抗可因其吸附及结合过程中抗体分子发生变构,使Fc 段的补体C1q 结合点暴露出来, 使C1q 成为一个中介物将二者交联起来出现假阳性结果。另一方面,固相抗体也会因为活化补体的结合,封闭抗体和抗原的表位结合能力而引起假阴性。解决的办法是:①用EDTA 稀释标本。②56℃ 30min 加热血清使C1q 灭活。
(2)外源性干扰因素
包括标本溶血、标本被细菌污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等。
A. 标本的溶血:血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶的活性,因此,在以辣根过氧化物酶
(HRP)为标志的ELISA 测定中,如血清样本中血红蛋白浓度较高,则很容易在温育过程中吸附于固相,从而与后面加入的HRP 底物反应显色。所以在采血时应注意手法,采集的血液勿用力振荡,严防标本溶血。
B. 标本的污染:污染物菌体可能含有内源性辣根过氧化物酶,可使实验出现非特异性显色。
因此,ELISA 检测宜采集新鲜标本,如不能当时测定,5 d 之内应4℃保存,1 周后检测应低温冻存;同时,收集标本采用无菌试管,可防止标本的污染。
C. 标本的保存:标本在冰箱中保存过久,血清中IgG 可聚合成多聚体,AFP 可形成二聚体,
在用间接法测定中会导致本底过深, 甚至造成假阳性。冰冻保存的标本反复冻融产 生机械剪切力对标本中的蛋白等分子有破坏作用,可引起假阴性结果。因此,ELISA 检测尽量采用新鲜标本,长时冻存的样本避免反复融冻。
D. 标本凝固不全:凝固不全的血清中含有部分纤维蛋白原,可使结果呈假阳性。解决的方法
有:①于采血管中加入适当的抗凝剂;②将采集后的血液放在架子上再放入37℃水浴中1 h,待充分凝固后再离心分离血清。
3. 操作中的因素
加样、保温等因素在“一. 简介”的“7. 基本操作注意事项”中已提到。除上述几点外,还
应注意以下内容:
“边缘效应”的排除:“边缘效应”是在使用96 孔板的ELISA 测定中,外周孔显色较中心孔深的现象。产生的原因可能是为96 孔板周围孔与中心孔在温育中的热力学梯度造成的,因此在温育时尽量采用水浴。
4. 结果判定
读取结果要在15~30 min 内完成,定性测定用肉眼判读试验结果时,反应板应水平距离白色背景10~15 cm;定量测定时用酶标仪读取结果, 酶标仪不应置于阳光或强光照射 下,需先预热15~30 min 再进行测试。
范文二:酶联免疫吸附试验
了解ELISA的基本原理,掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。
将抗原或抗体固化于某种载体的表面,并保持其免疫活性,加入待检血清(抗体),
然后加入与其相对应的既有酶活性又有免疫活性的酶标抗体或抗原,它们之间反应后,
通过洗涤去掉未结合的标记物。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,酶的
降解底物和呈现的色泽在一定条件下是呈正比的,故可根据颜色反应的深浅进行定性或
定量分析,因此可用分光光度计进行测定,计算出参加反应的抗原或抗体的含量,从
而达到测定抗原或抗体的目的。
常用酶及底物
常用酶 底物 加终止液前颜色 加终止液后颜色 辣根过氧化物酶(HRP) 邻苯二胺(OPD) 橙黄色 棕黄色
RZ>3.1 四甲基联苯胺(TMB) 蓝色 黄色 碱性磷酸酶(AP) 对硝基苯磷酸酯(p-NPP) 黄色 黄色
根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件,可设计出各种不同类型的检测方法。
常用的三种类型:
1
它的原理是将已知抗原连接在固相载体上,待测抗体与抗原结合
后再与酶标二抗结合,形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物,复合物的形成量与待测抗体
量成正比,属反应类型。
它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合,形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物,复合物的形成量与待测抗原含量成正比,属非竞争性反应类型。:将抗体吸附于固相表面;加抗
原,形成抗原-抗体复合物;加酶标抗体;加底物。底物的降解量=抗原量。
它是用酶标抗原(抗体)与待测的非标记
抗原(抗体)竞争性的与固相载体上的限量抗体(抗原)结合,待测抗原(抗体)多,则形
成非标记复合物多,酶标抗原与抗体结合就少,也就是酶标记复合物少,因此,显色程度与
待测物含量成反比。
以伪狂犬全病毒(PRV)间接酶联免疫吸附试验(PRV-ELISA)为例。
使用猪伪狂犬抗体检测试剂盒。本试剂盒含:
1、包被抗原的微孔板 ;2、阴、阳性对照血清; 3、抗猪IgG-HRP结合物;
4、洗涤液;5、底物A液、B液;6、终止液 ;7、样品稀释液
1、酶联免疫测定仪
2、已包被抗原(Ag)的酶标板(PRV蛋白)
3、血清:PRV阳性血清、PRV阴性血清、待检样品血清
4、酶标抗体(E-Ab):兔抗猪IgG-HRP
5、包被液(0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液): 1.59g NaCO,2.93g NaHCO,加33ddHO至1000mL 2
6、洗涤液(0.05% Tween-20的PBS(pH7.4) ): 8.0g NaCl,0.2g KCl,2.9g NaHPO?12HO,0.2g KHPO,0.5mL吐温-20(Tween-20),加ddHO至1000mL。 242242
7、保温液(含0.1% BSA 的洗涤液):0.1g 牛血清白蛋白(BSA),洗涤液100mL
2
8、底物液(TMB-H2O2):
磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH5.0):25.7mL 0.2mol/L Na HPO,24.3mL 0.1mol/L 柠24
檬酸液,加50mL ddHO。 2
TMB母液:0.2g TMB干粉溶于100mL无水乙醇中配制而成。
底物液(TMB):新鲜配制。TMB母液用底物缓冲液按1?20的比例稀释,每毫升底物
液加入0.2μL 30% HO。 22
9、终止液:0.25% 氢氟酸
1、包被液(0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液): 1.59g NaCO,2.93g NaHCO,加33ddHO至1000mL 2
2、洗涤液(0.05% Tween-20的PBS(pH7.4): 8.0g NaCl,0.2g KCl,2.9g NaHPO?12HO,0.2g KHPO,0.5mL吐温-20(Tween-20),加ddHO至1000mL。 242242
3、保温液(含0.1% BSA 的洗涤液):0.1g 牛血清白蛋白(BSA),洗涤液100mL。
4、底物液(TMB-H2O2):
磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH5.0):25.7mL 0.2mol/L Na HPO,24.3mL 0.1mol/L 柠24
檬酸液,加50mL ddHO。 2
TMB母液:0.2g TMB干粉溶于100mL无水乙醇中配制而成。
底物液(TMB):新鲜配制。TMB母液用底物缓冲液按1?20的比例稀释,每毫升底物
液加入0.2μL 30% HO。 22
5、终止液:0.25% 氢氟酸
1、取已包被伪狂犬病毒抗原的酶标板(根据样品多少,可拆开分次使用),用样品稀释
液(PBS)将待检样品1?40稀释后加入板孔中,每孔加100μl。同样1?40稀释阴、阳性对照血清,阴、阳性对照各设2孔,每孔100μl。另设一空白对照孔,空白对照孔加100μl稀释液(PBS)。轻轻振匀孔中样品(勿溢出),置37?温育20-30分钟。
2、洗板:甩掉板孔中的溶液,用洗涤液洗板3次,每次2-3分钟,200μl/孔,每次在干净吸水纸上拍干。
3、每孔加酶标二抗(抗猪IgG-HRP结合物)100μl,置37?温育20-30分钟。
4、洗板:洗涤3次(方法同步骤2)。
5、显色与终止:每孔加底物A液、B液各1滴(50μl),混匀。室温避光显色,10分钟
3
后,每孔加终止液(0.25% 氢氟酸)1滴(50μl),终止反应。
6、15分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。检测样本的OD值?0.4
为阳性。
1、实验前血清样品必须置37?灭活30分钟。
2、在ELISA的整个操作过程中,洗涤是不可缺少的重要步骤,每加一层反应结
束后均要洗涤固相载体反应板,目的在于防止重叠引起非特异性吸附。洗涤过程中
的助溶剂吐温20具有降低非特异吸附的作用。洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质,
用力甩干。
3、加入底物液后应该室温避光,结果判断须在10分钟内完成。
以空白孔调零,在酶标仪上测各孔OD值。试验成立的条件是阳性对照孔平均OD值630630
大于或等于1.0,阴性对照孔平均OD630值必须小于0.2。
样品OD值大于0.4,判为阳性;样品OD630值在0.38到0.40之间,判为可疑;样品630
OD值小于0.38,判为阴性。 630
1、间接酶联免疫吸附试验的原理。
2、鉴别诊断基本原理及其意义。
3、间接酶联免疫吸附试验检测的临床意义。
4
范文三:酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验 ;ELISA
定义:
一种酶联免疫技术。用于检测包被于固相板孔中的待测抗原(或抗体)。即用酶标记抗体,并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面,使抗原抗体反应在固相载体表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除,最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。
应用学科:
免疫学(一级学科);应用免疫(二级学科);免疫学检测和诊断(二级学科)
酶联免疫吸附试验 (以下简称ELISA) :是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法,前者用于检测大分子抗原,后者用于测定特异抗体
简介
自从Engvall和Perlman(1971)首次报道建立酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA)以来,由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点,使其得到迅速的发展和广泛应用。尽管早期的ELISA由于特异性不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐,但
酶联免疫吸附试验专用仪器
随着方法的不断改进、材料的不断更新,尤其是采用基因工程方法制备包被抗原,采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验,都大大提高了ELISA的特异性,加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用,使ELISA更为简便实用和标准化,从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。
如今ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面,ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。
基本原理
ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合,此种结合不会改变抗体的免疫学特性,也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后,底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型,出现颜色反应。因此,可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应,颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定,这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来,使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
特性
用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性:有高度的活性和敏感性;在室温下稳定;反应产物易于显现;能商品化生产。如今应用较多的有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等,其中以HRP应用最广。
辣根过氧化物酶
过氧化物酶(HRP)广泛分布于植物中,辣根中含量最高,从辣根中提取的称辣根过氧化物酶(HRP),是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白(含糖量18%),分子量约40 000,约由300个氨基酸组成,等电点为pH 3-9,催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异,一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm。
酶的纯度以RZ表示:RZ=OD403/OD275
纯酶的RZ多在3.0以上,最高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶,非酶蛋白约占 75%,不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢,催化反应时的供氢体有几种:⑴邻苯二胺(OPD),产物为橙色,可溶性,敏感性高,最大吸收值在490nm,可用肉眼观察判别,容易被浓硫酸终止反应,颜色可在数小时内不改变,是目前国内ELISA中最常用的一种;⑵联大茴香胺(OD),产物为橘黄色,最大吸收值在400nm,颜色较稳定;⑶5-氨基水杨酸(5-AS):产物为深棕色,最大吸收值在449nm,部分溶解,敏感性较差;⑷邻联甲苯胺(OT)产物为蓝色,最大吸收值在630nm,部分溶解,不稳定,不耐酸,但反应快,颜色明显。
碱性磷酸酶
系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取,由多个同功酶组成。它们的底物种类很多,常用者为硝基苯磷酸盐,廉价无毒性。酶解产物呈黄色,可溶,最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反应系统中,37℃1分钟水解1μg磷酸苯二钠为一个单位。
标记方法
良好的酶结合物取决于两个条件:即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要,因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中,抗体的活性有所降低,故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白,最好使用亲和层析提纯的抗体,可提高敏感性,而且可稀释使用,减少非特异性吸附。
酶与抗体交联,常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行,标记效果好,特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为:将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中,加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠(NaIO4)水溶液0.5ml,混匀置4℃冰箱30分钟 , 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml,室温放置30分钟后加入含5g纯化抗体的水溶液1ml,混匀并装透析袋,以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时(或过夜)使之结合,然后吸出,加硼氢化钠(NaBH4)溶液
(5(g/ml)0.2ml,置4℃冰箱2小时,将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液,置4℃冰箱30分钟后离心,将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中,并对之透析过夜(4℃),次日离心除去不溶物,即得到酶标抗体,用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml,进行测定后,冷冻干燥或低温保存。
效果测定
测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。
⑴ 酶与抗体的活性 常用琼脂扩散或免疫电泳法,使抗原与抗体形成沉淀线,经PBS漂洗1天,再以蒸馏水浸泡1小时,将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色,如果出现应有的颜色反应,再用生理盐水浸泡,颜色仍然不褪,表示结合物既有酶的活性,也有抗体活性。良好的结合物在显色后,琼扩滴度应在1:16以上。另一个测定方法是用系列稀释的酶标抗体直接以ELISA方法进行方阵滴定,此法不仅可以测定标记效果,还可以确定酶标抗体的使用浓度。
⑵ 结合物的定量测定 一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。常用紫外分光光度计于403nm和280nm进行测定,然后按下列公式计算:
酶量(mg/ml)=OD403×0.42
IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.4)×0.94×0.62
对于过碘酸钠氧化法制备的标记抗体量,按下列公式计算:
IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.34)×0.62
已知酶量和IgG量后,即可计算出标记抗体的摩尔(mol)比值。
HRP/IgG摩尔比值=HRP(mg/ml)/IgG(mg/ml)×4
结合物中酶总量=HRP(mg/ml)×结合物溶液量
结合物产率=结合物中酶总量/标记时加入的酶量×100%
用于ELISA的结合物的酶量为400(g/ml时效果一般,为500(g/ml时效果较好,达 1000(g/ml时效果最好。mol.比值由于结合物中含的IgG并不完全可靠,所以不能作为主要参数。一般认为mol.比值为0.7时效果一般,1.0时效果较好,
1.5-2.0时最好。酶结合率为 7%时效果一般,为9%-10%较好,达30%以上时最好。
ELISA方法的基本类型、用途及操作程序
根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型:一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA,即我们通常所指的ELISA(微量板ELISA);另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA,称为斑点ELISA(Dot-ELISA);再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA,称为布ELISA(C-ELISA)。在微量板ELISA中,又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。
范文四:酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验(ELISA)——直接法
一、 原理
酶联免疫吸附试验(enzyme linked
immunosorbent assay,ELISA)是一种固相酶免疫测定的方法,目前广泛应用于各种抗原和抗体的检测。其基本原理是将抗原或抗体固定在固相载体表面,并保持其免疫活性,再与酶标记抗体或抗原联结,并保留酶的活性,然后加入酶反应的底物,后者被酶催化变为有色产物,反应颜色的深浅可与相应抗原或抗体的量相关。在本实验中,以辣根过氧化物酶标记抗人IgG抗体,与相应抗原IgG结合,标记的酶可催化底物(邻苯二胺)起显色反应,从而指示特异性抗原抗体反应的存在。
二、材料:
1. 人IgG包被的微量酶标反应板(1:1万,1:10万,1:40万,1:80万,1:100万),
2. 酶标抗人IgG抗体稀释液、 洗涤液(PH7.4,0.01M PBS-Tween20)、底物溶液,
3. 微量移液器、移液头、吸水纸、洗瓶、湿盒、37℃恒温箱等。
三、方法:
1. 人IgG包被微量酶标反应板:取人IgG各100ul,分别加入第1至5孔,设第6孔为对照。置37℃恒温箱2小时,取出,移入4℃冰箱过夜。取出,用洗涤液洗3次,3分钟/次(略)。
2. 用含小牛血清(BSA)的PH7.4 PBS封闭,置37℃恒温箱,30分钟,取出。用洗涤液洗3次,3分钟/
次(略)。
3.用微量移液器吸取100ul酶标抗人IgG抗体,分别加入第6至1孔。置湿盒中,于37℃恒温箱中孵育30分钟。
4. 取出酶标板,用洗涤液洗3次,3分钟/次。
5. 按第6孔至第1孔的顺序,每孔各加100ul的底物溶液,置37℃恒温箱中10-15分钟。
6. 观察显色反应。
四、结果
五、结论
范文五:酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验(ELISA)
试剂准备
1. 将试剂盒及血清样本复温。
2. 标准品:1ml 标准品稀释液(standard diluent)重悬标准品(standard),轻微震荡10min,避免形成泡沫,此时,标准品的浓度为2000pg/ml。按照下图倍比稀释标准品,标准品稀释液的浓度为0 pg/ml
。
3. 分析稀释液A、B:6ml双蒸水将6ml 2×分析稀释液A、B稀释至12ml,稀释后的工作液不能冻存。
4. 检测试剂A、B:点动离心检测试剂A、B,用分析稀释液A、B分别以1:100将检测试剂A、B稀释成工作浓度。
5. 洗液:用双蒸水将20ml 30×洗液稀释成600ml。 注意事项:
1. 不要在96孔板里面做梯度稀释实验。
2. 实验前15min制备标准品溶液,不要直接在37℃溶解试剂。
3. 小心重悬标准品和检测试剂A、B至沉淀完全溶解,避免形成气泡。
4. 重悬后的标准品、检测试剂A、B只能使用一次。
5. 如果洗液中有沉淀形成,复温至室温,至沉淀完全溶解。
6. 建议使用双蒸水来稀释试剂盒样本。
实验过程:
1. 实验设计:7个标准品孔、1个空白孔。向96孔板的每个孔中
加入100 ul 标准品及样本,贴上封板胶,37℃孵育2h。
2. 弃孔中液体,不要洗。
3. 每孔中加入100 ul 检测试剂A的工作液,贴上封板胶,37℃
孵育1h。
4. 弃孔中液体,350 ul 洗液清洗孔三次,每次1~2min。
5. 每孔中加入100 ul 检测试剂B的工作液,贴上封板胶,37℃
孵育30min。
6. 按照步骤4重复洗板5次。
7. 每孔中加入底物溶液90ul,贴上封板胶后,37℃避光孵育
15~25min(不超过30min),溶液颜色变蓝。
8. 每孔中加入50ul终止液,溶液颜色变黄,轻轻拍打板的边缘
确保液体混匀。
9. 去除板底的液体,立即在酶标仪上450nm检测。
注意事项:
1. 准备工作:使用合适数量的孔,其余孔于-20℃保存。
2. 每一步加样时间不要超过10min,加样时轻轻混匀并避免形成
泡沫。
3. 实验过程中保持孔湿润。
4. 清洗过程中尽量去除所有的液体,尤其在清洗的最后一步。
5. 控制反应时间:加入TMB底物后每10min观察颜色变化,避
免反应过度。
6. TMB底物溶液容易污染,请避光保存。
结果计算:
对数作图,横轴为OD值的对数,纵轴为浓度的对数
作规程:
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