范文一:苹果酸脱氢酶
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苹果酸脱氢酶详细信息
本文详细介绍了苹果酸脱氢酶的产品信息,包括中英文名称、别名、cas号、分子结构等基本信息,以及产品的物化性质、产品用途、产品上下游产品等综合信息,为广大化学品研究、化工产品生产制造从业者提供专业的产品信息。本文所有信息来源化工字典。
苹果酸脱氢酶
http://product.chemmade.com/detail-苹果酸脱氢酶.html
产品介绍:
中文名称:苹果酸脱氢酶
中文别名:
英文名
称:malatedehydrogenasefromhogheartcryst.susp~1200U/mg
英文别名:
CAS:9001-64-3
分子结构式:
EINECS:232-622-5
分子式:
分子量:
风险术语:
网址:www.chemmade.com
电话:025-86816800 传真:025-86816808
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安全术语:
物化性质:
熔点:
相对密度:
溶解性:
用途:
上游原料:
下游产品:
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范文二:苹果酸脱氢酶(MDH)提取液
北京雷根生物技术有限公司www.leagene.com
苹果酸脱氢酶(MDH)提取液
简介:
苹果酸脱氢酶(MalateDehydrogenase,MDH)是合成苹果酸的关键酶之一,催化苹果酸和草酰乙酸(OAA)的相互转化,参与众多生理代谢途径如TCA循环C4循环脂肪酸的氧化呼吸作用氮同化等,因此MDH在植物的生长发育中发挥着重要作用,广泛存在于线粒体、细菌细胞膜上,为三羧酸循环中的一种酶,由于酶的来源不同,其某些性质也不尽相同。MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。
Leagene苹果酸脱氢酶(MDH)提取液主要用于裂解植物组织,提取样品中的苹果酸脱氢酶。该试剂仅用于科研领域,不宜用于临床诊断或其他用途。
组成:
编号
名称CS0431
500ml
1mlStorage试剂(A):苹果酸脱氢酶提取液试剂(B):PMSF
使用说明书4℃避光4℃1份
自备材料:
1、蒸馏水
2、离心管或试管
3、匀浆器或研钵
4、低温离心机
操作步骤(仅供参考):
1、取植物组织清洗干净,切碎。
2、配制苹果酸脱氢酶提取工作液:取出苹果酸脱氢酶提取液和PMSF,恢复至室温,混合,混匀,即配即用,不易久置,否则蛋白酶抑制剂PMSF的效率会有所下降。
3、加入预冷的苹果酸脱氢酶提取工作液,冰浴情况下充分匀浆或研磨。
4、离心,留取上清液即为苹果酸脱氢酶粗提液,保存,用于苹果酸脱氢酶的检测或其他用途。
计算:
组织或植物粗酶液获得率(ml)=上清液体积(ml)/组织或植物质量×100%
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1、实验材料应尽量新鲜,如取材后不立即使用,应存于-20-80℃。
2、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂,同时需避免反复冻融。
3、所测样本的值高于标准曲线的上限,应用苹果酸脱氢酶提取工作液稀释样品后重新测
定。
4、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期:12个月有效。
相关:编号
CC0007
CS0001
DC0032
DF0135
NR0001
PS0013
TC1167名称磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁)ACK红细胞裂解液(ACKLysisBuffer)Masson三色染色液多聚甲醛溶液(4%PFA)DEPC处理水(0.1%)RIPA裂解液(强)尿素(Urea)检测试剂盒(脲酶波氏比色法)
范文三:苹果酸脱氢酶的结构及功能
第26卷第4期2009年8月生物学杂志JOURNALOFBIOLOGYVol126 No14
Aug,2009
doi:10.3969/j.issn.1008-9632,2009.04.069
苹果酸脱氢酶的结构及功能
汪新颖,王 波,侯松涛,朱国萍
1
1
1
1,2
(1.安徽师范大学生物大分子进化重点实验室;2.安徽师范大学分子生物学及生物技术研究所,芜湖241000)
摘 要:苹果酸脱氢酶(MDH)可以催化苹果酸与草酰乙酸间的可逆转换,主要参与TC、C4循环
等代谢途径。苹果酸脱氢酶可分为NAD2依赖性的MDH(NAD)2MDH)。在所有真核生物和大部分细菌中,MDH通常形成同源二聚体,催化机制和它们的动力学性质十分类似,,包括线粒体中的能量提供和植物的活性氧代谢等。,并针对其生化特性、空间结构特点、。关键词:;;功能中图分类号:.文献标识码:B
文章编号:1008-9632(2009)04-0069-04
苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase,MDH)普遍存在于动物,植物,细菌等各种生物体中,是生物糖代谢的关键酶之一,能催化苹果酸与草酰乙酸之间的可逆转换。MDHs在细胞的多种生理活动中起着重要的作用,包括线粒体的能量代谢以及植物的活性氧代谢等。根据不同的辅酶特异性,MDHs分为NAD2依赖性的MDHs(NAD2MDHs)和NADP2依赖性的MDHs(NADP2MDHs)。细菌中通常只含有NAD2MDHs,存在于细胞膜上。在真核细胞中,NAD2MDHs分布于细胞质和线粒体中,NADP2MDHs位于叶绿体。近些年来由于MDHs的工业应用价值,其受关注的程度日益上升。1 苹果酸脱氢酶的生化特性1.1最适pH值和最适温度
MDHs的最适pH值偏碱性,约在8.0左右,如链霉菌(Streptomycesaureofaciens)和大肠杆菌的MDH(E.coliMDH,EcMDH)都在pH值8.1的时候酶活性最高。MDHs的最适反应温度为40~65℃。如枯草杆菌MDH和猪心肌MDH的最适温度约50℃,嗜热脂肪芽孢杆菌(BacillusstearothermophilusMDH,BsMDH)在65℃有较好的稳定性。在温度趋向两极的情况下,大多数种属的MDHs活力不高,但来自嗜寒细菌(Aquaspilliumarcticum)的MDH(AaMDH)在4℃左右仍然保持较高的活性,嗜热细菌(Thermophilicbacterium)的MDH在
收发日期:2008-10-10;修回日期:2008-11-13
90℃仍然可以保持1h左右的活力,这种差异可能是由
于活性位点某种残基的偏爱、底物和辅因子电荷的分
布以及亚基间离子对的相互作用等原因造成的。1.2热稳定性
EcMDH和枯草杆菌MDH的热稳定性较差。嗜热脂肪芽孢杆菌BsMDH在高温下相当稳定。嗜寒细菌AaMDH不耐热,推测与氢键数目、脯氨酸或甘氨酶分子的数量、位置、及它们的相互作用有关。有分析表明醇类物质对MDHs的热稳定有一定影响。在低温环境下,甘油是维持MDHs活性的最好稳定剂,而环多醇和山梨醇能在高温下维持MDHs的活性。这种稳定原理可能是羟基基团和酶分子的相互作用或是醇类减少了介质的介电常数而加强了酶分子的疏水作用,使酶蛋
[1,2]
受水分子的影响减少。还有的研究表明,增加二硫键或氢键可以改善MDHs的热稳定性。如嗜热细菌(Chlorobiumtepidum)和嗜温细菌(Chlorobiumvibrio2forme)的MDHs热稳定差异,是由于嗜热细菌MDH的极性残基在亚基之间形成更多的氢键。另外嗜热细菌(Chloroflexusaurantiacus)的MDH含有更多的脯氨酸和丙氨酸残基,能更好的稳定蛋白质骨架结构,同时在二聚体之间,一些带电荷的氨基酸所形成的离子间相
[3]
互作用有助于蛋白质的热稳定性。1.3金属离子的影响
作者简介:汪新颖(1984-),女,硕士研究生,专业方向,分子生物学,E2mail:154824459@qq.com;
通讯作者:朱国萍,博士,教授,博士生导师,主要从事蛋白质功能进化与分子生物学研究,E2mail:gpz1996@yahoo.com。
(NCET2基金项目:国家自然科学基金(30500300);教育部“新世纪优秀人才支持计划”0620558);教育部回国留学人员启动基金;安徽省优
秀青年科技基金(06043089);安徽省引进海外留学人才基金(2005Z032);安徽省教育厅自然科学基金重点项目(2006KJ061A)
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第26卷第4期2009年8月生物学杂志JOURNALOFBIOLOGYVol126 No14
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带各种电荷的离子对MDHs的活性及蛋白质的稳定性影响不同,通过不同金属离子对绿豆MDH的研究
+2+2+
表明:K有激活作用;Mg和Ca对酶活影响不大;2+2+2+Zn、Pb和Cu对酶活有不同程度的抑制作用,其
2+
中Cu抑制程度最强,当其浓度为1M时,97%的酶活
[4]
被抑制。还有来自嗜盐古菌的MDH(HaloarculamarismortuiMDH,HmMDH),其稳定性受多种离子的影响,当电荷密度高时,阴离子能有效的稳定酶的折叠结构,而阳离子需在低盐浓度下时才能发挥相同的作[5]
用。
2苹果酸脱氢酶的空间结构特点2.1序列比较
MDHs些细菌的MDHs(m,如EcMDH与猪mitMDH和酵DH级结构的一致性为5813%及4719%;其它细菌的MDHs,如嗜温细菌MDH(ThermusflavusMDH,TfMDH)则与真核细胞叶绿体MDHs(chlMDH)和细胞质MDHs(cyMDH)的氨基酸序列更加相似,归为另一个亚类。
MDHs存在各种形式的同工酶,不同来源的MDHs氨基酸序列关系很复杂。氨基酸序列对比显示动植物细胞质MDH和细菌MDH的氨基酸序列相似性为48%~67%。而且同一细胞器的MDHs在物种间的相似性超过了不同细胞器来源的MDHs在物种内的相似性,如大米的cyMDH与人、细菌的cyMDH的氨基酸序列同源性分别是59%和52%,但是大米的cyMDH和大米乙醛酸体MDH(gMDH)的氨基酸序列相似性只有24%,而猪mitMDH和猪cyMDH的序列相似性只有约20%。这表明在物种分化之前已经形成了不同种类的MDH同工酶。
十分有趣的是古菌(archaeal)MDH与乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenases,LDH)有着高度的氨基酸序列一致性,暗示MDHs与LDHs在进化过程中有很近的亲缘关系,嗜盐古菌HmMDH的晶体结构也有力的支持了这一观点,因为HmMDH的三维结构更接近四聚体的LDHs而不是二聚体的MDHs。基于氨基酸序列的系统进化树表明MDHs与LDHs起源于两次祖先共生同源(paralogous)的基因倍增(geneduplication),形成了结构和生化性质迥然不同的3个进化枝(clade):首次基因倍增形成了在结构上有差异的酶,主要分为二聚体酶和四聚体酶,二聚体酶主要包括mitMDHs和cyMDHs;随后在四聚体酶中,又发生了一次伴随着功能改变的基因倍增,将该进化枝上的酶分为了LDHs和类-乳酸脱氢酶型MDHs(LDH-likeMDH)。LDHs70
和MDHs的功能差异主要是与底物特异性相关的第102位氨基酸,在MDHs中是带正电荷的Arg,而LDHs中通常是不带电荷的Glu。2.2亚基组成及活性中心
MDHs为同源二聚体或四聚体,目前发现的真核生物MDHs都是二聚体,如猪心cyMDH和大米的cyM2DH。大肠杆菌的MDH是二聚体,但芽孢杆菌类MDHs多为四聚体,如枯草杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的MDH。NAD2MDHs32~37kDa之间,2。
,尽管其氨基酸,辅酶结合位点、起催化作MDHs的每个亚基包含结构性和功能性的两个结构域,NAD结合结构域占据着N2端,覆盖了分子的一半,包含着一个平行的β2折叠结构(Rossman折叠模体)。核心的二核苷酸结合结构由4个β2折叠和一个α2螺旋组成。MDHs的C2端结构域包含底物结合部位和催化必须的氨基酸残基。酶的活性中心位于两个结构域之间的裂缝中。
小鼠cyMDH的结构显示,NAD2MDHs通常包含N2端的NAD结合区、催化区及C-端尾区三个结构域,前两者构成MDH的活性中心。在NAD2MDHs的催化区中,Asp和His残基是核心氨基酸,如Asp2150和His2177是构成EcMDH活性位点的重要氨基酸;Asp2152和His2180是猪心cyMDH催化区中的关键氨基酸。它们通过氢键形成His2Asp离子对,在催化过程中作为质子中转系统,这也在一定程度上解释了MDHs与NADH的结合比其与NAD的结合更稳定些。而且His中的咪唑环、烟酰胺环以及Asp的羧基部分的相对位置对于MDHs的催化起着关键性作用。研究表明包括MDHs在内的所有的2-羟酸脱氢酶中都存在一个His2Asp离子对,它作为质子中转系统,催化时要求与22羟基集团正确定位,形成活性区域的阴离子空穴,以容纳柠檬酸盐、小的带电阴离子如硫酸盐。2.3辅酶特异性及底物特异性
NAD2MDHs和NADP2MDHs的催化部位及辅酶结合部位的同源性很高。Asp253对于MDH的辅酶特异性至关重要,它在NAD2MDHs中高度保守,而在玉米等植物叶绿体NADP-MDH中,该位置的氨基酸都为Gly。基因突变实验表明,MDHs的辅酶特异性仅由几个高度保守的氨基酸决定。Takeo等人构建了嗜温细菌TfMDH的两种突变体酶EX3和EX7。EX3是将TfMDH中的第41、42、45位氨基酸突变为叶绿体NADP2MDH中的对应氨基酸Gly、Ser和Ser。EX7是
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将41到47位氨基酸Glu2Ile2Pro2Gln2Ala2Met2Lys突变为叶绿体NADP2MDH中对应的Gly2Ser2Glu2Arg2Ser2
+
Phe2Gln。结构两种突变体酶都实现了NAD向
+
NADP辅酶特异性的转变。同理将高粱叶绿体NADP2MDH的第84、85、87、88位氨基酸替换成TfMDH中对应的Glu2Ile2Glu2Ala,突变体酶的动力学参数也发生了不同程度的改变。
来自嗜热脂肪芽胞杆菌的LDH(Bacillusstearo2thermophilusLDH,BsLDH)和EcMDH仅有25%的氨基酸序列一致性,但是两种酶的蛋白质折叠惊人的相似,只是在二级结构上略有微小的差异。在两者的活性中心,只有第102位的关键性残基不同,在BsLDHGln,而在EcMDH中是Arg。WilkssLDH的Gln2102突变为Arg2102,Bs的Arg2102突变为Gln2102后,为底物,但是催化效率很低。3苹果酸脱氢酶的催化机制
MDHs催化苹果酸羟基的氢离子定向地转移到
+
NAD(P)上,实现苹果酸与草酰乙酸之间的可逆转换。MDHs活性部位由一个疏水的空泡组成,它包含了底物和辅酶的结合位点。当形成酶2辅酶2底物三聚体复合物时,蛋白质构象发生改变。在这个变化过程中,复合体外部的一个环掩盖住活性中心以保护底物和重要氨基酸不受溶剂的干扰,而其余的一些起催化作用的氨基酸向底物靠近,同时位于活性中心的His2Asp离子对在反应过程中提供质子(如图1所示)
。
图1 苹果酸脱氢酶的催化机制
Fig1 ReactionmechanismofMDH,schemeofNAD2dependent
dehydrogenationof22hydroxyacids
研究表明MDHs活性区域高度保守的3个Arg决
定其催化反应的特异性。当酶与底物接触时,位于移动环侧链的2个Arg与底物相互作用,另一个Arg在底物转化时与其羧基基团的配位键结合,从而稳定新形成的羟基和酮基产物。
如猪心cyMDH与底物结合时,酶的Arg291和Arg297先固定在活性区的环中,His2186首先与底物C2的羰基氧原子结合,接着Arg2161的氢键直接结合到底
物C1的羧基上,后Arg297也结合到底物C2的羰基氧
原子,从而完成了与底物结合的主要过程。在整个反应中,第一步提供还原底物所需要的质子,第二步协助底物定向和定位,最后一步是极化底物的羰基基团而使C2上产生阳性电荷,从而激发NADH产生带一对电子的质子。同样在EcMDH催化反应时,Arg281、Arg287、Arg2153在稳定和定位底物中发挥重要作用。首先Arg281和Arg287定位在一个环上,向活性区域弯曲并形成氢键与底物的4-羧基和,Arg-12羧基上,从而完成4(malatedehydrogenase,MDH)存在,是生物糖代谢的关键酶之一,能催化苹果酸与草酰乙酸之间的可逆转换。MDH在细胞的多种生理活动中起着重要的作用,包括线粒体的能量代谢以及植物的活性氧代谢等,具有较高的理论研究和经济利用意义。如MDH同工酶参与不同的细胞生理代谢途径:cyMDH与丙酮酸羧化支路相联,与非自养性的二氧化碳固定有关;mitMDH是TCA循环中的关键酶,提供能量;微体MDH与光呼吸或乙醛酸循环有关;叶绿体MDH主要在光合作用中固定二氧化碳。
在农业生产中,酸性土壤中的铝毒是农作物生长的主要限制因子。研究发现,为了提高植物对土壤中磷元素的吸收,通过遗传工程进行植物分子改良育种,如在苜蓿中超量表达MDH基因后,增强转基因苜蓿对有机酸的吸收,从而提高适应酸性土壤和对付铝毒的
[6,7〗
耐受性。然而当MDH高表达的时候,植物有机酸含量的增多可以增加细胞的渗透压并且可以螯合除去部分离子,从而改善植物对盐的耐受性。最近有人提出,利用嗜盐细菌MDH的转基因技术来提高农作物的耐盐性,如盐生杜氏藻D.salina和D.bardwil是迄今为止发现的最耐盐真核生物,通过对它们的MDH基因克隆和序列的分析,可以为植物的耐盐性研究奠定基[8]
础。
除此之外,在番茄F1杂交种中,利用电泳检测MDH同工酶酶谱之间的差异来鉴定的杂交种的纯度,成为种子生产中一种新的省时省力的检测方法,有利于鉴别高产,抗病,抗逆优势的杂交种,这为农业生产带来较大的经济效益。浙江大学刘艳荷等人通过对西方蜜蜂10个蜂种的MDHII等位基因频率和蜂蜜、蜂王浆、蜂花粉、蜂蜡、蜂毒产量的研究,分析3个等位基因频率与这5个经济性状的相关性,认为MDHII等位基因频率将可能成为蜜蜂生产品质的生化遗传标
71
第26卷第4期2009年8月记
[9]
生物学杂志JOURNALOFBIOLOGYVol126 No14
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。
MDH在医学方面也引起越来越多的关注,如利用
基因工程疫苗预防人体带绦虫病已是备受关注的研究方向,通过牛带绦虫亚洲亚种MDH基因的生物信息学分析,预测到胞浆型MDH是一个潜在的诊断抗原,这为带绦虫在诊断、药物及疫苗研究中的应用前景提供了重要的线索。后又实验证明其可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达,这为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。同时通过多种重组疫苗联合免疫以求增大疫苗保护效果也成为今后研制绦虫疫苗
[10]
的主要方向。另外徐劲等人对华虫睾吸虫cyMDH活性位点的氨基酸突变研究,(nococcusgranulosus)it,,[11]
能。
利用MDH底物专一性,还可将其用于拆分D,L2苹果酸得到D-苹果酸。D-苹果酸是一种非天然有机酸,是一种极其重要的4-碳有机手性源,主要应用于手性药物、手性添加剂、手性助剂等领域。近年来全世界对D-苹果酸的需求量增加,从而引起了一些国家对D-苹果酸的研究兴趣。利用这种微生物转化法生产的苹果酸,耗能低,清洁环保,是制药行业合成泛酸、信息素及生物碱等手性物质的手性源。
总之,MDHs作为生物体中枢代谢途径的关键酶,国内外对其已进行了较为广泛的研究。目前各种MDHs同工酶正应用于生物分类、物种分化、遗传变异、物种杂交和个体发育等研究。因此深入了解MDHs的生理生化特性、结构及功能、催化机制,对于探讨生物体中MDHs的代谢作用以及一些疾病的分子
致病机制有着重要的意义。同时MDH的应用研究也将会推动MDHs转基因植物及手性药物的进一步发展。
参考文献:
[1]JaindlM,PoppM.Cyclitolsprotectglutaminesynthetaseandmalate
dehydrogenaseagainstheatinduceddeactivationandthermaldenatur2ation[J].BiochemBiophysResCommun,2006,345:761~765.[2]龚 韧,张大伟.[J].
河南工业大学学报(28(5):42~45.
[3jorkA,B,onofatetramericmalate
byonabridgeatthedimer2dimer[J].J2003,334:811~821.
[,.绿豆中苹果酸脱氢酶的性质及生物进化的研究
[J].中国食品学报,2006,6(1):262~266.
[5]MadernD,EbelC.Influenceofananion2bindingsiteinthestabiliza2
tionofhalophilicmalatedehydrogenasefromHaloarculamarismortui[J].Biochimie,2007,89:981~987.
[6]王晓云,毕玉芬.植物苹果酸脱氢酶研究进展[J].生物技术通
报,2006,4:44~47.
[7]赵 胡,陈丽梅.植物有效利用磷素营养有机酸代谢途径基因工
程研究进展[J].中国农学通报,2007,23(1):33~37.
[8]贺庆华,郑玉才.盐生杜氏藻D.salina和D.bardwil苹果酸脱氢酶
基因的克隆和序列分析[J].安徽农业科学,2008,36(11):4435~4436.
[9]刘艳荷,陈盛禄.西方蜜蜂苹果酸脱氢酶Ⅱ等位基因频率与经济
性状的相关性[J].上海交通大学学报(农业科学版)2006,24
(1):79~83.
[10]黄 江,胡旭初.牛带绦虫亚洲亚种苹果酸脱氢酶基因的生物
信息学分析[J].中国寄生虫学与寄生虫病志,2008,26(3):
225~227.
[11]张 静,王 洁.细粒棘球蚴(中国大陆株)线粒体苹果酸脱氢
酶重组蛋白的表达、纯化及免疫特性分析[J].中国病原生物学杂志,2006,1(4):249~252.
Structureandfunctionofmalatedehydrogenases
WANGXin2ying,WANGBo,HOUSong2tao,ZHUGuo2ping
(1.TheKeyLaboratoryofMolecularEvolution;
2.theInstituteofMolecularBiologyandBiotechnology,AnhuiNormalUniversity,Wuhu241000,China)
Abstract:Malatedehydrogenases(MDHs)maycatalyzethereversibleconversionbetweenmalateandoxaloacetate,whichplayakeyroleinmanymetabolicpathwayssuchasTCAcycle,photosynthesis,C4cycleandsoon.MDHsaredividedintoNAD2dependentMDHsandNADP2dependentMDHs,whichusuallyarehomodimericmoleculesinmostorganisms,includingalleukaryotesandthemostbacterialspecies(somebacterialMDHsaretetramer).Theenzymesshareacommoncatalyticmechanismandtheirkineticprop2ertiesaresimilar,whichdemonstrateahighdegreeofstructuralsimilarity.ThefunctionsofMDHsarebiologicaldiversity,includingenergygenerationinmitochondrial,reactiveoxygenspeciesmetabolisminplants,etc.Basedonthebiochemistry,stereoconformationandcatalysismechanism,theadvancesofMDHsinmolecularbiology,physiology,medicineandagriculturearediscussed.
Keywords:malatedehydrogenase;NAD;NADP;catalysismechanism;function
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范文四:QS1003NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)试剂盒说明书
货号 : QS1003 规格:50管 /48样 NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH )试剂盒说明书
紫外分光光度法
正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中 MDH 是 TCA 循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中 MDH 催化草酰乙酸形成 苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物, 连接多条重要的代谢途径。因此, MDH 在细胞多种 生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、 苹果酸 -天冬氨酸穿梭系统、活性氧 代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性, MDH 分为 NAD-依赖的 MDH 和 NADP-依赖 MDH , NADP-MDH 主要存在于真核细胞中。
测定原理:
NADP-MDH 催化 NADPH 还原草酰乙酸生成苹果酸,导致 340nm 处光吸收下降。 需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、 1 mL 石英比色皿和蒸馏水。 试剂的组成和配制:
试剂一、提取液 60 mL×1 瓶,在 4℃保存;
试剂二、液体 50 mL×1 瓶,在 4℃保存;
试剂三、粉剂×2 支, -20℃保存;临用前加入 300μL 蒸馏水,现配现用;
试剂四、粉剂×2 支, -20℃保存;临用前加入 300μL 蒸馏水,现配现用。
样本测定的准备:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内, 离心后弃上清; 按照细菌或细胞数量 (104个) :试剂一体积(mL )为 500~1000:1的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1mL 试剂一) , 超声波破碎细菌或细胞 (冰浴, 功率 20%或 200W , 超声 3s , 间隔 10s , 重复 30次) ; 8000g 4℃ 离心 10min ,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g ) :试剂一体积 (mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织, 加入 1mL 试剂一) ,进行冰浴匀浆。 8000g 4℃离心 10min ,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:
1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm ,蒸馏水调零。
2、 将试剂二在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min 以上。
3、 操作表:
第 1页,共 2页
第 2页,共 2页
范文五:NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)试剂盒使用说明
http://www.solarbio.com
NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)试剂盒使用说明
货号:BC1040
规格:50管/48样产品内容:
试剂一、提取液60mL×1瓶,在4℃保存;
试剂二、液体50mL×1瓶,在4℃保存;
试剂三、粉剂×2支,-20℃保存;临用前加入300μL蒸馏水,用不完的试剂仍-20℃保存;
试剂四、粉剂×2支,-20℃保存;临用前加入300μL蒸馏水,用不完的试剂仍-20℃保存。
产品说明:
MDH (EC1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中MDH 是TCA 循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物,连接多条重要的代谢途径。因此,MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH分为NAD-依赖的MDH 和NADP-依赖的MDH,细菌中通常只含有NAD-MDH,在真核细胞中,NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。
NAD-MDH 催化NADH 还原草酰乙酸生成苹果酸,导致340nm 处光吸收下降。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿和蒸馏水。操作步骤:
一、样本测定的准备:
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三、NAD-MDH 活力单位的计算:
1、血清(浆)NAD-MDH活力的计算
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。NAD-MDH(U/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=6430×ΔA
2、组织、细菌或细胞中NAD-MDH 活力的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg 组织蛋白每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。NAD-MDH(U/mgprot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T
=6430×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g 组织每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH(U/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V 样÷V样总)÷T=6430×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。NAD-MDH(U/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T
=12.86×ΔA
V 反总:反应体系总体积,8×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L /mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,1min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:细胞或细菌总数,500万。