范文一：注射用重组人组织型纤溶酶原激活剂说明书

注射用瑞替普酶说明书

【药品名称】

通用名：注射用瑞替普酶

英文名：Reteplase(rPA) for Injection

汉语拼音：Zhusheyong Rui Ti Pu Mei

本品主要成分及其化学名称为：瑞替普酶（rPA ）

分子量：39，751.5D

说明：rPA 是非糖基化组织型纤溶酶原激活物的变异体，含有绞链区2(Kringle2)及人组织型纤溶酶原激活物的酶结合点，含有天然组织型纤溶酶原激活物527个氨基酸中的355个（氨基酸1-3和176-527）。这种蛋白是从大肠杆菌中无活性的包涵体得到的，在体外经折叠后（空间结构改变）转变为活性形式。

溶液的PH=7.0-7.4

【性状】

本品为白色或类白色冻干粉剂

【药性毒理】

药理作用

本品可以使纤维蛋白溶解酶原激活为有活性的纤溶蛋白溶解酶，以降解血栓中的纤维蛋白，发挥溶栓作用。

毒理研究

生殖毒性：家兔给予人用剂量3倍（0.86MU/kg）时，rPA 有致流产作用；大鼠剂量达人用剂量15倍（4.3lMU/kg）时，对胎儿未见引起异常；但妊娠家兔给予rPA 可引起生殖道出血而致妊娠中期流产。

遗传毒性：多项染色体畸变、基因突变、微核试验试验结果均为阴性。

【药代动力学】

有5项关于rPA 的药代动力学特点的试验。包括3项健康志愿者的试验，和2项急性心肌 梗塞病人的试验。

健康志愿者：在这些研究中，rPA 的剂量范围在0.1125MU-6MU ，当剂量增加时，rPA 的血浆活性浓度增加，并呈单指数方式下降；其半衰期为11-16min ；较Alteplase 长4-7倍。

AUC 和Cmax 的增加与剂量呈线性正相关。

在较高剂量，血浆中rPA 的抗原浓度降低呈一双指数方式，较其活性的减低需更长的时间。其抗原性的半衰期为0.94-2.7h 。这一结果是可以推测到的，因为抗原测定的是总的rPA 而不是有活性的rPA 。

在健康受试者，rPA 的药代动力学在不同种族改变似乎不大，其中一项试验表明在日本人和高加索人之间，rPA 的活性及抗原性的药代动力学参数无明显不同。急性心肌梗塞病人：在两项临床研究中，测定rPA 的药代动力学。将急性心肌梗塞病人随机分组。在第一项试验中，以三种方式分别给药：1）10MU(18mg)+5MU(9mg)二次间隔30分钟，iv, 2）10MU+10MU，间隔30’iv, 3）15MU iv。在给予rPA 10MU后，测1）、2）组的平均血浆浓度、平均最大 及最小血浆浓度；另外，在给予第二次静注后，测定血浆浓度增加的平均值。在给予全部剂量15MU 后(10+5MU及15MU) ，测得AUC 分别为684及719MU ）。在健康志愿者，发现这些药代动力学数据的个体差异不大，且具有合理的线性关系，病人的rPA 的活性呈双指数下降，平均终末半衰期为 1.63-4.15 h ；与前述健康志愿者的活性呈单指数下降不同，这一差别可能是由于病人用药剂量高的结果。在一长期的血浆浓度以及由于肝脏或肾脏功能损伤时，可导致排泄减少。

在健康受试者，观察到与排泄半衰期一致的平均血中半衰期（t1/2）0.22-0.27hrs （12—16min ）可以作为rPA 的有效半衰期，相当于总AUC 的80%以 上，能够更好地反映全部rPA 的分布。在健康志愿者，尽管抗原及生化活性的减少速率都较低，但是rPA 的抗原活性较生化活性持续时间更长，在第二项研究中，给予rPA 10MU或15MU 静注，平均血浆浓度和药代动力学参数在15MU 组与第一项试验结果相同，且血浆浓度Cmax 和AUC 在10MU 组与15MU 组相同，排泄半衰期（≈0.20h ≈12min ）与第一项试验中观察到的一致。

健康志愿者和病人的比较：尽管给予病人的剂量为健康志愿者的3倍，但观察到AUC 及Cmax 与剂量间有一样的相关性。总之，rPA 的药代动力学似乎与受试者的疾病情况无关。

【适应症】

适用于成人由冠状动脉梗塞引起的急性心肌梗塞的溶栓疗法，能够改善心肌梗塞后的心室功 能。本药应在症状发生后，尽可能早期使用。

【用法用量】

rPA 只能静脉使用。

rPA 应该10MU+10MU分两次静脉注射，每次缓慢推注2分钟以上，两次间隔为30分钟。注射时应该使用单独的静脉通路，不能与其它药物混合后给药，也不能与其它药物使用共同的

静脉通路。没有多于两次给药的重复用药的经验。尽管没有足够的资料表明，在用药中或用药后合并使用抗凝或抗血小板药是否有利，但99%的病人在溶栓治疗期间同时使用肝素，用药期间或用肝素后，可合并使用阿斯匹林。

关于不合并使用肝素或阿斯匹林对于rPA 的安全性及效果的影响的研究还未进行。

当配制溶液时，肝素和rPA 是有配伍禁忌的，不能在同一静脉通路给药，如需共用一条静脉通路先后注射时，使用二种药之间，应该用生理盐水或5%葡萄糖溶液冲洗管道。

【不良反应】

出血：最常见的不良反应用是出血，与溶栓治疗有关的出血可分为2个主要类型：

1. 内脏出血：包括颅内、腹膜后或消化道、泌尿道、呼吸道。

2. 浅表或体表出血：主要有穿刺或破损部位（如静脉切开插管部位、动脉穿刺部位、新近外科手术部位）。

根据国外临床研究结果报道，在INJECT 临床试验中接受瑞替普酶的住院病人颅内出血的发生率为0.8%，与其他溶栓药一样，颅内出血的风险随年龄的增大和血压的升高而增加。除颅内出血外，其它各种类型的出血的总的发生率约为21.1%。

各次试验中，出血的范围不同，并与动脉导管插入及其它侵入性治疗的使用明显相关。 一旦关键部位发生严重出血（颅内、消化道、呼吸道、心包），立即停用肝素、抗凝或抗栓治疗，如第二次静注rPA 还未进行，应立即停用。发生中风（包括颅内出血）和其它严重出血事件的病人有可能导致死亡或永久性残疾。在rPA 治疗期间，由于注射部位形成血栓的纤维蛋白被溶解，所以必须仔细观察潜在出血部位（动脉穿刺、导管插入等）。

过敏反应：

在INJECT 试验中，接受rPA 治疗的3例病人，出现严重过敏反应，其中一例出现呼吸困难和低血压；在早期临床试验的3856例病人中，无过敏反应发生；GUSTO Ⅲ 的先期结果表明，在10000例接受rPA 治疗的病人中，有3例发生过敏反应。

其它不良反应：

心肌梗塞病人在使用rPA 治疗时也会出现许多心肌梗塞本身也具有的其它症状。无法分清是否由rPA 引起。这些事件包括：心源性休克、心律失常、（窦性心动过缓、室上性心动过速、加速性室性心律、早期复极综合症、期前收缩、室性心动过速、心室纤颤、房室传导阻滞）、肺水肿、心衰、心脏停搏、再发性心绞痛、再梗塞、心脏穿孔、二尖瓣返流、心包渗出、心包炎、急性心脏填塞、静脉血栓形成及栓塞和电机械分离。有些并发症十分凶险，可以导致死亡, 其它不良反应也有报导，如恶心、呕吐、发热及低血压。

【禁忌】

以下患者禁用：

1. 活动性内出血

2. 脑血管意外史

3. 新近（2个月内）颅脑或脊柱的手术及外伤史

4. 颅内肿瘤、动静脉畸型或动脉瘤

5. 已知的出血体质

6. 严重的未控制的高血压

【注意事项】

由于纤维蛋白被溶解，可能引起新近的注射部位出血，所以溶栓治疗期间，必须仔细观察所有潜在出血点（包括导管插入部位、穿刺点、切开点及肌注部位），如有大血管不可压迫的穿刺应尽量避免（如颈静脉或锁骨下静脉）。

在用药期间，如果必须进行动脉穿刺，最好采用上肢末端的血管、容易压迫止血，穿刺后，至少压迫30分钟，用敷料加压包扎，反复观察有无渗血。

用药期间，病人的肌肉注射和非必须的搬动应尽量避免。

静脉穿刺在必须进行时，操作应特别仔细。

一旦发生严重出血（局部无法加压止血），必须立即停用肝素、抗凝药及抗栓治疗；另外，如果出血发生在第一次静注后，第二次静注应该停用。

需用该药治疗的所有病人，用药前应仔细权衡治疗效果与潜在的危险性。在下列情况，用药的危险性可能增加，应该慎用：

1. 最近（10天内）大的外科手术：冠脉搭桥、产科分娩、器官移植、组织活检及不可压迫血 管的穿刺。

2. 脑血管疾病

3. 新近的消化道或泌尿道出血（10天内）

4. 新近的外伤（10天内）

5. 高血压：收缩压BP ≥180mmHg 及/或舒张压≥110mmHg

6. 高度怀疑存在左心栓子（二尖瓣狭窄伴心房纤颤）

7. 急性心包炎

8. 亚急性细菌性心内膜炎

9. 止血功能障碍，包括继发于严重肝肾疾病的凝血功能障碍

10. 严重的肝肾功能衰竭

11. 妊娠

12. 糖尿病引起的出血性视网膜病变或其它出血性眼病

13. 败血症性栓塞性静脉炎，或在严重感染部位存在动静脉瘘

14. 高龄（>70岁）

15. 病人长期使用口服抗凝剂（华法林等）

16. 其它：如潜在的难以止血的出血部位，或可能明显增加出血机会的各种情况

胆固醇栓塞形成:

用溶栓治疗的病人罕有胆固醇栓塞的报导，确切的发生率不清楚。最严重的情况可以是致死的。也可发生于侵入性检查及治疗过程中（心脏导管插入术、造影、血管外科等），和/或抗凝治疗。胆固醇栓塞可能的临床表现为：网状（青）斑块、“紫色趾”综合症、高血压、急性肾功衰竭、坏疽性指（趾）、心肌梗塞、胰腺炎、脑梗塞、脊髓梗塞、肾动脉栓塞、肠动脉栓塞和横纹肌溶解。

心律失常：

溶栓治疗可能引起再灌注性心律失常，这种心律失常（如窦性心动过缓、室上性心动过速、室性早搏、室性心动过速）与心肌梗塞本身并发的心律失常无任何不同，应该采用常规的抗心律失常药治疗，建议在给药时合并使用抗心动过缓和/或室性心律紊乱的药物

【孕妇及哺乳期妇女用药】

当给予人用剂量3倍rPA 时对白兔有致流产作用（0.86MU/kg）。重复试验表明，在给予人 用剂量15倍（4.31MU/kg）时，家兔的胎儿未发生异常。但是，给予妊娠家兔rPA 可引起生殖道出血，导致中孕流产。对于妊娠妇女，没有充分的良好对照的研究。最常见的溶栓治疗的并发症是出血，在某些病人，包括妊娠可以增加出血的危险性，故在妊娠期间，rPA 必须在权衡效果及可能引起的流产后慎用。

不能确定rPA 是否与人乳一同分泌。因为许多药物可由人乳分泌，故rPA 用于哺乳期时有可能随乳汁分泌，因此，在哺乳期妇女使用本品应极为慎重。

【儿童用药】

尚无rPA 在儿童使用时的安全性及疗效的研究资料。

【老年患者用药】

在病人≥70岁时，尤其是收缩压≥160mmHg 时，使用rPA 应特别注意。

【药物相互作用】

没有研究rPA 与其它心脏活性药物的相互作用。在rPA 治疗前及治疗后使用肝素、维生素K 拮抗剂及抗血小板药（阿斯匹林，潘生丁等）可能增加出血的危险。

【药物过量】

没有rPA 过量的经验。使用rPA 时纤维蛋白原水平降低，可以预先监测纤维蛋白原的水平。 纤维蛋白原及其它凝血成分的减少增加了出血的危险。如有严重出血发生，立即停用肝素及其它抗凝、抗栓药，必要时输入新鲜全血或血浆，及抗纤溶药物。对抗肝素的作用可使用鱼精蛋白。

【规格】

5.0MU/支

【贮藏】

置室温或冰箱（2-8℃）密封保存，切勿冷冻，避光保存。

【包装】：

每盒内有非真空小瓶一个。

【有效期】24个月

【批准文号】

【研制单位】

爱德生物技术发展（中国）有限公司

【生产企业】

爱德药业（北京）有限公司

地址：北京市昌平区北七家工业园区

联系电话：010-69756016

范文二：重组人组织型纤溶酶原激活剂中细胞残余DNA的检测

Ξ

重组人组织型纤溶酶原激活剂中细胞残余 D NA 的检测

李世崇 胥照平陈昭烈吴本传林福玉刘红

()军事医学科学院生物工程研究所 ,北京 100071

( ) 摘 要 采用地高辛标记探针 ,以核酸分子斑点杂交技术检测重组人组织型纤溶酶原激活剂 rt2PA中细

胞残余 DNA 的方法 。从样品中去掉蛋白提取 DNA 的方法能有效的避免蛋白对检测结果的干扰 ,其灵敏度和结

果都能较好地达到 W HO 的要求 。

关键词 残余 DNA ;重组人组织型纤溶酶原激活剂 ;地高辛标记探针 ;斑点杂交

DNA 对人体基因工程药物中宿主细胞残余 213 地高辛标记探针的制备

可能产生严重危害 。尤其是哺乳动物细胞的 DNA 用随机启动法将地高辛标记的 dU TP 掺入新

μ() 合成的 DNA 片断 。取 1g 小片断细胞 DNA 为模 带有癌基因 Oncogen,它在进入人体时 ,理论上可

1 能存在发生 重 组 而 导 致 肿 瘤 的 可 能, 因 而 对 基 板 ,按试剂盒说明书进行操作 ,过夜标记经乙醇处

μ因工程 药 物 中 外 源 DNA 的 控 制 具 有 重 要 意 义 。 理干燥后 ,加入 40l 10 mmol/ L Tris1 HCl ,1 mmol/

) ( L ED TA p H810 T E 液, - 20 ?保存备用 。 W HO 和 FDA 要求基因工 程 制 品 中 外 源 DNA 的

2 214 含量每剂量不能大于 100p g。一般残余 DNA 的 标记探针的定量

检测方法用斑点杂交 ,或是利用高亲和力的 DNA 用对照试纸条和定量试纸条按说明书进行 。

215 结合蛋白进行测定 ;前者目前有放射性标记探针和 rt2PA 样品中 DNA 的提取

化学标记探针 。本文用化学标记探针即地高辛标 取 rt2PA 40 mg , 用 酚2氯 仿 去 蛋 白 , 乙 醇 纯 化

μ记工程细胞 CHO 总 DNA 片断为探针 , 检测我们 DNA ,干燥后用 20l T E 液溶解 。

生产的 rt2PA 样品中的细胞残余 DNA 。 216 样品处理及制膜

μ 将纯化定量的工程细胞总 DNA 稀释为每 5l 含材 料1 10ng ,1ng ,100pg ,10pg ,1pg ,011pg 的标准系列 。将标

μ准系列 、阳性对照 DNA 及样品残余 DNA 提取液 20l 111 样品

生产 rt2PA 的 CHO 工 程 细 胞 由 本 所 三 室 构 置于 100 ?变性 10min ,迅速冷却 5min 后短暂离心 。

(建 ,rt2PA 由本所一室 t PA 组生产纯化 。 制备两张同样的膜 一张为杂交时不加探针的空白对

) μ112 试剂 地高辛标记检测试剂盒购自德国宝灵 曼照,标准系列每孔加样 5l ,样品提取液每张膜上加

μ公司 ,蛋白酶 K , RNase 购自北方同正公司 ,其他 生两孔 ,各 5l ,干燥后放置 80 ?烘烤 2 h 。

化试剂皆为分析纯 。 217 分子杂交及免疫显色

按试剂盒说明书进行 。2 方 法

3 结 果 211 rt2PA 工程细胞总 DNA 的制备

3 按《分子克隆》方法进行。311 工程细胞 DNA

212 小片断细胞 DNA 的制备动物细胞 DNA M 比较大 , 不适合于用来直 r

将 211 制 备 的 rt2PA 工 程 细 胞 总 DNA 于接作探针模板 。为了检测出样品中 所潜在的微量

100 ?沸水浴中裂解 70 min ,用紫外分光光度法测 DNA ,将大 M 的 DNA 裂 解 为 小 M 的 DNA 片r r

定其纯度和浓度 。 断 ,以这种片断作模板 ,制备的探针能检测样品中

Ξ 收稿日期 1999203217

的任何宿主细胞 DNA 。从图 1 看细胞 DNA 的裂DNA 量 每 斑 点 分 别 为对 照 试 纸 条 上 的

解片断的分子大小在 125bp,500bp 之间 。经紫外 300p g 、100p g 、30p g 、10p g 、3p g , 而定量试纸条按试

(分光光度法测定其纯度符合要求 。 剂盒说明书稀释点样与对照试纸条杂交显色后 图 ) 2按颜色深浅比较 ,表明二者完全一致 ,即达到每

μ毫 升 40g 地 高 辛 标 记 DNA 。则 探 针 总 量 为

800 ng 。

313 地高辛标记探针的检测灵敏度 以纯化定量的

工程细胞 DNA 为标准 ,经系列

稀释点膜杂交显色后 ,结果表明该探针检测 rt2PA

( ) 工程细胞 DNA 的灵敏度为 10p g 图 3B, 其灵敏 度足以达到 W HO 的要求 。

314 样品残余 DNA 检测

rt2PA 样品经去蛋白后 , 残余 DNA 与探 针 杂

() 交 ,结果未出现显色 图 3A,而没加探针的空白对 () 照 即 阴 性 对 照 也 没 显 色 , 说 明 无 假 阳 性 , 每 孔 1Cell 411DNA mar ker 2 、3 、51Cell DNA split ting f ragment

10 mg 样品中残余 DNA 在 10p g 以下 ,如果一个 rt2DNA

PA 剂 量 为 100 mg 那 么 残 余 DNA 也 在 100p g 以 Fig 1 Cell DNA and it s split ting f ragment

下 ,符合 W HO 要求设定超标 。由于 rt2PA 产品是 312 标记探针的定量 从细胞培养液中纯化出来的 ,纯化前经过了过滤 , 除去了培养细胞 ,此外 ,层析纯化产品的过程也能

4 有效除去 DNA,所以样品的细胞残余 DNA 量是 很低的 。

B : Cell DNA A :1 and 2 rt2PA residual DNA 1 10ng 121 1ng

31 100p g 41 10p g 51 1p g ,61 011p g

Fig 3 Sensitivit y of detectio n and measurement of rt2PA residual DNA

4 讨 论

基因工程 产 品 中 微 量 残 余 DNA 的 检 测 受 蛋

白质的干扰较大 ,由于其含量远高于残余 DNA ,检 11Co nt rol test st rip s 5 测结果可能 导 致 假 阳 性, 也 可 能 在 点 样 时 蛋 白 A :300pg B :100p g C :30pg D :10p g E :3pg

质在硝酸纤维膜上与 DNA 竞争使残余 DNA 检测 21Quantificatio n test st rip s 6 结果偏低。而我们的产品对病人使用时每剂量 Fig 2 Dig co nt rol test st rip s and dig quantificatio n test st rip s

2 World Healt h Organizatio n Accep tabilit y of cell subst rates 最大可为 100 mg ,如将样品直接点在膜上的方法 ,

( )1 W HO Reo S er , 1987 ,747 1 for p roductio n of biologicals要求探针检测灵敏度高 ,且上样量也较大 ,蛋白对

?1测定结果的影响就更显著 。为排除蛋白对检测的 3 萨姆布鲁克 J ,弗里奇 E F ,曼尼阿蒂斯 T1 分子克隆实 4 ,7 ,8 影响 ,本文在参考有关文献的基础上采用了 验指南 1 第 2 版 . 金 冬 雁 , 黎 孟 枫 译 1 北 京 : 科 学 出 版 酚2氯仿抽提法除去蛋白 ,而得到残余 DNA 样品的 社 ,19921463方法来检测残余 DNA ,试验结果说明本方法是可 Garnick R L , Ross M J , Mee C P1 Analysis of reco mbi2 4

行的 。 nant biologicals1 In encyclopedia of p harmaceutical tech2

此外 ,本文所用的地高辛标记探针是目前非放 ) ( nology1 Vol11 J 1Swarbrick and J 1C1 Boylan , eds1 , 射性探针中较灵敏的一种 ,其特异性好 ,检测结果 Marcel Dekker , New Yor k ,253

5 李佐刚 ,张占全 ,丁锡申 1 基因工程人白细胞介素 2 中 背景低 ,操作简便快速 。目前在 DNA 检测中不失

微量外源 DNA 的检测 . 中华微 生 物 学 和 免 疫 学 杂 志 , 为一种较好的方法 。

() 1991 ,11 3?197对微量 DNA 的 检 测 , W HO 曾 组 织 不 同 实 验

6 ,7 6 γ 陈宇光 1 人型基因工程干扰素中残余 DNA 的检测 .室用不同方法测定得到不同的结果,所以生物 ( ) 生物化学与生物物理进展 ,1995 ,22 4?355制品中残余 DNA 的检 测 是 一 项 困 难 的 工 作 。本 Robert so n J S , Helt h AB . A collaborative st udy to examine 7 文只是在此方面作了一点探讨 。要得到准确可靠 t he sensitivity and rep roducibilit y of assays for t he detec2 的结果 ,还需要进行进一步的研究 。tio n of DNA in biologicals derived f ro m co ntinuous cell

参 考 文 献 ( ) lines1 B iologicals , 1992 , 20 1?73

Robert so n J S , Helt h AB1 A collaborative st udy o n DNA 8 1 张新咏 ,卢圣栋 ,林缨 1 基因工程药物的质量控制 1 生

quantitatio n in biological p roduct s1 B iologicals , 1995 , ( ) 物工程进展 ,1997 ,17 1?13

( ) 23 3?199

Detection of Residual Cell D NA f rom Recombinant Human Tissue2Type Pla sminogen Activator

L i Shicho ng , Xu Zhaoping , Chen Zhaolie , L iu Ho ng , L in Fuyu

( )B ei j i n g I nsi t i t ue of B iotech nology , B ei j i n g 100071

( ) Abstracts Residual cell DNA of reco mbinant human tissue2t ype plasminogen activato r rt2PAwas detected by nucleic acids dot blot wit h digo xigenin2labed p ro be 1 The met ho d ,w hich DNA ext racted f ro m dep roteinized sample , can avoid t hat p rotein interfere result of detectio n in effect , it s senstivity and result can at tain re2 quir ment of W HO in goo d1

( ) 2t ype plasminogen activato r rt2PA , Digo xigenin2labed p ro be , Residual DNA , Human tissueKey Words

Dot2hybridizatio n

β人转化生长因子1 在大肠杆菌中的分泌表达 〃信息〃

ββ( ) 为了研究双体形式生长因子的原核基因工程 ,尝试了人转化生长因子1 h T GF1基因的分泌表达 。通过缺失突变 ,

ββ构建了能表达具有天然一级结构的 h T GF1 单体蛋白的周质分泌表达质粒 。采用双顺反子表达系统 ,使 T GF1 在周质中

32 σ获得了高效可溶性表达 。研究了改善转运通路对重组蛋白分泌表达的影响 ,发现共表达基因和 dsbA 基因可促进周质中

βββ T GF1 双体分子的形成 ;而共表达 sec E/ Y 基因对 T GF1 的分泌表达则没有明显影响 。通过共表达 kil 基因 ,使 T GF1

在胞外培养基中获分泌表达 ,并在胞外折叠 、组装形成具有生物活性的双体分子 。

( ) 龙建银 ,王会信 ,刘 莉 ,等 1 中国生物化学与分子生物学报 ,1999 ,15 2:179

范文三：首批重组人组织纤溶酶原激活剂国家标准品的研制

首批重组人组织纤溶酶原激活剂国家标准

品的研制

药物丹析杂志

SimultaneousDeterminationofAII..trans’—and

13..cis..RetinoicAcidinHumanSerumbyHPLC

YuZicheng,YaoShuaiandYuRenhai

(InstituteChaicalPharmacology,RuOinHospital,ShanghaiSecond,~dedicalG’ni~rsity,sk…gh200025

AbstractObjective!TodevelopanisocraficHPLCforthesimultaneousdeterminationofall—trans,and13

一cs—retinoicacid(ATRA,13一

cRA)jnhumanserum.Methods:Theserumsample(1mL)wasex

tractedwith5mLofetherfortwice.Theextractwasanalyzedonan~d3ondapakcIB(3.9mm×300mil1)col—

umnwithamobilephaseconsistingof85Vols.ofmethanoland15Vols.ofNHdAcbuffer(pH6.0)8t22?

Theflowratewas0.8mL?minTheretinoidsweredetectedat340nmandquantitatedbyjnternalstandard

method.DMAHwasusedasaninternalstandardResults:Thelinearityofmethodwasintherangeof0.8to

l120g?L一forATRAand0.82tOl312g’L一foI13一eRA.Thelimitofdeterminationwas0.6g’L

inserumforbothATRAand13cRA.Averagerecoverieswere98.86%,105.2%forATRA,101.6%,

dayandbetween—daypercisionofdeterminatio 101.8%for13cRAWchin—

nwere0.84%,5.5%for

ATRAand1.4%,5.7%forl3cRA.Conclusion:ThismethodiSsensitive,accurateandgoodenoug

hto

beutilizedfortheinvestigationofthedinicalpharmacokinetiesofATRA.

KeywordsalItrans—retinoicacid,13一cs—retinoicacid.serumdrugconcentration,HPLC

/

批重组人组织纤溶酶原激活剂国家标准一首批重组人组织纤溶酶原激活剂国家标准品的研制

/

杨化新张培孙磊徐康森———————一,—————,

(中目药品生物制品捡定所北京100050)

摘要目的:建立rhtPA效价测定用国家标准品.方涪:用uv法测定蛋白含量;HPSEC法分析纯度;体外

凝块裂解气泡上升法谢定效价;用t—PA国际标准品(86/670)对国家标准品的效价进行标定结果:标准品

的效价为每支30000IU,RSD=334%(n=10)结论:建立的rht—PA国家

标准品可用于国内同类药物的研

究开发和进.药

关键词重组人组织纤溶酶原激活剂纯度效价标准品

一一

,—,

重组人组织纤溶酶原激活剂(rhtPA)是治

疗血栓栓塞性疾病的新药,它与天然人组织纤溶酶

原激活剂(t—PA)具有相同的功效,尤其是治疗

急性心肌梗塞见效快.国外已有产品上市,国内正

处在研究开发阶段,并有单位准备申报新药.

t—PA第1次和第2次国际标准品分别于1984

年和1987年颁发,其t—PA均来源于melanoma

细胞衍生物【.引.美国于1990年建立rhI—PA国

家标准品J,欧洲亦于1998年建立了rht—PA的

欧洲药典标准品.而我国tPA标准品尚属空

白.为满足tPA产品的研究开发及进口检验的

需求,并与国际接轨,我们研制了rhtPA国家标

准品.

l仪器与材料

rhtPA原料:由德国BoeningerLingdheim

公司提供,为冻干品.t—PA标准品:第2次国际

标准品(86/670),每支850IU.人凝血酶(每瓶

1000单位),人纤维蛋白原(每瓶500mg),人纤

维蛋白溶酶原(每瓶1.2mg)均为Calbiochem

NovabiochemCorporation产品.

岛津LC—lOADHPLC系统;El立uv3210

分光光度计.玻璃恒温水浴,玻璃试管(12mm×

100mm),冰浴.其它试剂均为国产分析纯.

2实验方法

2.1HPLC法采用TSK30OOSw(7.5mm×

600mm)色谱柱;流动相为2.76%磷酸二氢钠一

0.1%SDS水溶液(pH6.8);流速0.5mL?min;

检测波长为210rllyl;室温下测定非还原性rht—PA

溶液(1mg?mL—rht—PA水溶液)和还原性rht

—

PA溶液(取1mg?mL水溶液与0.02mol?LI1

二硫苏糖醇流动相溶液3mL,混匀,置8O?水浴

3,5min,放冷),进样量为5O.

2.2蛋白含量测定参照文献[4].

2.3效价测定

2.3.1溶液配制

磷酸盐缓冲液:取磷酸二氢钠(含2H2O)

1.79g,磷酸氢二钠7.10g,叠氮化钠0.20g,吐

温一8O0.1g,加水至1000mL.

人凝血酶溶液:取人凝血酶,加磷酸盐缓冲液

制成每1mL中含33单位的溶液.

人纤维蛋白原溶液:取人纤维蛋白原,加磷酸

盐缓冲液制成每1mL含可凝蛋白2nag的溶液.

人血纤维蛋白溶酶原溶液:取人血纤维蛋白溶

酶原,加磷酸盐缓冲液制成每1mL含1nag的溶

液.

混合溶液:临用前取等体积的标准品溶液或供

试品溶液与人凝血酶溶液,混匀,置冰浴中.

标准品溶液的制备:取t—PA国际标准品用

磷酸盐缓冲液制成浓度分别为每1mL含850,

425,213,107,54,271U的溶液

供试品溶液的制备:取待标定的样品同标准溶

液配制.

2.3.2测定法取试管6支,加人血纤维蛋白溶

酶原溶液2O与人纤维蛋白溶液1mL,混匀,

置冰浴中,依次加不同单位的混合溶液200L,

立即摇匀并置(37?0.5)?水浴中,分别计时.反

应系统应在30s内凝结,当凝块内所有气泡上升

至表面时作为反应终点,计时.以rht—PA浓度的

对数为横坐标,反应时间(s)的对数为纵坐标,

进行线性回归,其相关系数不得低于一0.9900.

同法测定供试品溶液.

3结果与讨论

3.1标准品的原料选择原料的选择是制备标准

品的关键,我们选择了国外的3批rht—PA为原

料,对其纯度,蛋白含量及效价进行分析.

3.1.1HPLC纯度分析rht—PA是由真核细胞

(CHO)表达的一种高分子量糖蛋白.其产品的纯

度,除了比活力外,还要检查单体和单链L4.rht

—

PA是一种含有多个二硫键的单链分子(单体),

但是在其第275,276氨基酸残基之间的肽键容易

断开,而二硫键未被破坏时,容易形成含切口的分

子(亦称双链).在非还原条件下,由于链内二硫

键的存在,单,双链分子的分子量相原(B)rht—PA的HPSEC图谱

1rht—PA单体2精氟酸3单链rht—PA

4.双链rht—PA5.二硫苏糖醇

3.1.2比活力效价单位数与蛋白含量的比值为

比活力(IU?mg).3批rht—PA每瓶蛋白含量

分别为53.0,52.0和53.5nag;每瓶效价分别为

27.8×10.29.0×10和33.3×10.1U;比活力分

别为5.3×10.5.6×10和5.7×10IU?mg,=

rht—PA原料的比活力符合要求(不少于5.0×10

IU?mg一)[?.

3.2标准品的制备

3.2.1配方的选择配方的选择关系到标准品的

稳定性和标准品与供试品的量效曲线是否平行本

文选用了与t—PA国际标准品一致的配方,其中

人血清白蛋白(HsA)具有长期稳定的作用,精氨

酸在达到一定浓度时,可促进溶解也具有稳定作

用;吐温一8O具有促溶作用,磷酸盐缓冲液(pH

7.3)最适于t—PA.

3.2.2分装和熔封取rht—PA原料,加适量水

溶解后,再用含白蛋白的精氨酸磷酸缓冲液制成约

23O药物分析杂志

60000IU?mL的溶液,在恒温,避光,无微生

物及其它化学物质污染处分装,每支0.5mL,经

冷冻干燥后,熔封,于一20?保存.

3.3标准品的标定

3.3.1方法的选择本文所用体外凝块裂解气泡

上升法为国际上公认的方法,是t—PA国际标准

品标定,USP和EP均采用的效价测定法,此法要

求标准品与样品曲线平行,相关系数在一0.9900

至一1.0000;重复试验的RSD不得过10%.

3.3.2均一性试验随机抽取冻干后待标品10

支,每支用磷酸盐缓冲液溶解并稀释至5.0mL,

取1.25mL置25mL量瓶中,加磷酸盐缓冲溶液

至刻度按上述效价测定方法测定,10支平均凝

块溶解时间为389S,RSD=1.75%.

3.3效价单位的标定

按上述效价测定方法,用t—PA国际标准品

标定待标品的效价单位数,国际标准品和待标品的

线性回归方程分别为:

Y:一0.417X一3.623r=一0.9988

Y=一0.413X一3.618r:一0.9999

标准品与待标品的量效曲线平行.

标定了10支rht—PA待标品,每支的效价分

别为29650,31100,31450,32050,30400,

31050,31150,30200.32000和28800IU,平

均为每支30785IU(RSD:3.34%).由此可见,

由测定结果确定国家标准品的效价为每支30000

IU.

3.4稳定性用费休氏库仑计方法-测定国家标

准品的水分为346%(n=3,RSD=3.0%).比

较冻干前后效价单位,结果基本不变,说明该配方

在冻干过程中有保护t—PA活性的作用.长期稳

定性还有待于考察

3.5小结首批rht—PA国家标准品均一稳

定,其标定结果准确可靠,该标准品的建立解决了

进口检验,新药审批以及溶血栓类药物质控对t—

PA标准品的需求问题.

参考文献

1GMfneyPJCurtisADAcollaborativestudyo1ppinter—

nationalst~dardforti~uepl~ninogenactivator(1一PA)

Th,槲6H~most.1985.53:134

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A~llahorativestudytoestabbshtheSee-

ondInternationalSraadardfortissueplasminogenactix~cor(t—

CA)ThrombHaemost.1987.59:1085

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PA)ThrobHaemost.1990.63: plasmincge~~tivator(t—

139

4USPXX?49

5EPSupplment1999248

6中国药典I995年腹1998年增补本136

(本支于1999年8月26日啦到)

EstablishmentandStandardizationoftheNationalReferenceStandard

ofRecombinantHumanTissuePlasminogenActivator

YangHuaxin,ZhangPeipei,SunLeiandXuKangsen

Natlo~lInstitutefortheCont.10fPharraaceuticalandBiologicalProducts,Be

~jing100050

AbstractObjeetive:Toestablishanationa1referencestandardforrht—PApot

encyMethods:Theprotein

cx)ntent.thepurityandthepotencyofrht—PApreparationwereanalyzedbyUV,HPSECandthedotlysis

assay.respectively.usingtheSecondInternationalStandardfort—PAtOcali

bratenationalreferencestandard

ofrht—PA.Results:Thefirstnationalreferencestandardforrht—PAwasesta

blished,withanassignedpo—

tencyof30000internationa1units(IU)eachampouleConclusion:TheNationa1referencestandardforrht—

PAhasbeenestablishedItcanbeusefu1forthedevelopmentofanalogousdrugsprcduceddomesticallyandthe

qualityCOntrolofimportmedicines.

Keywordsrht—PA,purity,potency,referencestandard

范文四：【doc】重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体的表达、复性与分离纯化

重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体的表

达、复性与分离纯化

重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体的表达,复性与分离纯化

冯长根,陈嫒,任启生,宋新荣(1.北京理工大学新医药开发研究中心,北京100081;2.

北京江中泽生科技有限责任公司,北京

100050)

摘要:目的获得具有高纯度,高生物活性的重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体

(瑞替普酶,reteplase.r-PA).方法reteplase

基因克隆到表达质粒pjZ-100中,转化EscherichiacoliBI21(DE3).在0.05mmol?L异

丙基硫代D半乳糖苷(IP)诱导下获

得高效表达,表达产物通过脉冲稀释法复性,复性后的蛋白质用Eq]Sepharose4B亲

和色谱纯化.结果表达产物占茵体总蛋

白质的20%,脉冲稀释法复性后复性收率为28%,经纯化后纯度达96%以上,比活

为580000IU?nag,.结论建立了reteplase

表达,复性与纯化工艺,以此工艺可获得高活性高纯度的reteplase.

关键词:重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体;表达;复性;纯化

中图分类号:Q814文献标识码:A文章编号:1001—2494(2034)07—0550—04

StudyOnexpression,renaturafionandpurificationofmteplase FENGChang—gen,CHENMan,RENQi—sheng:,SONGXin—

mn(1.Research&DevelopmentCentreforNewMedicine,& /nst/tnteofTechno/ogy,&100081,China;2.&J/angzhongZeshengScheneeandT

echno/ogyCo.,,~/j/,,g100050,Ch/na)

ABSTRACT:OKW_Lq'IVEToobtaintherecombinanthumantissu~typeplasminogenacti

vatormutant(reteplase,r-PA)withhighpurityand highspecificactivity.METHODSReteplase.sequencewasclonedintopJZ一

100expressionvector.BeinginducedbyWIG.reteplasewas highlyexpressedinEscherwh/acoliBI21(DE3).Theactivityofexpressedproteinwasrecove

redbystep-wi~dilutioninvitro.Thereteplase Waspurifiedbyaffinitychromatography.RESULTSExpressedreteplaseconstitutedmoret

han20%oftotalbacterialprotein.Theactivity recoverybystep-wisedilutionWas28%.Afterpurification.thepurityofmteplaseWasabove

96%anditsspecificactivityWas580000IU'

nag

一.CONCLUSIONThemethodofmteplaseexpression.renaturationandpurificationWase

stablished.TheprocessCanbeaschemetoob—

tainreteplasewithhiighpurityandthehighactivityfromE.coli. KEYWORDS:mteplase;expression;renaturation;purification 自1980年Dewood等…用链激酶静脉滴注治疗急性心肌

梗死(acutemyocardialinfarction,AMI)引起的血栓并发症以

来,溶栓疗法已成为治疗AMI的主要手段之一.链激酶为第

一

代溶栓剂,纤溶效果较好,但易导致全身纤溶状态引起出

血的不良反应,且有免疫原性,因此新型溶栓剂的研究成为

热点.重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(瑞替普酶,re

teplase,r-PA)属于第三代溶栓剂,是第二代溶栓剂组织型纤

溶酶原激活剂(t-PA)的改构体,依次由t-PA的1—3,176,527

位氨基酸组成,含有l8个半胱氨酸,形成9对二硫键,Mr约

39000J.和天然t-PA相比,r-PA具有体内半衰期长,给药方

式简单,溶栓速度快,血管再通率高,使用剂量低等优点,被

认为是一种更为安全可靠的溶栓药-41.Reteplase在大肠杆

菌中获得高效表达,以不溶性的包涵体形式存在,通过体外

折叠恢复生物功能,并利用亲和色谱分离获得高纯度高活性

的reteplase.本文报道了reteplase在大肠杆菌中的表达,体外

复性和分离纯化研究.

l材料

1.1质粒与菌株

大肠杆菌菌株BI21(DE3),质粒pJZ100由北京江中泽 生科技有限责任公司保存,重组质粒pJZ/r-PA由北京江中泽 生科技有限责任公司构建.

lI2仪器与试剂

电转移电泳槽(北京六一仪器厂);Hilo色谱系统

(Pharmacia公司);血纤蛋白原,血纤蛋白溶酶原,凝血酶,重 组t.PA标准品(中国药品生物制品检定所);异丙基硫代. D.半乳糖苷(WIG)(Inacol公司);氨苄青霉素(Sit~a公司);2. 巯基乙醇(2ME,nul(公司);蛋白胨,酵母抽提物(OXOID公 司);氧化型谷胱甘肽(GSSG),还原型谷胱甘肽(GSH,华美生 物工程公司);重组刺桐胰蛋白酶抑制剂(erylhrinatrypsinin.

hibitor,El3,北京江中泽生科技有限责任公司);t-PA单克隆抗 体IgG(Santa公司);羊抗兔IgG(HRP,北京中山生物技术有限 公司);Q-SepharoseFF和CNBr活化Sepharose4B(Pharmacia公 司);其他试剂均为国产分析纯.

2方法

2.1工程菌的培养及诱导表达

将转化了重组质粒pJZ/r-PA的BI21(DE3)以1%比例接 作者简介:冯长根,男,教授,博士生导师Tel:(010)68912764E-mail:egfeng@wuma.COIn.cn

'

550'ChinnJ,2004July,Vo1.39No.72O04年7月第39卷第7

种于I|R培养液(含100mg?L氨苄青霉素),37~C恒温振荡 培养过夜,然后将过夜培养物以1:50比例稀释,加入含有氨 苄青霉素的IJB培养液中继续培养3h,再加入WIG至终浓 度为0.05mmol?L,,诱导表达4h.离心(5000r?min一,5 min),收集菌体.

2.2包涵体的获得与变性

以l0mL?g菌体的比例加入细菌裂解缓冲液(50mmol? Ls,1mmol?L,EDTA,0.1%2一巯基乙醇,0.1%TfintonX. 100,pH8.5),每克菌体加入50mmol?L苯甲基磺酰氟

(PMsF)8悬浮沉淀,超声波细胞粉碎机超声破碎,离心

(8000r?min,,4~C)收集包涵体沉淀.沉淀分别用10%乙醇 和洗涤液(50mmol?L,Tris,1mmol?L,EDTA,0.1%Tfinton x.100,pH8.5)反复洗涤,离心收集的沉淀用溶解液(8mol? L脲,20mmol?L—Tris?HCI,pH8.5,1mmol?LEDTA,1%2.

巯基乙醇)充分溶解,室温放置2h,离心去除不溶物,得到变 性的包涵体溶液.

2.3重组蛋白的复性

包涵体溶液在0.05tool?Ls—HCI,8tool?L脲,0.05 tool?L,GSSC,0.5tool?L,L-Arg,pH9.3条件下,2^5?保温8 h,用稀释液(0.05tool?Ls—HCI,8tool?L脲,pH9.3)稀释

至蛋白质浓度为0.6mg?mL,,将稀释后的溶液分成3等份, 以1:10的比例,间隔120min,滴加至折叠缓冲液(0.7tool? LL.Arg,pH8.6,lmmol?L,GSH,1mmol?LEDTA)中,室

温静止24h,用纤维蛋白.平板法测定活性.

2.4ETI.Sepharose4B亲和填料的制备和mteplase的纯化 称取CNBr活化Sepharose4B冻干粉2g,加入适量1mmol ?

LHCI溶胀并反复抽洗,再用0.1tool?L,NaHC03,0.5tool? L..NaCl,pH8.3洗涤,将洗涤好的活化胶与纯化的重组ETI 蛋白40rng在4?下偶联过夜,用适量0.1tool?L,NaHC03, 0.5mol?L,NaCl,pH8.3洗去过剩配基,并用0.1tool?Ls. HCI,pH8.0封闭剩余活化基团,制成ETI.~pharose4B亲和填 料.取ETI.Sepharose4B5mIJ,用缓冲液(20mmol?Ls. HCI,0.1%聚山梨酯80,pH8.0)平衡,真空除气泡装柱.

复性液经截留Mr为10.0Xl的膜超滤浓缩,用缓冲液

稀释至200?mL,,量取100mL,以0.5mI?min流速上 ETI.Sepharose4B柱,用缓冲液平衡至基线;再用20mmol?L Tfis-HCl,0.0l%聚山梨酯80,0.4tool?L—NaCl,pH7.4洗柱, 除去杂蛋白;最后用20mmol?L,Tris.HCI,0.O1%Tween80,

0.4mol?L—NaCl,1.6tool?L,KSCN,pH7.4溶液洗脱目的蛋 白.用SDS-PAGE检测洗脱的蛋白质峰,经灰度扫描仪扫描 凝胶,确定纯化后~teplase的纯度.

2.5生物活性测定方法

纤维蛋白.琼脂糖平板测定法:配制平板用溶液均为TBS (pH7.4).量取血纤蛋白原(4.2rng?mL)溶液l2.7mL,琼 脂糖溶液(0.8%)l3.4mL,血纤蛋白溶酶原(1酪蛋白单位? mL)溶液0.67n1L,凝血酶(70BP单位?mL)0.067mL.混 匀,倒入直径90mm的平皿中,凝固后打孑L使用. 用微量移液器分别吸取不同比活性的t-PA标准品l0 2004年7月第39卷第7

,滴于孔中,平皿加盖后,于37~C温育l8h.用游标卡尺测 量溶圈相互垂直的两直径,以两直径乘积的对数为纵坐标, 以对照品(t.PA)单位活性的对数(1ogIU?mL)为横坐标,作 标准曲线.同样,取待测定的reteplase样品依上述方法检测, 将测得数据代入标准曲线方程,求出相应的单位活性(Iu? mL),再根据样品的蛋白含量,进而求得比活性(Iu?rng). 2.6蛋白质浓度测定方法

参照文献方法进行.BSA为标准蛋白作标准曲线. 2.7蛋白质纯度测定方法

参考文献方法经SDS-PAGE进行检测,再由灰度扫描 仪测出r-PA占菌体总蛋白的百分含量,计算表达率. 2.8蛋白质免疫印迹(Westernblot)分析

将经SDS-PACE后的重组蛋白转移至硝酸纤维素膜上, 转移后,凝胶做银染色,硝酸纤维素膜用0.0lmol?LPBS-

3%BSA(pH7.4)封闭过夜.封闭后的膜加入t—PA单克隆抗 体I,室温反应2h.洗涤后膜与羊抗兔I(HRP)作用2h, 洗涤.洗涤后膜浸入二氨基联苯胺(DAB)中显色. 3结果

3.1工程菌的培养及诱导表达

3.1.1诱导时机对工程菌生长和表达的影响将菌种接种 I|R培养基,分别于37~C培养2,5h,加入IP诱导表达3h, 观察培养时间对工程菌生长和表达的影响,确定最佳诱导时 机.结果表明,当培养时间在2,3h时,A锄在2,3之间 时诱导,表达率最高.

3.1.2工程菌诱导表达的最佳时间37?摇瓶培养3h后, 加入WrG至0.1mmol?L,,分别诱导表达1,2,3,4,5h,观察 不同诱导时间对表达的影响.结果表明,目的蛋白表达率从 诱导4h后不再增大,随着诱导时间的延长呈下降趋势,因此 将诱导表达时间定在4h比较合适.

,分别加 3.1.3IIrrG浓度的确定工程菌株摇瓶培养3h后

入IIrrG至不同终浓度,继续振荡培养4h后收菌.实验结果 表明,IlrrG浓度为0.08,0.12mmol?L时r-PA的表达率最 高,大于0.2mmol?L及小于0.04mmol?L表达率均明显下 降.随着IIrrG加入量的增高,菌体密度降低,说明IIrrG对工 程菌的生长有不良反应.为了兼顾菌体得率和重组蛋白质 的表达量,选择0.05mmol?L做为诱导浓度.

3.2包涵体的获得与变性

含有重组质粒的工程菌经IIrrG诱导表达,每lL发酵液 中约可得到20g菌体.SDS-PAGE检测分析诱导表达产物,在 Mr39000处有一蛋白质条带.经凝胶扫描分析,该蛋白占菌 体可溶性总蛋白的2o%.菌体经超声破碎后离心,上清液和 沉淀分别进行电泳,表达产物主要集中在沉淀中,说明重组 蛋白以包涵体的形式存在.包涵体经提取分离和反复洗涤,

蛋白纯度达70%以上,见图1.

3.3重组蛋白的复性

变性包涵体蛋白,经脉冲稀释法复性,复性产物用纤维 蛋白.琼脂糖平板法测活,比活性为l4万,l5万IU?mg,,复 性率约28%,30%.

ChinPharml,2004如,Vo1.39No.7'551'

I1J

图1重与^蛆虹玎酶博擞岳殴津时丧过SP1,I:l: l琶坷图

I也两14::2一l盲仆:3一*显标f.J.4一或体

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Illuh……IhlilI.T,ki2一FJz'."rPAl?I"21IIfIG':]rInl?ur ,一f4一『l)?I-IBI2I11t~3?

3.4『1-Sephm~4B录和垣}畚

制箭庶和Jll(料『I匀雕堆为蕈壹I1.Mr较大圳 备填料过程{I.量过高.易活r点之形成.怍

障碑,造成亲相I},结台能力碱少,基慨时会导致亲和牲 肿存艟】降为J提高申位填料埘teleI~lase的吸跗辱:. 蔌体与刚单厦.Jj靛f比删为IrI蔽伴州脯i5—8n属 乖实验似门j57"-m_.n0肇浓崖bl备亲和填书f 3.5r】一t@phr,l411亲和邑谱纯咆【叩Ij- f订【:述制箭r19H1一pl-n一4B亲l啊1填料纯化r~letolase结 果见丧l-步纯化性rel~I—Ia-的比衙提高J406倍.比活 达刊58万儿__mg.回收宰为9l7付经SI3t~-PA(;E分析纯 化样丧现由一条带.纯度96%1.,图2佯l透

析脱盐.冻r.一加1:保存

表1ETI-,%~ph)4B枉色碧纯fIAlla

Tab1Purifi~:atiort?fph脚[1,nmni1v"m~graphy0n兀一 Ia『I411

3.6蛋白埔生接审适析

F现柱尚无市售罨.fli,pl肥单范隆抗体,而重组— tepla~-有J1一?{?的K2ix和蛋If{每.1?l=i此,抗K2和 蛋n酶区晌执体.该对reh?pl~se也有特异忡,率宴验遣川 了抗rel{~tll&-ir,中K2的抗原陡定簇位点自口特异抗体,检洲 tpfB纳抗原特井.;免症印舟析表剐.纯化样品可'j 抗K2医f靠体发生特异胜反应,|兑[1月吨化样品县有预期f由 抗原.3

4讨论

向J1.产高衍竹,高纯度的Il,鹿用于临床首先 面越堆州[:程的段使retep]a.~e大肠补菌中莸得表达表 达产物尤活性的包懒体彤式存在,必须经过体外复胜才能 552rln,.2?.|.‰f39,7

图2?ph;?4H纯也aI{三陌

I一?I;~if样|j2仆f鲭标篮H:1一纯化衍样Ij Fig2SI):4-pA(rIa,Mysi~rIpufifi,~llwJ『一Sepha~ 4B

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图3重组蛋刍觅疫印记好析翟谱

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篮II晒印连jr析

Fig3WvglemIJ,Hnahsofrm11)Ir哪IpJ~leJri I—l,l?目:2一.1pI.j一[e*4JJL~-wl邢14,itarul 慨筻叶三柳功能.由frewpla.~禽有9埘二硫键,Jf-L1.疏水性 较强.采用常垌『『勺稀释复惟皓进行复性.复收率较慨.一 般8性,10%透折复惟丰H叫较好.但利于耵I业化牛产, 脉稀释法屉一种比较理想们复性式.通过脉中稀释,可 "使篷白在较低浓度下通过易壤集的早期巾问件阶段,减少 聚集悼的形成.使复惟牧率得到提高本实验采州脉冲稀 释法州变萤门进行复忭可以使复性收率达到28%一 3O错,

为了得到高纯度n々fepIa,FH具有特异性吸附Iefd 能力的和填举I是最佧选择研1届丝氯酸蛋酶抑制剂. terda是精氰酸特性的丝氨酸坦白酶所能被田l作 ?值点1的精氰酸识刑.利用硎为配基,制备亲研填 料.分离纯化retepla.~.7kr以方便快速地完成对重组蛋白的分 (F转第557更1

删年7闩第39卷幕7

?

,矗????雪l

二一一一

I-

人吸收,氯霉素在276nnl处有最大吸收.

2.1.2标准液的配制精密称取甲硝唑对照品和氯霉素对 照品各125mg,分别置于100rnL量瓶中,用蒸馏水稀释至刻 度,作为贮备液.再精密吸取上述两贮备液各5rnL分别置 50rnL量瓶中,用0.05mol?L硫酸稀释至刻度,再从中分别

吸取6,7,8,9,10m1分别置于50rnL量瓶中,用0.05mol?L 硫酸稀释至刻度在uv一160A紫外分光光度计上,对上述 l0个纯组分在226,300nnl之间,I刮隔2nnl,分别测其吸光 度,并计算上E交多项式系数.

2.1.3标准混合物的配制以处方量的?20%浓度范围问 隔10%,按正交设计表,精密量取两贮备液适量,配制成l6 个不同浓度的校正样品液.以上各溶液以0.05mol?L硫酸 液为空白,在UV一160A紫外分光光度计上,在226,300一 之间,间隔21,1/n测其吸光度,并计算正交多项式系数,再用 于因子分析法,测其二组分的回收率.0F一.rFA法的平均同 收率和RSD分别为甲硝唑:99.85%,0.96%;氯霉素: 100.01%,1.00%.

2.2线性范围考察

甲硝唑和氯霉素的线性浓度范围分别为:l0,30/lg? mI(r=0.9991)和l0,30/lg?m1(r=0.9996). 2.3稳定性考察

对两个纯组分溶液及相应的混合溶液配制后立即测定 并每间隔一定时间进行测定,结果表明,各溶液至少在6h内 稳定不变.

2.4加和性考察

按处方比例配制成含一定浓度各纯组分溶液及相应浓 度的混合物溶液,在某些具有代表性的波长点,测定各纯组 分的吸光度及混合物相应的吸光度,比较两者数值非常接 近,RSD均小于0.52%,表明体系加和性良好.

2.5样品测定

按上述方法配制成3份不同浓度的模拟样品(相当于取 样品液lrnL,置50rnL量瓶中,用0.05mol?I硫酸稀释至刻 度)作为待测样品,在UV一160A紫外分光光度计上,在226, 300nm之间,间隔2nnl测其吸光度,并计算正交多项式系

数,再用于因子分析法,计算待测样品中各组分标示量的百

分含量.样品测定结果见表l.

表1复方甲硝唑注射液测定结果.%,n=6

3讨论

把正交函数应用于全光谱作为一种信号变换技术可不

必考虑中间波长等参数的选定,但求多项式系数选取的测定

波长点数目(N)和正交多项式次数()随组分光谱形状而定,

可参阅文献.

作者以经典的因子分析法和经褶积变换后用于因子分

析法,结果满意,即经正交变换后用于多元校正方法进行相

关性强的混合体系对样品进行测定,以相对标准偏差和回收

率来评价方法的可靠性,结果令人满意.

参考文献

[1]马波,刘立行.多波长线性回归.导数吸光光度法同时测定三

组分混合物[J].理化检验.化学手册,1994,30(6):337.

[2]刘萍,苏跃增.因子分析.导数光度法同时测定苯酚,间苯二

酚,对苯二酚混合体系的比较[J].分析实验室,1999,l8(1):

5O.

[3]吴庆生,】'亚平.一阶紫外导数光谱PLS法直接同时测定硝酸

银和亚硝酸银[J].分析测试,1995,14(3):1.

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(收稿日期:2003—12-28)

(七接第552页)

离,得到高纯度的mteplase.但由于洗脱液中含有高浓度的

盐,必须通过脱盐处理,才能应用于临床.用透析方法脱盐,

由于操作不便和热源不易控制等原因,只适合小量制备.如

需进行生产规模的脱盐处理,用凝胶柱色谱是比较好的方

式,但蛋白质的回收率会有一定程度的降低.

参考文献

[1]DewoodMA,SporesJ,NotskeR,eta1.Prevalenceoftotalcoronar)~ occlusionduringthee~rlyhoursoftransmuralmyocarbalrafarction [J].NEnglJMed,1980,303:897.

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与生物活性关系[J].生物技术通讯,2002,3:222.

(收稿日期:2003.11一l4)

Chin?J.2004July.Vo1.39No.7?557?

范文五：铭复乐：注射用重组人TNK组织型纤溶酶原激活剂（rhTNK

一针溶栓，分秒必争！

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