神奇段哥
范文一：阿魏酸酯酶的制备
阿魏酸酯酶的制备 3
薛 枫 欧仕益 汪 勇 黄才欢 刘子立
(暨南大学食品科学与工程系 , 广州 ,510632)
摘 要 阿魏酸酯酶是一种新型酶制剂 , 在食品 、 饲料和造纸工业中都有着广阔的应用前景 , 但目前还没有工业 化产品 。 文中研究了超滤和冷冻干燥制备阿魏酸酯酶的工艺条件 , 结果表明 , 酶液 p H 值为 8106时有利于酶蛋 白截留 ; 装液厚度为 6mm 时 , 酶粉剂冷冻干燥时间为 24h ; 添加 1%~2%的聚乙二醇可以保护酶液在冷冻干燥 过程中不失活 ; 阿魏酸酯酶的液体和固体产品在保存过程中均表现出了较好的稳定性 。 关键词 阿魏酸酯酶 , 超滤 , 冷冻干燥
第一作者 :硕士研究生。
3广州市科技攻关重点项目 (No. 2003Z3-E0061) 收稿日期 :2005-08-24, 改回日期 :2006-01-23
阿魏酸酯酶 (ferulic acid esterase ) 是最近才分离
纯化出来的一种酯酶 , 它是羧酸酯水解酶的一个亚 类 , 也是一种胞外酶 [1]。 阿魏酸酯酶最主要的用途是 水解阿魏酸甲酯 、 低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中 的酯键 , 将阿魏酸游离出来 [2]。因此 , 在食品工业中 可利用该酶打断阿魏酸与细胞壁材料如麸皮 、 秸秆中 多糖的交联 , 高效降解多糖并获得反式阿魏酸 (42羟 基 232甲基 222苯丙烯酸 ) 、 生 产木糖醇等 。 提高纤维饲料的消化率和帮助脱除木质素 。 可见 , 阿 魏酸酯酶具有广阔的应用前景 [3,4]
。
目前阿魏酸酯酶还没有工业化产品 。研究者在 采用麦麸和蔗渣的混合培养基发酵生产这种酶制剂 方面做了系列研究 , 并利用中空纤维超滤膜组件将浸 提后的酶液进行超滤浓缩 。 在前期的试验中 , 作者对 超滤的工艺条件 (采用不同截流分子量膜管 、 超滤压 力 、 超滤温度等 ) 做了探讨 [5], 本文在此基础上 , 研究 了酶液 p H 值对超滤过程的影响 。同时 , 为了更加方 便于该酶制剂的保存 、 运输和使用 , 文中探讨了采用 冷冻干燥技术将液体酶制剂制备成为固体酶制剂的 工艺条件 , 并测定了 2种酶制剂在保存过程中的酶活 保持率 。
1 材料与方法
111 试剂 、 原料及仪器
黑曲霉 (Aspergill us niger , A TCC 16404) :广州
环凯生化试剂公司 , 经选育获得 , 采用 PDA 培养基保
藏 ; 麦麸 :南方面粉厂 ; 玉米麸皮 :华北制药厂 ; 蔗渣 :使用前浸泡除去残余蔗糖 , 干燥、 粉碎 ; 淀粉酶、 木瓜 蛋白酶 :远天酶制剂厂。 (NH 4) 2SO 4、 MgSO 4、 柠檬酸、 Na 2HPO 4、 聚乙二醇 (分子质量 6u ) 均为分析纯。
, ;NU F 中空纤维超 , 2, ; 2, ;53B UV/V IS 分 光 光 度 计 , 上 海 光 学 仪 器 厂 ; P YX 2250S 2A 生化培养箱 , 科力仪器 ; 三足式离心机 , 张家
港市苏南化工机械厂 ; SHA 2BA 恒温水浴振荡器 , 浙 江富华 ; K DN 204A 定氮仪 。 112 试验方法 11211 发 酵
发酵种子培养基 :20g 麦麸 +10g 蔗渣 +112g (N H 4) 2SO 4+0107g MgSO 4+30mL 水 , 培养基于 121℃ 灭菌 30min , 冷却 , 接种黑曲霉菌种 (每斜面孢
子悬浮液接种 6瓶 ) ,32℃ 培养 3d 。
扩大发酵培养基 :1000g 麦麸 +500g 蔗渣 +60g (N H 4) 2SO 4+315g MgSO 4+1500mL 水 , 培养基 混合均匀后灭菌 , 冷却 , 分装在 6个浅盘中 , 将上述发 酵种子按接种量 5%接种 ,36℃ 培养 3d 。 11212 酶液制备
发酵结束后 , 加入麸曲总重 10倍的水 ,40℃ 搅拌 浸提 2h 。 后用三足式离心机离心浸提液 , 去除固体 残渣 , 获得清液为酶液 。 11213 超 滤
采用截留分子质量为 2万 u 的超滤膜管 , 在进口 压力为 011MPa 、 温度 32℃ 的条件下进行试验 。
测定酶液 p H 值为 8106、 6134、 4140三个不同条 件下的超滤通量 , 原酶液 、 滤过液和浓缩液分别取样
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
46
测定酶活 、 蛋白质浓度 (注 :测定酶活时原酶液和滤过 液直接测定 , 浓缩液因浓缩 6倍后对底物过饱和 , 因 此稀释 6倍后测定 , 测定结果乘以 6为浓缩液酶活 ) 。 11214 冷冻干燥
样品预冻温度 :-20℃ ; 预冻时间 :12h ; 干燥室 压力 10~100Pa ; 加热板加热方式 :空气自然加热 。 1121411 干燥时间对酶活的影响
将装液厚度为 6mm 的样品进行冷冻干燥 , 分别 在干燥 8、 12、 16、 24、 30h 测定酶活 , 并按重量法测定 水分含量 。 取未冷冻及只冷冻未干燥样品测定酶活 。 计算剩余酶活 。
1121412 保护剂聚乙二醇浓度对酶活的影响
在酶液中分别加入 0105%、 011%、 015%、 1%、 2%、 4%、 5%的聚乙二醇 , 待冻干结束后测定酶活 。 计算剩余酶活 。
11215 液体及固体酶制剂保存过程中酶活保持率的 测定
将液体酶制剂 (加入 2000mg/kg 的山梨酸钾 , 1000mg/kg 的尼泊金乙酯做防腐剂 )
加 1%PEG 、 加 2
4℃ 冰箱 , 。将加 1%PEG 、 加 2%
环境下 1个星期后测定酶活 。 计算酶活保持率 。 酶活保持率 /%=
保存试验开始时酶活
×100 11216 酶活测定
阿魏酸酯酶酶活定义 :1个酶活力单位 (U ) 是指 在温度 40℃ 、 p H414条件下 , 水解去淀粉玉米麸皮 1 min 产生 1μg 阿魏酸所需要的酶量 。
酶解底物为除去蛋白质和淀粉后的玉米麸皮 。 蛋白质和淀粉的去除按欧仕益等 [6]的方法进行 , 烘 干 , 粉碎 。
液体酶用稀酸调 p H 到 414(酶的最适 p H ) , 测定 酶活 。 只冷冻未干燥样品 , 融化后按同样方法测定酶 活 。 干燥后样品用 p H 414的柠檬酸 2Na 2HPO 4缓冲 溶液把酶粉复溶到冻干前体积 , 测定酶活 。
剩余酶活 /%=
冷冻干燥前样品酶活
×100
酶活性测定按欧仕益等的方法进行 [7]。
蛋白质测定按凯氏定氮法进行 [8]。
2 结果与讨论
211 酶液 pH 值对超滤膜通量的影响
超滤的目的是为了进一步浓缩酶液 , 以方便酶的 保存 , 并且除去发酵过程中产生的阿魏酸等小分子物 质 , 消除产物抑制 。当酶液 p H 值为 6134时获得了 最大的超滤膜通量 (图 1) , 而 p H 值为 4140时的膜通 量相比中性和碱性条件显著降低 。阿魏酸酯酶的等 电点在 4左右 , 可推测在酸性条件下进行超滤时 , 由 于接近等电点 , 酶表面电荷较少 , 酶相互聚集 。这种 酶的聚集体更容易吸附到表面带负电荷聚砜膜的表 面 , 形成凝胶层 , 从而增加了膜的阻力 , 使得膜通量下 降 。 当溶液 p H 值在 8106时超滤膜通量也较中性条 件下要小 , 可能是因为黑曲霉发酵本身能够产生一些 壳聚糖类物质 [9], 这些物质在碱性条件下沉淀 , 形成 较大的颗粒 , 从而堵塞膜孔 , 导致膜通量的减小
。
图 1 超滤 p H 值对膜通量的影响
(进口压力 011MPa , 温度 32℃ )
212 酶液 pH 值对超滤后酶活的影响
经过超滤后 , 酶液浓缩了 6倍 , 大部分的酶蛋白 被截留 。 从表 1可知 , 在滤过液中阿魏酸酯酶只有微 量酶活 , 而蛋白质含量太低未检出 ; 浓缩酶液蛋白质 浓度相比原酶液提高了 5倍以上 。 同样 , 酶活也提高 了 5倍以上 , 说明中空纤维膜可以对阿魏酸酯酶起到 很好的浓缩作用 。 当 p H 为 8106和 4140时 , 回收率 超过 100%, 这是因为测定浓缩酶液酶活时用水稀释 6倍 , 测定的酶活值再乘以稀释倍数 6为浓缩酶液酶 活 (浓缩酶液对底物过饱和 , 需稀释后测定 , 有研究表 明发酵产阿魏酸酯酶稀释后酶活甚至比未稀释时更 高 [4]) , 而稀释后浓缩酶液相比原酶液含有的阿魏酸 更少 , 消除了产物抑制效应 (酶液中的小分子物质阿 魏酸产生于发酵过程 , 也是该酶水解玉米皮的产物之 一 , 对水解反应有产物抑制效应 。 在膜浓缩过程中小 分子的阿魏酸透过膜而大分子的酶被截留 , 经超滤后 的浓缩液和原酶液中的阿魏酸浓度相当 , 但是浓缩液 稀释 6倍后阿魏酸浓度则大大降低 , 因此测定酶活时 消除了产物抑制效应 ) , 提高了酶活 , 所以回收率超过 了 100%。 根据回收率和截留率以及蛋白质浓缩倍 生产与科研经验 47
数来判断 ,8106为最佳的超滤 p H 值 , 原因是碱性条 件下酶分子带负电 , 所带电荷正好与超滤膜相同 , 酶
分子和膜之间存在一定的斥力 , 因而提高了超滤膜对
酶的截留 。
表 1 在不同的 pH 值条件下超滤 , 酶液的酶活 、 回收率 、 截留率 、 总蛋白比较表
超滤 p H
酶活
-1
总酶活
/U 浓缩倍数 1)
回收率 2)
截留率 3)
蛋白质浓度 4)
-1
总蛋白含量
/g 8106
原酶液 2143291186
111138
65133
0187
10148
滤过液 110110093— — — — — — 浓缩液 1612232433413381656134
原酶液 21052464369515657169
01546147滤过液 110410425— — — — — — 浓缩液 111772354931396178414
原酶液 11922753610111758106
01495189滤过液 01959541— — — — — — 浓缩液
11151
23018
21765152
1) 浓缩倍数 =
浓缩液体积 ;2) 回收率 =原酶液总酶活
×100%;3) 截留率 :膜对酶的截留情况 , 通过截留率可以考察膜及该装置的质量水平 ,
通常情况下 , 截留率大 , 有助于提高酶的收率 , 截留率 =(1-原酶液总活力 )
×100%;4) 滤过液中的蛋白质未检出。
213 冷冻干燥时间对酶粉失水率及酶活的影响
图 2 冷冻干燥时间与酶液失水率及阿魏酸酯酶
剩余酶活的关系
采用冷冻干燥技术将液体酶制剂进一步制成固 体产品 , 可大大减小酶制剂的体积 , 方便保存 、 运输和 使用 。 线 (图 2) 可知 , 冷冻干燥 24h 96%, 2曲线的起点是酶液只冷冻未干 燥时的剩余酶活 , 可见酶液在冷冻过程中活性并没有 损失 , 而主要的酶活损失都是水分升华过程造成的 。 在冻干开始的 16h 内 , 水分损失较快 , 酶活的损失也 较大 , 而后变化趋于平缓 。一些研究者认为 , 在冷冻 过程中 , 只要蛋白质分子表面的单层水分子没有冻 结 , 蛋白质表面的氢键以及极性基团没有暴露在周围 环境中就不会导致蛋白质的失活变性 [10], 在本实验 过程中冻结没有引起酶的失活变性 。在干燥过程中 脱水本身能使蛋白质受到损伤 , 这可能是造成本实验 中酶制剂部分失活的最主要原因 。 因此 , 在冷冻干燥
过程中一般要添加保护剂来减少蛋白质的脱水损伤 。 2
14 图 3 添加不同剂量的聚乙二醇对混合酶制剂
冷冻干燥过程的保护作用
(剩余酶活指干燥后样品酶活同干燥前酶液酶活
相比的百分数 ; 对照组指不添加保护剂样品 )
聚乙二醇是一种多羟基类化合物 , 在冷冻干燥过 程中 , 这类物质会与蛋白质表面形成氢键 , 代替水的 存在 , 使蛋白质在缺水条件下仍能保持稳定的结构 , 从而减少活性的损失 [11]。如图 3所示 , 添加聚乙二 醇可以对冻干过程中的酶活损失起到保护作用 , 随用 量的增大 , 这种保护作用有所增强 :当添加量为 1%和 2%时 , 阿魏酸酯酶剩余酶活分别为 96178%和 100171%; 其用量为 4%和 5%时 , 酶活达到了冷冻干 燥前的 126%和 134%。 添加较多的聚乙二醇不但可 以保护酶制剂在冷冻干燥过程中不受损伤 , 而且对酶 有一定的激活作用 , 其原理是大分子结合修饰 , 使得 酶的空间结构发生了某些细微的改变 , 从而提高了酶 活力 [12]。 但是考虑到成本和增加保护剂的用量会增 加溶液粘度 , 延长冻干时间 , 因此不宜添加过多的保 护剂 , 在本试验中添加 1%~2%的聚乙二醇就可以 有效的保护酶液干燥过程中不失活 。
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
48
215 液体及固体酶制剂保存过程中的酶活保持率测 定
表 2 不同保存条件下酶制剂的酶活保持率
保存条件
酶活保持率 /%
液体酶
固体酶
不加保护剂 加 1%PEG加 2%PEG
4℃ 冰箱 1个月 10012596170108137104180 3个月 8819594125102156101123室温保存 7d --7212779134 注 :室温指 30℃ 左右 , 在此条件下液体酶制剂容易变质 , 不加保 护剂固体酶制剂容易结块 , 因此未检测。
如表 2中结果所示 ,4℃ 低温条件下 , 阿魏酸酯酶 在未添加任何稳定剂的情况下 , 无论是液体酶制剂还 是固体酶制剂均表现出了较好的稳定性 , 固体酶制剂 即使放置较久的时间 (3个月 ) 也无显著失活 。在室 温情况下固体酶制剂仍能够在短期内保存 , 而不显著 失活 , 这为酶制剂的运输和保存提供了便利 。
3 结 论
魏酸酯酶粗酶液进行了超滤 , 倍 ,
以上 , 实验发现 81
, 而超滤通量在 p H 值为 6134时最高 。采用冷冻干燥法把酶液制成固体产 品 , 冷冻干燥时间为 24h (装液厚度为 6mm ) 。添加 1%~2%的聚乙二醇可以有效保护阿魏酸酯酶在冷 冻干 燥 过 程 中 不 失 活 , 所 得 产 品 酶 活 保 持 接 近 100%。 无论是液体酶制剂还是固体酶制剂在保存过 程中均表现出了较好的稳定性 。
参 考 文 献
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Preparation of Ferulic Acid Esterase
Xue Feng Ou Shiyi Wang Y ong Huang Caihuan Liu Zili
(Department of Food Science and Engineering , Jinan University , Guangzhou 510632,China )
ABSTRACT Ferulic acid esterase is a new enzyme and shows potential application in food , feed and papermaking industry. Y et the production has not been industrialized. In this study ,hollow fiber membrane was used to concen 2 trate ferulic acid esterase and freeze 2drying was used to prepare powder enzyme. The results showed that the opti 2 mal p H of ultrafiltration was 8106and the optimal drying time was 24hour if the material thickness was 6mm. It was seen that the enzyme remained active after freeze 2drying when 1%~2%PEG was added. The activity of fer 2 ulic acid esterase was stable in storage for both liquid enzyme and solid one.
K ey w ords ferulic acid esterase , ultrafiltration , freeze 2drying
生产与科研经验 49
范文二：阿魏酸酯酶的研究与应用
综述
食品研究与开发
2006. Vol . 27. NO. 5
169
阿魏酸酯酶的研究与应用
刘鹏展, 欧仕益, 包惠燕
(暨南大学食品科学系, 广东广州510632)
摘
要:阿魏酸酯酶指能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键, 将阿魏酸游离出来的一种酶。它能切断细胞壁中多糖-多糖、多糖-木质素间的交联, 有利于细胞壁物质中多糖的降解和木质素的释放, 因此在食品、饲料和造纸工业具有广阔的应用前景。本文介绍了阿魏酸酯酶的结构特征、酶学特性、产酶微生物及其在食品、饲料和造纸工业中应用的前景。关键词:阿魏酸酯酶; 食品; 饲料; 造纸
RESEARCH AND APPLI CATI ON OF FERULI C ACI D ESTERASE
LI U Pe ng -z ha n,OU Shi -y i ,BAO Hui -y a n
(Fo o d Sc i e nc eCo l l e g e , J i na n Uni v e r s i t y ,Gua ng z ho u 510632, Gua ng do ng ,Chi na )
Abs t r ac t :Fer ul i ca c i d e s t e r a s e s(FAE)i sa n e s t e r a s ewhi c h c a n hy dr o l y z eme t hy lf e r ul a t e ,o l i g o s a c c ha r i de s f e r ul a t e a nd po l y s a c c ha r i de s f e r ul a t e , whi c h c a n br e a k c r o s s -l i nki ng be t we e n po l y s a c c ha r i de s po l y s a c c ha r i de s a nd l i g ni n i n pl a ntc e l lwa l l .Sug g e s t i ng t ha ti ts ho wspe r s pe c t i v e a ppl i c a t i o n i n f o o d ,f e e d a nd pa pe ri ndus t r y ,a si ti sbe ne f i c i a lf o rhy dr o l y z i ngpo l y s a c c ha r i de sa nd r e l e a s el i g ni n whe n c o -c a t a l y z i ng wi t h po l y s a c c ha r i de s hy dr o l a s e s . I n t hi s pa pe r , i t s s t r uc t ur e , c a t a l y s i s c ha r a c t e r i s t i c s , t he ma i n e nz y me -pr o duc i ngmi c r o o r g a ni s msa ndi t spo t e nt i a la ppl i c a t i o ni ndi f f e r e nta r e aa r er e v i e we d . K e y wor ds :fe r ul i ca c i d e s t e r a s e ;f o o d;f e e d;pa pe r -ma ki ng
(E. 阿魏酸酯酶C.3. 1. 1. 73, Fe r ul i c a c i d e s t e r a s e s , FAE ) 又称肉桂酸酯酶。它是一种羧酸酯酶, 指能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键, 将阿魏酸
1~2]
游离出来的酶[。用阿魏酸酯酶处理植物性原料在食品、
在食品工业中, 利用阿魏酸酯酶来降解植物细胞壁中的阿魏酸酯键, 可以得到有药用价值和保健功能的游离阿魏酸。而植物性原材料通过阿魏酸酯酶的处理细胞壁变的疏松, 作为饲料工业的原料更容易被禽畜消化利用, 作为制浆造纸工业的原料可以减少制浆工序化学药品的使用, 减少污染, 并有利于后续工序的进行。
5~9]
。研究表明真菌、细菌和酵母都能分泌阿魏酸酯酶[
饲料和造纸工业中有着光明的前景。
阿魏酸在植物细胞壁结构中起着重要的作用, 它可以在植物细胞壁的木质素与木质素之间、木质素与半纤维素之间、半纤维素与半纤维素之间形成交接, 从而构成一个骨架结构, 使得整个细胞壁变得坚硬。在谷物的细胞壁中, 阿魏酸的单体和多种二聚体主要以酯键的形式连接在阿
3~4]
。拉伯木聚糖的阿拉伯糖残基上(图1) [
各种微生物分泌的阿魏酸酯酶在氨基酸序列、肽链的结构、物化性质和催化特性上都有所不同。目前由黑曲霉(As ) 得到的两种阿魏酸酯酶AnFa e A 和An-pe r g i l l usni g e r
Fa e B 受到了研究者的普遍关注。1
阿魏酸酯酶的结构以及催化特性
由于其催化底物的结构复杂, 相应的阿魏酸酯酶也有
β-1, 4-苷键聚木糖主链
1. 1阿魏酸酯酶的结构与催化机理
阿魏酸二聚体的交联
a r a bi no x y t a n
着相当复杂的结构。虽然不同的阿魏酸酯酶结构有差异, 但都为球蛋白质(图2), 且大都具有Se r “三点-Hi s -As p 的(图3), 仅结核分枝杆菌(M y c o ba c t 催化活性中心”e r i um t u-10]
。) 产生的酶的活性中心由Se r -Gl u-Hi s 组成[be r c ul o s i s
阿魏酸
a r a bi no x y t a n
催化过程中, 阿魏酸酯酶的催化中心和辅助中心将阿魏酸酯化合物中的阿魏酸残基束缚(图4, 5), 而后经过一系列化学过程将酯键断裂, 使阿魏酸游离出来。
图1阿魏酸和阿魏二聚体与阿拉伯木聚糖的链接
基金项目:广州市重点攻关引导项目, 编号:2003Z3-E0061
(1976-), 男, 在读研究生, 研究方向:功能性食品。作者简介:刘鹏展
2. 2阿魏酸酯酶的分类和催化专一性
170
2006. Vol . 27. NO. 5
食品研究与开发
综述
阿魏酸二聚体游离出来。B 型阿魏酸酯酶表现为对苯环上羟基较多的酚酸酯具有较好的催化作用, 当苯环上有甲氧基时, 催化作用会明显降低。B 型阿魏酸酯酶还可以催化水解人工合成的阿魏酸甲酯、咖啡酸甲酯以及香兰酸甲酯中的酯键, 但是对芥子酸甲酯无效。B 型阿魏酸酯酶的产酶微生物主要有黑曲霉、青霉和链孢霉菌等。
图2阿魏酸酯酶Xyn10B 的三维结构图
图5阿魏酸酯酶催化机机理
2. 2. 3第三种类型
图33种不同阿魏酸酯酶的活性中心蓝) , FAE_XynZ(绿) FAE-I I I (黄) , FAE_Xyn10B(
目前还发现一种称作XYLD 的乙酸酯酶具有阿魏酸酯酶活性, 它是从荧光假单胞杆菌的一个亚种中分离得到的, 它对苯乙烯酚酸酯类咖啡酸酯、香兰酸酯以(阿魏酸酯、用XYLD 处理小麦及芥子酸酯) 的化合物同样有催化作用。
11]
的外壳, 产物中有5, 。5’-阿魏酸二聚体[
此外, 也有研究者依据诱导产酶培养基、能水解的酯键、肽链中氨基酸的序列和产物中是否产生阿魏酸的二聚
2]体等因素进一步把阿魏酸酯酶细分为A 、。B 、C 、D 4类[
2. 3阿魏酸酯酶的最适作用条件
阿魏酸酯酶种类不同, 其作用的最适条件也不尽相
图4阿魏酸酯酶Xyn10B 与阿魏酸残基结合
同
[12~13]
, 表1列出了典型的产酶微生物黑曲霉所产生的几
阿魏酸酯酶对苯乙酸酯类具有催化专一性, 然而不同的阿魏酸酯酶的催化专一性也有所不同, 依据催化专一性的不同, 阿魏酸酯酶最初被分为A 、B 两种类型, 后来又发现了一些其他类型。
种阿魏酸酯酶的最适作用条件。
表1黑曲霉来源的阿魏酸酯酶的理化性质
酶
分子量(kDa )
最适pH
最适温度(°C) 等电点
Fa e -I Fa e -I I Fa e A (FAE-I I I ) Ci nnAE CE
63293675. 8120
3. 03. 65. 06. 0
6050
3. 34. 8
2. 2. 1A 型
这一类阿魏酸酯酶对以1, 5-酯键连接在阿拉伯糖残基C-5上的阿魏酸具有催化专一性。当原料用木聚糖酶预处理过或用木聚糖酶与阿魏酸酯酶协同水解时, 产物中有少量的5, 5’-和8-O-4’-阿魏酸二聚体。A 型的阿魏酸酯(特别是在3, 5位) 的酚类酯都有催化酶对苯环上有甲氧基
特性。A 型阿魏酸酯酶还可以催化水解人工合成的阿魏酸甲酯、芥子酸甲酯以及香兰酸甲酯中的酯键, 但是对咖啡酸甲酯无效。AnFa e A 就是属于A 型的阿魏酸酯酶。当以谷物作为培养基时, 微生物倾向于产生A 型阿魏酸酯酶。
3阿魏酸酯酶的应用
14]
用于油脂的抗氧研究表明阿魏酸可以作为抗氧化剂[
3. 1在食品工业中的应用
15]
化, 除此之外, 阿魏酸还具有的抗肿瘤、消炎、促进伤口愈合[
等保健作用, 所以阿魏酸可作为功能因子开发功能性的食
16]品。同时, 阿魏酸可以作为合成天然香兰素的前体[, 以阿
2. 2. 2B 型
以甜菜渣做培养基时, 微生物倾向于分泌B 型阿魏酸酯酶。B 型的阿魏酸酯酶对连接在阿拉伯糖残基C-2和半乳糖残基C-6上的阿魏酸酯键具有专一性, 黑曲霉来源的
魏酸为原料, 利用微生物的方法生产的香兰素与合成的香兰素相比具有毒性低, 安全性高的特点, 可以用作食品和化妆品行业的香料。
阿魏酸大量存在于植物的细胞壁中, 研究者使用阿魏酸酯酶和使用阿魏酸酯酶与其他酶协同作用从各种农作物
B 型阿魏酸酯酶对1, 5-阿魏酸阿拉伯糖酯键也有催化作
用, 但效果远远低于A 型。另外B 型的阿魏酸酯酶不能使
综述
食品研究与开发
2006. Vol . 27. NO. 5
171
的副产品中提取阿魏酸的研究取得了一定的成果, 目前主
17~19]
要使用麦麸、玉米麸皮等作为原材料来提取阿魏酸[。
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3. 2在饲料和造纸工业中的应用
利用阿魏酸酯酶处理植物性的原材料, 可以将阿魏酸从植物细胞壁的结构中游离出来, 从而破坏了细胞壁的骨架结构, 使得木质素、半纤维素以及纤维素之间的连接被部分打破, 结构变得比处理前疏松。
在饲料工业中, 变得疏松的原料更容易被牲畜消化吸收利用, 可以提高饲料的利用效率。而在造纸工业中, 纤维素是构成纸张的主要成分, 半纤维素可部分被利用, 木质素是需要去除的成分, 经阿魏酸酯酶处理的原料, 木质素更容易脱除, 因而可以减少制浆工序的化学药品用量。而纤维细胞壁经阿魏酸酯处理后, 表面变得疏松, 更容易形成分叉, 在成纸时, 纤维间的交织力变大, 可以提高纸品的机械强度。
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4阿魏酸酯酶的研究现状及展望
到目前为止, 阿魏酸酯酶的研究上已进行了一些卓
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有成效的工作。首先, 筛选了一批能高效分泌阿魏酸酯酶的微生物; 其次, 对该酶的酶学特性进行了详细研究, 如酶的结构、最适温度、最适pH 值及影响酶稳定性的其他因素; 第三, 探讨了阿魏酸酯酶与一些多糖降解酶的协同作用; 第四, 探讨了微生物产酶的影响因素和酶的工业化分离方法。
但是, 对阿魏酸酯酶的研究仍有很多工作要做。第一, 筛选出的分泌阿魏酸酯酶的微生物阿魏酸酯酶的分泌量仍然达不到工业化生产阿魏酸酯酶的要求, 利用现代生物技术来改良微生物, 使阿魏酸酯酶的产量提高是解决这一问题的根本途径, 目前已经有研究者定位了与阿魏酸酯酶合
21~24]成有关的基因[, 为进一步的研究奠定了基础; 第二, 目前
[20]
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164
5
前景展望
2006. Vol . 27. NO. 5
食品研究与开发
综述
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有机磷农药残留分析是一门综合性强, 涉及面广的分析学科。食品的多样性及其成分的复杂性对应用于食品分析的方法提出了很高的要求。一个理想的分析方法最好可以应用于不同的食品基质, 并可测定同一食品基质中不同的复杂食品成分。新的分析技术将要求多方面学科知识的支持。目前有机磷农药残留成分大都是分子量一般在500以下, 而未来的15～20年, 有可能发生由化学品向用生物工程生产出来的生物制品的转化。那时, 分析对象的分子量将会大得多。要将分析对象与原动植组织中的蛋白质、多肽、核酸、细菌或病毒等分离将会更加困难。新的分析技术将要求有细胞化学、发酵化学、免疫化学和多肽排列结构等多方面学科知识的支持, 这也是农药残留分析工作者面临的新课题。参考文献:
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范文三：阿魏酸酯酶产生菌的培养条件优化_范韵敏
第 31卷 第 4期 华 侨 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) Vo l. 31No. 4 2010年 7月 Jo ur nal of H uaqiao U niversity (Natur al Science) Jul. 2010
文章编号 :1000-5013(2010) 04-0426-04
阿魏酸酯酶产生菌的培养条件优化
范韵敏 , 李夏兰 , 方柏山
(华侨大学 工业生物技术福建省高校重点实验室 , 福建 泉州 362021)
摘要 :通过均匀设计法和二次多项式逐步回归 , 对产阿魏酸酯酶的培养基配方进行优化 , 得出优化的培养基 配方 (质量分数 ) :0. 30%K H 2P O 4, 0. 60%N a 2H PO 4#7H 2O , 0. 01%NaCl, 0. 80%酵母粉 , 1. 33%麦 糟 . 在 此 基础上 , 用单因素法 考察发酵条件对产酶的影响 , 确定最佳条件 :初始 pH 值为 6. 0, 培养温度为 28e , 摇床转 速为 210r #min -1, 发酵时间为 68h, 装液量为 75mL , 接种量为 5%, 麦糟粒 径为 0. 054mm. 采用优化的培养 基组分进行最优发酵培养 , 优化后的阿魏酸酯酶 酶活达到 119. 36L kat #L -1, 比优化前提高了 32倍 .
关键词 :阿魏酸酯酶 ; 麦糟 ; 优化 ; 均匀设计
中图分类号 :T Q 920. 6; Q 814. 9文献标识码 :A
阿魏酸酯酶 (EC 3. 1. 1. 73, Ferulic Acid Ester ases, FAE) 是羧酸酯水解酶的一个亚类 , 属胞外酶 , 能水解阿魏酸甲酯、 低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键 [1O 2]. 真菌、 细菌和酵母都能分泌阿魏酸酯 酶 [3]. 各种微生物分泌的阿魏酸酯酶 , 在氨基酸序列、 肽链的结构、 物化性质和催化特性上有所不同 . 目 前 , 由黑曲霉 (Asp erg illusniger ) 得到的 2种阿魏酸 酯酶 A nFae A 和 AnFae B 受到研究者的普遍关 注 [4]. 在禾本植物纤维质中 , 阿魏酸是含量最多的酚酸 [5O 7], 主要是以酯键与半纤维素连结 [8], 阿魏酸及 双阿魏酸的含量和连结方式 , 是决定半纤维素生物降解的最关键因素 . 因此 , 通过阿魏酸酯酶断裂阿魏 酸与半纤维素连结的酯键 , 可提高半纤维素降解程度 [7O 8]. 本文对已筛选到一株能产阿魏酸酯酶 , 能降 解麦糟的放线菌 , 进行产阿魏酸酯酶发酵条件的优化 .
1材料与方法
1. 1菌种
菌种从土壤中筛选得到 , 本实验室保藏 , 初步鉴定为放线菌白色种属 .
1. 2培养基及培养条件
(1) 斜面培养基 :高氏 1号培养基 , pH 值自然 . (2) 液体种子培养基 :高氏 1号培养基 , 不加琼脂 , pH 值自 然 , 于 28e , 200r #min -1的 条件 下培养 4d. (3) 基 础发酵 培养 基 [9](质 量分 数 ) :0. 1% KH 2PO 4, 0. 4%Na 2H PO 4#12H 2O, 0. 02%NaCl, 0. 02%Mg SO 4#7H 2O, 0. 005%CaCl 2, 0. 6%酵母 粉 , 6. 0%麦糟 . (4) 初始发酵条件 :在 250m L 三角瓶中装入 100mL 发酵培养基 , 按 1%接种量接入种 子培养液 , pH 值自然 , 于 28e , 200r #m in -1的条件下培养 80h.
1. 3阿魏酸酯酶酶活定义及测定
阿魏酸采用高效液相色谱法 [10]测定 . 取 250L L 离心后的发酵上清液加入到 250L L 阿魏酸甲酯溶 液中 , 50e 保温 15min, 加入 500L L 体积分数为 10%的冰乙酸 . 样品于离心机 (10000r #min -1) 离心 15min, 于 4e 下保存 . 空白样品为煮沸失活的发酵上清液 , 处理方法同上 . 阿魏酸酯酶的酶活定义 :在 50e , pH 值为 6. 0的条件下 , 每分钟酯解阿魏酸甲酯 , 生成 1L m ol 阿魏酸所需的酶量 1
1. 4优化设计
(1) 培养基的优化 1根据 DPS 统计软件 [11], 设计出 7因素 7水平均匀设计表 U *7(77) [12O 13]. 优化因
收稿日期 :2008-11-19
通信作者 :方柏山 (1957-) , 男 , 教授 , 主要从事生物信息化的研究 . E -mail:fang bs@hqu. edu. cn.
:
素 (质量分数 ) :X 1为酵母粉 , X 2为麦糟 , X 3为 KH 2PO 4, X 4为 Na 2H PO 4#7H 2O, X 5为 NaCl, X 6为 Mg SO 4#7H 2O, X 7为 CaCl 2#H 2O. (2) 发酵条件的优化 1采用单因子设计实验 , 按照初始发酵条件 , 先得到的优化结果用于后续的实验 , 分别进行培养基装液量 (V 1) 、 培养基的起始 pH 值、 培养温度 (H ) 、 摇床转速 (v ) 、 接种量 (V 2) 、 发酵时间 (t ) 、 麦糟粒径 (d ) 优化 .
2 结果与讨论
2. 1 培养基优化结果
考察培养 基成分对 阿魏酸酯 酶的影响 , 结果 如表 1所示 . 表 1中 , z 为阿 魏酸酯酶 的酶活 1以 KH 2PO 4(X 1) , Na 2H PO 4#7H 2O(X 2) , NaCl(X 3) , Mg SO 4#7H 2O (X 4) , CaCl 2#H 2O(X 5) , 酵母粉 (X 6) , 麦糟 (X 7) 为自变量 , 阿魏酸酯酶的酶活为因变量 , 进行二次多项式逐步回归分析 1以调整相关系 数 R 最大为原则 , 对该模型进行显著性检验 , 建立回归方程为
Y =26. 762-1713. 678X 4-2622. 615X 5+41831. 527X 42+47299. 663X 3X 51
表 1 优化培养基组成的均匀 设计实验结果
T ab. 1 Results of unifor m -desig n for o pt imizatio n o f medium for mulatio ns
因子
X 1/%X 2/%X 3/%X 4/%X 5/%X 6/%X 7/%z /L kat #L -1
N 10. 3000. 0150. 0250. 0040. 4510. 00. 433
N 200. 10. 0050. 0100. 0020. 157. 01. 734N 30. 250. 30. 025000. 304. 04. 434N 40. 050. 20. 0300. 0150. 0050. 601. 00. 733N 50. 150. 60. 0100. 0300. 00302. 51. 134N 60. 200. 400. 0050. 0060. 755. 50. 500N 7
0. 10
0. 5
0. 020
0. 020
0. 001
0. 90
8. 5
1. 067
其相关系数 R 为 0. 996, F 值为 58. 852, 显著水平 p 值为 0. 017, 剩余标准差 S 为 1. 331, Durbin O Watson 统计量 d 为 1. 299. 说明 , 该方程能很好地拟合产酶的影响过程 1对该模型的显著性检验 , 结果 如表 2所示 1从表 2可知 , 对阿魏酸酯酶产量的影响的大小顺序 :r(y , X 5) >r (y , X 4) >r (y , X 42
) >
表 2 显著性检验结果 T ab. 2 Sig nificant test results 因素 偏 相关 t 检验值 p r (y , X 4) -0. 9857. 9680. 004r (y , X 5) -0. 9899. 2660. 003r (y , X 42) 0. 9766. 2980. 008r(y , X 3X 5)
0. 932
3. 637
0. 036
r(y , X 3X 5). 即因素之间存在交互作用 .
由此 可得 , 优化 的培 养基 成分 (质 量分 数 ) :0. 30%KH 2PO 4, 0. 60%Na 2H PO 4#7H 2O, 0. 01%NaCl, 0. 80%
酵母粉 , 1. 33%麦糟 . 根据以上结果进行验证 , 测得阿魏酸 酯酶酶活为 4. 818L kat #L -1, 与 DPS 软件预测值 4. 468L kat #L
-1
的相对误差为 7. 84%.培养基优化前 , 阿魏酸酯
酶酶活力为 3. 734L kat #L -1
, 而优化后的 阿魏酸酯酶酶
活力比优化前提高了 29%, 能较好的达到优化的目的 . M g 2+
, Ca 2+
是许多重要酶的激活剂 , 对培养基质 的氧化和蛋白质的合成均有影响 [10]
1但是 , 优化后的培养基中没有另添加 Mg
2+
, Ca 2+
, 这可能是因为
在麦糟中已含有 Mg 2+, Ca 2+, 不需要另外添加 .
2. 2 发酵条件对产酶量的影响
2. 2. 1 装液量 按照初始发酵条件 (下同 ) , 考察装液量 (V 1) 对产酶量 (以阿魏酸酯酶的酶活力 z 表 征 , 下同 ) 的影响 , 如图 1所示 1由图 1可知 , 培养基装液量对产酶影响较大 . 随着装液量的增加 , 阿魏酸 酯酶产量也增大 . 装液量达到 75m L 时 , 产酶量最大 , 随后逐渐减小 . 这是因为装液量对供氧量有一定 影响 , 从而影响菌体的生长 .
2. 2. 2 培养基的起始 pH 值 考察培养基起始 pH 值对产酶量的影响 , 如图 2所示 1从图 2可知 , 和胞 内酶不同的 , pH 值对胞外酶的影响较大 . 该菌株在 pH 值为 5. 0~8. 0的条件下均能产酶 , 但产酶量变 化较大 ; 在 pH 值为 6. 0处 , 菌株产酶达到最大值 . 酸性有利于该菌体的发酵产酶 , 但偏酸会导致产酶量 急剧下降 ; 而碱性环境对酶的生产是否有抑制作用 , 还需进一步研究 .
2. 1427
第 4期 范韵敏 , 等 :阿魏酸酯酶产生菌的培养条件优化
量 , 随着溶解氧的增大 , 酶的表达量相应提高 . 在 210r #min -1时 , 阿魏酸酯酶的产量最高
.
图 1 装液量对 产酶的影响 图 2 培养基 的起始 pH 对产酶的影响 图 3 摇床转速对产酶的 影响 Fig. 1 Effects o f vo lumes o n F A E Fig. 2 Effects o f pH on FA E F ig 13 Effects of shaker speed o n FA E
2. 2. 4 摇床温度 考察摇床温度 (H ) 对产酶量的影响 , 如图 4所示 1摇床温度在 28~32e 之间 , 酶的 表达量较高 . 这是由于 28~32e 是菌种的最适宜生长温度 , 可能在此条件下 , 菌种的活力较高 , 产酶能 提也较高 1
2. 2. 5 接种量 考察接种量 (V 2) 对产酶量的影响 , 如图 5所示 1从图 5可知 , 随着菌体浓度的增多 , 阿 魏酸酯酶产量随之增加 1当接种量为 4mL 时 , 阿魏酸酯酶产量最大 .
2. 2. 6 发酵时间 不同培养时间 (t ) 对产酶量的影响 , 如图 6所示 1从图 6可知 , 发酵 68h 左右 , 酶的 表达量最高 ; 随后开始呈下降趋势 1这可能与阿魏酸诱导作用有关 . 适当浓度的阿魏酸能诱导生成大量 的阿魏酸酯酶 , 而过高浓度的阿魏酸对细胞产生毒害作用 , 反而使阿魏酸酯酶的产量有所下降
.
图 4 培养温度对产酶的 影响 图 5 接种量对产 酶的影响 图 6 发酵时 间对产酶的影响 Fig. 4 Effect s o f temper ature F ig. 5 Effects of bact eria F ig. 6 Effects of cultur e
on F AE
concent ratio n o n FA E time on F AE
2. 2. 7 麦糟粒径 考察麦糟粒径 (d ) 对产酶量的影响 , 如图 7所示 1从图 7可知 ,
麦糟粒径对产酶影响 图 7 麦糟粒径对产酶的影 响 F ig. 7 Effects of g rain diameter on FA E
较大 . 麦糟粒径越小 , 相对表面积越大 , 菌种产酶量越高 .
通过上述发酵条件的考察 , 可以确定产酶的最优条件 :培养温度为 28e , 摇床转速为 210r #min -1, 发酵时间为 68h, 装液量为 75mL, 接种量为 5%, 初始 pH 值为 6. 0, 麦 糟粒径为 0. 054mm. 采用优化的培养基组分进行最优发酵 培养 , 阿魏酸酯酶的酶活为 119. 36L kat #L -1, 比优化前酶 活 3. 734L kat #L -1提高了 32倍 . 其中 , 发酵时间对阿魏酸 酯酶的影响最大 .
3 结论
通过实验分析不同培养条件对阿魏酸酯酶生产菌产酶
的影响 . 采用均匀设计 , 二次多项式逐步回归分析所得的发酵培养基组成 , 并通过单因素实验得到发酵
培养的最优条件 1结果表明 , 优化后的酶活比优化前提高了近 32倍 , 起到了优化的效果 , 有助于木质纤 维降解工艺的研究 . 在此基础上 , 下一步工作是研究此菌种分泌的阿魏酸酯酶的分离和纯化条件 , 为木 质纤维的生物炼制提供前期的研究基础 .
参考文献 :
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Optimization of Fermentation Conditions of
Ferulic Acid Esterase Producers
FAN Y un O m in, LI Xia O lan, FA N G Bai O shan
(Key Laboratory of Indu strial Biotechnology of Fujian Province, Hu aqiao Un iversity, Quanzhou 362021, C hina)
Abstract:T he optima l parameters of fer mentation co nditions o f fer ulic acid esterase fro m br ewer . s spent gr ain w ere ob -tained thro ug h unifo rm -design and quadratic polynomial reg ression techniques. T he o ptimal cult ur e medium wer e as fo -l low s(%) :K H 2P O 40. 30, N a 2H PO 4#7H 2O 0. 60, N aCl 0. 01, yeast pow der 0. 80, brewer . s spent g rain 1. 33. Based on the r esults abo ve, the influence o f fermentatio n conditio ns o n enzy mes were also studied by single factor metho d and the optimal co nditions w ere confir med as follow s:the optimizatio n initial pH 6. 0, cultural temper atur e 28e , the str ain w as cultivated w ith 75mL medium in a 250mL flask fo r 68h o n 210r #min -1shaker , ino culum concentr atio n 5%and gr ain diameter 0. 054mm. Ferulic acid esterase r eached 119. 36L kat #L -1under optima l co nditions, incr eased 32times than that befo re optimization.
Keywords:f er ulic acid esterase; brew er . s spent g r ain; optimization; unifor m O desig n
(责任编辑 :黄晓楠 英文审校 :刘源岗 )
范文四：结构预测及分子对接方法研究几种水解产物对新阿魏酸酯酶的抑制作用
结构预测及分子对接方法研究几种水解产物对
新阿魏酸酯酶的抑制作用
1 1 2 1,3 1 1 1,,,,,, 程凡升张茂秋程凡杰生吉萍陈婧雨郑鄢燕申琳
( 1, ,100083; 2, ,610041; 中国农业大学食品科学与营养工程学院北京 四川大学物理科学与技术学院成都
3, ,100872)中国人民大学农业与农村发展学院北京
, 摘要 应用基于生物信息学的蛋白质结构预测方法探讨了来源于荷斯坦奶牛瘤胃宏基因组文库的一个新
( FAE-SH1) , 4 型阿魏酸酯酶的结构及可能的催化机制同时通过对该酶的预测结构与 种模式底物的对接研
,,V究发现实验所测得酶促反应动力参数 与对接的亲和能存在线性关系底物与酶形成的氢键可能是影 响max
, ,D-、L-、D-FAE-SH1 同时本研究发现 木糖阿拉伯糖葡萄糖及阿魏酸能够对 的水解 反催化效率的关键因素
,,并对其进行了验证 应产生抑制作用
; ; ; 关键词 阿魏酸酯酶结构预测分子对接抑制作用
O641 A DO: 10, 3969 / , ssn, 0251-0790, 2012, 08, 028Iji中图分类号文献标识码
、,, 秸秆麸皮等农业废弃物是农业生产和食品加工中产生的副产物也是重要的可再生生物资源
, 、这些生物材料主要由纤维素木质素和半纤维素等成分组成上述成分的化学性质稳定且相互形成致
,1,,,, 、难以被微生物降解和利用因此一直以来没有被环保高效及高值地加以利用阿 魏酸密的交联结构
( Feruloyl esterase,EC3 , 1, 1, 73) ,、、 酯酶作为一种能够解离这种交联结构的水解酶在食品纺织造纸
,2,3,, 、但目前仅有部分真菌少数细菌和极少数植物能 够产生和饲料等工业中具有非常广泛的应用前景,4,,, 、且对该家族酶的分类及底物的利用特性一直存有争议对新阿魏酸酯酶的发 现研究阿魏酸酯酶
, ,,此外阿魏酸酯酶能够从植物材料中释放出阿魏酸阿魏酸 是具有抗氧和利用一直是目前研究的热点,1,、,、, 抗衰老及抗肿瘤等作用的天然产物在化妆品食品等工业中具有广泛的应用前景对阿魏酸酯酶的化,5,, Xiros Fusarium oxysporum 目前仅有 等以 催化特性和酶活抑制因素的研究对工业制取阿魏酸极为重要
,,发酵产生的含阿魏酸酯酶的粗酶液为材料研究了从酒糟中释放阿魏酸的影响因 素并发现阿魏酸的
, ( ) 但阿魏酸酯酶水解过程中产生的其它物质如糖 类等是否对阿魏酸存在可抑制阿魏酸酯酶的活力
, 的释放有抑制作用还有待进一步研究,6,,,在前期的研究中本实验室利用宏基因组学技术构建了荷斯坦奶牛瘤胃微生物基因文库筛选 并
( FAE-SH1) , 成功表达了一个新型阿魏酸酯酶该阿魏酸酯酶蛋白序列与目前已知阿魏酸酯酶相似度 仅,7,% , Crepin ,C ; ,57E 根据 分类法分析表明该酶属于 类阿魏酸酯酶蛋白序列聚类分析表明该酶 与 为
, pta Udatha FAE1 ,Gu1B 类阿魏酸酯酶相似性最高根据 分类法将其归属于 家族下 亚家族但在该 家族,4,Crepin A,B,C , 、D 4 中目前还没有发现属于 分类法中的 和 种家族的阿魏酸酯酶从蛋白质序列 特征
,, 蛋白质结构和底物分子利用角度对该酶进行研究将拓宽人们对阿魏酸酯酶的认识本文应用 多序列
FAE-SH1 ,比对方法探讨了 一级结构保守序列与功能的关系应用基于生物信息学的结构预测 方法研
, 4 ,将阿魏酸酯酶的 种模式底物与该酶预测结构进行分子对接并研究对接数 据与实究了其三级结构
, ,FAE-SH1 ,此外本文还预测了几种糖类物质对阿魏酸酯酶 活力的影响并利 用实验验数据间的关系
, 进行了验证
收稿日期: 2011-12-05,
: ( ) ( : 200803033) ,基金项目国家公益性行业农业科技专项批准号资助
: ,,,,, E-mail: shen5000@ cau, edu, cn联系人简介申 琳男博士副教授主要从事农副产品综合利用和果蔬采后生物技术研究
No, 8 : 1789 程凡升等结构预测及分子对接方法研究几种水解产物对新阿魏酸酯酶的抑制作用1 材料与方法
阿魏酸酯酶一级结构分析及三级结构的模拟及评价 1, 1 ( FAE-SH1) ,789 阿魏酸酯酶来源于中国荷斯坦牛瘤胃宏基因组文库其核酸序列共有 个碱基对 ( GenBank: HQ338149) , Translate tool 262 ,ExPASy 蛋白质序列由 个氨基酸组成其序列由 数据库 翻译
( http: / /web, expasy, org / translate / ) ; Blastx ( http: / /blast, ncbi, nlm, nih, gov / 程序获得应用 程序,8,Bast,c g) ,Tagn ; Custa liM-lillW对蛋白序列相似性进行比对应用在线程序 用于结构相似性比对应用 软
Accelrys Discovery Studio 2, 5 ( http: / /accelrys, com / products / discovery-; 完成多序列比对应用 软件件
stud- o / ) pot( ,,,pot) Profe 3D ; iRamachandran llil的 φψ和 程序对建模结果进行分析蛋白质模拟使用 Robetta I-TASSER( The Iterative Threading Assembly Refinement) , Robetta Baker 和 程序进行是 实验室研
Rosetta novo ,De 白质结构模型预测平台该平台主要应用同源建模和 的 片段插入建模法进行蛋发的蛋 ,9,,10,, I-TASSER ,,Zhang 程序由 等研发是一个综合的蛋白质三级结构与功能注释平台该程白质结 构预测
, 序 应用多重穿线法和迭代结构模拟法对蛋白质三级结构进行预测
, 2 1 分子对接及评价
( Methy feruate,MFA) ( Methy -coumarate,MCA) ( Methyll、l、l 阿魏酸甲酯香豆酸甲酯ρρ咖啡酸甲酯caffeate,MCA) 、( Methyl sinapinat,MSA) 、L-( L-Arabinobiose ) 、D-( D-Xy- 芥子酸甲酯阿拉伯糖木糖lose) 、D-lucose ) Trans-ferulic acid ) ( G( PubChem Compound 葡 萄 糖 和 阿 魏 酸 的 结 构 模 型 从 数 据 库 ( http: / /www, ncbi, nlm, nih, gov / pccompound) , PyMOL ( http: / /www, pymol, org / ) 中获得应用 程序观察
, Autodock tool ,pdbqt , 应用 对蛋白质及小分子结构进行编辑并转换成 格式应用 蛋白质和小分子结构,11,××Autodock vna , 50 50 50 ,0. 0375 nm,i程序进行柔性对接晶格大小 点点点格点间距 即空间大小
× 1. 875 nm, nm × 1. 875 nm 1. 875 , 为 此晶格的中心位于预测得到的蛋白质活性中心附近坐标为,,( 24. 150,13. 616,13. 701 ) , ( RMSD,) 应用均方根偏差表示预测构象对实际构象的偏差对对接结
, Accerys Dscovery Studo 2, 5 ,lii果进行评价应用 程序对对接结果进行分析
, 3 1FAE-SH1 阿魏酸酯酶 的表达及纯化
( PCR ) FAE-SH1 , 应用聚全酶链式反应 扩增阿魏酸酯酶 基 因引 物 为 GGATCCGCGATG- GCAAGACTGCAGATTG CTCGAGCGGGCCGAACATCCATTCCACG ( 和 划 线部分为保护碱基和酶切位
+) , PC R BamHI XhoI ,T4 DNA ligase pET30 a( ) ,点产物纯化后进行 和 双酶切并用 连接到 载体中选
Eschercha co) BL21( DE3) ,1 mmo / L ( iilil取大肠杆菌为宿主进行转化表达在生长对数期应用 异丙基硫
IPTG) ,28 ? 5 h, ,( 300--D-( 为诱导剂在 条件下诱导 离心收集细胞沉淀并用超声波法 代β半乳糖苷
TM W,10 s,s,, Ni Sepharose6 Fast Flow( GE Healthcare, 10 60 ) 工作 间歇 共 次破碎大肠杆菌菌体应用
,USA) , 4 ? ,,20 ? , 进行亲和层析纯化将获得的蛋白质在 条件下过夜透析除盐并于保存应用聚丙 烯
,12,( SDS-PAGE) ,酰胺凝胶电泳 检测并保证其纯度
1, 4 K阿魏酸酯酶的酶活及 值的测定m
( HPLC) FAE-SH1 4 MFA,MCA,MCA MSA 应用高效液相色谱法测定 对不同浓度的 种底物 ρ和 ( 10 : 2000 mol / L) , : FAE-SH1 ol / L 10 L,1 mmμ的酶活反应体系为一定浓度的 酶液 μ阿魏酸甲酯溶
= 8. 0 L, ? in 40 L,pH 3-( N-) ( MOPS) 120 42 30 m μ用 的 吗啉代丙烷磺酸缓冲溶液定容至 μ于 反应 液
,, HPLC : Zorbax Eclipse XDB-C( Agilent后用高效液相色谱法测定阿魏酸的产量测定参数色谱柱为 18 Technologies,Canada) ; = ? ? ?34 ?1 ( ) ; 330 nm; 1 mL / 65 流动相为甲醇 水 乙酸 体积比检测波长 流速 mn; i进样量 20 μL, 将阿魏酸酯酶的酶活力单位定义为在上述条件下,1 min 生成 1 μmol 阿魏酸所需
,12, , , Michaelis-Menten VKK的酶量应用 方程计算其最大反应速度 及米氏常数 值 其中 是酶的特 max m m 征性物理常数,表示酶和底物之间的亲和能力,V表示酶在最适底物浓度时的最大反应速度, max
, 5 1FAE-SH1 不同浓度的几种糖类物质和阿魏酸对 水解阿魏酸甲酯的影响
,, MFA HPLC 以 为模式底物在反应体系中加入不同浓度的糖类和阿魏酸应用 测定不同浓度的糖 类
FAE-SH1 MFA , L-、D-D-,物质和阿魏酸对 水解 活力的影响糖类物质包括 阿拉伯糖木糖和 葡萄糖
Vol, 33 1790 高等学校化学学报
g / L; 0. 2 0. 4 g / L, 30 60 其终浓度为 和 阿魏酸的终浓度为 和
2 结果与讨论
2, 1 阿魏酸酯酶序列比对及一级结构分析
Bastx ,FAE-SH1 ( GenBank: CBL34630) l结果显示阿魏酸酯酶 蛋白序列与目前已知蛋白序列最大
57% , TM -align ,FAE-SH1 PDB Streptococcuspn eumonia Tribu- 相似度为 比对显示与 数据库中来源于 的 tyrn esterase( 2UZ0) ,2 , i29. %,相似度最大为 在同源建模技术中目标序列与模板的同源性大小直接
,,,, ,决定了建模的准确性与工作量同源性越高所得到的模型越准确工作量也越小一般来讲同源性 在 ,13,30 , ,FAE-SH1 ,%以上时建模的结果才具有可靠性因此蛋白质一级结构基本符合同源建模条件
,,阿魏酸酯酶属于酯酶类能够水解植物细胞壁中的阿魏酸及多糖等物质形成的酯键在一级结构 ,14,, 1 FAE-SH1 ( GenBank: CBL34630 ) 上与脂肪酶类似图 给出了 与目前已知最相似蛋白序列和相似
( 2UZ0 ) , 1 ,FAE-SH1 Gy-X-Ser-X-Gy ll度最高的晶体蛋白序列的多序列比对结果由图 可见有一个以 ( 121 : 127) ,, ( Ser123 ) 为特征的保守区域这个区域是酯酶和脂肪酶的保守域其丝氨酸残基可以与天
( Asp215) ( His244) ,FAE-SH1 冬氨酸残基及赖氨酸残基在空间构型上构成可能的催化中心这是 属于 ,15,16,/ , ,Ile-His-Gly( 49 :51 ) ,α β 水解酶的典型特征此外该基因序列还存在一个 保守区域该区域可 以,16,,,“”形成一个氧空洞该空洞可能在酯键水解过程起稳定中间体的作用
, 1 te et of the most s sequences FigMuliplalignmnFAE-SH1 with imilarprotein
Similar residues were shaded,conservedd omains were highlighted with rectangle, HQ338149: feruloyl esteraseFA E-SH1 in this
stuy 2UZ0 ( PDB data) : trutyrn esterase from Streptococcusp neumon CBL34630 ( GenBank data) : Precte esterase from d;ibiia;did
Eubacterium siraeum V10Sc8a,
2, 2 三级结构预测与分析
,随着生物信息学及生物物理学的发展通过生物信息学方法及分子模拟手段来预测蛋白质的高级 ,17,,, 结构已取得了一些进展并在揭示生物大分子功能等方面得到了应用本文尝试应用两种目前较为 精
Robetta I-TASSER FAE-SH1 确且建模算法不同的在线蛋白质结构预测程序 和 来预测阿魏酸酯酶 的 三
, ,10 , Discovery Studio 2. 5 级结构通过这两个程序本文共得到 种可能的蛋白质结构模型再应用 软 件
Ramachandran plot Profile 3D ,Robetta 中的 和 程序对建模结果进行评价和筛选发现一个来源于 程序 的
,结构模型有较高的可信度
Ramachandran plot 程序通过对蛋白质结构中氨基酸允许的和不允许的构象的评价以实现对蛋白质
, 结构的评价该程序主要阐述蛋白质或者肽段立体结构中肽键内 α 碳原子和羰基原子之间的旋转度 ,18,( psi) ( phi) , 2 ( A) ,,与 α 碳原子和氮原子间键的旋转度如图 所示蓝色区域内是最适区粉色区是 允
, FAE-SH1 99. 62 , %1 许区这两个区域中所有的氨基酸占所有 氨基酸数目的 有 个结构不合理的氨 基
,, Porfile 3D ,Verify score 125. 7,酸位于预测模型表面且远离活性位点结果显示该模型 打分为 大 于 Verify expected high score 119. 091) , ,( ,打分表明该模型有较高的可靠性可用于后续实验和分析
2( B) , 7 8 , 8 蛋白质三级结构建模结果如图 所示该结构由 个 α 螺旋和 个 β 折叠组成个 β 折叠形
No, 8 : 1791 程凡升等结构预测及分子对接方法研究几种水解产物对新阿魏酸酯酶的抑制作用
Fig, 2 Ramachandran plot analysis( A) and predicted 3D structure of FAE-SH1( B and C)
( A) Bue and pink regons represent thefavore d and aowed regons as defned by ProCheck,greenc yces and red trange re- lilliilil
present favored and generousy aowed resdues,respectvey; ( B) llliilred,yellow and green represented α-helix,β-sheet and random
loops of FAE-SH1 secondary structure,gramy ist indicated the predicted protein surface; ( C) colored and labeled surfaces indicated
the putative catalytic residues of FAE-SH1,
, 7 , 8 ,2 ,成了该酶的主体结构位于结构的中心个 α 螺旋分布于 β 折叠的周围个 β 折叠相互平行第 个
( 2) 7 , , 2 ( C) β 折叠β的方向与其它 个折叠方向相反所有 α 螺旋和 β 折叠的方向均是右手旋由图 所
,( Ser123 ) ( Asp215 ) 示的三级结构建模结果还发现丝氨酸残基可以与天冬氨酸残基和组氨酸残基 ( His244) ,“”, 在空间上接近并且在蛋白表面形成凹陷的裂缝构成了供小分子进入的入口这一结构是 ,19,,,, 典型的酯键降解结构与一级结构预测结果相吻合是完成酯键的水解过程的关键步骤此外第 136 : 176 “”“”,号氨基酸残基在裂缝入口处形成一个类似盖子的结构该结构可阻止底物或者其它溶 ,7,, 剂进入活性中心其结构内部疏水性的大小以及周围氨基酸残基的极性可能会影响该酶的活力或底 物
, FAE-SH1 / ,选择性该结构模型的上述特征可以解释 作为一个 α β 水解酶的功能对于阿魏酸酯酶的 进
,一步定向进化或定点改造具有借鉴意义
, 3 24 种底物与阿魏酸酯酶模型的分子对接与分析
,Autodock Vina 4 以预测得到的活性中心附近区域的残基为中心应用 程序将阿魏酸酯酶 种模式
, 2, 2 RMSD , 3 ,底物进行柔性对接根据 节的分析结果及 值选择最佳的对接构象模式由图 可见与此 4
Fig, 3 Steric contour plots of four substrates docking with FAE-SH1 catalytic center residues
FAE-SH1structure was sketched using gray ribbon lines, Green sticks in gray surface represent substrates: MCA ( A) ,MρCA
( B) ,MFA( C) and MSA( D) , Lab eled lines represent FAE-SH1 residues in catalytic center, Green dotted lines represent hydrogen
bonds between ligands and receptor,
Tyr52,Ile167,Ser123,His214,Ile218 Asp245 , Asn-Gly-Ile- 种底物相互作用的残基主要有 和 等其中 Aa( 165 : 168) , l“”,4 残基作为裂缝盖子的一部分并未全部参与了与 种底物间的相互作用此区域可
Table 1 Docking result and experimental enzyme kine- ,2, 2 能参与了底物的识别过程这与 节的分析结果*, MCA FAE-SH1 Ser123 , tics of four substrates docking with FAE-SH1 一致可 与 的 形 成 氢 键 MSA FAE-SH1 Aa168 ,MFA l可与 的 形成氢键而 和 /KV/Affinity energy / max m Substrate ,1 ,,1 1 ( kJmol) ?( molmin)?( mmolL) ?μ MCA ,MSA MCA ρ则未形成氢键且 及 的亲和能小
,17, 974 MFA , 75 ?0, 12 , 63 ?0, 03 271MFA MCA , 1 ,于 和 ρ的亲和能由表 可见本对接反 ,MCA 19, 84 ?4, 01 3, 23 ?0, 80 17, 556 ρMSA ,65, 48 ?3, 43 9, 48 ?0, 81 19, 646 K 应中亲和能与实验所测的 值之间相关性并不明m MCA 46 , 53 ?1 , 08 4 , 28 ?0 , 21 ,18 , 810 :,V,显但与 呈线性关系即 max * Affinity energy was the docking result,while Vand Kwere max m 2 ,,= = Y 22, 0X367, 02,R0, 9992 the experimental enzyme kinetics results,
Vol, 33 1792 高等学校化学学报
V; X ,,Y 式中代表 代表亲和能 max
,氢键相互作用在生物分子的结构和活性功能上起着非常重要的作用特别是对酶的催化性能更起
,20,, K ,,K 到关键的作用酶动力学参数 是酶的特征性物理常数用于表示酶和底物之间的亲和能力m m
, ,4 FAE-SH1 ,,值越大亲和能力越弱反之亦然本文结果表明此 种底物与 形成的氢键与实验测得的K, ,密切相关氢键可能是影响催化效率的关键因素 m
, 4 2FAE-SH1 与几种糖的分子对接及实验验证
, 、、木质纤维素的主要成分是纤维素半纤维素和木质素阿魏酸通过酯键与阿拉伯糖木聚糖和葡 ,21,,“”, ,聚糖等残基形成酯键并构成了木质纤维素复杂结构的结点目前针对阿魏酸酯酶的水解产物 是
, ( L-、否对酶的水解反应有抑制作用的研究较少本文尝试将木质纤维素的几种常见降解产物阿拉伯 糖D-、D-) FAE-SH1 ,木糖葡萄糖和阿魏酸结构与 预测模型进行了对接
,L-D-、D-FAE-SH1 对接结果显示阿拉伯糖木糖及 葡萄糖与阿魏酸均在 活性位点区域存在结合位 ,( RMSD) 4 , “” 点且对接参数亲和能和 均落在 种模式底物的对接参数区间内这几种物质与活性口袋
His244 Tyr52 ,D-L-FAE-SH1 内的多个氨基酸残基形成氢键即 木糖及 阿拉伯木聚糖与 的 及 残基形
Tabe 2 Effects of sevea sugas on lrlr; D-Ser123,His244 Tyr52 氢键成葡萄糖与 及 残基形
FAE-SH1 activity ; Aa168 , l成氢 键阿 魏 酸 与 残 基 形 成 氢 键其 中
His244 Ser123 FAE-SH1 及 是阿魏酸酯酶 的活性中 Affinity energy / Inhibitory Sugar ,1 ,Ala168 ,Tyr52 rate( ) % 心可能参与了酶对底物的识别可 ( kJmol) ? a b,19, 646 L-Arabinobiose , 7 ,12, 4 7 , FAE-“” 能参与了 氧空洞 的形成 糖类及阿魏酸对a b,D-Xyose l17, 556 6, 0 ,11, 2 a bSH1 ,活性区域的占据及与活性中心区域关键氨基酸Gucose 19, 646 l12, 6 ,14, 8 a b,19, 646 Feruc acd lii残基形成的氢键可能对阿魏酸酯酶的水解起抑制作 25, 6 ,35, 2 , 2,,L-用酶活性抑制实验数据列于表 可见阿拉伯 a, 30 g / L for sugars and 0, 2 g / L for ferulic acid; b, 60 g / L for
sugars and 0, 4 g / L for feruc ac, 、D-、D-FAE-liid糖木糖葡萄糖及阿魏酸对阿魏酸酯酶
SH1 ,,, 降解阿魏酸甲酯的反应均有显著抑制作用且有浓度效应但与对接参数无数量关系
FAE-SH1 ,本文中阿魏酸酯酶 与目前已知阿魏酸酯酶的一级结构相似度低且其预测所得结构的
, -精度也低于晶体测定结构这种配体和受体微小的结构差异和变化可能导致配体受体相互作用的变 ,22,, FAE-SH1 , , 化糖分子对阿魏酸酯酶 活性的抑制及结构的影响有待进一步实验研究目前从木质纤
, , 维素中提取阿魏酸的方法主要以碱处理提取法为主酶法提取阿魏酸仍存在一定的局限除价格较为
,,昂贵和提纯较难外最主要原因是目前所发现的阿魏酸酯酶水解率不高且往往还需要其它酶辅助进 ,23, ,行水解
,FAE-SH1 ,综上所述以宏基因组文库来源的新阿魏酸酯酶 为研究对象分析了其一级结构并预测
,,了三级结构模型探讨了此低序列同源性的阿魏酸酯酶的可能催化机制对进行阿魏酸酯酶的定向进
; ,4 化和理性设计具有重要的借鉴意义分子对接实验和酶促动力学参数测定实验发现该酶对 种模式
,底物的对接数据和催化数据存在一定关系并发现底物与酶之间形成的氢键可能是影响酶催化活力的
; L-、D-、D-FAE-SH1 关键因素通过分子对接实验预测了 阿拉伯糖木糖葡萄糖和阿魏酸对 的水解反应
,,有抑制作用对从秸秆等木质纤维素材料中提取阿魏酸具有指导意义
, 感谢中国农业大学生物学院张盖华博士的帮助
参 考 文 献
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Structure Prediction and Molecular Docking Studies on the Inhibitory
Effect of Several Hydrolyzate on a Novel Feruloyl Esterase
1 1 2 1,3 CHENG Fan-Sheng,ZHANG Mao-Qiu,CHENG Fan-Jie,SHENG Ji-Ping,
1 1 1*CHEN Jng-Yu,ZHENG Yan-Yan,SHEN Ln ii
( 1, College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China;
2, Coege of Physca Scence and Technoogy,Schuan Unversty,Chengdu 610041,Chna; llililiiii
3, School of Agricultural Economics and Rural Development,Renmin University of China,Beijing 100872,China) Abstract Feruloyl esterases,oneof the key enzymes in biomass degradation,show great prospectsi n food, textile,forge and pulp industries, In this study,a feruloyl esterase with low sequence identity was studied, whch was orgnated from Chna Hosten cow rumen metagenomc brary, Possbe cataytc mechansms were iiiiliiliilliidscussed based on conserved domans and tertary structure modeng, Moecuar dockng studes show that iiillilliithe predicted affinity energy exhibits liner relations to experimental Vvalues and hydrogen bond may play a max
key role on catalytic efficiency, In addition,molecular docking study indicates that L-arabinobiose,D-xylose, D-glucose and trans-ferulic acid may have inhibitory effect on feruloyl esterase a ctivity and the inhibition stues verfy ths hyothess, Ths study may pave a way on ratona esgn of feruoy esterase and rove diiipiiildillpidguidance on ferulic acid production from lignocellulose materials,
Keywords Feruloyl esterase; Structure prediction; Molecular docking; Inhibitory effect
( Ed, : Y,Z,A)
范文五：宇佐美曲霉阿魏酸酯酶与木聚糖酶协同作用降解小麦麸皮制备阿魏酸
孙佐美曲霉阿魏酸酯酶与木聚糖酶协同作用
降解小麦麸皮制备阿魏酸
12231龚燕燕 ，殷欣 ，唐存多 ，邬敏辰 ，曾妍
1. 江南大学药学院,江苏 无锡 214122;2. 江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏 无锡 214122;
3. 江南大学无锡医学院,江苏 无锡 214122 摘要:目的 利用孙佐美曲霉:Aspergillus usamii:阿魏酸酯酶与木聚糖酶协同降解小麦麸皮,制备阿魏酸:rulic acid,fe
FA:。方法 将工程酵母菌 P. pastoris GS115 , AusfaeA 和 GS115 , Ausxyn11A 经甲醇诱导发酵,分别获得重组阿魏酸酯 酶和木聚糖酶。在 pH 5. 0、40 ?、料液比 1 ? 60:g ? ml:、水解 10 h 的条件下,探讨木聚糖酶添加量、阿魏酸酯酶与木聚糖 酶协同作用对阿魏酸酯酶水解去淀粉麦麸:destarched wheat bran,DSWB:,释放 FA 的影响,并检测酶解产物 FA 的体
外抗氧化活性。结果 在 0. 5 g DSWB 中单独加入 56 U 阿魏酸酯酶时,FA 的释放率为碱提等量麸皮总 FA 含量的 19. 48%;
在此基础上添加木聚糖酶,能促进阿魏酸酯酶进一步释放 FA,当木聚糖酶添加量为 300 U 时,FA 的释放率从 19. 48%
上升至 70. 10%;木聚糖酶单独作用于 DSWB 未检测到 FA 的释放;在反应体系中先添加木聚糖酶,能释放 1. 23 mg
FA,比先添加阿魏酸酯酶提高了 0. 3 mg;随着 FA 浓度的增加,FA 的还原能力及其对 DPPH 自由基和羟基自由基的清 除能力均呈稳定增长,各浓度 FA 对羟基自由基的清除能力均高于对 DPPH 自由基的清除能力。结论 阿魏酸酯酶与
木聚糖酶之间存在协同作用,双酶共同作用,有利于小麦麸皮的降解,提高 FA 的释放率。 关键词:
孙佐美曲霉;阿魏酸酯酶;木聚糖酶;小麦麸皮;协同作用;阿魏酸
中图分类号: TS261. 4 Q55 文献标识码: A 文章编号:1004-5503:2014:02-0262-05
Synergistic effect of feruloyl esterase and xylanase from Aspergillus
usamii in preparation of ferulic acid by degradation
of wheat bran
*GONG Yan-yan，YIN Xin，TANG Cun-duo，WU Min-chen，ZENG Yan
* School of Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu Province,China
Corresponding author:WU Min-chen,E-mail:bioch@163.com
Abstract:Objective To prepare ferulic acid:FA:by degradation of wheat bran via the synergistic effect of feruloyl esterase
and xylanase from Aspergillus usamii:abbreviated as reAusFaeA and reAusXyn11A respectively:. Methods P. pastoris
GS115 , AusfaeA and GS115 , Ausxyn11A were fermented under induction of methanol to express reAusFaeA and
reAusXyn11A. The effects of reAusXyn11A content and its synergistic mode with reAusFaeA on the lysis of destarched
wheat bran:DSWB:and release of FA were investigated at pH 5. 0,40 ? and a ratio of solid to liquid of 1 ? 60:g ? ml:
for 10 h,and the antioxidant activity in vitro of FA was determined. Results After 56 U reAusFaeA was added into 0. 5 g
DSWB,the release rate of FA was 19. 48% of total FA content extracted with alkaline. However,further addition with
reAuXyn11A enhanced the release of FA. After 300 U reAuXyn11A was added,the release rate of FA increased from
19. 48% to 70. 10%. No release of FA was detected in the DSWB treated with reAuXyn11A alone. When reAuXyn11A
was added into the reaction system at first,the release of FA was 1. 23 mg,which increased by 0. 3 mg as compared with
that when reAusFaeA was added after first. With the increasing FA concentration, the reduction ability of FA as well as its
clearance abilities to free DPPH radical and free hydroxide radical increased stably. However, the clearance abilities of
FA at various concentrations to free hydroxide radical were stronger than those to free DPPH radical. Conclusion Sig,
nificant synergistic interaction between the reAuFaeA and reAuXyn11A was observed,which was beneficial to the degra,
dation of wheat bran and enhanced the release of FA.
Key words:Aspergillus usamii;Feruloyl esterase;Xylanase;Wheat bran;Synergistic effect;Ferulic acid:FA: 基金项目:国家自然科学基金项目:31101299:.
通讯作者:邬敏辰,E-mail:bioch@163.com
阿魏酸:ferulic acid,FA:是普遍存在于植物中 加入0. 1 ml 稀释的酶液,于 45 ?反应 10 min 后,加
, 1,的一种天然抗氧化剂,在谷物植物细胞壁中主要入 400 μl 冰乙酸终止反应,采用高效液相色谱法 以酯键的形式连接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖残基 :HPLC:测定 FA 的释放量。在测定条件下:45 ?, , 2,上。将阿魏酸酯酶和木聚糖酶共同作用于植物性 pH 6. 0:,以每分钟产生 1 μmol FA 所需的酶量定义
细胞壁原料,可同时打断阿魏酸酯键和糖苷键,有效 为一个酶活性单位:U: 。
, 3-4,,7,提高水解效率,获得 FA。 1. 5. 2 木聚糖酶活性的测定 采用改进的 DNS 法。
在 2. 4 ml 0. 5,木聚糖溶液:pH 4. 6:中加入 0. 1 ml 本实验将工程酵母菌 GS115 , AusfaeA 和 GS115
稀释的酶液,于 50 ?反应 10 min 后,加入 2. 5 ml , Ausxyn11A 进行甲醇诱导发酵,分别获得来源于孙
试剂,沸水浴中显色 7 min,测定 A。在上述反 DNS佐 美曲霉:540Aspergillus usamii:的重组阿魏酸酯酶和木
聚 糖酶,并利用双酶协同降解小麦麸皮,获得 FA,以应条件下,以每分钟产生 1 μmol 还原糖所需的酶量
定义为一个酶活性单位:U:。 期 为重组酶制剂高效水解农业废弃物,制备功能性
,8,FA, 降低生产成本奠定基础 。1. 6 总 FA 的提取 采用碱提取法测定小麦麸中
总 FA 的含量,并以此来判断酶解效率。 0. 5 称取g
1 材料与方法 DSWB 于 100 ml 摇瓶中,再加入 30 ml 1 mol , L NaOH 溶液,置 40 ?恒温振荡器中反应 10 h。水
1. 1 菌 株 P. pastoris GS115 , AusfaeA 和 解液于
GS115 , Ausxyn11A 由江南大学医学院分子生物学10 000 r , min 离心 10 min,取上清液,用冰醋酸实验室构建 并保存。 调 pH 为 3,10 000 r , min 离心 5 min,上清液过 0. 45
1. 2 主要试剂及仪器 标准反式阿魏酸和阿魏酸 μm 滤膜后进行 HPLC 分析。色谱条件:-3000 U色谱甲酯购自盐城朗德化学品科技有限公司;甲醇:色谱 仪, ZW&A-C18 反相柱,流动相为甲醇,1%乙酸梯度洗
1,1-二苯基-2-三 纯:购自江苏汉邦科剂有限公司;脱, 流速为 1. 0 ml , min,紫外检测仪检测波长为 硝基苯肼:DPPH:购自美国 Sigma 公司;其他试剂均 320 nm, 进样量为 20 μl,柱温为 30 ?。 为国产或进口分析纯;YPD、BMGY 和 BMMY 培养基 1. 7 阿魏酸酯酶添加量对 FA 释放率影响的检测
分别称取 0. 5 g DSWB 于 100 ml 摇瓶中,加入 0 ,
参照 Multi-Copy Pichia Expression Ki:t 美国 Invitrogen 140 U 的阿魏酸酯酶,以 100 mmol , L 磷酸钠缓冲液
公司:操作手册配制;ZW&A-C18 反相柱购自无锡科 1. 5. 1 阿魏酸酯酶活性的测定 参照文献,6,方法。 奥美萃生物科技有限公司;U-3000 色谱仪购自美国 在 0. 9 ml 1 mmol , L 阿魏酸甲酯溶液:pH 6. 0:中 戴安公司。
1. 3 去淀粉麦麸 :destarched wheat bran，DSWB:的
, 5 ,制备 按照 Mukherjee 等 的方法略加改进制备
DSWB。称取 50 g 新鲜小麦麸皮,于 95 ?,0. 3%:w , v:
醋酸钾中浸泡 30 min,期间不停搅拌,再用大量蒸馏
水冲洗麸皮去除淀粉。在 105 ?下烘干至恒重,粉
碎,过 60 目筛备用。
1. 4 阿魏酸酯酶和木聚糖酶粗酶液的制备 从YPD
平板上分别挑取 GS115 , AusfaeA 和 GS115 ,
Ausxyn 11A 单菌落,接种至 30 ml 液体 BMGY 培养
基中,于
30 ?,220 r , min 振荡培养 24 h 后,室温静置约 1 h;
弃尽上清,加入 30 ml 含 1. 0%甲醇的 BMMY 培养基,
按上述条件继续培养 72 h,每 24 h 添加 1%:v , v:
甲醇进行诱导。酵母发酵液于 8 000 r , min 离
心 10 min,收获上清,即分别为阿魏酸酯酶和木聚糖
酶 粗酶液。
1. 5 酶活性的测定
:pH 5. 0:补足反应体积至 30 ml,置 40 ?恒温振荡 器中酶解 10 h 后,于沸水浴中灭酶 10 min 终止反应。 水解液于 10 000 r , min 离心 10 min,取 1 ml
上清液, 加入等体积的无水乙醇,混匀,10 000 r
, min 离心5 min,取上清液,过 0. 45 μm 滤膜后进行 HPLC 分 析。以底物中只加缓冲液作为对
照。按下式计算F A 的释放率。
FA 的释放率:%:= 酶解 DSWB 释放的 FA 量 , 碱提等量
DSWB 得到的 FA 量 × 100%
1. 8 木聚糖酶添加量对阿魏酸酯酶水解 DSWB 影
响的检测 分别称取 DSWB 0. 5 g,先加入 56 U 阿魏
酸酯酶,再加入 0 , 1 200 U 的木聚糖酶,按 1. 7
项 方法进行水解,以底物中只加木聚糖酶作为对
照。 计算 FA 的释放率。
1. 9 阿魏酸酯酶和木聚糖酶协同作用对 FA 释放
量 影响的检测 设计两种协同方式:先加阿魏酸酯酶 反应 5 h,灭酶后再加入木聚糖酶反应 5
h;先加木 聚糖酶反应 5 h,灭酶后再加入阿魏酸酯酶反应 5 h。 考察两种酶协同方式对 FA 释放量的影响。以反应 体系中只添加缓冲液、阿魏酸酯酶或木聚糖酶作为 对照。
双氧水测定的吸光值为 A,水杨酸代替 FA 测得的 xo1. 10 酶解产物 FA 体外抗氧化活性的检测
空白对照吸光度值为 A,按下式计算?OH 自由基的 o1. 10. 1 FA 的初步提纯 将酶解液于 10 000 r ,
min 清除率。
离心 10 min 后,取上清,加入 7 倍体积的无水乙醇, ?OH 自由基的清除率:%: =,A-:A- A:, , A× o x xoo
混匀后于 15 000 r , min 离心 5 min,去除蛋白。将100% 含 乙醇的上清液旋转蒸发至 10 ml,于上述液体中加 入 3 倍体积的无水乙醇,15 000 r , min 离心 5 min,2 结 果 去 除部分多糖。取含 FA 的上清,进行体外抗氧化活 性 分析。 2. 1 阿魏酸酯酶和木聚糖酶的活性 检测结果显
1. 10. 2 还原力的检测 铁氰化钾 KFe :CN:可被 36 示,重组阿魏酸酯酶的活性为 7. 05 U , ml,重组木
还原剂还原成亚铁氰化钾 KFe:CN:,KFe:CN:再 4646 聚糖酶的活性为 600 U , ml。 3+与 Fe作用生成普鲁士蓝,其在 700 nm 处有最大吸 2. 2 酶解底物 DSWB 中总 FA 的含量 检测结果显 收值,可间接反应还原剂的还原能力,吸光值越大, 示,酶解原料 DSWB 中 FA 的总含量为 4. 398 mg , g。 还原力越高。在具塞试管中加入 1 ml 4 , 20 μg , ml
2. 3 阿魏酸酯酶添加量对 FA 释放率的影响 检测 的 FA 样品溶液1、 ml 0. 2 mol , L 的 PBS:pH 6. 6:和
结果显示,阿魏酸酯酶添加量在 0 , 56 U , 0. 5 g 2 ml 1%的铁氰化钾溶液,置 50 ?恒温水浴中反应 20
底 物时,酶解所得的 FA 释放率随着酶量的增加而升高; min; 迅速冷却,再加入 1. 0 ml 10%:w , v:的三氯
阿魏酸酯酶添加量为 56 U , 0. 5 g 底物时,FA 的乙酸溶 液,3 000 r , min 离心 10 min,取上清液 2 ml,
释 加入 1 ml 1%的三氯化铁溶液和 2. 0 ml 去离子水,振
放量为 0. 326 mg,相应的释放率为 19. 48%;阿魏酸 荡均匀, 静置 5 min;在 700 nm 处测定吸光度值。以
酯酶添加量大于 56 U , 0. 5 g 底物时,FA 的释放蒸馏水代 替 FA 溶液作为空白。 以FA 样品浓度为横
量 趋于平稳,原因可能是加入的阿魏酸酯酶的量已A值为纵坐标,绘制 FA 还原力曲线。 坐标,700
趋 于饱和。见图 1。对照组未检测到 FA。 1. 10. 3 清除 DPPH 自由基活性的检测 DPPH 自 由基是一种稳定的自由基,依靠整个分子上备用电 20 子的离域作用而保持稳定,以致不能形成二聚体,其 醇溶液为紫色,在可见光区 517 nm 处有最大吸收峰。 :15 % 当 DPPH 溶液与能提供氢原子的抗氧化剂混合时,被 10 还原,颜色发生变化,由深紫色变为淡黄色。紫色越 释放率: 5 FA浅,抗氧化剂的自由基清除率越大,抗氧化能力越强 。 0
, L:、 1 ml 水杨酸:10 mmol , L:,37 ?反应 15 min,在具塞试管中加入 1 ml 4 , 20 μg , ml 的 FA 样
-5 于 510 nm 处测定不同 FA 浓度下的吸光度值:A:,水x品溶 液、3 ml 8 × 10mol , L 的 DPPH 乙醇溶液,
杨酸代替 再加入 1 ml 无水乙醇,使反应终体积为 5 ml,室温避光放置
30 min 后,在 517 nm 处测定吸光度值:A:,空白管 x 用无水乙醇代替 FA 溶液,测定的吸光度值为 A,乙 o醇代替 DPPH 测定的吸光度值为 A,按下式计算 xo
DPPH 自由基清除率。
DPPH 自由基清除率:%:=,A-:A- A:,, A× 100% o x xo o
1. 10. 4 清除羟基自由基活性的检测 利用 HO22
2+和 Fe混合发生 Fenton 反应,生成具有很高反应活 性的?OH,在该体系内加入水杨酸可捕捉OH,并产? 生深色物质,该物质在 510 nm 处有最大吸收,紫色越 浅,抗氧化剂的自由基清除率越大,抗氧化能力越强。 在具塞试管中加入 1 ml 4 , 20 μg , ml 的 FA 样品 溶液、2 ml FeSO:5 mmol , L:、1 ml HO:10 mmol 4 22
0 20 40 60 80 100 120 140
阿魏酸酯酶量:U:
图 1 阿魏酸酯酶不同添加量 FA 的释放率
Fig 1. Release rates of FA from DSWB added with
reAus- FaeA at various dosages
2. 4 木聚糖酶添加量对阿魏酸酯酶水解 DSWB
的 影响 检测结果显示,木聚糖酶的添加进一步促
进了 FA 的释放,且 FA 释放率随着木聚糖酶添加
量的增 加而升高。木聚糖酶添加量为 300 U ,
0. 5 g 底物
时,FA 的释放量为 1. 5 mg,比阿魏酸酯酶单独作用 时增加了 1. 174 mg,相应的释放率从 19. 48%上升至
70. 1%;木聚糖酶添加量大于 300 U , 0. 5 g 底物时, FA 释放量增加不明显,趋于饱和。 2见图。对照组未 检测到 FA。表明阿魏酸酯酶是释放 FA 的关键酶, 木聚糖酶能促进阿魏酸酯酶释放 FA,两种酶之间存 在良好的协同作用。
80 自由基的清除率达 49. 3%,而对羟基自由基的清除
70 率达 92%。见图 5。 :% 60 50 0. 6 释放率:40 A0. 5 30 0. 4 20 700 0 150 300 450 600 750 900 1 050 1 200 A0. 3 木聚糖酶量:U: 0. 2 图 2 木聚糖酶添加量对阿魏酸酯酶释放 FA 的影响 0.14 8 12 16 20 Fig 2. Influence of additive of reAusXyn11A on release of
FA 浓度:μg , ml: FA from DSWB treated with reAusFaeA
图 4 FA 的还原力曲线 2. 5 阿魏酸酯酶与木聚糖酶协同作用对 FA 释放量 Fig 4. Curve of reducing power of FA 的影响 检测结果显示,在反应体系中只添加缓冲液 或木聚糖酶均未检测到 FA;在反应体系中先添加木 DPPH 自由基
100 羟基自由基 聚糖酶:300 U:,能释放 1. 23 mg FA,比先添加阿魏酸 80 : 酯酶:56 U:提高了 0. 3 mg,表明双酶在协同降解 DSWB % 60 的过程中,两种酶的添加顺序也能影响 FA 的释放量; 40 在反应体系中同时添加阿魏酸酯酶和木聚糖酶,FA 20 释放量最高,表明双酶在植物性材料降解过程中相 自由基清除率: 0互促进。见图 3。 4 8 12 16 20
FA 浓度:μg , ml: 1. 6 图 5 FA 对 DPPH 自由基和羟基自由基的清除能力 1. 4 Fig 5. Clearance of DPPH and OH with FA 1. 2 F 1. 0 0. 8 3 讨 论 释放0. 6量 :mg: A0. 4 F 0. 2 本 实 验 使 用 的 小 麦 麸 皮 中 , 总 FA 的 含 量 为 4. 0 ,9,398 mg , g,与欧仕益等报道的结果:4. 236 mg , g: 相1 2 3 4 5 6
,10,试验方案 近,但稍低于 Koseki 等报道的结果:0. 5% , 0. 7%:。
本实验在 0. 5 g DSWB 中单独加入 56 U 的阿魏酸酯 1:只添加缓冲液;2:只添加阿魏酸酯酶;3:只添加木聚糖酶; 酶时,能释放 0. 326 mg FA,相应的释放率为19. 48%, 4:先添加阿魏酸酯酶;5:先添加木聚糖酶;6:同时添加阿魏酸酯酶和 在此基础上添加 300 U 木聚糖酶时,FA 的释放量达1. 木聚糖酶。 5 mg,相应的 释 放 率 上 升 为 70. 1% ,该 结 果 与 图 3 不同协同方式下 FA 的释放量 , 11,, 12,Topakas 等和 Faulds 等的报道相似,均证明阿 Fig 3. Release modes of FA under various synergistic
魏酸酯酶是释放 FA 的关键酶,木聚糖的添加能促进 modes of reAusFaeA and reAusXyn11A
阿魏酸酯酶进一步释放 FA,两者具有良好的协同作
用,能有效降解小麦麸皮。在反应体系中先添加木 2. 6 酶解产物:FA:的体外抗氧化活性
聚糖酶比先添加阿魏酸酯酶更能有效促进 FA 的释 2. 6. 1 还原力 检测结果显示,FA 的还原能力随
放,原因可能是从复杂的植物细胞壁中释放出 FA 着 FA 浓度的增加呈稳定增长,见图 4。
有两步:第 1 步为木聚糖酶将细胞壁中的半纤维素 2. 6. 2 清除 DPPH 自由基和羟基自由基的活性 检
降解为相对分子质量相对较小的阿魏酸寡聚多糖, 测结果显示,随着 FA 浓度的增加,FA 对 DPPH 自
改变细胞壁的物理化学性质;第 2 步为阿魏酸酯酶 由基和羟基自由基的清除能力均呈稳定增长;各浓
作用于阿魏酸寡聚多糖,使 FA 释放,从而提高了FA 度 FA 对羟基自由基的清除能力均高于对 DPPH 自
的释放量。本实验结果也证明了该结论。 由基的清除能力;当 FA 浓度为 20 μg , ml 时,对 DPPH
Appl Microbiol Biotechnol,2012,94:2::399-411. 目前,许多研究者也利用双酶协同作用成功降解
,5, Mukherjee G, Singh RK, Mitra A, et al. Ferulic acid es ,13, 了其他的农业废弃物,并高效获得了 FA。Shin 等 production by Streptomyces sp ,J,. Bioresource terase从 层 生 镰 刀 菌:Fusarium proliferatum:中 分 离 获 得 Technol,2007,98:1::211-213. 1 株阿魏酸酯酶,单独作用于玉米糠仅能释放 6%的 ,6, Zhang SB,Pei XQ,Wu ZL. Multiple amino acid substitu, FA,当加入来自疏棉状嗜热丝孢菌:Thermomyce lan- tions significantly improve the thermostability of feruloyl es uginosus:的木聚糖酶时,FA 的释放量增加至 11. 3%。teraseYu A from Aspergillus niger,J,. Bioresource Technol,2012, , 14,117:1::140-147. 等报道,黑曲霉分泌的阿魏酸酯酶单独作用燕麦
,7, Wang JQ,Zhang HM,Wu MC,et al .Cloning and sequence 壳,其 FA 的释放率仅为 14%,但加入木聚糖酶后, analysis of a novel xylanase gene,Auxyn10A,from Aspergillus FA 的最高释放率可达 69%。上述研究均为酶法降 usamii,J,. Biotechnol Lett,2011,33:5::1029-1038. 解农业废弃物,合理利用资源,高效获得 FA 等奠定 ,8, Mukherjee G,Singh RK,Mitra A,et al. Ferulic acid esterase
了基础。 production by Streptomyces sp ,J,. Bioresour Technol,2007,
本实验对酶解混合物进行乙醇沉淀、离心、旋转 98:1::211-213.
,9, Ou SY,Zhang Y,Zhang J,et al .Study on Ferulic-acid re, 蒸发,在去除蛋白质和部分多糖的同时,初步分离纯
lease from wheat bran treated with sodium hydroxide,J,. Food 化了反应液中的 FA,并分析了其体外抗氧化活性,还 Sci,2002,23:8::162-165.:in Chinese: 欧仕益,张颖,原力、DPPH 自由基和羟基自由基清除率均证明 FA 张景,等. 碱解麦麸制备阿魏酸的研究,J,. 食品 科学,2002,23是一种有效的天然抗氧化剂,能广泛应用于食品、 :8::162-165.
医药、新型化妆品等领域中 。,10, Koseki T,Fushinobu S,Ardiansyah,et al .Occurrence,pro -
perties,and applications of feruloylesterases ,J,. Appl Mi , crobiol Biotechnol ,2009,84:5::803-810. 参考文献 ,11, Topakas E,Vafiadi C,Stamatis H,et al .Sporotrichum ther , mophile type C feruloyl esterase :StFae C:: ,1, Mathew S,Abraham TE. Ferulic acid:an antioxidant found purification, characterization,and its use for phenolic acid in plant cell walls and feruloylesterases involved in naturally:sugar: ester synthesis,J,. Enzyme Microb Tech,2005,36:its release and their applications ,J,. Crit Rev Biotechnol , 729-736. 2004,24:2-3::59-83. ,12, Faulds CB,Williamson GR. Release of ferulic acid from wheat ,2, de Vries RP,Visser J. Aspergillus enzymes involved in de - bran by a ferulic acid esterase :FAE-?:from Aspergillus niger gradation of plant cell wall polysaccharides,J,. Microbiol Mol ,J,. Appl Microbiol Biotechnol,1995,43:6::1082-1087. Biol Rev,2001,65:4::497-522. ,13, Shin HD, Chen RR. Production and characterization of a ,3, Wong DW,Chan VJ,Liao H,et al .Cloning of a novel fertype B feruloyl esterase from Fusarium proliferatum NRRL , uloyl esterase gene from rumen microbial metagenome 26517,J,. Enzy Microb Technol,2006,38:3-4::478-485. and enzyme characterization in synergism with endoxylanases ,14, Yu P,Maenz D,McKinnon J,et al. Enzymic release of fer, ,J,. J Ind Microbiol Biotechnol,2013,40:3-4::287-295. ulic acid from oat hulls by As pergillus ferulic acid esterase,J,. ,4, Topakas E,Moukouli M,Dimarogona M,et al .Expression, Can J Anim Sci,2000,80:776-777. characterization and structural modelling of a feruloyl esterase from the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila,J,. 收稿日期:2013-06-03 编辑:何巍
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