范文一：耐药结核病的发病机制及诊治

耐药结核病的发病机制及诊治

耐药结核病是引起全球结核病第三次回升的重大原因,是控制结核病的严重障碍,是研究结核 病的难点与热点问题 ? 。

耐药结核病一般可分为三类:

耐多药 (Multi drugresitance)(MDR):结核病患者感染的结核分枝杆菌至少对异烟肼、 利福平耐药。 严重多耐药 (XDR)或称超级耐药或称广泛耐药:对异烟肼、利福平以及任何氟喹诺酮类药物耐 药,同时对 3种最主要二线药物注射剂 (丁胺卡那霉素、卡那霉素、卷曲霉素 ) 中的任何一种药 物也耐药。

耐药结核病产生的原因 :

1 医生给予不合适的治疗方案

2 病人的依从性差 :

患者初治时不规律用药所致,责任在医患双方,做为医生未向患者及家属作结核病的健康 教育宣传,使患者缺乏对该病的认识,患者不明白一次治愈终身受益的重要性,不按时服药, 自行停药,不坚持疗程服药等现象严重。

3 社会 -经济困难

化疗方案不合理, 用药不规则:未能合理使用抗结核药物是产生获得性 MDR — TB 的最主要 原因,单用药和不合理的联合用药是其主要的表现形式 。

?未经专门培训的医疗服务提供者可能不理解化疗原则和有效化疗方案的组成,任意组合抗结 核药物,甚至单用抗结核药物,频繁的更换方案;对药物引起的毒副反应不能给予正确及时处 理,盲目停药、换药;把患者已产生耐药、药物浓度低或生物利用度差的抗结核药与另一种抗 结核药联用; 在患者治疗效果差时不断加入单一药物等。 这些做法不但导致获得性耐药的产生, 反过来又加剧了初始耐药的发生,造成恶性循环,成为导致获得性 MDR — TB 产生的首要人为 因素。

?药物质量和供应不到位:

?药物的装量、含量和生物利用度不合格及服药方法不正确均可直接导致患者得不到足量有效 的抗结核药,形成实质上的不合理用药。

?由于招标、采购、签约供货不及时,造成短时间的药品供应短缺,亦可导致不能配发出合理 治疗方案所需药物。

?患者的顺应性问题:缺乏足够的结核病相关知识,就业、失业压力,婚姻传统和社会歧视, 免费政策范围外的辅助检查和诊断费用及毒副反应处理不及时等,均会影响患者的顺应性,有 时还会造成患者隐瞒病情自行乱用药, 不仅延误了疾病的治疗, 而且易引起 MDR — TB 的产生。 ?间断治疗造成的单用药:

?这种现象常发生在患者管理差、患者不遵医嘱、药物不良反应、药物供应问题、患者经济困 难和有其它疾病等情况。

?滥用抗结核药物:

?某些重要的一线抗结核药物,尤其是异烟肼和利福平被作为抗菌素或广谱抗菌素单独使用的 现象在我国仍普遍存在。在初治患者中滥用氟喹喏酮类抗结核药物也应引起高度警惕,二线药

物耐药将导致更多的 MDR — TB 产生。

结核杆菌耐药机制及检测方法

?近 10多年分子生物学技术的迅速发展, 使人们能在分子水平上研究结核分枝杆菌的耐药机理, 并定位耐药基因的位置和基因突变位点。

结核杆菌耐药机制

结核杆菌耐药机制

?3 rpsL 基因与 rrs 基因 :大多数结核分枝杆菌耐链霉素的产生是由于 rpsL 基因与 rrs 基因突变 所导致的。

?4 pncA 基因 :资料表明, 70% -97%的吡嗪酰胺 (PZA)耐药分离株存在由 pncA 突变所造成的 PncA 的蛋白结构改变, 从而改变了吡嗪酰胺酶酶结构,失去了将 PZA 转换成活性形式的能力, 导致耐药。

结核杆菌耐药机制

耐药基因的检测方法 :

?1、 变性梯度凝胶电泳 (DGGE):双链 DNA 在递增的变性剂浓度梯度或温度梯度中电泳时, DNA 不同区段可根据不同的溶解温度 (Tm)而解离。

?2 痰液中直接洗提 DNA: PCR方法检测结核杆菌耐药基因往往需要花费六个星期的时间 . 耐药基因的检测方法 :

耐药基因的检测方法 :

?5、 分子灯塔法 :在 PCR 过程中引入荧光标记探针, 游离的 DNA 探针以一种茎环结构存在, 环 状结构与靶序列互补,茎状结构即探针两臂的末端分别连有荧光物质和能淬灭荧光的物质。 ?6、 低聚核昔酸微阵列技术 :一个中等密度的低聚核昔酸微阵列能很快的检测结核杆菌耐利福平 菌株,这种方法通过检测 rpoB 基因的点突变和重组来决定该菌株利福平耐药性 .

?7 Multi-PCR-SSCP方法

耐多药结核病的综合治疗 :

耐多药结核病的综合治疗 :

?第四组 :口服二线抑菌类药物 , 如丙硫异烟胺 , 环丝氨酸 , 对氨基水扬酸等 .

耐多药结核病的综合治疗 :

?化疗原则 :

?(1)在有条件开展结核菌培养并作药敏试验的地方 , 应以药敏试验的结果为指导 选择含 3种以 上敏感药物组成新的方案 .

?(2)未获结核菌药敏试验前或无条件做药敏试验的地方需根据患者既往用药历史和本地区耐药 情况选择可能敏感药组成新方案 .

耐多药结核病的综合治疗 :

耐多药结核病的综合治疗 :

治疗方案的选择 :

在制定每一个化疗方案时所选药物应符合化疗方案的原则 , 强化期疗程不低于 6个月 , 继续期疗 程 18~24个月 . 强化期结束时痰菌仍阳性 , 需延长强化期 , 直至痰菌阴转后方可进入巩固期 .

耐多药结核病的综合治疗 :

?免疫治疗 :

结核病是以细胞免疫水平低下为特征的疾病 , 患者的保护性免疫往往处于劣势 , 因此 , 治 前免疫功能较差者 , 在化疗基础上应用免疫增强剂 , 如胸腺肽 .

耐多药结核病的综合治疗 :

?三 手术治疗 :

?耐多药结核病的出现 , 使外科手术这一传统的有效手段又为人们所重视 , 其手术指征如下 .(1)已 局限的空洞型肺结核 ;(2)已毁损的肺叶或一侧全肺 ;(3)支气管胸膜瘘 ;(4)支气管狭窄、 支气管内膜 结核; (5)大咯血; (6)心肺功能储备足以承受手术治疗的条件.

耐多药结核病的综合治疗 :

范文二：结核分枝杆菌耐药机制的研究进展

?

１５０ｌ?

．综述．

结核分枝杆菌耐药机制的研究进展

孙勇

李传友许绍发

【摘要】在人类的传染病中，结核病死亡率最高。每年约有２００万人死于结核病Ｉ而且估计每年有９２０万的新发病例，更为严重的是全世界１／３的人口都感染过结核分枝杆菌。据ＷＨＯ统计，目前全世界耐多药结核患者已占２０％．而且这个数字在逐年递增。因此．明确结核分枝杆菌耐药机制不仅能够建立快速、灵敏、准确的检测方法，更重要的是能找到抗结核药物靶点，开发新的抗结核药物。控制结核病疫情．减轻患者的负担与痛苦。

【关键词】结核分枝杆菌；耐药机制；细胞壁；分子机制；外排泵

Ｐｒｏｇｒｅｓｓ

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目前对于结核分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，ＭＴＢ）耐药性机制研究很多，但主要有３种观点：①细胞壁结构与组成变化，使细胞壁通透性改变。药物通透性降低．产生降解或灭活酶类。改变了药物作用靶位。②可能存在耐药质粒或转座子介导的耐药；在ＭＴＢ中己经发现了活跃的药物外排泵系统，外排泵能将菌体内药物泵出，使得胞内药物浓度不能有效抑制或杀死分枝杆菌。从而产生耐药性。③结核杆菌耐药性的产生多见于其基因组上编码药物标靶的基因或药物活性有关的酶基因突变

Ｉ）（）ｌｌ

所造成。目前对结核杆菌耐药分子机制的研究主要集中在各种药物的作用靶点及其相关基因的突变上。本文就这三个方面与耐药机制关系作一综述。

１

ＭＴＢ的细胞壁的结构与组成变化

ＭＴＢ的细胞壁和其他细菌有着很大的差别，其

肽聚糖主要由Ｎ一乙酰葡萄糖胺和Ｎ一乙酰胞壁酸组成，类脂质含量超过６０％，而革兰阴性细菌类脂质含量仅占２０％左右。类脂质是一类复杂的复合物，它赋予ＭＴＢ表面疏水性，含有分枝菌酸、索状因子、多糖类、磷脂、蜡质Ｄ等［１】。分枝菌酸是ＭＴＢ和棒状杆菌属独有的结构，主要由２２—２４碳短链和４０－６４长链分枝脂肪酸组成．分枝菌酸层能形成有效的屏障。使ＭＴＢ免受溶菌酶、自由基等损伤。抵抗亲水性化合物或抗生素的攻击。而阿拉伯半乳聚糖层又能阻止疏水性分子的进入。此外。分枝杆菌细胞壁上有选择性阳离子的孔蛋白．能有效控制或阻滞亲水性小分子的扩散，大大降低了化合物的渗

１０．３７６０／ｃｍａ．ｉ．ｉｓｓｎ．１６７３－４３６Ｘ．２０１０．０２４．００９

基金项目ｌ同家重大科技专项（２００８ＺＸｌ０００３—００５）

作者单位１１０１１４９北京市结核病胸部肿瘤研究所细菌免疫学室（孙勇、李传友）．胸外科（许绍发）

通信作者ｌ李传友．ＥｍａｉｌｌＩ．ｃｈｕａｎｙｏｕ６６８８＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ

许绍发．Ｅｍａｉｌｌｘｕｓｈａｏｆａ＠２６３．ｎｅｔ

?１５０２?

旦隧唑咝壅查！！！！堡！；旦箜！！堂筮！！塑！坐』垦！！区！！望！堡竺生！！！！！！∑！！：ｉ！：型！：丝

透性，导致药物进入高疏水性细胞擘间隙比较慢，这便筑成了ＭＴＢ对药物的第一道防线。

有些抗结核药物是以细胞壁为靶点的，例如异烟肼（ＩＮＨ）和乙硫异烟胺抑制合成分枝菌酸，乙胺丁醇（ＥＭＢ）则主要干扰阿拉伯糖的合成，ＭＴＢ细胞壁的变化使得药物作用靶位改变，从而导致耐药的发生。Ｖｅｌａｙａｔｉ等∞３用透射电子显微镜观察了ＭＴＢ的细胞壁。发现广泛耐药结核和耐多药结核菌株的细胞壁厚度分别是（２０．２±１．５）ｎｍ和（１７．１±１．０３）ｎｍ，而敏感株的细胞壁厚度仅为（１５．６±１．３）ｎｍ（Ｐ＜０．０１），这说明细胞壁与ＭＴＢ耐药性是密切相关的。

由于ＭＴＢ有相对的耐干燥、耐碱等特性，使得它很难被清除，ＭＴＢ的抵抗力和耐药性也得益于它的细胞壁结构。这种非常特殊的细胞壁同样破坏了巨噬细胞的吞噬作用，也使得ＭＴＢ能在巨噬细胞内得以存活。正是因为细胞壁在耐药和抵抗力中独特的作用。科学家希单能通过找到潜在药物作用的新位点或改变细胞壁的结构而增强ＭＴＢ对药物的敏感性。

２基因突变与ＭＴＢ耐药

基因学的研究表明。基因变异是ＭＴＢ产生耐药性的主要机制。例如碱基的插入、缺失、置换等。抗菌药物作川靶点的突变，使其结合靶点的能力下降。从而导致其对抗结核药物的耐药。下面对几种主要的抗结核药物的耐药分子机制进行详细的阐述（表１）。

２．１

内外的ＭＴＢ。其作用机制可能有多种方式：①研究表明ＩＮＨ实际上是一个药物前体．它可以被ＭＴＢ的触酶一过氧化物酶激活。抑制细胞壁中磷脂和分枝菌酸的生物合成，导致细胞壁的通透性增强，使分枝杆菌失去抗酸性而死亡。②ＩＮＨ在菌体内被氧化为异烟酸，取代烟酰胺。形成烟酰胺腺核苷酸的同系物，干扰酶的活性，使之失去递氢作用，因而抑制ＭＴＢ的生长。③ＩＮＨ与ＭＴＢ的某些酶所需铜离子结合，使酶失去活性而发挥抗菌作用。ＭＴＢ耐ＩＮＨ主要与下列基因突变有关。

２．１．１

ＫａｔＧ基因ＫａｔＧ基冈是触酶一过氧化物酶

的编码基因。研究认为ＫａｔＧ基冈的变异导致ＭＴＢ触酶一过氧化物酶活性降低或缺失，从而引起ＩＮＨ耐药。２０世纪９０年代早期，Ｚｈａｎｇ等【１４３将ＫａｔＧ基冈克隆导入耐ＩＮＨ的耻垢分枝杆菌町恢复ＩＮＨ敏感性，使ＫａｔＧ基因成为第１个发现并被验证的ＭＴＢ耐药基因。最常见ＫａｔＧ基凶随机耐药突变的ｆ移点是３１５位密码子（Ｓｅｒ－－Ｔｈｒ）【３ｊ。

２．１．２

ｉｎｈＡ基冈ｉｎｈＡ是烯酰基还原酶的编码

基因，其编码的ＮＡＤＨ依赖的烯酰基还原酶催化不饱和脂肪酸转化为饱和脂肪酸的还原反应，参与长链脂肪酸的合成。分枝杆菌利用该产物合成的超长链ａ脂肪酸组成其细胞壁。ＩＮＨ进入菌体后，在分枝杆菌触酶一过氧化物酶的作用下氧化脱氢生成亲电子形式。这种形式能与分枝菌酸生化合成途径中的烯酞基还原酶一还原型烟酞胺二核昔酸复合体结合。干扰分枝菌酸合成而发挥抗菌作用。ｉｎｈＡ基因突变主要发生在其启动子区的一１５和一２４两个

ＩＮＨ耐药的分子机制ＩＮＨ是防治结核病的

一线用药，对各种ＭＴＢ都有杀菌作用，可杀灭细胞

表ｌ

结核分枝杆菌药物作用机制与耐药突变频率

位点上。

２．１．３

ｏｘｙＲ—ａｈｐＣ基冈

ｏｘｙＲ基冈作为一个调节蛋白．它即是氧压的感应器义是基肉转录的活化剂，ｏｘｙＲ基因控制编码解毒酶基因如触酶一过氧化物酶（ＫａｔＧ基因编码）和烷基氢过氧化物酶（ａｈｐＣ基冈编码）的表达。研究表明。在ＭＴＢ复合体中的ｏｘｙＲ基冈发生大量的移码突变和缺失、失活，使其成为一个无活性的假基因。当ａｈｐＣ基因的启动子突变时，ａｈｐＣ表达上调。弥补了ｏｘｙＲ基因缺陷，产生ＩＮＨ耐药。一般研究者发现在ＩＮＨ耐药菌株中ｏｘｙＲ启动子序列的突变常伴随着ＫａｔＧ活性的不足。因此，一般将ａｈｐＣ基因突变作为ＫａｔＧ损伤的标志。

此外，尽管有学者发现ｋａｓＡ、ｎｄｈ、ｅｆｐＡ、ｆｕｒＡ等基因突变可能与ＩＮＨ耐药有关，但其作用机制等有待进一步研究。

２．２利福平（ＲＦＰ）耐药的分子机制

ＲＦＰ是用于

防治结核病的一线药物。通过与ＤＮＡ依赖的细菌ＲＮＡ聚合酶ｐ亚基结合，干扰、抑制细菌ＲＮＡ的合成。抑制细菌的生长繁殖，导致细菌的死亡。ＲＦＰ有很强的杀菌能力，它能有效地杀灭细胞内外的

细菌。

ＲＦＰ耐药的产生主要是因为当ｒｐｏＢ基因发生突变时。ＲＮＡ聚合酶８一亚单位酶活性改变，ＲＦＰ不能与细菌ＲＮＡ聚合酶８一亚单位结合而表现为耐药。ｒｐｏＢ基因突变一般是单个碱基突变或数个碱基联合突变。也有碱基的插入和缺失，共３０多种，主要的突变位点发生在５０７－－－５３３位密码子，其中最常见的突变位点是５３１、５２６、５１６位［６｜。２．３链霉素（ＳＭ）耐药的分子机制

ＳＭ是防治结

核病的一线药物，是氨基环醇糖苷类抗菌药物．主要作用于核糖体３０Ｓ亚基，抑制肽链的延长．影响蛋白质的合成，发挥抗菌作用，但ＳＭ仅对吞噬细胞外的ＭＴＢ具有杀菌作用。研究表明耐ＳＭ菌株有ｒｐｓＩ．或ｒｒｓ基因的突变。其中以ｒｐｓＩ。基因突变为主，突变主要位于４３位密码子（Ｌｙｓ—Ａｒｇ）【７Ｊ。２．４吡嗪酰胺（ＰＺＡ）耐药的分子机制

ＰＺＡ是一

线的抗结核常用药物，ＰＺＡ对人型ＭＴＢ有较好的抗菌作用．而对非ＭＴＢ不敏感。而且其抗菌作用易受环境影响。只在酸性环境有较强的杀菌作用．对中性和碱性环境中的结核菌几乎无抑菌作用。这可能与吡嗪酸有关。一般认为是ＭＴＢ的吡嗪酰胺酶将ＰＺＡ转化成具有活性的吡嗪酸而发挥杀菌作朋。研究表明ｐｎｃＡ基肉的突变造成吡嗪酰胺酶活性降低或丧失，这是导致ＭＴＢ对ＰＺＡ耐药的主要原

?１５０３?

因。ｐｎｃＡ基闪突变位点较多且较为分散，有多达

５０多个位点突变可能与ＰＺＡ耐药有关。其中突变位点主要分布在１８～５７氨基酸，８２～１２８氨基酸，发现耐药株２４位密码子（Ｇｌｙ—Ａｓｐ）、１６０位（Ｔｈｒ—Ｌｙｓ）、５１位（Ｈｉｓ—Ｐｒｏ）有不同的突变。研究同时发现第１０２位发生移码突变，导致１６７

ｂｐ

核酸缺失【８ｊ，而有些耐ＰＺＡ菌株没有发生ｐｎｃＡ基因突变，这说明还存在其他的耐药机制，还有待更广泛深入的研究。

２．５

ＥＭＢ耐药的分子机制ＥＭＢ是抗结核治疗

的一线药物。是一种阿拉伯糖类似物。ＥＭＢ通过抑制阿拉伯糖基转移酶来阻断阿拉伯聚糖的合成。造成阿拉伯半乳聚糖的合成障碍，增加了细胞壁通透性。从而导致细菌的死亡。此外，ＥＭＢ还干扰磷脂的新陈代谢和分枝菌酸的合成，导致细胞壁合成障碍，抑制了细菌的繁殖。

研究表明，ＭＴＢ对ＥＭＢ耐药主要是由阿拉伯糖基转移酶的编码基因ｅｍｂＢ基因突变引起的，ｅｍｂＢ基因的突变主要以发生在３０６位密码子的突变最为常见，其突变可作为耐药的快速诊断［９］。

２．６

氟喹诺酮类药物（ＦＱｓ）耐药的分子机制

Ｆｑｓ属二线抗结核药物，其主要作用靶位是ＤＮＡ促旋酶和拓扑异构酶ＩＶ。ＤＮＡ促旋酶通过暂时切断ＤＮＡ双链，促进ＤＮＡ复制转录过程中形成的超螺旋松解，阻止ＤＮＡ拓扑异构变化，妨碍细菌ＤＮＡ复制、转录。以达到杀菌目的。ＤＮＡ促旋酶是由ｇｙｒＡ基因编码的ＧｙｒＡ蛋白和由ｇｙｒＢ基因编码的ＧｙｒＢ蛋白质组成的四聚体，其中任一亚基变异都会引起ＦＱｓ耐药性。拓扑异构酶Ⅳ在ＤＮＡ切

断、重接和复制终了后ＤＮＡ双链分离等过程中起重要作用。它是由ｐａｒＣ基因与ｐａｒＥ基因分别编码的ＰａｒＣ蛋白与Ｐａｒｅ蛋白各分子组成的四聚体．拓扑异构酶Ⅳ是ＦＱｓ的次级靶标。研究表明ＭＴＢ在所有的突变型中，耐Ｆｑｓ主要与ｇｙｒＡ和ｇｙｒＢ基因突变有关，以ｇｙｒＡ的突变为主。在对Ｆｑｓ耐药株做分子特点分析发现。ｇｙｒＡ基因８８（Ｇｌｙ—Ｃｙｓ）、

９０（Ａｌａ—Ｖａｌ）、９１（Ｓｅｔ－－－－Ｐｒｏ）、９４（Ａｓｐ—ＧＩｙ／Ａｌａ／Ｈｉｓ／Ａｓｎ）氨基酸发生了突变，ｇｙｒＢ基因４９５、５１６、５３３氨基酸发生突变【Ｉ…。其中，ｇｙｒＡ基因是ＭＴＢ对ＦＱｓ耐药的主要原因（８１．５％）Ｌ１１１。ｇｙｒＢ基因的突变引起ＭＴＢ对ＦＱｓ的耐药突变率很低，对此还需要进行进一步研究。

２．７对氨基水杨酸钠（ＰＡＳ）ＰＡＳ是较早使用的抗结核药物之一。一般认为ＰＡＳ的化学结构与对氨苯甲酸近似．ＰＡＳ竞争性地替代对氨苯甲酸参与

结核菌的代谢，影响叶酸的合成，造成ＭＴＢ蛋白质的合成受阻，细菌不能繁殖。研究发现，胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因（ｔｈｙＡ）编码一种酶，决定着细胞内叶酸的合成，如果ｔｈｙＡ基因发生突变，胸腺嘧啶核苷酸合成酶活性减弱，则阻止了ＰＡＳ拮抗菌体合成叶酸的通路，导致耐药的发生。研究发现ｔｈｙＡ有多个多态性位点，其中Ｔ２０２Ａ的突变与耐药相关‘１

２ｌ。

耐药的产生，但是在分枝杆菌质粒一般仅分布在非ＭＴＢ中。目前为止，虽有ＭＴＢ质粒存在报道，但未发现质粒介导耐药的现象。仅凭ＭＴＢ天然细胞壁屏障作用和耐药基因并不能全面解释其耐药机制，有些患者虽然发生了突变但却不耐药，有些耐药的患者却没有发现突变基因，这说明ＭＴＢ还有其他的耐药机制。研究表明，分枝杆菌存在药物主动外排泵的表达，并被视为是ＭＴＢ药物靶分子突变

２．８卷曲霉素（ＣＰＭ）和阿米卡星（ＡＭ）

ＣＰＭ和机制外的一个重要耐药机制。

抗生素是外来毒素而将其排除体外。最早人们只是在肿瘤细胞及细菌中发现存在外排泵，并导致低浓度耐药的产生。虽然导致的是低浓度的耐药，但正是外排泵出现增加了基因突变的频率，并最终导致产生高浓度的耐药［１５。引。从第１个耐ＦＱｓ耐药泵Ｉ。ｆｒＡ发现以来【ｌ７｜，相继有许多泵蛋白被发现（表２）。Ｒａｍｂｎ—Ｇａｒｃｉａ等［２２］的研究也表明，Ｐ５５外排泵的缺失，增加了ＭＴＢ对ＲＦＰ等化学制剂的易感性。ＭＴＢ外排泵的发现时间并不是很长，但却是对耐药机制研究的一个重要补充。

随着ＭＴＢ标准株Ｈ３７Ｒｖ基因组的破译［２引，科学家惊奇地发现Ｈ３７Ｒｖ存在２０多种细胞色素Ｐ４５０酶，随后研究发现Ｐ４５０酶不仅与细菌毒力、宿主感染、ＭＴＢ繁殖等有关，而且还是药物作用的靶点。最近，Ｄｉａｃｏｎ等【２４］发现抗结核新药

ｄｉａｒｙｌｑｕｉｎｏｌｉｎｅ

ＡＭ都是抑制ＭＴＢ生长、协同其他抗结核药物作用的二线药，对耐药菌及持留菌有很好的疗效。其作用机制相同，主要与核糖体３０Ｓ亚基１６Ｓ

ｒＲＮＡ

结合，抑制其蛋白质的合成。ＣＰＭ和ＡＭ耐药的产生主要是由于ｒｒｓ基因发生突变，ＣＰＭ耐药也可由ｔｌｙＡ基因突变引起。ｔｌｙＡ基因编码ｒＲＮＡ修饰酶，它的突变使得ｒＲＮＡ无法被甲基化，影响了核糖体的功能，从而导致ＣＰＭ耐药的发生。Ｆｅｕｅｒｒｉｅｇｅｌ等［１３］研究表明基因ｒｒｓ（Ａ１４０１Ｇ）突变与ＣＰＭ和ＡＭ耐药有关，而其Ｃ１４０２Ｔ位点的突变仅与ＣＰＭ耐药有关。在研究中还发现ｔｌｙＡ基因有３个多态性位点（Ａ１８ＳＴＯＰ、Ｌ１１８Ａ、Ｌ１６０Ｔ），其中１８和１１８位点的突变与ＣＰＭ耐药有关。

虽然现在普遍认为ＭＴＢ分子机制的改变是其产生耐药的主要机制。但是这种突变在自然条件下发生的几率非常低，ＩＮＨ突变频率是１／１０万，ＲＦＰ是１／１０００万，ＥＭＢ和环丝氨酸的突变频率分别是

ｌ／１０００万和１／１００万。如此低的突变频率是如何

ＴＭＣ２０７通过抑制ＭＴＢ的ＡＴＰ合

酶来发挥其抗结核作用。提供了一种新的抗结核机制。动物实验结果表明，ＴＭＣ２０７不仅可有效地抑制敏感以及耐药性ＭＴＢ的生长，并且在对潜伏的持留菌同样具有杀菌活性。ＴＭＣ２０７除具有ＩＮＨ、ＲＦＰ等抗结核药一样的活性，它还能协同提高其他抗结核二线药的抗菌活性。目前，该药已经进入临床试验。

科学家经过针对ＭＴＢ耐药机理的大量研究，已经基本明确其耐药机制：抗结核药物作用的靶分子突变是最主要方面；其次是物理屏障，细胞壁特殊结构会减少抗菌药物的摄取而产生耐药性；而分枝

产生和蔓延的，还需要进一步深入的研究。研究耐药突变的分子机制，不仅有利于明确抗结核药物的耐药和作用机理，而且为我们快速鉴定耐药菌株提供可靠的依据。目前应用于临床的快速检测耐药基因试剂盒。如Ｇ－ＭＴＢＤＲｐｌｕｓ等，由于检测位点较少，导致其敏感性较低。因此。如果能全面系统研究耐药相关的突变基因及其突变位点，那么就能快速准确地确定耐药情况，指导临床用药。

３

ＭＴＢ外排泵等其他机制在耐药中的作用许多病原菌拥有耐药质粒，并能迅速传播，导致

表２结核分枝杆菌耐药相关的外排泵系统与药物作用关系

垦竖竖咝盘查！！！！堡！！旦箜ｉ！鲞璺；！塑！！！』曼墅画！！旦！！！巴蛙！！！！！：！！！：ｉ！：盥！：！！

?１５０５?

杆菌外排泵能将菌细胞内药物泵出。使得胞内药物浓度不能有效抑制或杀死分枝杆菌．从而产生耐药性。药物外排泵系统是对ＭＴＢ耐药机制的重要补充。尽管从ＭＴＢ的细胞壁、分子机制、外排泵等都能部分说明耐药机制，但药物如何突破或作用于ＭＴＢ的细胞壁。使得抗结核药物发挥作用尚需进一步研究。目前虽然已检测到大量耐药突变基因。但仍可能存在未检测到的突变基因，而有些耐药株并未检测到耐药基因的突变。外排泵和分子机制如何相互发挥作用等。目前仍存在许多问题需要进一步深入研究。科学家根据已知的研究成果建立了ＭＴＢ的数据库（：／／．ｂｒｏａｄｉｎｓｄｔｕｔｅ．ｏｒｇ／

ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｇｅｎｏｍｅ／ｍｙｃｏｈａｃｔｅｒｉｕｍ．．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ——

ｓｐｐ／ＭｕｌｔｉＨｏｍｅ．ｈｔｍｌ和：／／．ｔｂｄｂ．ｏｒｇ／），使得研究者能方便、快捷地获得已知的研究结果，这其中也有包括耐药方面的最新研究进展。明确抗结核药物活性与耐药作用机制，寻找药物作用靶点。从而能合理地用药。提高疗效、预防耐药的发生，而且对于研制更有效的抗结核药物具有十分重要意义。

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（收稿日期，２０１０—０７—２３）

范文三：结核分支杆菌耐药的分子机制研究进展

鳖验医学与临床2009年6月第6卷第儿期Lab Med Clin,June 2009,V01.6,No.11 5总结和展望

TSI。P在过敏性皮炎的皮肤上皮和过敏性哮喘的气道上

皮中明显表达是比较明确的事实,目前也都倾向于认为TSLP

在过敏性炎性反应疾病中扮演着举足轻重的角色,但对于

TSLP在过敏性炎性反应疾病中的作用的具体机制还有很多

不明确的地方。近来的研究主要表现TSLP的作用可通过激

发肥大细胞和树突状细胞来产生过敏性炎症反应,在树突状细

胞的激发过程中OX40I。途径又起着重要的作用,这就对临床

工作者在过敏性炎性反应疾病的治疗途径上又提供了一条崭

新的道路。同时炎性反应性Th2细胞理论的提出也为Thl、

Th2平衡理论在过敏性炎性反应疾病的发生机制中做了更深

入的解释。虽然在TSLP的研究中还存在着许多的未解之谜,

但相信随着这些迷题的解决,在人类治疗过敏性炎性反应疾病

的过程中将会有突破性的进展。

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(收稿日期:2009—03—05) 结核分支杆菌耐药的分子机制研究进展

徐龙强1综述,于 红2审校(青岛大学医学院:1.附属医院检验科;2.微生物学教研室,山东青岛 266003)

【关键词】 结核分支杆菌; 耐药基因; 分子机制f 基因突变

中图分类号:R978.3文献标志码:A 文章编号:1672—9455(2009)11-0887~04

目前结核病仍是威胁人类健康的3大感染性疾病之一,是 仅次于艾滋病的第2大致死性感染性疾病。我国至今仍是结 核病的高发国家,结核病的患患者数仅次于印度居于第2位。 现在全国约有600万名结核病患者,每年约25万人死于结核 病,结核病仍然是世界卫生组织和我国重点防治的重大传染性 疾病之一。

目前用于抗结核治疗的药物有很多,其中属于一线类的药 物主要有利福平、异烟肼、链霉素、吡嗪酰胺、乙胺丁醇等;属于 2线类的药物主要有氟喹诺酮类、乙硫异烟胺、大环内酯类和 对氨基水杨酸等。下面就各种抗结核药物耐药的分子机制及

万方数据

?888?

进展做一综述。

1利福平(RFP)耐药的分子机制

检验医学与临床2009年6月第6卷第11期Lab Med Clin,Jllrle

2009,V01.6,No.11

RFP是用于防治结核病的一线药物,是利福霉索的半合 成衍生物,通过与细菌RNA聚合酶p亚基结合,干扰、抑制细 菌的转录过程,实现杀菌效果¨]。大多数结核分支杆菌

(MTB)耐RFP是由于其RNA聚合酶p一皿单位的编码基因

rpoB突变所致。当rpoB基因耐RFP决定区发生突变时,使 DNA依赖性RNA聚合酶8-亚单他酶活性改变,RFP不能与 细菌RNA聚合酶酽亚单位结合而表现为耐药。

rpoB基因突变一般是单个碱基突变或数个碱基联合突 变。约95%的突变发生在507~533位密码子,其中约80%~

86%的碱基突变发生在3个氨基酸伉点上,最常她的突变佗点

是531位和526位f 2--4]。53l、526和513位点的突变一般导致 高水平耐药,514和533位点的突变一般导致低水平耐药。还

町能发生511、516和518位的点突变产生低水平的RFP耐

受H]。另外约3%~5%的菌株未发巩rpoB基因的突变。

2异烟肼(INH)耐药的分子机制

摊’ INH是防治结核病的一线用药,它可以被MTB内过氧化 氢酶一过氧化物酶激活。作用于enovl-ACP还原酶,抑制细胞壁 分支菌酸的生物合成,造成细胞肇的破损,使分支杆菌抵抗氧 化和侵袭的屏障受到损害。MTB耐INH与下列基因突变

有关。

2.1

KatG

katG是过氧化氢酶一过氧化物酶的编码基因,研 究认为,katG基因的变异导致的MTB触酶一过氧化物酶活性 降低或缺失町以解释90%以上的异烟肼耐药。KatG的完全 缺失主要出现于高耐异烟肼分离株中;katG随机突变最常见 的位点是315位密码子口““。该位置的变异通过对katG活性 位点甲基化阻碍r异烟肼与katG的结合,导致酶失去活化异

烟肼的能力。

2.2

inhA

inhA是烯酰基还原酶的编码摹因,其编码的

NADH依赖的enoyl—Acp还原酶催化△一不饱和脂肪酸转化为 饱和脂肪酸的还原反应,分支杆菌利用该产物合成的超长链a一 脂肪酸是其细胞壁的霞要成分。研究[8.9J表明,INH可以阻断 99%的分支杆菌、分支菌酸即细胞壁长链脂肪酸的生物合成。

inhA突变导致低水平耐INH;最常见的突变位点是一15位,

inhA编码基因突变的发生率高低不一,现在认为inhA94位的

氨基酸突变可能与耐INH有关[1…。

2.3

axyR—ahpC

axyR是调节分支杆菌氧化一应激的基因,

ahp(

ahpC突变作为katG基冈损伤的标志,还有学者认为ahpC编 码基因突变极少,町能与耐INH无关。

2.4

kasA

kasA是p酮酰基运转蛋白合成酶的编码基因,参 与分支杆菌生物合成。kasA的基闪突变约占10%,已发现

R12lK、G269S、G312S和G387D的突变,在有些INH敏感株

中也发现312位密码子突变,可能该位点存在基因多态性。另 有少部分耐INH分离菌株末发现上述基因的突变,kasA基因 突变与耐INH之间的关系还需进一步研究。

2.5

ndh

ndh是编码NADH脱氢酶的基因,Lee等‘”]2001

年首次报道了影响MTB对INH耐药的新型突变基因ndh,认 为该基因的突变使得NADH脱氖酶的活性受到抑制,NADH

/NAD+的比值升高,而产生r对INH的耐药。

3链霉素(SM)耐药的分子机制

SM是防治结核病的一线药物,是氨基环醇糖苷类抗菌药 物,主要作用于核糖体30S幔基,诱导遗传密码的错读,抑制

mRNA翻译的开始,干扰翻译过程中的校对,抑制蛋白质的合 成,发挥抗菌作用。研究表明MTB耐SM是由于核糖体蛋白 S12编码的基因(rpsl。)和16s rRNA基因(rrs)突变所致。约

80%的耐SM菌株有rpsl,或rrs的突变,其中rpsI。的突变率

高于rrs。rpsL基因突变主要位于43位和88位密码子,其中 43位密码子突变率最高。rr￥基因突变通常发生在513位碱 基,还可见于905、491、512、516和904化碱基卟]。大约有1/3的临床耐药标本没有rr￥幕因和rps!。基因的突变,表明可能

存在其他的耐SM机制…。

4吡嗪酰胺IPZA)耐药的分子机制

PZA是一线的抗结核常用药,是尼克酰胺的类似物。 PZA的体内作用机制尚不十分明确,一般认为是MTB的吡嗪

酰胺酶(PZase)将PZA转化成具有活性的吡嗪酸(POA)而发

挥作用。

众多的研究结果支持pncA基因的突变造成PZase活性 降低或丧失是MTB产生对PZA耐药的主要原闪【l““。现已 发现pncA基冈至少有175种突变,突变位点主要分布在3~

17位、61~85位和132~142位3个区域,尤以第78、79和143

位的移码突变较常见,最常见的突变位点是一1l位点A.G的点 突变。研究发现自.蝗耐PZA菌株没有发生pncA基阒突变?还 有研究表明pncA基因存在突变但PZA还保持活性,这说明还 存在其他的耐药机制。

5乙胺丁醇(EMB)耐药的分子机制

EMB是抗结核治疗的一线药物,是一种阿拉伯糖类似物。 EMB作用的靶分子阿拉伯糖基转移酶,通过抑制阿拉伯糖基 转移酶来阻断阿拉伯聚糖的合成,造成阿拉伯半乳聚糖和脂阿 拉伯甘露聚糖的合成障碍,导致细菌无法合成完整的细胞壁并 造成分枝菌酸的积累,从而导致细菌的死亡。

研究表明MTB对EMB的耐受与embC,embA和embB 等基因的过量表达有关,其中embB基因的突变是耐EMB的

主要原因,以发生在306位密码子的突变最为常见。此外,发 生在第285、313、319、330、406以及630位的氨基酸置换也可

引起对EMB的耐药。有报道第306位密码子突变具有相当的 普遍性,可作为快速测定耐EMB菌株的标准n“,也有学者认 为embB306位的突变与EMB的耐受之间的关系有争议。研 究表明有部分耐EMB的分离株未发现embB基冈的变化,说 明存在其他耐药机制。有报道embC第394、738位的氨基酸

置换,embA中第462、913位的氨基酸置换,以及位于embC-embA之间区域内的第1,12、16位的突变,另外,还发现与 EMB耐受相关的embR突变,都可能与耐EMB有关,其确切

关系需进一步研究。

6氟喹诺酮类药物(FqNS)耐药的分子机制

FQNS类药物属二线抗结核药物,该类药物的主要作用靶 位是菌体内DNA解旋酶,DNA解旋酶为一种1I类拓扑异构

酶,其由A亚单位和B亚单位组成,两个亚单位分别由gyrA

和gyrB基因编码,研究表明MTB耐FQNS主要与gyrA和 gyrB基因突变有关。

gyrA突变叮导致高度耐药,突变率约为75%~94%,突

变主要集中在gyrA的保守区,即67~106位氨基酸,此处被认

万方数据

塑鲎医学与l临床2009年6月堑6卷第1l期_Lab Med Clin,June 2009,V01.6,No.11?889?

为是FQNS类耐药的决定区。目前已经发现在94、90、88、91、 87和83位的氨基酸发生突变或氨基酸的置换,有报道发生在 gyrA基因90位和94位密码子的突变可导致MTB对FQNS 的耐药,是MTB对FQNS耐药的主要原因。对gyrB的突变 是否能引起MTB对FQNS的耐药,有的认为gyrB的突变率 很低,且仅导致低度耐药,对此还需要进一步进行研究。

7乙硫异烟胺(ETH)耐药的分子机制

ETH属二线抗结核药物,其结构与异烟肼类似,但很少有 交叉耐药性。它能够抑制MTB的结核环酸合成酶,阻碍结核 环酸的合成,从『『Ii发挥抗菌活性。有学者证实与MTB耐 ETH有关的基因是inhA、Rv3854C(ethA)和Rv3855(ethR)。 inhA启动子和结构基因均可发生突变。ethA的突变分布于 整个基因,inhA结构基因和ethA的突变可以引起高水平的 ETH的耐受。而ethR是一个与ethA调节有关的摹阏,ethR 基因编码的阻抑物能够负性调节ethA基因编码的蛋白的表 达‘1“。

8大环内酯类药物fMls)耐药的分子机制

MIs类药物为二线的抗结核应用药,能够可逆性地结合到 细菌50S核蛋白体大亚基的23S单位上,抑制肽酰基转移酶, 影响核蛋白的位移,抑制细菌蛋白合成肽链的延伸,从而发挥 其抗菌的作用。研究发现,ermMT基因(Rvl988)与MTB对 Mls类抗菌药物的耐药作用有关。ermMT基因编码arm甲基 转移酶,所产生的酶能将23S rRNA上的一个特异性腺嘌呤残 基6位双甲基化,改变核糖体的构象,使抗菌药物结合位点发 生重叠,从而降低对抗菌药物的亲和力。ermMT基因的表达 就意味着MTB对MIs类抗菌药物有耐药性[1”,除r某螳卡 介苗菌株ermMT(RD2区)缺失外,该基因存在于所有MTB 复合群菌株[6]。

9对氨基水杨酸(PASA)耐药的分子机制

PASA是二线应用的抗结核药。属抑菌性药物,其作用机 制可能是在MTB的叶酸合成过程中与对氨基苯甲酸进行竞 争,从而阻碍MTB叶酸的合成¨“。

研究发现,胸腺嘧啶核苷酸合酶(thyA)基因是细菌体内 叶酸盐水平的决定基阏,thyA突变菌株有耐PASA的现象。 研究表明,临床MTB感染者对PASA耐药的分离株,thyA基 因发生了突变,且编码酶的活性下降,因此,有学者认为,thyA 突变很可能是对PASA耐药的一个标志,或者是其他靶点为 叶酸代谢过程的药物产生耐药的分子机制[1“。

lO存在的问题和展望

尽管现在对MTB耐药分子机制的研究取得了较大的进 展,但是日前还存在许多问题需要进一步的深入研究。应用基 因突变的各种检测技术分析耐药基因有意义的突变位点,虽可 检出大部分的耐药MTB,但仍有部分的耐药菌株未能检测出 耐药基冈的突变,说明可能存在有其他的耐药机制。而有些耐 药基因位点的突变与耐药表型之间的关系仍然需进一步研究, 以确定其确切的临床意义。在加强对一线抗结核药物研究的 同时,应该更加广泛深入地开展对二线抗结核药物耐药的机制 研究,寻找药物的作用靶点,明确药物的作用机制以及耐药基 因编码酶的调节途径,寻找耐药基因与可能的诱变因素之间的 关系,建立新的更加快速、灵敏、特异的检测方法等。

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1ate pathway is a target for resistance to the drug para-

aminosalicylic acid(PSA)in myeobacteria l-J].Mol Mi一

自体输血的I临床应用

谭庆芬综述,李聚林,罗 志审校(广西壮族自治区柳州市血液中心 545005)

【关键词】 自体输血; 临床应用; 输血安全

中图分类号:R457.1文献标志码:A 文章编号:1672—9455(2009)11-0890-04

由于异体输血存在一定的风险,这些风险主要来源于输血

的不良反应和经血传播病毒感染等,因此,自体输血就显得更

为安全,特别是近几年来输血技术的发展,也推动了临床自体

输血技术的发展,笔者就自体输血的有关情况作以下综述。

l 自体输血的种类与方法

I.I贮存式自体输血(PAT)[1]贮存式自体输血的采血过程

与异体献血过程相似,通常对估计手术中可能要输血的患者于

择期手术前3~5周根据需要分几次抽取一定量的血液,以保

证有足够的时间使红细胞再生,最后一次采血至少在术前72h

进行。这样可在患者血红蛋白(Hb)降至110g/L之前采集2

~4个U自身血。将采出的血液贴上标签,置于4℃储血冰箱

保存。待术中或术后将血液还输给患者。需要注意的是对于儿

童及未成年患者应减少血袋中抗凝剂用最以防止血液回输时

出现枸椽酸盐中毒。为了增加术前备血量,通常建议患者口服

铁剂以有利于贮存式自体输血过程中的红细胞牛成。然而,许

多患者冈出现胃肠道不良反应而未应用铁剂治疗,但有应用红

细胞生成素(EPo)的报道。成分血的术前采集也是可行的,术

前采集的富含血小板血浆,于进行体外循环期间回输可提高止

血效果并减少输注异体血,但有学者持反对意见。术前采集自

身血小板尤其在体外循环中行不通,这是因为患者可能在术前

服用了抗血小板药物,而且手术通常在应急状态下进行,因而

采集的血小板数最相对较少[2]。

1.2稀释式自体输血(ANH) 采血前约10min输注乳酸林

格氏液(10~15)mL/kg,实施控制性低血压,放血量的计算采

用Gross公式f3]。麻醉诱导后经静脉采血,同时穿刺另一侧静

脉,快速同步输入晶体液或/和胶体液,采血最与所用液体量的

比例:晶体液1:3,胶体液1:1,晶体与胶体液合用1:2。放

血与输液的同时应监测心电、动脉压和中心静脉压的动态变

化,调整输液的速度和量以维持循环的稳定。放血完毕再次测

定红细胞比积(Hct)和Hb,与理论的计算值做对照,在计算采

血量时,还应考虑手术的失血情况,一般按计算量的2/3采血

为宜,采血400~800ml。,平均600mL,采血时要边放血边摇

动,保证血液与抗凝剂混匀,避免出现凝血。所采血液收集于

含抗凝剂的标准血袋内(肝素抗凝会破坏血小板活性),贴上标

签,在室温下可放置4~6h,大于6h应放冰箱并于24h内用

完。一般在术中待大出血基本控制后输还给患者,术中Hct

维持在0.25~o.30E“。

1.3回收式自体输血(IBS) IBS有两种方法[5]:(1)简单的

回收系统(非洗涤式血液回收)它是术中和术后最古老、最简单

的自体血回输方法,包括心胸和整形外科术野和术后引流血的

吸引收集,经过简单过滤(小于170“m滤器、抗凝剂与血之比

1:7),然后再经40pm滤器回输给患者。这种方法称为未处 (收稿日期:2009—02—21)

理自体血回输(Autotransfusion of unprocessed blood。AUB)。 (2)洗血细胞机系统是将术野血或引流血经离心、清洗加工为 洗涤红细胞,然后回输给患者。

非洗涤式(滤过式)血液回收自体输血:把一次性带泵管的 管道放在右心滚轴泵上,长端做为台上吸引管,并通过三通与 一次性右心吸引头连接(三通另一接口与肝素盐水相连),短端 在台下接贮血器、钳闭贮血器的出口。通过三通滴人肝素盐 水,每100mL回收血液中滴入含肝素4mg的盐水容量抗凝。 当贮血器内血液达一定量时,松开贮血器出口的血管钳,过滤 后的血液,收集到无菌瓶中,然后回输给患者本人,用鱼精蛋白 中和肝素(每100U肝素加1mg鱼精蛋白)[6]。贮血器中的滤 器为渗透式,它可滤除来自腹腔内或术野吸引血带来的微栓, 滤器上还涂有硅油,能达到祛泡作用,有效防止气体栓塞u J。 洗血细胞机系统[8]患者人手术室后监测血压、心率、心电 图和脉搏血氧饱和度。快速麻醉诱导后气管插管,连接麻醉机 进行辅助呼吸,术中维持呼吸气末COz分压35~45mm Hg。 诱导完毕行桡动脉和颈内静脉穿刺连续监测直接动脉压和中 心静脉压。手术开始后使用2000型自体血液回收机(北京京 精医疗设备公司)收集术野出血,吸引负压在100mm Hg以 内,吸引到储血瓶中。抗凝药肝素经双腔吸引管在吸头处与血 液混合,每毫升回收血加入5~7U肝素以防凝聚。血液经滤 孔直径40gm的滤器滤过,经大量生理盐水(生理盐水与收集 血液按2:1冲洗)清洗后至离心泵自动洗涤离心。将清洗液、 抗凝药、游离血红蛋白、细胞碎片等分离入废液袋内,洗涤离心 后的浓缩红细胞收集到血液袋内,手术主要步骤结束后回输给 患者。通常町回收大于80%的失血,和单纯滤过回收血的最 大区别在于经离心除去了血浆成分(凝m因子、血小板、血浆蛋 白),洗涤后显著减少了残留的多种有害物质。可适当补充凝 血因子、血小板等以防止凝血功能异常t-…。同时应该注意:(1) 严格无菌操作;(2)肝破裂患者因存在胆汁污染的町能尽量不 用,在紧急抢救休克而又无血源,同时排除胆管损伤时慎用,此 时应加用大量激素[1…。

2自体输血的适应证及输血阚值

美国血库协会(AABB)标准规定只要术前Hb≥110g/L, Hct≥O.33的患者均可应用贮存式白体输血[1“。PAT常用于 全髋关节置换术,血管外科手术,心脏外科手术或胸外科手术, 其中以全髋关节置换术最为合适,但骨髓炎例外。PAT无年 龄及体质蕈限制,无并发症的孕妇亦可应用PAT,但因为正常 分娩很少需要输血,妊娠期间并不建议常规应用贮存式自体输 血。儿科患者在对其身体状况充分评价及采血量作出适当调 整后可进行PAT【1]。某些手术由于几乎不需要输血而不必应 用PAT,有下列情况之一的患者则禁用PAT:(1)并发细菌感

万方数据

范文四：浅谈抗结核药物的作用机制及结核分枝杆菌的耐药机制

浅谈抗结核药物的作用机制及结核分枝杆

菌的耐药机制 结核病与胸部肿瘤2011年第1期Tuber&ThorTumor,Mar2011,No.1

.

教育园地.

浅谈抗结核药物的作用机制及结核分枝杆菌的耐药机制 高静韬傅瑜

自上世纪40年代抗结核药物的相继问世使全 球结核病疫情得到有效控制,异烟肼,利福平等抗 结核药物的广泛使用,使结核病发病率和死亡率大幅 度下降.然而20世纪80年代后期,随着结核菌耐药 现象的出现,结核病又重新蔓延扩散,近年来已发展 到非常严重的地步,成为亟待解决的全球性公共卫 生问题.目前对结核病的治疗主要采用一线药物异 烟肼,利福平,吡嗪酰胺,链霉素以及乙胺丁醇联 用的疗法,疗程为6至9个月.如果由于结核分枝杆 菌的耐药性或患者对一种或多种一线药物的不耐受 而导致疗效不佳,则考虑选用二线药物,包括对氨基 水杨酸,卡那霉素,阿米卡星,氟喹诺酮类药物, 卷曲霉素,乙醇硫异烟胺和环丝氨酸等,这些二线药 物通常较一线药物的疗效差,且具有更严重的不良反 应,治疗疗程往往为18至24个月.

深入了解抗结核药物的作用及相关耐药分子机 制,发现新的作用靶点,对研发及筛选更加有效的 新型抗结核药物意义重大,其中某些具有巨大潜力 抗结核新药的研发,可能会成为最终根除结核病的 基础药品.本文仅就目前临床常用的几种抗结核药

物作用机制和耐药发生的分子机制作一介绍. 1利福平(Rifampicin,R) 利福平作用方式及耐药机制一直是分枝杆菌病 基础研究的热点之一.1967年,Hartmann等研究 发现利福平是许多原核细胞DNA依赖性RNA聚合 酶强有力的抑制剂,利福平与该酶结合封闭了转录的 起始.随后,Wehrli等皿研究结果表明利福平不能与 耐药突变株的RNA聚合酶结合,提示利福平耐药可 能与该酶改变有关.1985年,Yamada等口的研究进 一

步表明,结核分枝杆菌利福平耐药株的DNA依赖 性RNA聚合酶发生改变,从而使药物不能与该酶结 合,导致抗菌作用消失.利福平是多药联合方案中 75?

的主要成份,该药通过与依赖于DNA的RNA聚合 酶的B亚单位特异性结合,抑制RNA聚合酶的活性. 从而干扰转录起始,抑制mRNA的转录过程,进而阻 碍蛋白质的合成,导致细菌死亡H.RNA聚合酶在 生物体内基因转录合成mRNA信息传递过程中起着 至关重要的作用.依赖DNA的RNA聚合酶,为含 4个亚单位(o,B,B',6)的复合体,编码a,

p,13'和6亚单位基因分别称为rpoA,rpoB, rpoC,rpoD.96%,98%利福平耐药菌株的产生是 因为编码该酶亚基的聊B基因发生突变所致,这 些突变集中发生在507~533位密码子81个碱基区 域(利福平耐药决定区),从而导致RNA聚合酶分 子原有的利福平结合位点构象发生改变,失去了与 利福平结合的能力而导致耐药发生】.另外,利福 布汀和利福喷丁同属利福霉素衍生物,利福霉素类

之间存在交叉耐药现象,有学者报道部分结核分枝 杆菌对利福平达到临床耐药时,仍未达到利福喷丁临 床耐药,对利福平耐药的部分结核分枝杆菌对利福喷 丁仍具有一定程度的敏感性,提示临床上对利福平耐 药的结核病患者使用利福喷丁可能有一定效果:另 有报道利福布汀与利福平之间为非完全交叉耐药, 约30%利福平耐药株对利福布汀仍然敏感,因此,利 福平耐药株可酌情使用利福布汀.国际上虽然已有 少量关于测定利福喷丁和利福布汀的药物敏感性报 道,但至今尚未形成国际公认标准,仍需更多的实 践性研究以促进这一问题的解决.

2异烟肼(Isoniazid,H)

异烟肼是最早使用的抗结核药物之一,早在 1954年Cohn等就首先报道,耐异烟肼的分枝杆菌 中过氧化氢酶活性丧失或降低.同年Middlebrook【9 的研究也证实了这一点,认为过氧化氢酶在结核 分枝杆菌对异烟肼耐药中起了重要作用.1992年 作者单位:101149北京,中国疾病预防控制中心结核病防治临床中心

结核病与胸部肿瘤2011年第1期Tuber&ThorTumor,Mar2011,No.1

Zhang[】卅等首先从基因水平上证实了结核分枝杆菌 过氧化氢酶介导了其对异烟肼的敏感性,并克隆出 该酶的基因(katG).异烟肼被视为前体药物,被结 核分枝杆菌内过氧化氢酶一过氧化物酶(由katG基 因编码)激活u.',氧化成异烟酸,成为尼克酸的类 似物,作用于烯酰基载体蛋白还原酶(enoyl—ACP还 原酶,由烯酰基还原酶编码基因inhA编码),使分枝 菌酸合成减少,抑制分枝杆菌细胞壁生物合成而杀 菌./catG将异烟肼氧化为亲核自由基,后者与辅因 子NAD反应,形成一个共价化合物一异烟肼一NAD

(H),使其不能起同工酶的作用,抑制依赖NADH的 enoyl—ACP还原酶InhA,该酶催化?不饱和脂肪酸 转化为饱和脂肪酸的还原反应,是结核分枝杆菌合 成分枝菌酸所必需的酶,InhA被抑制后,细胞壁重 要组分分枝菌酸的合成受到影响,使结核分枝杆菌 损失细胞壁的完整性和抗酸性,细胞壁保护及抗氧 化,侵袭的屏障功能受损,随着碳水化合物,氨基 酸和磷酸盐的丢失致使结核菌死亡.异烟肼并非直 接与InhA相互作用,需要转化为活性形式,抑制 InhA需要异烟肼,NADH,Mn?和氧等,KatG参 与了异烟肼活化,KatG能够有效催化Mn氧化为 MnIl31.

异烟肼在菌体内有多个作用靶位,因而其耐药 机理相当复杂.目前已发现katG,iahA或mabA, ahpC,oxyR和kasA基因的变异与耐药性产生有关 [14,15]

.其中katG为编码过氧化氢酶一过氧化物酶的基 因,该基因突变造成酶分子活性降低或失活,使异 烟肼不能转化为活性形式而发挥杀菌作用,被认为 是造成结核分枝杆菌对异烟肼耐药的主要机制,该基 因的完全缺失在异烟肼耐药株中只占很小一部分但 却导致对异烟肼高度耐药.inhA基因编码与脂肪酸 合成有关的enoy1.ACP还原酶,其调节序列基因突变, 可使InhA(inhA蛋白)过度表达,从而增加酶的含 量,使药物的抑制作用相对减弱,导致耐药的产生. inhA基因突变导致对异烟肼低度耐药,约占异烟肼 临床耐药株的10%,35%【1.另外,研究发现n, 与异烟肼耐药相伴发生结核分枝杆菌对乙硫异烟胺/ 丙硫异烟胺的耐药,它们化学结构相似,且乙硫异

烟胺/丙硫异烟胺的药理作用也被认为是抑制分枝菌 酸合成有关,由此推断由inhA编码的酶是异烟肼与 乙硫异烟胺/丙硫异烟胺共同的作用靶位,实验证实 inhA突变常引起异烟肼和二线药物乙硫异烟胺/丙 硫异烟胺的交叉耐药n.

3乙胺丁醇(Ethambutol,E) 乙胺丁醇是一种阿拉伯糖类似物,仅对细胞外 生长繁殖期的结核分枝杆菌有抑制作用,虽然有几 种假说论述其作用机制,但大多数研究都提示该药对 结核分枝杆菌的细胞壁结构有损伤性改变.该药作 用于靶分子阿拉伯糖基转移酶,抑制其聚合入阿拉 伯半乳糖,从而影响细胞壁分枝菌酸一阿拉伯半乳聚 糖一肽聚糖复合物的形成,其对结核菌细胞壁的破壁 作用有效促进了其他药物进入细菌体内的速度,而 与其他一线抗结核药物有协同作用.

多数研究报道,结核分枝杆菌对乙胺丁醇耐药 与阿拉伯糖基转移酶的编码基因embABC操纵子表 达增高或突变有关'】,表达增高导致低度耐药,基 因突变导致高度耐药.该操纵子由embC,embA和 embB基因组成,embB基因突变占36%~69%. 4吡嗪酰胺(pyrazinamide,Z) 毗嗪酰胺在酸性环境中具有较强的杀菌活性, 在中性或碱性环境中几乎失去杀菌活性.对细胞内 酸性环境下生长缓慢的结核分枝杆菌有独特的杀菌 作用,该药能进入含结核分枝杆菌的巨噬细胞并进 入菌体,在毗嗪酰胺酶作用下,脱去酰胺基,转变 成吡嗪酸而发挥抗菌作用.另因吡嗪酰胺在化学结 构上与烟酰胺相似,通过取代烟酰胺而干扰脱氢 酶,阻止脱氢作用,妨碍结核分枝杆菌对氧的利

用,而影响细菌的正常代谢,造成细菌死亡. 结核分枝杆菌对毗嗪酰胺发生耐药主要是由于 编码毗嗪酰胺酶的基因pncA发生突变所致n2o】,使 该酶活性降低或丧失而不能将毗嗪酰胺转变为活性 吡嗪酸[21,22].

5链霉素(Streptomycin,S) 链霉素仅对细胞外碱性环境中生长较快的结核 分枝杆菌有杀菌作用,主要作用于结核分枝杆菌的 核糖体,它与30S亚单位结合使其不能形成30S始 动复合物,诱导三联密码子的错读,抑制mRNA翻 译,干扰翻译过程中的校对而抑制蛋白质的合成. 结核分枝杆菌对链霉素的耐药机制尚未清楚, 大量研究认为多数链霉素耐药菌株的产生是 由于核糖体蛋白S12编码基因(rpsL)和(或)16S rRNA编码基因(rrs)突变所致.核糖体蛋白S12的 正常作用可能是维持读码过程中的一些轻微的不准 确性,而突变的s12蛋白却严格要求核糖体只使用 与每一密码对应的氨酰.tRNA,从而更准确地表达 mRNA上的每一个密码,抑制了链霉素诱导的遗传 密码错读而产生耐药性.此外,链霉素是与结核分 枝杆菌905位碱基周围的区域结合的,并保护该区域 结核病与胸部肿瘤2011年第1期Tuber&ThorTumor,Mar2011,No.1

免受烷化剂和核酸酶的作用.该区域若发生突变就 会破坏与链霉素的结合和链霉素诱导的错读. 6卡那霉素(Kanamycin,Km),丁胺卡那霉素 (Amikacin,Am)和卷曲霉素(Capreomycin,Cm)

前两种药物为氨基糖苷类抗生素,卷曲霉素为多 肽类抗生素,但它们作用机制相似,均通过干扰蛋白质 的合成阻止细菌的生长.结核分枝杆菌对卡那霉素和丁

胺卡那霉素耐药可能是由于16SrRNA编码基因O括)突 变所致,对卷曲霉素耐药是由于对册基因和/或编码甲 基转移酶的dyA基因发生突变所致..从基因型上来 讲,两类药物存在共同的耐药相关基因.研究发现关于 这两类药物交叉耐药性的问题一直存在争论口.有研究 表明,对卷曲霉素耐药的分离株往往对卡那霉素和丁胺 那霉素敏感,仅有一小部分对卡那霉素耐药,对丁胺 卡那霉素耐药的比例更低.当dyA发生突变,结核分枝 杆菌对卷曲霉素产生耐药,而对卡那霉素和丁胺卡那霉 素霉素依然敏感.相反地,也有研究发现耐链霉素,卡 那霉素和丁胺卡那霉素的结核分枝杆菌仍然对卷曲霉素 敏感或部分敏感.因此如何合理选择注射剂的使用顺序 有赖于对其分子机制的深入研究.目前国内多数结核病 学专家建议,考虑到耐药结核病患者对链霉素的高耐药 比例,将卡那霉素和丁胺卡那霉素作为注射剂的首选, 如果分离株对上述二药耐药,就使用卷曲霉素.但值得 注意的是一些国外专家提出合理使用注射剂的顺序应为 S—Cm—Km~Am.

7氟喹诺酮类(Fluoroquinolones,Fq) 氟喹诺酮类药物主要包括氧氟沙星(Ofx),左氧 氟沙星(Lfx),莫西沙星(Mfx).此类药物对结核分枝 杆菌的作用效果依次为:氧氟沙星<左氧氟沙星<莫 西沙星.该类药物主要作用靶位是菌体内DNA螺旋 酶(拓扑异构酶II),该酶由两个A亚基和两个B亚 基组成的四聚体,由gyrA和gyrB分别编码其A亚 基和B亚基,与拓扑酶I共同决定着细菌体内负超 螺旋的水平.DNA螺旋酶在原核细胞DNA复制过程 中暂时切断DNA双链,引入负超螺旋结构,使复制又 移动时不因张力太大而不能前进.由于药物嵌入断

裂DNA链中,形成复合物阻止DNA拓扑异构变化,干 扰细菌DNA复制,修复和重组,导致菌体死亡.基因 gyrA第67—106位氨基酸被认为是喹诺酮类耐药决定 区,氨基酸密码子突变导致高一中度耐药且突变率较 高,而gyrB突变导致低度耐药,突变率很低.目 前研究多从临床分离株体外敏感性改变等表型检测结 果来分析氟喹诺酮类药物之问交叉耐药性口?,报道不 尽一致,而从分子水平或蛋白水平研究该类药物交叉 耐药性报道屈指可数.

综上所述,每类药物都有自己的耐药基因

决定区,这些区域的点突变,碱基插入和缺失均 可造成表达差异,引起菌体内酶或蛋白质结构或 功能的改变,从而导致耐药性的产生.同时,从 上文所介绍的结核分枝杆菌对几种常见药物产生 耐药的机制可以大略归纳出耐药发生的几大环节 (详见表1).必须指出的是,并不是每一种药物 的耐药基因只有一个或只有一种突变或只有一种 耐药机制在起作用,仅凭分枝杆菌的天然细胞壁 屏障作用和基因突变因素尚不足以解释其耐药机 制.最新研究表明,分枝杆菌存在药物主动外排 泵的表达,分枝杆菌外排泵能将菌体细胞内药物 泵出,使得胞内药物浓度不能有效抑制分枝杆菌 生长,从而产生耐药性.从目前的研究来看,如 果编码这些外排泵蛋白的基因或相关调控基因发 生突变,可能导致外排泵高表达,从而导致耐药 性的增加.因此对于结核分枝杆菌耐药机制仍需 进一步研究探索,查找和发现每种药物全部或绝 大部分的耐药基因,加强分枝杆菌外排泵的基础 研究,了解结核分枝杆菌耐药性的产生和发展规

律,为临床更好地选择抗结核药物和有效地进行

疾病治疗提供理论基础.同时对改进药物设计和

推动新型药物的开发将产生重要影响.

表1抗结核药物作用机制 药物名称

利福tz

片烟肼

乙版'醇

吡嗪酰胺

链霉素

}那霉索和

J胺卡那霉蔡

卷曲霉素

氟喹诺酮类

作用机制

抑制mRNA转录起始 抑制细胞壁分枝菌酸合成 抑制细胞壁半乳糖合成 影响细菌代谢

抑制蛋白质合成

抑制蛋白质合成

抑制蛋白质合成

抑制细菌DNA复制 作用环节

RNA转录水平

细胞壁成分改变

细胞壁成分改变

其他

蛋白翻译水平

蛋白翻译水平

蛋白翻译水平

DNA复制水平

RNA聚合酶B亚基

过氧化氢酶一过氧化物酶,烯酰基载

体蛋白还原酶

阿拉伯糖基转移酶

吡嗪酰胺酶

核糖体蛋白S12和16SrRNA

l6SrRNA

16SrRNA,甲基转移酶

DNA螺旋酶

范文五：【doc】抗结核药物的作用机制及结核分枝杆菌的耐药机理

抗结核药物的作用机制及结核分枝杆菌的

耐药机理

?712?中国抗生索杂志2004年12月第29卷第12期

文章编号:l001—8689(2004)12-0712-20

Mechanismsofdrugactionandresistance

inMycobacteriumtuberculosis

ZhangYing.XuShun—qingandLiChuan一

(1DepartmentofMolecularMicrobiologyandImmunology,Bloomberg

JohnsHopkinsUniverslty.Baltimore.MD21205,USA:

you.

Schoo1ofPublicHea1th.

2InstituteofEnvironmentalMedicine.TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityof ScienceandTechnology,Wuhan430030;

3BeijingInstituteofTuberculosis&ThoracicTumor,Beijing101149) ABSTRACTTuberculosis(TB)isaglobalhealthproblemthatposesincreasingthreatwiththespread

ofHIVinfectionanddrugresistantstrainsofMycoba,'teriumtuberculosis.EffectivecontrolofTBremainsa

significantchallengedespitetheavailabilityofchemotherapyandBCGvaccine.Theemergenceofstrainsof

M.tuberculosisresistanttomultipleanti-tuberculosisdrugsisincreasingduetoinadequatecompliancetothe

lengthyTBtherapyandpresentsasignificantproblemforthetreatment.Inordertocombatthethreatof

drugresistanttuberculosisandtomoreeffectivelycontrolthedisease,anunderstandingofthemechanisms

underlyingdrugresistanceisnecessary.Mechanismsofactionandresistanceofmajoranti-tu

berculosisdrugs

arerex,iewedinthisarticle.Thisknowledgecouldbeusedforthedevelopmentofmoleculartestsforrapid

detectionofdrugresistantstrainsandforthedesignofnewantl-tuberculosisdrugs. KEYWORDSMycobacteriumtuberculosis;Anti-tuberculosisdrugs;Mechanismsofactionandresis—

tance;Tuberculosis

中图分类号:R378.911文献标识码:A

1ntroduction

Tuberculosis(TB)isanancientinfectiouskillerthatstillremainstheleadingcauseofdeathbyaninfec—

tiousagentworldwidetoday.Itisestimatedthatone—

thirdoftheworldspopulationisinfectedwithMycobac—

teliumtuberculosis,thecausativeagentofTB,withapproximately8millionnewcasesand2milliondeathseach

year.TBhasbecomeanincreasinghealthproblemwiththeemergenceofHIVandtheincreasingappearance

ofdrugresistantstrains[.AlthoughdrugresistantTBwasreportedinthepastbeforetheemergenceofHIV,

theproblemofdrugresistantTBwasnotassevereasitistoday.TheHIVinfectionallowsdrugresistantTB

strainstotransmitandcausediseasemoreeasilybecauseofthesuppressionoftheimmunesystem.Drugresis—

lancehasbeenobservedforal1fiveofthefirst-1iReantituberculosisdrugsisoniazid(INH),rifampin(RIF),

pyrazinamide(PZA),streptomycin(SM)andethambuto1(EMB)andforsevera1ofthesecondlineanti—tuber

culosisdrugs.人

hhoughthemostcommonformofdrugresistanceisresistancetoonlyonedrug,strainsofTB

resistantlonltl11ipledrugssuchasINHandRIF(alsocalledMDR—TB)hasbeenreportedandisofgreatcon—

cernL

.Duetotheproblemofdrugresistanttuberculosis.therehasbeenagreatdealofinteresttounder

stand

themolecularmechanismsofdrugresistanceinM.nc}】r}'tttlosis.TheoutbreakofMDR—TBinNewYorkCityin

thelate1980sandearly1990shasdrawnmuchmediaal1ention.Thefirstmolecularstudyofdr

ugresistance

mechanisnlsin^,,.1u/)erculosiswasthatbyZhangandct1lleaguesin1992onthemechanism

ofINHresistancein

M.tube1(ul,)sis'.Subsequentstudiesidentifiedmechanisn>ofresistance1oothermajora

nti—tuberculosisdrugs

suchasRIF.SM一,一,targetofINHlnhA[.PZ人l.andEMB.~evera1recentrex,iewsOnt1aistopicare 收稿日期:200.1…15

作者简介:张颖.辫.于l963年.博士.副教授.从事结核药物研究

d

Amibioticresistanceinbacteri

r

acanoc

,

cLJr

,

b

.

y

,

a

,

variividedintofivemaity.f——一一L一'r111,1——'

rltn

cat

:.vmii,,iegories.,Fig.主;.:c.i,d:creadumpteackh.an.ismims.p......mJ.T一

hes.emeeihia"iism,s..areypically"nzym删a1ionan砌ficatIon0fIheantibi

otictargetand(v)_~tl

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Oilil

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◎/,..?P岫【ljdeE恤 I1altl

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Fig.2

Fig.1

HH1

Cycloserme

Ciprofloxacin

srucures.fc.mm.nlyusedfi

rst-lineandsec.nd—lineTBdrug

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』,.

1

CO

Mlanisnnsofdrugresistanc

einn】y.ba<ferla.Diamondsrepreel1tanti,

TBdrLg

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一,,一一,叭一?一.一,一.一,一,一,,

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?714?中国抗生素杂志2004年12月第29卷第12期

enzymeactivity.Thesemechanismsofresistancemaybearesultofintrinsic(natura1)resistanceoracquired

means.Intrinsicornaturalresistancereferstoresistancethatisnotcausedbyanygeneticalteration,while

acquiredresistanceisduetoamutationortransferofgeneticmateria1.M.tuberculosishasseveralmeansof

intrinsicresistance.Forexample,M.tuberculosishasaveryhydrophobiccellsurface,whichprovidesaperme,

abilitvbarrierforsomeantibiotics['.Inaddition,M.tuberculosispossessesbeta—

lactamasenecessarytoinac—

tivatepenicillin[8,

2.Asidefromnatura1resistancemechanisms,M.tuberculosishasacquiredresistancenlecha

—

nismstoanti,

tuberculosisdrugsbyspontaneousmutationsinchromosomalgenesratherthanbyanytypeof genetransfer[?.AstrainofM.tuberculosisisconsideredtobemulti—

drugresistanttuberculosis(MDR—TB)

whenitexhibitsresistancetoat1eastINHandRIF.TheMDR—

TBphenotypeisduetoanaccumulationof

mutationsatdifferentlociratherthanbyasinglemutation

【..Typicallypoorpatientadherencetotreatmentis

thoughttoberesponsibleforthedevelopmentofMDR—

TB.Unlikemanyotherbacterialspecies,plasmidsor

transposonsplaynoroleindrugresistanceinM.tubelculosis["'

引.despitetheirpresenceinsomeother

mycobacterialspeciesL.'..

Isoniazidresistance

BecauseoftheimportanceofINHinTBchemotherapy,itsmechanismsofactionandresistancehavebeen

reviewedmanytimesinthepast.includingsomemorerecentreviews[.,..

M:echanismofaclion

INHisanimportantfirst——lineanti——

tuberculosisdrugresponsiblefortheinitialdramaticdecreaseinactively metabolizingbacilliduringtreatmentofTB.M.tuberculosisishighlysusceptibleIoINHwithMICvaluesinthe

rangeof0.01,0.25~g/ml

【26].INHisactiveagainstgrowingtuberclebacilliinthepresenceofoxygen,bulnot activeagainstrestingbacilliunderanaerobicconditions[..TheactivityofINHismostobviousat37C,butis

greatlyreducedat4C[3

们,presumablyareflectionofoptimaltemperaturerequirementfortheKaIG—mediated

INHactivation(seebelow).

INHisapro—drugthatrequiresactivationbytheM.tuberculosiscatalase—

peroxidaseenzyme(KatG)toits

activeform[.?.,.

Uponactivationreactiveradicalsareformeddamagingmultipletargetsinthecell['.The activespeciesderivedftomINHactivationbyKatGincludeisonicotinicacylradical,isonicotinicacyl

species[37.383.inadditiontoreactiveoxygenspecies[..?.BesidesKatG.MnhasalsobeenshownIomediate

similarINHactivationasKatG[.'.ArecentstudyhasshownthatduringMn—

mediatedINHoxidationinthe

presenceof(NAD),arangeofisomericINH,

NAD(H)adductswereformed,including1heopenformofison—

icotinoylradicalfoundIobeboundwithInhA[..Thisstudyraisedthequestionastowhetheronlyoneformor

otherisomericcyclicformsofisonicotinoylradicalistileactivespecies[..Tilemostconvincingmolecularfar—

gethasbeenshownIObeInhA,anNADH—

dependentenoylacylcarrierprotein(ACP)reductase,involvedin

mycolicacidsynIbests

【42.43].Interestingly.InhAisalsothetargetoftriclosanL?]andcthionamidcL.人great

dealofprogresshasbeenmadeconcerninghowINHinhibitslheInhAenzymethroughaseriesofcryslallo

graphy[.']andfunclionalstudies【.

卜.?DuringINHactivation.thevariousreactiveoxygenradicalspro

duced[31.32.39.40]andrcaclirenitrogensuchasnilricoxide

【.couldcausedamageIovariouscellularlargelsinclud

ingDNAL8_.carbohydralesandlipids—

andinhibilionofrespiralionenzymessuchascylochronlecoxidase….

Inaddition,INHhasbeenproposedlOaffectNADmetabolismbyincorporalinginloNAD1hroughexchange

withnicolinamidc.orbyaclivalingNADlycol1ydrolasbyremovingitsrepressorleading10NADdeple

lionL.aspossibk,mechanisnlsofaction.However.1hereisnorecentwork1OCOlffirmiheeffectofINHOl1the

abox,easpectsofNADn~etabolism.ThebaclericidalaclivityofINHismostlikelydueIoacombilmlionofits

muhipieeffects0111hc1u1)crclebaciI1i(SeeFig.3)foraSUnlmaryofINHmechanismofaction.

M.tube1'culosisisuniquelysusceptiblelOINH[.

DespileIhepresenceofKal(;enzymencedcdforINH

抗结核药物的作用机制及结核分枝杆菌的耐药机理张颖等?715?

0NH—NH2

Fig.3MechanismofactionofINH.Seetextfordetails

susceptiblewithanMICin1herangeof10,

1OOug/mlINH[.However,M.aurum,M.kamasii,M.gastri

andM..renopi(MIC:1,5ug/m1)aremoresusceptibletoINHthanothernon—

tuberculousmycobacteriaL.

OtherbacterialspeciesoutsidethemycobacterialgeneraarehighlyresistanttoINHwithMICsofatleast

600ug/ml[.Thereasonsforthisdifferencearecomplexandnotwellunderstood.butmayhavetodowiththe

following:First,thereishigherperoxidaseactivityoftheKatGenzymeinM.tuberculosisthaninotherbacteria

suchasEsche,ichiacoliandM.smegmatisorM.vaccae[.,whichcanleadtoincreasedactivationofINHin

M.tuberculosis.Indeed,arecentstudyhasshownthatM.smegmatisKatGcannotdirectlyactivateINHand

requiresmanganeseforactivation[,whichmayberelatedtothelessINHsusceptiblephenotypeofM.

smeg—

matis[.

Second,thesensitivetarget(s)suchasInhAinvolvedinmycolicacidbiosynthesismaybemoresensi—

livetoINH—

derivedreactivespeciesinM.tuberculosisthantheircounterpartsinothermycobacteriaorbacteria.

Third,M.tuberculosismayhaveadeficienteffluxforINH—

derivedtoxicradicalsorisonicotinicacidgenerated

duringINHactivation,comparedwithothermycobacteriaorbacteria,asshownforpyrazinoicacidinthecase

ofPZAsusceptibilityL.ItisquiteremarkablethatonlythehighlysusceptibleM.tuberculosisaccumulates

radioactiveINHwhereasnaturallyresistantmycobacteriaorbacteriadonot[.ThissuggeststhatM.tuberculo

sismayhavesomedeficiencyinremovingtheINHderivedradicalsfromthecellcomparedwithnon—tuberculous

bacteria.hisofinteresltonote1hat11le1esssusceptibleM.smegmatishasademonstrableeffluxmechanismfor

INH[..

AlthoughM.tube1culosiseffluxproteinEfpAisinducedbyINHL.itwillbeofinteresttoseeif M.tube?culosis1NHelf1uxmechanisnais1essactive11lan111a1inM.sinegmatis.Fourth,M.tubc1losismaY1ack

antagonistsorade(tuat~antioxidativedefenseforINHoritsderivatire.TheKalEtype(HP一

11)heatstable

catalaseisabseulinM.tube1'ulosis,butpresentinothermycobacteriaorbacteriaL.TheKatEtypecalalase

mayremovethetoxic1)roxideproducedduringorneededforINHactivationandmayprovideprotectionagainst

INHinnon—

tuberctllollsmycobacteriaorbacteria.However,overcxprcssion0f."t,,zf,,katEinM.tubenulosis

didnotappeartoconfelresistancelOlNH}..Theobservationtj]at0vrcxIjrcssi0nofM.f"6,losiKat(;con,

ferredsomedegreeof1NHsensitivitYtoanE.(f,,kat(;/katEdoublenlutant,ledtoexamination0ft1lcroleof

()xyRinsuscepliMiiyi()INHinE.c'?

/L.MulalionofOxyRandKatG/AhpCinE.(Dcausedincreased

susceptibilitylOINH.Fhesefindingsledtothediscoveryofadefective()xyR,

andtheassessmenlofthe

?

716?中国抗生索杂志2004年12月第29卷第12期

ro1eofAhpCinINHactioninM.tuberculosis.

删.M.tuberculosisseemstobeparticularlysuscePtbleto

endogenouslygeneratedreactiveoxygenororganicradicals,presumablyareflectionofitsdeficientant一oxda—

tivedefenseanddefectiveeffluxmechanisms.AnotherpotentialantagonistarylamineN-acetyltranslerase

(NAT)involvedininactivalionofINH[64.65]maybelessactiveorpoorlyexpressedinM?tube-culosbutmore

activeorhighlyexpressedinotherlesssusceptiblemycobacteriaorbacteria. Mechanismsofresistance

INHresistancewasencounteredshortlyafteritsuseasananti—

tuberculosisdruginthe1950sLb;

however,itwasno1un1iltl1e1990sthatthemechanismsunderlyingrestslancewereelucidated【朋]?Zhang

fZ.

【2]werethefirs1toshowthatmurationsordeletionsinthekatGgeneresultedinresistancetoINHinclin—

ica1isolatesofM.f"be7-culosis.SusceptibilitycouldberestoredupontransformationwithafunctonalkatGgene

inresistantstrainsharboringkatGmutationsItwasalsonotedthatINH—

resistantstrainsthalosecatalase

activitvhadreducedvirulence~6G.683.

UponrestoringthekatGgene,notonlyINHsensitivity'butalsovirulence couldberestored[6.?.].

VariousmutationsinthekatGgenehavebeenreportedamonglNH—resstant

isolatesD9?7卜

77l,butthemostcommonmutationistheSer315Thrmutation'whichispresentinaPProximateiY

50ofa11INH-restsrantisolatesandresultsinhigh—levelresistancetoINH.

ThegeneinhA,encodinganNADH—

dependentenoylacylcarrierprotein(ACP)reductase'hasalsobeen

showntobeinvolvedinlNHresistance[].AhhoughmutationsintheinhAstructuralgenewerefoundntallY

tocauseINHresistance[],subsequentstudieshaveshownthatmutationsinthepromoterregOnotan

upstreamgene777"bA,encoding3一

ketoacylACPreductase,whichformsanoperonwithinhA'aremore

frequentthan,2^structuralgenemutations[].ThemabApromoterup—

mutationswillcauseoverexPresson

oftargetInhA,whereasmutationsinInhAitselfcausealterationsoftheInhAtarget,bothofwhichcauseINH

resistance.However,overexpressionofMabAalonedidnotappeartocauseINHresistanceinmycobacteria?

Theresistancec0nferredbyinhAmutationsisgenerallyoflowlevel,whereaskatGmutations

aremorecom—

mon1vassociatedwiIhhighlevelsofINHresistance[?.MutationsinInhAcausenotonlyIN

Hresistance'but

a1soresistance1othestruclurallyrelatedsecond—

linedrugethionamideandthecommonantibacteralagent

triclosaninM.7e7n"ti4..AnothergenekasA,encodingabeta—keto—

acylACPsynthase,adifferentenzyme

involvedinmycolicacidsynthesis,wasidentifiedbasedonitsinductionbylowlevelsofINH[.].Although

kasAmutationswereinitiallyfoundin4INH—

resistantstrains["],subsequentstudieshavereportedthatkasA

mutationscou1da1sobefoundinINHsusceptiblestrains.Recently,itwasshownthatoverexpresslonot

,z^increasedresistancetoINH,whilekasAoverexpressiondidnotcauseINHresistance'butcausedthiel一

ton1vcinresis1ancetsz3.

1naddition,arecentstudyhasshownthatKatG—activatedINHandtriclosaninhibited

InhA.butno1Kas人.Also,InhAinhibitioninducedtheformationofKasA—

AcpMcomplexthatdoesnotcon-

1ainINH,suggcs1ingthatInhA,butnotKasAistheprimarytargetofINH.TheroleofKasAinINHrests—

tanceisunclearandneedsfurtherstudy.

Mutationsin,2dh,encodinNADHdehydrogenaseII.initiallyidentifiedinM.777g77zatiasinvolvedin

lNHresistancel{,.11avcsubsequentlybeenfoundinsomeINHresistantclinicalisolatesL.DecreasedNdh

af1ivi1vincreasrs1l1cNADH/NADratio,whichcouldcompeleforthebindingofactivatedINH(isonicotinic

acv1radica1)t0111ctargetI,ll1

人.()rmaypromotedisplacementoftheisonicminicacylNADHfromlnhA?

T11isn1echanisIn0fINHrcsistaneehasrecentlybeenconfirmedtooccurin^彳.boz,isBCGandM?stttegnlatis

tW.R.Jaco1).1)crs0nalcornInunication).InKatG,ncati,cINHrcsisrants1raiI】

s?n1utatim1sil1thepron1oler

rci0nof/)('.(,needinganalkylhydroperoxidereduc~ase-havebeenobserved:isaconlpensa1l'ntor1helacK

0fala1ase一

rf)xidascactivityinsuchstrains…,862.Howcx,or.overexpressionofAph(didnotapleartoco

n1cr

INHrcsistancc.butcanbcanlarkerforINHresistance.Mutationsinfi~dE24,RJ1592c,Rv1772,

Ru03,t0,andilliB1(,genes[,whichwereinducedbyINHinamicroarrayanalysis',were|oundtobeP一

抗结核药物的作m*0t~l及结核分枝杆菌的耐药机理张颖等?717?

sentinsome1owlevelINH-resistantstrainst.However,theroleofthesenewlyidentifiedgenesinINHresis—

tanceneedstobeconfirmedbygeneticcomplcmentationexperiments.AmongINH—

resistantM?tuberculosis

strains,mutationsinkatGisthemostfrequentmechanismofresistancecomparedwithotherINHresistance

gcnessuct1asinhA,,2^L?

'];however,theexactpercentageofstrainshavingkatGmutationsmayvary accordingtodiffcrcntstudies.Despitetheseadvances,someINH—

resistantstrfiins,especiallythoseoflowto

intermediatelevelresislancewithpositivecatalaseactivity,donothavemutationsinanyoftheabovegenes,

whichsuggestsnewmechanismsofINHresistance.

Rifampinresistance

RIFisanott1crimportantfirst—

linetuberculosisdrugthatkillslogphaseandtoagreatextentalsostation—

arv1)?

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