达?矢抾哆拉?
范文一：【doc】用病毒中和试验和ELISA对禽呼肠孤病毒进行株间血清学比较
用病毒中和试验和ELISA对禽呼肠孤病毒
进行株间血清学比较 '—
——..一
避簦匿学=童宣盟塑赛舅9鲞蔓2弼坦o垒5月 用病毒中和试验和EUSA对禽呼肠孤病毒
进行株问血清学比较
3.J.Giam~tone等
摘娶甩病毒中(vN)试验和ELIsA测定8
株禽呼旧孤癌毒(Co8SII~3,8卜5.2408L733和 uMI02.株间的血清学相差性.6组sF鸡(20R/组). 每组各用其中1橡病毒两次接种.抗每株辩的血清手鸡 胚肾细胞上进行6-VN试验.抗S1133寤毒血清作 ELIS相关(R)值用交叉VN试啦潮定表明均为单一 皿荷型.怛Cos栋有一,,不同于其他栋的主要亚型.其他 5株的R值襄明它仉间的亚型差异较小或没有盐异. ELISA也表暇co榱与其砘株有较士差异. 呼肠孤病毒与鸡的腿疾,重减轻儡
科转化和育种有是.死营和漕苗联台应用可 控制育种鸡及其后裔的与呼肠孤病毒相关的 疾病.但死苗和活苗怎样联台使用才能取得 最佳效果仍不清楚,只有了解所有疫苗毒住 和主要野毒抹的抗厦相关性后才能解决.
Rosenbe逸er测定了4种疫苗毒株(Co-, S1133,2408和1733)的抗原关系.在鸡胚
肾(『cK)细胞上进行交叉中和试验自发现4 株疯毒有紧密妁关系.然而,Hiero~ymus发
现,Co有一个不同于$1133株的野毒81-5 株的血清型,Town.~end研究表明,UIV~203 弱毒抹与S1133株和西弗吉尼亚大学保存的 几株野毒栋有密切嚣关系
本研究测定了5株商品苗株(co, St133,2408,UMI203和1733)与致病性 野毒81-5株闻的血清学关系.在CK细胞上 进行B—VN试验和EL【sA(用$1133株作指 示毒),以确定不目株同的相共性,为更有效 制订呼晒孤病毒相关疾病疫苗的免疫程序提 供依据.
材科和方法
鸡:i2oY{3周龄SPF鸡,分成6组,
每组2O其,隔离饲嚣...
病毒:Co.,'S113g,2408,1733和
UM[203株为各厂家生产疫苗的种毒,8卜5 株系分离真艋床病鸡曲野毒.一
抗血清糊备:每只鸡经眼内,鼻内和口 腔接种(每栋毒接种一组鸡)约"PFU, 2周后用相同毒栋相同途径再接种10PFU 病毒,2局后采血分离血清,热灭活,一4~C 保存.
曼咒中和试验l在CK细胞上用匿定病 毒(160PFU/~L)稀释血清的l方法进行-VN 试验,血穗效债以抑铷病毒的最高血清稀释 度的嘲数表示.,'
鹭LISA:'用间接法.以1133株感染
Veto细胞的悬液作为抗原使试验标准亿,结 台_物为山羊抗鸡IgG辣根过氧化物酶.结台
物柳备方法及ELIsA程序按Sohnb(i985)
报道进行.?
RiE的计算:值按Arche~i等报道韵方 法计算和评价.如R僮为0,1口,??认为血 清型不同Jn,32,为亚型差别较大,33 —7O,亚型差别较小;70以上,?口差异 甚微或没有差异.
结果萼?讨论
'交叉中和滴虔t其他株的抗血礴对Coa 株的中和作用差,厨样,cos抗血清对4掾毒 (S1133,240g,17&3和81;-5)的中和谪度 低.相反,S1133,81—5,2408和1733株所 产生的同源或异源中和滴度相似,但2408抗 血清对同源裸的中和滴度最高.
6株呼脚嚣病毒抗血清抗SI133株的
辱尊墨喾二齑鱼盟病第堕墅l期塑噬里月 沙门氏菌病一一对鸡群微生物学控制的展望 P.A.Barrow
从长远观点看,要控制沙门氏菌病不能 仅限于预肪禽类自身感染的措施上,还必须 重视尸体处理过程中广泛存在的交叉污染. 一
些能够减少传染的微生物学技术,尚未被 普遍采用}某些控制措施,如化学治疗,在 一
定程度上已失去可靠性|另外一些措施, 如竞争排斥和免疫接种,虽在实验室条件下 证明可用,但有待于生产实践检验;采用噬
稿体控制动物细菌性传染的方法,也有待于 在禽类中验证.
被感染的雒鸡于出壳后不久就排泄沙门 氏菌,并且排菌时间比成年鸡长,这是因为 战年鸡盲肠混合菌群的活动受到抑制所致. 咀成年鸡粪便或盲肠内容物的悬液或粗制培 养枥;经口腔接种雏鸡,能使其获得成年鸡 才具有的充分的抗感染能力.这些非纯化培 养物在体外经大量培养传代或冻千后,采用 饮水或喷雾法施用能有效地控制沙门氏菌 病,其机理尚不清楚.有人认为,这是正常 菌群与沙门氏菌竞争盲肠内的结合位点或细 菌的代谢被抑制的结果.
很多国家因担心传入致病因子,而不瑟 ELIsA抗体效价:Cos抗血清的效价最低,而 2408和Sl133抗血清的最高,8卜5,UMI203 和l733抗血请的效价相似.
各株问交又VN试验的R值:Co抗其他 4株(除UMI203)的R值为l1,l5,一抗 UMI203的R值为30(说明亚型差异较大)j 相反,其他5株(除Coi)间的R值为33, 70(表明亚型差异较小)或在7O以上 (表明差异甚小或没有差异).
本研究的重要性在于首次查明目前所有 商品苗毒株(2408,1744,S1133,Cos和 应用非纯化培养物,然而,通过体外反复传 代培养和稀释可消除病毒和原虫污染形成的 危险.也可通过8PF鸸传代,从而保证培养 物不含传染性因子.通过分离出具有抑翩怍
用的细菌,以这种单个菌落的混合物接种 鸡,可使非纯化培养物的致病性危睑和性质 控制问题得到解决,但这种混合物的抑菌作 用一般低于非纯化培养物.纯化稻非纯化培 养物虽在实验室内都有效,但田间使用效果 却较低,可能是由于随着鸡的生长而出现的 交叉感染,或者是因为在接种对巳被沙门氏 菌感染.
由于以上制备物存在这些问题,有些研 究者已抗到具有沙门氏荫的集落特征且无毒 性的纯株沙门氏菌具有一种尚未鉴定的属 特异性抑制作用,这种作用既不是典型的免 疫反应,也不是噬菌体或细菌素活力的作 用.其中能抑触鼠伤寒沙门氏菌集落形成的 一
株是同源细菌的无致病突变株.这些菌株 在翻间是否有效,有待于观察.用相应的血 清型沙门氏菌免疫过的鸡群,能减少肠遭沙 门氏菌菌落和降低粪便排菌作用,采用弱毒 UMI203)和野毒株81—5前血清学相关性. 其中5株密切相关.S1133或UMI203为商品 活苗,是育种鸡的最佳选择;2408,1733和 S1133为灭活苗,可用于激发鸡体的血清抗 体.因Cos与其他5株的相关性小,故cba 可与其他任何一种灭活苗联合使用,以增加 其抗原谱.
(参考文献8篇,表3幅,从略)
Av.Dis.,1988,32,678~680(英文)
汪铭书译程安春'捩
范文二：阻断ELISA与中和试验检测猪瘟疫苗免疫猪血清抗体的比较
阻断ELISA与中和试验检测猪瘟疫苗免疫
猪血清抗体的比较
动物医学进展.2007,28(10):40—43
ProgressinVeterinaryMedicine 阻断ELISA与中和试验检测猪瘟疫苗免疫猪血清抗体的比较
李素,李尚波,王文成,苗玉和,马振宇,马秀玲
(1.吉林大学畜牧兽医学院.吉林长春130062;2.辽宁益康生物制品有限公司,辽宁辽阳111000)
摘要:应用阻断ELISA和中和试验2种不同的方法对猪瘟疫苗免疫前后的猪血清抗体进行了检测,
在所检测的6头仔猪免疫前和免疫后的l2份血清中,2种方法的检测结果相符.应用Westernblot对部分
血清进行了验证,结果与2种方法检测结果一致,表明阻断ELISA和中和试验结果确实,特异,能真实反映
免疫猪群的抗体水平.
关键词:猪瘟疫苗;抗体;阻断ELISA;中和试验
中图分类号:$852.651文献标识码:A文章编号:1007—5038(2007)10—0040—04 猪瘟(Classicalswinefever,CFS)是由猪瘟病毒
(Classicalswinefevervirus,CSFV)引起的一种急
性,热性高度接触性传染病口],该病是严重危害全球
养猪业的重要传染病,是世界动物卫生组织(OIE)
,我 疫病目录所列的必须通报的疫病之一.近年来
国猪瘟时有发生,主要表现为隐性带毒和慢性感染,
成为影响养猪业发展的一大隐患[2].定期开展免
疫猪群的抗体监测,淘汰免疫水平低下的猪,对防控
猪瘟具有重要意义.目前,猪瘟抗体监测的方法主
要有中和试验和ELISA,中和试验必须应用荧光抗
体染色,所以不利于临床检测,但结果准确,而 ElISA由于自身的弊端,容易出现非特异性反应, 但方法简便,易于操作,已成为临床检验常用的方 法.本试验应用国际公认的IDEXXCSFV抗体检 测ELISA试剂盒和参照欧盟中和试验方法检测 CSF疫苗免疫的猪血清,并应用Westernblot方法 对所检测血清进行了验证.
l材料与方法
1.1血清
1.1.1CSF阳性血清和阴性血清由辽宁益康生 物制品有限公司动物饲养中心提供,经过IDEXX CSFV抗体检测EIISA试剂盒验证,确定为CSF阳 性血清和阴性血清.
1.1_2CSF疫苗免疫前后猪血清由辽宁某养殖 场提供.6头40日龄仔猪,编号分别为l,2,3,4,5,
6号.6头仔猪分别于免疫前和2次免疫21d耳缘 静脉采血分离血清,免疫剂量为4头份/头. 1.2CSFV石门株血毒
购自中国兽医药品监察所,病毒效价为
10.一TCID5o/o.1mL.
1.3主要试剂
FITC标记的兔抗猪IgG荧光抗体和HRP标 记的兔抗猪IgG酶标抗体,购自Sigma公司;底物发 光试剂盒,购自Pierce公司;PVDF膜,购自Milli— pore公司;IDEXXCSFV抗体检测试剂盒,购自北 京爱得士元亨生物科技有限公司.
1.4阻断ELISA检测CSFV免疫猪血清 应用IDEXXCSFV抗体CSFV试剂盒进行检 测,方法如下:分别将5OL样品稀释液加入每个检
测孔和对照孔中,加入检测的血清5OL,阴性和阳 性对照血清5OL,混合后,将微量反应板在室温 (18?,25?)条件下于湿盒中感作2h,弃去反应 孔中的液体,应用PBST洗板3次,加入抗CSFV酶 标二抗,100sL/:~L,室温感作30min,应用PBST洗 板3次,加入底物溶液TMB,100肚L/孔,室温避光 感作lOmin,加入100L/孔的终止液,ELx800检 测OD..,计算阻断率.阻断率一(ODNeg-ODT)/
ODNe×1009/6.阳性血清对照阻断率大于5O,阴性对照平均OD.应大于0.5,阻断率小于3O为阴 性,阻断率在3O9/6,4O9/6之间为可疑,大于4O9/6为 阳性.
1.5中和试验检测CSF疫苗免疫猪血清
采用荧光抗体染色法进行中和试验,方法如下: 将CSF阳性,阴性血清以及待检血清按1:5, 收稿日期:2007—07—01
作者简介:李素(1978一).男.黑龙江巴彦人,博士研究生,主要从事分子病毒学研究.
李素等:阻断ELISA与中和试验检测猪瘟疫苗免疫猪血清抗体的比较4l
l:10,l:20,l:40,l:80,l:l60稀释.每份待
检血清设4个重复,将CSFV石门株血毒稀释至 200TCID./o.1mL,与等体积的稀释后的血清混 合,于37?感作lh.共同接种PK细胞,
100L/孑L(病毒i00TCID../孑L).72h后应用 800mL/L冷丙酮固定,将CSF阳性血清作50倍稀 释,100ttL/~L,37?感作1.5h,加入50倍稀释的 FITC标记的兔抗猪IgG50ttL/~L,在37?感作lh 后,应用200LPBST洗涤5次,每次5rain,加入 30L50mL/L的甘油生理盐水,在荧光显微镜下
观察结果.以每孑L中出现荧光斑数目大于或等于1 个,即判为病毒没有被完全中和.4个重复孑L中有 "
一一
"(4个孔均为阴性)为病毒完全被中和,该稀释 度N即为血清的效价,此时的血清抗体效价为l: N;若4个孑L中有1个孔为"+",为该稀释度的病毒 没有完全被中和,此时的效价为l:[(N/2)3/4+ N/2)].
1.6Westernblot
将纯化的MBP—E2蛋白[43,经SD~PAGE分析 后,将蛋白条带以30mA电转4h转移至PVDF膜 上,以10g/LBSA在4?条件下封闭过夜,PBST 洗涤3次,每次10rain,加入l500倍稀释的免疫前 和免疫后的l号,4号和6号血清,37?作用2h,以 PBST洗涤3次,每次10rain,加入15000倍稀释的 兔抗猪IgG酶标抗体,37?作用lh,以PBST洗涤 3次,每次10rain,加入Pierce发光底物室温作用 3rain,于暗室曝光,显影后定影.
2结果
2.1阻断ELISA检测CSFV免疫猪血清
根据IDEXX试剂盒的判定标准,阳性血清对照 阻断率大于50,阴性对照平均OD.应大于0.5, 本次试验标准阳性血清的阻断率为86.0l,阴性 血清的ODs.为1.126,显示本次试验成立.免疫接 种前的6份血清除4号为可疑外,其余5份均为阴 性(阻断率小于30%为阴性,阻断率在30%,40% 之间为可疑,大于40为阳性);免疫后的血清除6 号外,其余5份血清均为阳性.血清检测结果见图 l.
123456
编Coding
图lELSIA检测CSF疫苗免疫猪前后的抗体水平
Fig.1ELISAresultsfortheantibodiesofCSFvaccinepre-immunizedandpost-immunizedpi
gs
2.2中和试验结果效价结果见表l.
中和试验结果见图2,免疫前后猪血清抗体中和
表1免疫前后猪血清抗体中和效价检测结果
Table1Neutralizationantibodytitersofthepre-immunedandpost—immunedpigs ??如?加0
.IMII一)Iu0一?
\释藉岛
42动物医学进展2007年第28卷第lO期(总第170期)
A.正常细胞,B.标准阴性血清(40×稀释),C.标准阳性血清(40×稀释){D.1号免疫前血清5×稀释,E.1号免疫后血清25×稀释;F.4号免疫
前血清7.5×稀释{G.4号免疫后血清35×稀释{H.6号免疫前血清5×稀释;I.6号免疫后血清5×稀释
A.SampleofnoiTNalPK-15lB.Negativeserumcontrol(dilutedinto4O
×);C.Positiveserumcontrol(dilutedinto4O×),D.Pre-immunizedser- um1(dilutedinto5×)lE.Post—immunizedserum1(dilutedinto25
×){F.Pre-immunizedserum4(dilutedinto7.5×){G.Post-immunizedser—
um4(dilutedinto35×)lH.Pr~immunizedserum6(dilutedinto5
×),I.Post-immunizedserum6(dilutedinto5×)
图2免疫前后血清的中和试验结果
Fig.2Neutralizationtestsoftheserumofpre-immunizedandpost—immunizedpigs 图2列出的为该稀释度下的荧光照片结果,如
D代表该血清在5倍稀释时的中和试验结果,说明
在该稀释度下血清没有中和病毒,抗体效价小于
1:5;G代表该血清在35倍稀释时的中和试验结
97ku
66ku
43ku
3lku
M
l果,说明在该稀释度下病毒完全被血清中和,抗体效价等于1:35.2.3Westernblot应用化学发光法进行Westemblot,结果见图3.234—-
67
1.一79ku
M.蛋白分子质量标准,1.MBP-E2蛋白的SDS-PAGE,2.MBP-E2蛋白与1号免疫前血清反应的Westernblot,3.MBP-E2蛋白与1号免疫后
血清反应的Westernblot,4.MBP-E2蛋白与4号免疫前血清反应的Westernblot,5.MBP-E2蛋白与4号免疫后血清反应的Westernblot{ 6.MBP—E2蛋白与6号免疫前血清反应的Westernblot,7.MBP—E2蛋白与6号免疫后血清反应的Westernblot
M.ProteinmoleculeweightMarker,1.SDS-PAGEanalysisofMBP-E2proteinl2.3.Western
blotanalysisofthepre-immunizedandpost-immu- nizedserum1reactedwithMBp-E2protein;4,5.Westernblotanalysisofthepre-immunizeda
ndpost?immunizedserum4reactedwithMBp-E2 proteinl6.7.Westernblotanalysisofthepre-immunizedandpost—immunizedserum6reactedwithMBp-E2protein 图3免疫前后血清的Westernblot分析
Fig.3Westernblotanalysisoftheserumofpre-immunizedandpost-immunizedpigs
李素等:阻断ELISA与中和试验检测猪瘟疫苗免疫猪血清抗体的比较43 3讨论
本试验应用ELISA和中和试验两种不同的方
法对CSF疫苗免疫猪的血清抗体进行了检测,6份
猪血清经过ELISA检测,有1份血清免疫前(4号血 清免疫前)为可疑,而中和试验结果也证实了这一血 清中含有CSFV抗体(在病毒为100TCID./孔时的 抗体效价为1:7.5),免疫后的血清除6号外,其余 5份血清经ELISA检测均为阳性,中和试验检测这 5份血清抗体效价均高于1:25,这两种方法在检测 CSFV血清上有一定的相关性,检测结果的符合程 度非常高,由于ELISA和中和实验的敏感程度不一
致,不能确定二者线性关系.2种方法均未检测到6号猪免疫后所产生的抗体,可能CSF疫苗没有诱导 6号猪产生免疫应答.
为了进一步验证这两种方法的可靠性,本试验 应用所表达和纯化的MBP—E2蛋白通过Western blot方法来检测1号,4号和6号猪免疫前后的血清 的反应性,Westernblot结果表明MBP—E2蛋白不 与1号,4号和6号猪免疫前的血清反应,也不与6 号猪免疫后的血清发生反应,而与1号,4号猪免疫 的血清发生反应,进一步说明了6号猪免疫后没有 产生抗体,而1号,4号猪免疫后产生了抗体.这种 情况与临床的实际情况相符,临床上存在着免疫水 平低下的猪,猪瘟疫苗免疫水平低下的猪是造成猪 瘟感染,传播以及免疫失败的一个因素,定期的开 展免疫监测以清除免疫水平低下的猪对于猪瘟的净 化具有重要意义.本试验通过养殖场提供的猪瘟免 疫弱毒疫苗免疫前后猪血清,通过阻断ELISA和中 和试验来检测其抗体水平,结果表明二种方法具有 很好的相关性,并与临床的实际情况相符.Western blot验证,没有出现非特异性的反应.关于本次中 和试验,其不足之处是初始稀释倍数(1:5)有些偏
高,倍比稀释倍数为1:10,1:20,1:40,1:80,1:
160倍稀释,导致所测得的抗体效价准确程度不高,
若初始稀释倍数为1:2,倍比稀释倍数为1:4,1:
8,1:16,1:32,1:64,1:128,结果的准确程度就
更高了.因此,本次中和试验中每个稀释度的血清
作了4个重复,相对地减少了试验的误差,中和试验
的结果能够反映免疫猪的血清抗体水平.
参考文献:
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1997.
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ComparasionofBlockingEnzyme-linkedlmmunosorbentAssayand
NutralizationTestjnDetecingAntibodiesofPigsInoculatedwithCSFVaccine
L1Su",LIShang—bo.,WANGWen-cheng.,MIAOYu—he.,MAZhen—yu.,MAXiu—
ling.
(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changchun,Jilin,1
30062,Chinat
2.LiaoningYikangBiologicalProductCO,.Ltd,Liaoyang,Liaoning,111000,China)
Abstract:BlockingELISAandneutralizationtestwereusedindetectingantibodiesofpigsino
culatedwith
CSFvaccineinclinicaltest.Therewere12piecesofseracollectingfrom6pre—
immunizedandpost—immu—
nizedpigs,respectively.TheresultsshowedthattheywereidenticalbetweentheblockingELISAandneu—
tralizationtestindetectingantibodies.Inordertoidentifytheresultsfurther,Westernblotmethodwas
usedindetectingsomeofantibodies.TheresultsshowedthattheywereidenticalamongWesternblot,
blockingELISAandneutralizationtest.Inconclusion,blockingELISAandneutralizationtestwerepre—
cise,correctandspecific.Itcanreallyreflecttheclinicalconditionofantibodiesinpigs. Keywords:CSFvaccine;antibody;blockingenzyme-linkedimmunosorbentassay;neutralizationtest
范文三：本试剂盒仅供血站和试验筛查用体外测定血清中麝香草酚...
执行标准号:YZB/国 0741-2003
产品注册号:国食药监械(试)自2004第3061223号 麝香草酚浊度试剂盒-TTT
生产许可证号:京 药管械生产许 20000106,更,号
编号 1031
简介
本试剂盒仅供血站和试验筛查用体外测定血清中麝香草酚浊度。适用于手工、半自动生化分析仪。 麝香草酚浊度实验是肝功常规检查项目，当肝脏有实质性病变时，血清蛋白的质与量可能有所改变。当血清与麝香草酚巴比妥缓冲液作用时，麝香草酚可减低血清酯质的分散力，而血清经低离子化巴比妥缓冲液稀释后，球蛋白部分溶解度降低而产生沉淀，此沉淀为球蛋白类酯质胆固醇与麝香草酚的复合体，使溶液变浑浊。其浊度可与人工标准浊度管比较，求出麝香草酚浊度，大小可用麦氏单位表示。
测定原理
当肝脏有实质性病变时，血清蛋白的质与量可发生变化，加入麝香草酚试剂后，可产生球蛋白-麝香草酚-磷脂复合物沉淀而浑浊，其浑浊程度和沉淀的多少与肝病的严重程度有一定关系。
试剂盒组成
规 格 组 份 浓 度
500mL×1
麝香草酚浊度试剂 200mL×1 麝香草酚 > 0.5%
2500mL×1
样本要求
按临床检验常规要求采集处理样本，选用未溶血血清、血浆作样本。
操作方法
测定管 标准管
样 本(μL) 25 ——
试 剂(mL) 1.5 —— 混匀，室温放置30分钟，在630 nm，以蒸馏水调零，测定吸光度。
标准管直接测定且可反复使用。
1.用一般分光光度计测量各管吸光度A.
2.用半自动生化仪测定:
调零:以蒸馏水调零
校正:吸入标准溶液，显示值为A标
测定:吸入测定溶液，显示值为A样
计算: A样 TTT = × 10 A标
比浊后置37?水浴中，1小时30分钟观察絮状反应。
絮状反应标准:
(,):管内液体仍保持均匀乳白色，无颗粒出现。
(，):管内液体呈颗粒状，均匀分布。
(，，):管内液体显较粗之絮状物，但并不沉淀。
(，，，):管内已有絮状沉淀，但上层液体仍浑浊。
(，，，，):管上层液体完全澄清，絮状物全部沉淀于管底。
注意事项
1.试剂出现混浊，请不要使用。
2.室温变化对结果有影响，要求室温在20?,30?最好。
3.所用试管必须清洁，避免酸碱污染。
4.标准管测定前应充分混匀后再测定吸光度值。
贮存条件及有效期
25?以下保存，禁冻结，有效期12个月。
参考值范围
浊度0,5单位
建议各实验室建立本地区人群的正常参考值范围。
参考文献
1.朱忠勇、陈之航 临床医学检验 上海科学技术出版社1978， P317。
2.叶应妩、王毓三 全国检验操作规程(第二版) 东南大学出版社1997，P253,P255。
北京北化康泰临床试剂有限公司 Beijing BHKT Clinical Reagent Co.,Ltd 注册地址:北京市通州区台湖镇董村工业园5号 生产地址:北京市通州区台湖镇董村工业园5号 通信地址:北京邮政100023—116信箱 网址:WWW.BJBHKT.COM E-mail:bjbhkt@163.com 传真:010—81502836/2838-14 电话:010—81502836/2838/2819/2892-11
2005年版
范文四：血清胱抑素C、血清肌酐和血清尿素在临床检验中的比较和应用
血清胱抑素 C 、血清肌酐和血清尿素在临床检验中的比较和应用 09-05-18
管超楠
【 摘要 】 目的 讨论血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂 C (血清胱抑素 C ) (Cys C)的浓度和血清肌酐 (Scr )血清尿素 (Sur )浓度在成年人肾功能评价中的意义比较。 方法 用颗粒曾强透视免疫比 浊法在日产 HITACHI 7600自动生化分析仪上测定血清胱抑素 C ,同时用苦味酸动力学法测定血清 肌酐和尿酶速率法测定血清尿素浓度。 结果 血清胱抑素 C 异常结果检出率高于血清肌酐和血清 尿素;血清胱抑素 C 浓度各相邻年龄组间比较,差异均有统计学意义(p<0.05) ,血清肌酐和血="" 清尿素浓度各相邻年龄组间差异均无统计学意义(p="">0.05) ;血清胱抑素 C 、血清肌酐和血清尿素 与年龄的相关系数 r 分别为 0.535、 0.342和 0.279。 结论 在血清胱抑素 C 、血清肌酐和血清尿 素中血清胱抑素 C 是评价成年人肾功能最理想的指标,但是联合检测血清胱抑素 C 、血清肌酐和 血清尿素可以提高诊断的准确性
【 关键词 】半胱氨酸蛋白酶抑制剂 C ;血清肌酐;血清尿素;肾功能测试;成年人
自 2000年开始,我国已经步入人口老龄化时代,如何提高成年人的生活质量预防各种老年病 已经为各级政府及广大医务工作者所关注。由于成年人特有的生活工作压力,不健康的生活习惯 和不规则的生活起居导致机体多脏器出现老年人才会表现出的机体脏器功能代偿。而肾脏率过功 能也像机体的其他技能一样在逐渐受损,功能减退。所以对于成年人各种慢性疾病的前期体检预 警成为成年人临床治疗的关键。而且慢性疾病的前期观察诊断对临床治疗的预后具有非常积极重 要的作用。目前,临床通常以血清肌酐和血清尿素作为肾功能的实验室指标,但它们都有各自的 弊端。今年来随着检验技术的发展及检测自动化,血清胱抑素 C (cystatin C , Cys C )作为肾功 能的实验室指标,倍受人们关注。本组以参加我院健康体检的 250例成年人为对象,测定其血清 胱抑素 C 、血清肌酐和血清尿素的浓度,来探讨血清胱抑素 C 和血清肌酐、血清尿素在评价成年 人肾功能方面的作用比较。
材料与方法
1、 对象:随机选取来我院进行健康体检的成年人 250例,其中男性 117例,女性 133例,年 龄在 50~59岁,均否认有原发性肝肾病史。按不同年龄分为 4组:50~59岁组(其中男性 10例,女性 16例) ; 40~49岁组(其中男性 19例,女性 17例) ; 30~39岁组(其中男性 69例,女性 65例) 20~29岁组(其中男性 19例,女性 37例) 。
2、 仪器与试剂:实验仪器为 HITACHI 7600自动生化仪,胱抑素 C 检测试剂由 BACKMAN 实验系
统有限公司提供,按说明书设置参数, 6点定标;肌酐、尿素检测试剂购买自 BACKMAN 实验 系统有限公司,按规定各项定标通过,质控符合要求。
3、 方法:血清胱抑素 C 检测采用德灵公司提出的乳胶增强的散射免疫比浊发,它是以多克隆 兔抗体为基础的改良免疫比浊发;血清肌酐检测采用苦味酸动力学法;血清尿素检测采用 尿素酶速率法。
4、 统计学处理:所有计量资料以?±s 表示,多组间比较采用方差分析,组间差异率的比较分 析采用 x 2检验,以 p<0.05为差异有统计学意义,对各数据与年龄进行相关分析,数据采用>
结果
1、 以血清胱抑素 C 大于 1.55mg/l,血清肌酐大于 135μmol/l,血清尿素大于 3.75mmol/l为异 常, 250例成年人体检者的肾功能指标异常者分别为血清胱抑素 C15例(6.0%) 、血清肌酐 5例(2.0%) 、血清尿素 21例(8.4%) 。血清尿素、胱抑素 C 的异常率高于肌酐,尚无统计 学意义(p>0.05) 。但血清肌酐异常者其血清胱抑素 C 、血清尿素全部异常,在血清胱抑素 C 异常的 15例中,既往有或者体检结果有高血压病者 6例、糖尿病者 4例、糖尿病合并高 血压者 3例,无明显疾病者 2例。
2、 以 10岁为年龄段分组, 250例成年体检者血清胱抑素 C 、血清肌酐、血清尿素结果见表 1. 血清肌酐除 50~59岁组显著提高于各组外,其余各相邻组间血清肌酐、血清尿素差均无统 计学意义。血清胱抑素 C 在各相邻组间差异有统计学意义(p<0.05)>
表 1 成年人体检者各年龄段血清胱抑素 C 、肌酐、尿素结果 (±s )
组别 例数 胱抑素 C (mg/L) 肌酐(μmol/L) 尿素(mmol/L)
50~59岁组 26 1.40±031102.06±19.61 3.250±1.86
40~49岁组 36 1.16±0.2796.72±18.70 2.81±1.64
30~39岁组 134 1.05±0.1890.43±14.03 3.61±1.33
20~29岁组 54 0.92±0.1885.96±17.52 2.46±1.20
3、 血清胱抑素 C 、肌酐、尿素与年龄作相关性分析,相关系数分别为 0.535、 0.342、 0.279, 3项指标都与年龄存在一定正相关,但胱抑素 C 与年龄的相关程度高于肌酐和尿素。
讨论
血清尿素首先被作为肾功能的评价指标,但它不符合内源性肾小球滤过率(glomerular filtration rate , GFR )标志物的要求,当 GFR 减少到正常值的 40%以前,尿素浓度升高缓慢,
并且与外源性(蛋白质摄入量)与内源性(感染、肾上腺皮质激素的应用、胃肠出血等)尿素 负荷的大小有关,更重要的是肾小管对尿素有明显的被动重吸收刈。肌酐基本符合内源性 GFR 标志物的要求,目前国内外仍用血清肌酐作为临床常规评估肾小球滤过功能受损的指标.但只 有当 GFR 下降 1/3~1/2时.血清肌酐才有明显变化,而且受性别、饮食、肌肉量等因素的影 响。因此,尿素、肌酐都不是评价肾功能的理想指标。
1983年 Anastasi 等首次在鸡蛋清中分离得到高纯度的半胱胺酸蛋白酶抑制剂(cysteinne proteinase in hibitor, CPI)后被命名为胱抑素 C ,是一种半胱胺酸蛋白酶抑制剂,也被称 为 r-微量蛋白及 r-后球蛋白。 Northernx 印记也发现胱抑素 C 基因在所有的被观察的组织均表 达,包括肾、肝、胰、肠、胃、肺及胎盘,无组织特异性。由于胱抑素 C 是一种分泌蛋白故广 泛存在于各种组织的有核细胞和体液中, 是一种低分子量、 碱性非糖化蛋白质, 分子量为 13.3KD , 由 122个氨基酸残基组成,血浆中带正电荷,可由机体所有有核细胞产生,产生率恒定,可以 自由的通过肾小球。肾小球近曲小管上皮细胞对胱抑素 C 有重吸收作用,但随后就被分解,这 样肾小球滤过的胱抑素 C 就不会返回血液中。循环中的胱抑素 c 仅经肾小球滤过而被清除,是 一种反映肾小球滤过率变化的内源性标志物。
Crubb 及 Simonsen 等首先研究了血中低分子量蛋白质(β2-微球蛋白、视黄醇结合蛋白、 胱抑素 C )浓度与 GFR (51Cr-EDTA 清除率)相关性,发现血清胱抑素 C 、 β2-微球蛋白及视黄 醇结合蛋白浓度的倒数与 GFR 的相关系数 γ分别为 0.77、 0.7、 0.39, 血清肌酐浓度倒数与 GFR 的相关系数 γ为 0.75。 Bokenkamp 等将菊粉测定的 GFR 与血清胱抑素 C 和血清肌酐比较, 相关 系数 γ分别是 0.88和 0.72;用碘海醇法测定的 GFR 与血清胱抑素 C 和血清肌酐比较,相关系 数分别是 0.87和 0.71。以上研究表明血清胱抑素 C 与 GFR 比血清肌酐与 GFR 有更好的相关性。 李玉林等用乳胶增强的免疫散射法测试血清胱抑素 C ,还分别测试了血清肌酐和尿肌酐,并比 较了它们之间的关系,结果发现血清胱抑素 C 与血清肌酐有显著正线形关系(p<0.001) ,与尿="" 肌酐的对数成显著负线形相关:logcystatin="" c="-0.606logCcr+1.209(r=-0.709)。肾脏是清除" 血液循环中胱抑素="" c="" 的唯一器官,所以血清胱抑素="" c="" 浓度主要由="" gfr="" 决定,由此可见血清胱抑="" 素="" c="" 比血清肌酐更能理想的反映="" gfr="">
本实验结果显示,在全部 250例成年体检者中有 l 5例血清胱抑素 C 异常(6%) 、 5例血清 肌酐异常(2%) 、 21例血清尿素异常(8.4%) ,异常率血清胱抑素 C 高于肌酐,二者尚无统计 学意义,与多数报道不符,这可能是本组的标本量少而且来自健康体检者所致。同时,各年龄 组的胱抑素 C 浓度随年龄的增长而增高,且各相邻组间差异均有统计学意义,而肌酐除与 50~ 59岁组相比有统计学意义外, 其余各相邻组间血清肌酐、 血清尿素差异均无统计学意义。 再者,
虽然三者都与年龄呈正相关.但血清胱抑素 C 与年龄的相关程度最大,说明胱抑素 C 浓度随年 龄的增长而明显增高,而血清肌酐、血清尿素随着年龄的增长其浓度仅小幅升高,是因为当成 年人的肾脏滤过功能轻度受损,特别是长期不健康的生活习惯导致机体个代谢功能的损伤,而 长期的生活工作压力导致高血压的几率升高,肌肉量及健康饮食减少,影响到血清肌酐、血清 尿素小幅升高。因此本人认为,胱抑素 C 在评价肾脏滤过功能方面比肌酐更敏感,将血清胱抑 素 C 作为评价成年人肾功能指标尤为必要。
综上所述,血清胱抑素 C 作为评价肾功能的指标时, 敏感性优于血清肌酐,特别适用于成年 人健康体检。对于慢性肾功能疾病的早期预警诊断比血清肌酐、血清尿素更准确、更敏感。然 而,对于肾脏疾病患者,联合检测血清胱抑素 C 、血清肌酐和血清尿素可以提高诊断的准确性, 有助于对后期的治疗、预后情况的临床评价。
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范文五：梅毒的血清学试验和临床相关问题（1）
梅毒是由梅毒螺旋体（Treponema pallidum，TP）引起的一种慢性传染病。对梅毒的诊断除了通过临床症状外，主要是通过实验室血清学试验进行诊断。以下对于梅毒的相关试验进行概述。
??????? 梅毒螺旋体的抗原结构
梅毒的抗原结构包括：
1.外膜脂蛋白抗原：具有强免疫原性，是梅毒螺旋体的主要免疫优势抗原。
2.轴丝抗原：是梅毒螺旋体的运动器官，其免疫原性很强，可以刺激机体产生细胞和体液免疫应答。
3.4D抗原：为螺旋体特异性表面抗原
???????? 机体对梅毒螺旋体感染的免疫应答包括：
1.非特异性类脂质反应素抗体：即抗心磷脂（cardiolipin）抗体，又称为反应素。是梅毒螺旋体在破坏机体组织的过程中，体内释放一种心磷脂抗原，这种抗原可刺激机体产生相应的抗体。反应素多为IgA和IgM混合型抗体，此类类脂质抗体在体外可增强巨噬细胞对梅毒螺旋体的吞噬作用。未经治疗的梅毒患者血清中反应素可长期存在，经适当治疗后可逐渐减少，直至消失。
2.抗密螺旋体的特异性抗体：早期患者以产生针对梅毒螺旋体轴丝中37KDa鞘亚单位成分的IgM抗体为主；另外还有针对梅毒螺旋体多肽（分子量分别为45、42、33、30、16.5、15.5KDa）的抗体。二期梅毒时，血循环中可出现抗全部梅毒螺旋体抗原的IgM和IgG抗体，对多肽的抗体除了以上六种外，又增加了另外16种多肽抗体。如经治疗，IgM抗体浓度降低，血清中只能检出IgG抗体。当疾病进入晚期时，则血循环中的某些抗梅毒螺旋体抗原多肽的抗体会逐步消失。
??????? 梅毒血清学检查
1．经典的梅毒血清学试验
补体结合试验：1906年由Wasserman建立，是最早使用的梅毒螺旋体感染诊断的血清学试验。
絮状沉淀试验：1920年由Kahn建立.
2．使用类脂质抗原的血清学试验
性病研究实验室试验（ Venereal diseaseresearch laboratory test, VDRL）
不加热血清反应素试验(Unheated serumreagin test, USR)
快速血浆反应素环状卡片试验(Rapid plasmareagin circle card test， RPR)
甲苯胺红不加热血清试验（ Toluidine redunheated serum test ， TRUST）
使用类脂质抗原的血清学试验：优缺点---测定操作简便快速，对一期梅毒的阳性反应出现较早，对二期梅毒也有诊断价值。但该试验特异性较差，生物学假阳性可见于多种疾病，如麻风、结核、红斑狼疮、性、猩红热、慢性肝病、HIV感染等。由于感染梅毒螺旋体后，机体血循环中心磷脂抗体的出现要晚于特异性的抗梅毒螺旋体抗体，并且晚期梅毒这类抗体还有可能转阴，因此，上述过筛试验不适于一期梅毒早期和三期梅毒的临床诊断。
3．使用密螺旋体抗原的血清学试验
荧光密螺旋体抗体吸收试验（Fluoresenttreponemal antibody-absorption test, FTA-ABS）
梅毒螺旋体血球凝集试验（Treponema pallidumhemagglutination assay, TPHA）
梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（Treponemapallidum particle agglutination assay, TPPA）
酶联免疫吸附试验（ELISA）
蛋白印迹技术（Western blotting, WB）
荧光密螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）
本试验是将梅毒螺旋体Nichols株抗原直接涂在载玻片上，然后将密螺旋体无毒株（Reiter株）制成吸收剂加至待测血清标本中反应30分钟，以去除同属抗原的交叉反应。再将吸收后的血清加到玻片的抗原膜上，37℃温育30分钟，用PBS缓冲液冲洗晾干，再加荧光素标记的抗人IgG， 37℃温育后冲洗，晾干，最后在荧光显微镜下观察结果。本试验由于吸收试剂的使用， 提高了测定的特异性，可达92%。由于使用的是梅毒螺旋体Nichols株抗原，密螺旋体各种抗原分子均存在，提高了试验的敏感性。对一期梅毒的敏感性为80%，，二期为99~100%， 三期为95~100%。测定假阳性可见于高丙种球蛋、全身免疫性疾病和生殖器疱疹等。FTA-ABS是公认的“经典”密螺旋体抗原的血清学试验。
梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）
本试验是以梅毒螺旋体作为抗原的间接血凝试验，操作简便， 通常作为梅毒螺旋体感染的特异性验证试验。所用抗原为将梅毒螺旋体Nichols株经超声破碎后得到的可溶性抗原成分，用其致敏红细胞。同时，同样用Reiter株制成吸收剂稀释血清，可将血清中的非特异性抗体吸收掉， 以加强测定的特异性。本方法测定敏感性和特异性均较高，操作较为简便，无需特殊的仪器设备，但其对一期梅毒的检测阳性率不如FTA-ABS。
梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）
TPPA的测定原理基本上与TPHA类同，所不同的是TPPA所用的凝集颗粒为明胶，而非TPHA中的红细胞。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
采用基因工程梅毒螺旋体抗原以双抗原夹心法检测梅毒抗体，具有简单、快速和高通量的优点，应是梅毒血清学诊断试验的首选方法。
蛋白印迹（WB）
首先将将梅毒螺旋体Nichols株菌体细胞用SDS破碎，再使用聚丙烯酰胺凝胶电泳将将梅毒螺旋体各种抗原成分分开形成不同区带，经电转印可将这些条带转移至硝酸纤维素膜上作为抗原，最后采用酶标技术检测病人血清中的相应特异抗体。梅毒螺旋体特异区带如TpN15,TpN17,TpN45 和TpN47至少两条以上出现阳性时即可判断为阳性。本方法要优于FTA-ABS；其对二期梅毒、早期梅毒、神经梅毒具有100%的阳性诊断率，对使用RPR、FTA-ABS和TPHA等试验出现的假阳性血清标本，用本法均为阴性。本法使用商品试剂，则操作简单，易于掌握且无需特殊设备和试验条件，是一种很好的确认试验。
??????? 梅毒螺旋体感染的临床检测程序
??????? 结果报告和解释
结果报告和解释
方法
结果
解释
RPR、TRUST
反应性
有梅毒感染的可能性， 一期或二期梅毒， 假阳性反应性常见于感染性疾病、自身免疫病和慢性肝病等。可采用特异性抗体实验验证确认。
非反应性
不能排除梅毒一期早期和三期。可采用TPPA、ELISA等特异抗体检测方法排除
ELISA、TPPA、TPHA
反应性
有梅毒感染的可能性， 可为各期梅毒， 假阳性反应性常见于感染性疾病、自身免疫病和慢性肝病等。可采用蛋白印迹（ WB）方法确认。
非反应性
未检出梅毒抗体。患者未感染梅毒。除非有其他证据证明感染的存在。
WB、FTA-ABS
阳性
梅毒抗体阳性， 假阳性的可能性较小， 结合临床病史及症状判断。
不确定
梅毒抗体检测结果为不确定， 建议对患者追踪观察或采用PCR方法检测确认
阴性
未检出梅毒抗体。患者未感染梅毒。除非有其他证据证明感染的存在。
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