苹果酸结构及溶剂效应的研究

范文一：苹果酸结构及溶剂效应的研究

苹果酸结构及溶剂效应的研究

摘要

苹果酸是一种非常重要的有机酸,广泛地应用于化工、食品及医药工业等领。 .苹果酸广泛存在于动物、植物和微生物细胞等各种生物体中,是三羧酸循环的

重要一员,在生物体中具有重要的生理功能。。苹果酸呈右旋不易为人体代谢,

吸入或吞咽对人体有害,作为手性合成的手性源,可以合成许多重要有机化合物,

在医药、精细化学品等领域用途广泛。

通过/.

对.苹果酸和.苹果酸不同构型的优化,获得了气

态中种。苹果酸和种.苹果酸稳定构型。通过/.

分别

对两种手性苹果酸最稳定构型进行电荷集居分析、轨道分析和振动频率计算,绘

制两者在气态中的红外光谱图。通过热力学分析和振动频率分析,发现气态下两

种手性苹果酸热力学性质相近,振动频率非常相似。

采用密度泛函理论.极化电介质模型模型在水平获

得水溶液种.苹果酸稳定构型与种.苹果酸过渡态构型,种一苹果酸稳

定构型与种.苹果酸过渡态构型,并对其最稳定构型进行电荷分布、振动频

率分析。发现两种手性苹果酸在水溶液的性质有差别,而且对苹果酸分子的振动

出现蓝移。水溶液中两种手性苹果酸离子形式的前线轨道能量差均比其中性分子

形式低,即水溶液中苹果酸离子更活泼。

采用在.水平对两种手性苹果酸在甲醇、乙醇、乙腈、丙

酮、氯仿、苯、四氢呋喃和正己烷等有机溶剂体系中性质进行了研究,获得了苹

果酸在这些有机溶剂体系中的溶剂化自由能、偶极矩以及前线轨道能量差。结果

表明,.苹果酸在有机溶剂中的前线轨道能量差一般比水溶液中未解离的苹果酸

分子低,但高于水溶液中苹果酸的离子形式,而.苹果酸在有机溶剂中不如在

水中活泼,即苹果酸分子在不同的溶剂体系中其溶解性、化学活性均存在较

大差

别。

本文通过从头计算得到苹果酸分子的某些性质,对苹果酸的性质、分子设计

和合成具有一定的指导和理论意义。

关键词:苹果酸;密度泛函理论;分子结构;溶剂效应;极化电介质模型,

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摘要??.??.

第一章文献综述.

.苹果酸.

..苹果酸?

..苹果酸的应用?

..苹果酸生产方法

.主要计算方法概述?.. ..

.方:法.

..半经验分子轨道法..电子相关及其计算理论

..密度泛函理论?

.溶剂效应??.

..溶剂效应

..溶剂效应连续模型?.

.苹果酸及其衍生物的理论研究?一 .研究的主要内容第二章苹果酸的结构研究?.

.引言?

.计算方法.苹果酸几何构型.. .苹果酸几何构型..

.苹果酸几何构型?一

..两种手性苹果酸性质比较?. .小结?

第三章苹果酸溶剂效应研究.

.引言?

.计算原理与方法.苹果酸溶剂效应研究 ..

.苹果酸溶剂化效应研究..

.苹果酸溶剂化效应研究?.. ..两种手性苹果酸在水溶液中性质比较??. ..苹果酸在有机溶剂中的溶剂化研究.. .小结?

第四章结论与展望?一

.结论?

.展望?

参考文献攻读硕士学位期间成果一致谢?一硕士学位论文

第一章文献综述

.苹果酸

..苹果酸

苹果酸又名羟基丁二酸、羟基琥珀酸或.羟基乙烷二羧酸,俗名

,化学名

?,分子式为,

分子量为.。分子结构中含有一个不对称的碳原子,因而具有旋光性,即存

在一苹果酸和一苹果酸两个手性对映体。.苹果酸、.苹果酸、.苹果酸的

登记号分别为..、..和..。

苹果酸是一种非常重要的有机酸,广泛地应用于化工、食品及医药工业等领

域?】。.苹果酸广泛存在于动物、植物和微生物细胞等各种生物体中,是生物

体内基本的氧化代谢循环一三羧酸循环的重要一员,也是乙醛酸循环中的一员,

还是固定反应的产物岭,在生物体中具有重要的生理功能。一苹果酸呈右旋

不易为人体代谢,吸入或吞咽对人体有害,作为手性合成的手性源,可以合成许

多重要有机化合物;等量的一苹果酸和一苹果酸的混合物为外消旋体一苹果

酸,在化学工业方面用途广泛。

..苹果酸的应用

由于.苹果酸在生物体中具有重要的生理功能,.苹果酸是非生理活性的

【】,两者在应用方面差别较大。

天然果汁所含的有机酸中,.苹果酸的含量仅次子柠檬酸,苹果、樱桃、葡

萄、李子等水果中含有较丰富的苹果酸,是天然果酸的重要组成部分,并提供特

别风味。苹果酸与柠檬酸、酒石酸以::.的比例配合使用可模拟天然果实

的酸味特征,使甜酸口感显得更加自然、丰富、谐调。苹果酸的呈味作用明

显,

酸味持久柔和、风味别致、解渴爽口、性质稳定,是优良的酸味剂和调酸剂,于

年在美国食品和药品监督管理局登记,是国际上公认的安全、无

毒无害的食用有机酸【】。在食品方面,苹果酸还可作为保鲜剂、软饮料的风味固

定剂、天然果汁色泽和果胶的萃取助剂、配制各种防腐和调味等复配添加剂卜】。

此外,.苹果酸在抗体力疲劳【、治疗心脏病【引、保护肝脏【、降低药物对

肾脏和骨髓细胞的毒害【川】、以及对学习记忆的正性调节【.等方面有着显著的第一章文献综述

作用。它具有重要的生理功能,食药两用,对加强机体健康有所裨益。

生命体必须借助于肝脏分泌的消旋酶处理.苹果酸,并由肾脏的..羟羧.

细胞色素氧化还原酶将.苹果酸转化为.苹果酸,方能进入代谢循环。因此

一苹果酸可生化代谢性不如.苹果酸,在食品及医药上的应用受到限制,婴幼

儿和肝、肾疾病患者不宜食用】。年美国食品与药品管理局规定外消旋的

.苹果酸不能用于婴儿食品添加剂。

.苹果酸是制药工业的重要手性原料,可用于合成泛酸、.内酞胺类抗生素、

信息素和生物碱等手性药物;可作为拆分试剂以非对映体盐的形式拆分外消旋

体,如:用来拆分一些神经安定药和肌肉放松药【】等;可在不对称合成中作为配

体手性催化剂来提高反应的立体特异性,以提高反应产物的光学纯度。

除了在食品和医药领域有较广泛的应用外,苹果酸在日化化工方面也有广泛

的应用。苹果酸具有抗氧化作用和较强的螯合作用,可作为印染工业的保色剂和

增效剂、焊锡助焊剂、废气脱硫剂、电镀合剂、各种金属容器、精密机械的除锈

剂、油漆添加剂。由于苹果酸具有特定的物化性能,在工业上可用于生产聚酯树

脂和醇酸树脂作为特殊用途的塑料,还可用于合成染料助剂荧光增白剂。以一

苹果酸及.苹果酸为起始原料可以合成许多苹果酸衍生物,在材料、苹果酸、.

生物医药、食品及化工等领域用途广泛【训。

鉴于苹果酸在有机酸工业中的重要地位和作用,国际市场对苹果酸的需求量

快速增加,近年来需求量一直以年均%左右的高速度增长和保持。苹果酸主

要生产国有美国、加拿大、日本等,世界总产量每年约为万吨,其中.苹

果酸产量每年约为万,世界市场潜在需求量达到每年万吨,市场发展空间

大。

..苹果酸生产方法

.苹果酸合成技术主要有高温高压水合法、糠醛氧化法、水解法等。高温

高压水合法年便应用于苹果酸生产,后来人们不断对其进行改进,当今普遍

采用的化学合成法是由美国和报道的一种高温高压水合法。.苹

果酸的生产方法主要有发酵法、酶或细胞转化法【】。.苹果酸的合成方法有

不对

称合成法、消旋体的拆分法和生物拆分法?。

由于,型、.型苹果酸的用途各异,从环保、日用、特别是医药与食品需求硕士学位论文

角度来看,合成单一手性的苹果酸是必然趋势,但其生产成本是一个重要挑战。

化学合成法生产.苹果酸的工艺路线短、成本低,而发酵法生产一苹果酸存在

发酵时间长、产酸率低等问题,价格上难与.苹果酸相竞争。是目前普遍采用

的一苹果酸生产方法,但大多存在菌体酶活低、转化率低,工艺路线长等问题。

苹果酸的原料或催化剂均比较昂贵,且反应步骤由于不对称合成法生产.

长,产率较低,不对称合成法生产.苹果酸仅停留在研究阶段;而消旋体物理

拆分法的拆分试剂成本较高,收率较低,影响了此法的发展阻?】。生物法制备

.苹果酸是近十几年发展起来的,主要有微生物拆分法和酶法【。引,目前日本和

荷兰已采用酶转化法实现了.苹果酸微生物转化法工业化生产。

.主要计算方法概述

世纪初,人们创立了量子力学理论用于研究微观粒子的运动规律。

年海特勒和伦敦应用量子力学原理研究了两个氢原子组成氢分子的化学键本质,

从而开创了量子化学的先河。从量子化学理论确立时,人们就开始对小分子

的分

子结构、电荷分布特点等进行了简单的计算。随着等量子化学计算软

件以及高性能计算机的出现,非量子化学专业的化学工作人员开始运用量子化学

理论解决化学问题。上世纪年代至今,已有大量运用量子化学计算方法对实

验上无法实现的化学问题进行了研究,并取得了很大理论成果】。

量子化学计算的理论依据是方程,即在非相对论近似下求解定

态方程以确定一个分子体系某状态的电子结构:

式,,

一车‖ 一车弘

荟去一莓莓吾荔哿喝

式中为核电荷,为核间距,为核质量,为电子间距;左边第一项为

核动能项,第二项为电子动能项,第三项为电子相互作用排斥能,第四项为核与

电子间吸引能,第五项为核.核间排除能。分子轨道从头计算是在非相对论近似、

近似和单电子近似的基础上进行的。

量子化计算中只有分子获得了方程的精确解,一般分子要获

得体系状态波函数与能量,都需要做一些近似。由于这些计算需要的计算量比较

大,极为耗时,计算的系统规模也不大。为提高量子化学计算方法的效率,发展

了许多计算方法。目前常用的量子化学计算方法主要有从.方法、半第一章

文献综述

经验算法、多体微扰方法和密度泛函方法皿。

.. .方法

方程近似解中最成功的是.自洽场方法,其体系波函

数采用单电子近似,个电子体系的总波函数表达为个电子波函数的乘积。从头算

方法是在非相对论近似、?近似和.

近似即独立电子近似的基础上,通过求解.方程获得体系的波函数和能量,进而得到各体系原子、离子、分子、原子簇及化学反应体系等的电子运动状况及其有关的微观信息。

在.方程处理原子结构基础上,将分子轨道按某个基组集合展开, 用有限展开项按一定精确度逼近分子轨道。.方程就由一组非线性的积分.微分方程转化为~组数目有限的代数方程,即.?方程

式.

式中为轨道重叠矩阵,为轨道组合系数,为能量本征值。这些方程都是非线性方程,只能用迭代方法求解。

从头算方法理论上较为严格,计算结果也比较可靠,因此它可以合理地解释与预测原子间的键级、分子的结构、化学反应的过程、物质的性质以及有关

实验

的结果等。在量子化学计算方法中起主导作用【。

..半经验分子轨道法

半经验分子轨道法,是针对.方程的近似计算,利用忽略全部

三中心、四中心双电子积分计算,引进经验参量等方法,使矩阵计算的数

量级从约化至,从而使得从头计算得以简化,可以用于计算较大体系的结

构一性能变化规律。不过这种近似对于小分子体系计算结果较为粗略,可信度很

低,但对于大分子体系的计算结果与实验事实符合较好。一般半经验方法限制体

系在个原子以内。近来一些方法的改进集中在轨道的获得用其他方法

替代矩阵对角化。例如,随着原子数目增加,采用线性比率替代方法,允许体系

含有几千个原子。

由于半经验分子轨道法计算速率非常快,可用于对较大分子体系以及氢键体

系物理化学性质规律的定性总结与归纳。常用的半经验方法翊、

硕士学位论文

、方法【矧、全略微分重叠【,、,删、、

和】等。近年量子化学组合方法出现,大体系的外围仍采用半经验方法

计算。

..电子相关及其计算理论

由于.方法采用单电子近似模型,没有考虑电子间的瞬时相关,

而电子并不是独立运动的,而是相互间存在一定的制约关系,以及电子运动间的

部分相关。单组态自洽场只包含电子间的平均势能,没有考虑电子相关,求得

的

体系总能比实际值要高。电子相关能在体系能量中,所占比例大约在.%左右。

由于化学和物理过程涉及的是能量差值,电子相关能的数值与一般化学反应的生

成热、活化能等属于同一个数量级,或是大于一个数量级。因此,在研究电子激

发、反应途径、分子离解等化学中非常重要的过程中,相关能误差变得非常严重

【。电子相关能校正的计算方法目前主要有多体微扰理论,描述电子相关的方法

,。是组态相互作用

一般把基于单行列式的电子相关方法统称为单参考态电子相关方法,微

扰理论是其中的一种,常用的主要有多体微扰理论,该方法在

?微扰展开基础上,做展开处理,把单电子

算符之和组成零级哈密顿,利用微扰理论考虑了电子相关,从而改善了

.模型由于使用单行列式波函数而造成的对自旋反平行电子的运动之

间电子相关的忽略。多体微扰方法以级数为标准可以表示为

。对电子相关来说只混合了双电子激发组态的影响,是最简单的应用

微扰程序;也只涉及双电子激发组态的情况;包含单电子激发组态的间

接影响、三电子激发组态的主要贡献以及对四电子激发组态的一些处理。微扰

理论方法,由于考虑了电子相关性,所得计算结果更为准确,从而使量子化学

从

头算方法得到了更大范围的应用,但计算比较昂贵。。

组态相互作用是在近似下解与时间无关的方

程。组态函数描述个电子的分布状态,若所有可能函数都包含在过程中, 则得到单粒子基的方程的精确解。由于全的维数随着分子的增大而迅速增大,只能选择比较重要的电子函数,一般只考虑到双重激发,最多能考虑三重激发、四重激发】。第一章文献综述

考虑电子相关的理论还有多组态自洽场方法、全活性空间自洽场方法、耦合簇理论等。在这些方法中,常用的有、、、

、和。各种计算精度可大致按一下顺序排列:

。。声‘,

..密度泛函理论

年和假设各自在,体积内以两种速率运动的电子可看做在

六维相空间中自由运动的电子气,其运动取决于核电荷与这些电子分布的势

场,

从统计角度可近似描绘原子中的电荷分布,含个电子体系的能量可表达为: 式

】】,,毋圪。】

电子间相

式中丁】为动能,

,.办为核与电子相互作用势,圪。

互作用能。一个多电子体系基态能量可从能量泛函极小化得到

式

其中

】圪。【

?乘相关模型采用直接近似,建立了吃【】的近似形式, 整个方程只包含电子密度,但是这些模型在提高精度方面比较困难。年和抛弃了动能函数的直接近似,提出在一个密度为的非相互作用体系,基态】可表示为:

式一

】以】。

式中:是精确的动能分量,。为交换项功能。

式

。】三一圪。一】

包含了与之间的差,以及非经典的圪。【】。

自从和提%..方程,使密度泛函理论成为精确计算

的工具。方程开辟了一条途径,只要成功的获得了。似,就可得到准确的电荷密度与能量。.正则方程以及动能】的表示建立后,和提出了局部密度近似 ,,即用具有相同密度的均

匀电子气的交换相关泛函作为对应的非均匀系统的近似值硕士学位论文式

?】,。

式中,。为密度为的均匀电子气中每个粒子的交换相关能,可分为交换和

相关能,即近似公式:

式

。阪以

当旯时为纯交换能,当旯时为纯相关能,兄从~,交换能相关能比例

不断变化,从而可提高密度泛函精度。

另一种是等人,以一定的物理规律为基础,这些规律包括标度关系、

渐进行为等,构造等泛函啪】。基于或者近似的密度泛函理论

计算构成了当今使用较多的电子结构计算方案。在此基础之上人们寻找更精确的

交换相关泛函所作的较多努力,目前主要有在密度泛函理论中运用.

方法的杂化密度泛函,在非局域框架内描述交换相关穴的屏蔽交换,该方法通过

包含一个屏蔽交换项来提高交换相关近似的质量,消除带结构理论中的不

真实的电子与自身的相互作用的自相互作用修正、近似包含更多半局域

泛函。信息的.

随着密度泛函理论的发展,人们在现有基础上对密度泛函理论的扩展。主要第一章文献综述

有含时密度泛函.、相对论性密度泛函理论、近似、动力学平均场理

论、流密度泛函理论。.多应用于求解,相对论性密度泛

函理论主要应用于某些重元素的计算激发态等问题,近似应用于有较长寿命

的准粒子本征态计算,为一种强有力的关联体系电子结构计算方法,

是一种用来处理任意强度磁场下相互作用电子体系的方法】。

在.理论的基础上发展起来的电子密度泛函理论一直是凝聚态

物理领域计算电子结构及其特性最有力的工具。电子基态能量与原子核位置之间

的关系可以用来确定分子或晶体的结构,而当原子不处在它的平衡位置时,

可以给出作用在原子核位置上的力,可以解决原子分子物理中的许多问题,

适应于大量不同类型的应用,如电离势的计算【】,振动谱研究,化学反应问题,

生物分子的结构四,催化活性位置的特性【】等等。提供了第一性原理或从

头计算框架,在这个框架下可以发展各式各样的能带计算方法,能解决原子、分

子中许多问题。由于在应用中采用局域密度近似,没有任何直接的方

法可以改善的精度,允许发展别的方法作为补充,实现了可较大幅度减

少误差,提高方法的有效性。对于原子及小分子,可以提供比

.模型好得多的结果,它甚至在许多方面超过更为复杂的.

方法。

由于诸多优点,经过几十年的发展,密度泛函理论体系及其数值实现方

法都有了很大的发展,使得密度泛函理论被广泛地应用在化学、物理、材料和生

物等学科中。目前越来越精确的交换相关能量泛函近似正在被不断地发展,同时

密度泛函理论从静态到含时、从平均场到动力学平均场以及从零场到外电场外磁

场的扩展正不断地丰富着密度泛函理论体系。而局域原子轨道、平面波基组和实

空间网格、小波基组等数值实现方法以及基于量子力学局域性的线性标度算法的

发展和成熟,使得密度泛函理论可以准确快速地数值求解。这些理论体系和数值

方法的发展使得密度泛函理论的应用越来越广泛【,,引。

.溶剂效应

许多化学过程、生物体的生化过程是在溶液中进行的,气相反应在化学反应

中只很小的部分。一般的理论研究主要讨论孤立分子的能量及其物理、化学性质,

然而分子或离子在溶液体系中化学行为与在真空或气相体系中的差别很大。在某硕士学位论文

些溶液中,溶质与溶剂分子会发生相互作用,形成水合离子、氢键等,溶质分子

的几何构型、振动频率、总能、电子光谱等均受到溶剂分子的影响,特别是极性

溶剂会使溶质的电荷密度及相关性质发生变化;在另一些溶剂中,溶剂与溶质分

子不直接发生作用,但溶剂作为环境会强烈的影响溶质的行;。由于分子

行为与性质在真空或气相体系中存在较大差异,溶剂效应的理论能较好的反映出

溶液中分子的真实行为。

..溶剂效应

溶剂效应是溶剂分子通过与溶质分子相互作用,积累在溶质周围的过程。溶

液是由大量的溶质与溶剂分子组成,是一个多体问题,其解析解很难获得。计

算

化学处理溶剂效应的方法可分为两类。一类是不连续模型,将中心分子和包围它

的溶剂分子作为一个体系来处理,但所需的计算量非常大,很难展开研究。另一

类是使用连续溶剂模型计算溶剂效应。

在分子中,原子核周围的电子分布产生了一个静电场,并和其他核相互作用。

静电力在溶质与溶剂分子间相互作用中处于首要地位,溶质分子和溶剂分子的电

荷分布在溶剂化过程中十分重要。当在溶液中产生一个溶质分子的气相电荷分布

并且使溶质分子极化时,溶质分子由于极化而出现的偶极矩产又作用于溶剂分

子,使得溶剂分子产生诱导偶极矩,而溶剂分子的诱导偶极矩反过来作用于溶质

分子,从而对溶质分子产生一个额外的稳定作用,故溶质分子周围产生电场作用

在溶质分子上,改变了溶质分子的自身的能量。而且由于溶剂分子的出现,溶质

分子的分子内库仑相互作用也被屏蔽了,该效应即静电效应。

溶质分子与溶剂分子还存在短程力效应,包括吸引.排斥相互作用。由于通

常在孔洞周围吸引力强于排斥力,短程力效应对溶剂化起促进作用的。分子

对于

化学反应,反应物和生成物的自由能可确定化学平衡,过渡态和生成物的自由能

的差值是控制反应速率的重要因素,因此一般采用溶剂化自由能?。,

描述溶剂效应。?。,是指将溶质分子从真空移至溶剂中自由能的变

化,由静电势、力和空洞能三部分组成:

式?

。。,。,。?,协。。其中:?出。为静电势,讨论溶质与溶剂分子的相互作用;?咖为

力,也可分为吸引力和排斥力两部分;?。.为溶质分子在溶剂分子中形成空洞第一章文献综述

所需的自由能。其:洞能是溶质分子要在溶剂分子中形成孔洞所需要的能量。

孔洞能属于熵效应,表明由于在溶质分子周围溶剂分子的重新分布而使得熵减少

了。尤其对于水,熵减少是因为一个非氢键溶质的出现而便有利于形成氢键的方

法减少了。孔洞能还包括溶剂分子与溶剂分子间吸引一排斥相互作用的改变,而

这个变化是由于孔洞内溶剂分子的遗漏以及局部的溶剂结构的改变。

一般来说,极性溶剂,?吒占主导地位的,?%是次要的。另一方面,对

于非极性溶剂,由于溶剂分子间相互作用较弱,?。和?括。比较小,?咖却

占优势。对于极性溶质在极性溶剂的情况,?。占主导地位;反之对于非极性

溶质在非极性溶剂的情况,咖占主导地位【】。

处理溶液体系的模型有很多种可分为不连续模型和连续模型

两类。不连续模型考虑一个块状液体,研究方法一般是把多个

溶剂分子放入模拟模型,然后进行分子动力学或计算,得到体系性质

的时间平均、系统平均,这样计算量也是非常巨大,较少采用从头计算量子化学

来模拟溶液中的化学线性。不连续模型通常也不考虑溶质的电子极化效应,而且

溶质和溶剂之间的静电作用也依赖于所选力场的电荷参数。这种近似模型常用于

而这些溶质分子仅被少数的溶剂分子研究小的溶质分子的电子和结构性质,

包

围。另一方面,不连续计算提出将整个波函数分成两个独立的部分,分别来描述

溶剂和溶质分子,溶剂.溶剂和溶质.溶剂的相互作用用半经典的方法来处理,不

连续模型仍被广泛地应用于一些量子力学或分子力学方法中,并能得出好的结

果。连续模型是考虑溶液效应,主要是溶质分子由于溶剂的影响发生的行为变化。

在有些溶液中,溶质与溶剂分子发生相互作用,溶质分子的几何构型、振动频率、

总能、电子光谱等都受溶剂分子的影响;在另一些溶液中,溶剂分子不直接与

溶

质分子发生作用,而作为环境强烈的影响溶质的行为,故可将溶剂作为某种

场来

处理。

..溶剂效应连续模型

.模型

用一个电荷为与一个半径为且镶嵌在介电常数为介质中的球形溶剂孔洞来替代溶液自由能的出。分量,一个离子的?。等于将该离子从真空环境移动到连续介质中所做的功:硕士学位论文

式

?,。:一一

模型只需要选择一套孔洞半径。一般选用晶体结构的离子半径,对碱金属卤化物,阴离子半径

,阳离子半径取 ,可取得与实验较吻合的结

果。和等应用模型,进行分子轨道方法计算,推出的

程序中一系列算法【。

.模型

模型将一个偶极分子放入一个孔洞内,周围是连续极性溶剂电场。这个孔洞通常选为球形,且偶极分子处在球形孔洞的中心,计算采用方程, 电势场中的二阶微商与电荷密度、电场介电常数占有关【蚓 ??

式. 式.

矽:??

模型采用方程的解析解,结合方法,可以得到定

量结果,再用或杂化的方法,可提高计算精确度。该模型计算结果稳定, 而且速度快。该模型只考虑静电相互作用,没有考虑短程效应和熵效应。 ..方法【】

方程假定溶剂是完全均匀的,但是有些溶剂是电荷分离的,会出现溶质向溶剂分子负电荷方向或正电荷方向迁移。.方法在方

程上增加一项描述溶剂电荷分离,并用分布表示离子在处密度数式

?矽,.一尼’矽】

式中:’为?反演长度,定义为

七“:??

式中?彳为常量

将.方程做展开,其微分方程只取展开第一项,则

式矽,一尼?,.

这个方程能很精确的描述溶质与溶剂分子间的静电极化作用,但求解比较困难。一些研究者运用有限差分.方法进行广泛的研究。溶液自由能是进行两次分开计算,用相同的晶格、相同的溶质电导,但是用不同的阶段

常

数。和采用方法设计了一种计算方法,先分别计算分子、分子第一章文献综

述

具有相同电导率在溶剂介电常数为中的自由能,再将这两个分子分别移到电导率为的介质中再计算,然后用定律计算两个分子在介质

中的结合能,最后再将结合的分子移回中计算自由能。 .自洽反应场方法

自洽反应场方法江方法从模型发展而来,孔洞中的偶极分子诱导环绕它的周围介质,介质又反过来使孔洞内产生电场,该电场作用在溶质

分子

上,增加体系稳定性。该电场反应性的大小可表示为: 式

办丽‘‖

式中/为溶质偶极矩。电场中偶极矩能力为痧,?‖,极化偶极矩还与孔洞内电荷分布相关能去办?‖有关,故溶液的自由能的静电场分量为式

?赢一言办?‖

和将反应场理论结合量子力学自洽场计算,发展成反应自洽场理论【】

式

式中。为分子在气相中的,反应场的,则为微扰项。

则溶液自由能的场分量为

式

??少一‰?一面丽/

式中‖为总波函数,%是分子气相中波函数,上式第三项为孔洞内溶质分子电荷分别产生的相关能。

方法中孔洞可以是球形、椭球形或更接近某些分子的形状,但不论是球形或椭球形孔洞,能量一阶、二阶微商都存在,所以几何构型的优化都可以

进

行,溶质分子不仅可以偶极,也可以四极、多极或用电荷密度的数值积分【】。到目前为止有许多方法已经被发展,它们都对溶剂化自由能的静电场分量有着特殊的关注。其中等例提出的模型?

是最常的模型之一。方法的真实孔洞形状来自溶质分子中原子的

半径,?瓯。的计算是溶质分子电荷密度的数值积分。将孔洞表硕士学位论文

面通过投影到内接的多面体而分成小表面元,每个表面元与一个点电荷相连,

点

电荷的大小表示溶剂的极化程度,与该点电场梯度成正比,总电场势为溶质

和其

他表面电荷势之和

式

矽,痧。,.丸,

式中九,.为溶质势,力,为表面电荷势。点电荷的初始值则按下式计算船。, 顷卜?

吼杀等。铲弋丽人蔷‖

式中豢为电场梯度,为表面元的面积。

屯厂可用定律计算,这些电荷通过迭代直至自洽,在将所得的?。厂加到溶质的,成为自洽场的初始值。经过多轮迭代直至溶质波函数与表面电荷都自洽。

还衍生出等密度方法和.方法等算法。的孔

洞是定义电子密度的等密度表面,用自洽场运算迭代至收敛。.是先计算孔洞密度,将孔洞计算嵌、过程,将两部分结合起来计算。 .紧密表面层溶剂法紧密表面层溶剂法 ,【明常用来处理非常大的分子,仅用于分子动力学模拟。模型中溶质分子由最靠近它的与它作用最大的一层溶剂分子环绕,用测定每个原子或基团与溶剂接触的表面积

计算

溶液的自由能?。,

式?

?。,?口

式中;是溶质区域的表面矢量,,为该区域的表面积。

该方法不区分各种能量的贡献,表面矢量参数包括可能考虑的多种相互作用,与其相关的几种算法主要是测定紧密相连表面积方法不同,该方法常用

来处

理非常大的分子,仅用于分子力学模拟。

.苹果酸及其衍生物的理论研究

随着量子化学和计算机的飞速发展,人们采用量子化学对重要的化工产品的物性进行研究,如等四用.、和/对第一章文献综述

富马酸与马来酸结构进行研究, 等【采用方法研究富马

酸与马来酸之间的光异构机理。对有机酸的结构、振动情况进行详细的研究,

可

为其相关衍生物分子设计与物性研究提供信息。

尽管苹果酸是一种重要的有机酸,但目前未见采用了从头算方法对苹果酸结构及溶剂化效应进行系统的研究报道,亦未见苹果酸与其他分子作用机理的

研究

报道,对其衍生物研究也极其有限。张艳兰等【采用/.

,方法

对.苹果酸脲分子结构进行优化,并进行红外和紫外可见光谱计算,分析溶剂化效应对其光谱性质的影响。等【】在实验的基础上获得茶碱与.苹果酸或.苹果酸共晶的结构,然后采用/.对其振动情况进行计算,并与光谱进行比较以此判断该光谱技术的灵敏性。

.研究的主要内容

尽管苹果酸是一种重要的天然有机酸,但未见通过量子化学理论计算系统研究其结构与性能的报道。目前理论已取得了长足的进步,以为代表的方法对于小体系共价键的描述可以逼近化学精度,因此本文将采用 /方法对苹果酸进行理论计算,探讨其结构与性能之间的规律性关系。本文的研究内容主要包括:

.本文通过量子化学理论计算,采用密度泛函理论对苹果酸的几何构型、电子结构进行了全优化,并在全优化构型的基础上计算红外振动光谱频率及其

对应

的红外振动强度;

.采用溶剂化模型对苹果酸在水溶液中的几何结构、电子结构进行全优化, 并计算红外振动光谱频率即红外振动强度。

.采用溶剂化模型对苹果酸在常见有机溶剂中的结构进行优化,研究不同溶剂体系对苹果酸结构和性能的影响。

本文拟通过大量的计算,探讨两种手性苹果酸结构和性能的差异,以及不同环境的影响,为苹果酸及其衍生物的分子设计和合成提供参考信息。硕士学位论文

第二章苹果酸结构研究

.引言

迄今为止,苹果酸的实验结构信息非常有限。量子化学计算是获得分子结构参数的重要途径。通过对苹果酸进量子化学研究,可以获得分子立体结构、

分子

轨道能级、原子的电荷密度等信息。从头算法是非经验方法,在一定水平下

计算

结果非常精确,在研究中被广泛使用。目前常见的从头算方法主要集中有、微扰和密度泛函等种方法。这种方法的精确度已比较好,而其他的更精确的方法需要的计算机资源十分庞大,故上述三种方法具有较大的

优

势。这三种方法中,计算方法既考虑了电子相关性,也不是太费时与相比,计算精度与相当,因此具有明显的优势。从目前来看,在计算小体系共价键的热力学性质、结构和光谱性质时非常精确,是最常用的一

个泛

函,本章将采用密度泛函的方法对两种手性苹果酸的几何构型进行研究, 并对其稳定构型的电荷分别、红外振动等进行讨论,计算其稳定构型的标准

热力

学数据,分析两种手性苹果酸的差别与共同点。

.计算方法

本文对苹果酸的初始构型采用/.进行初步优化,然后利用密度泛、/

函理论依次在/ 、/ ,等水

平上对所有构型进行优化计算。

得到没有虚频的稳定构型,然后通过结构全优化及同样水平下的频率计算,

对稳定构型进行和集居数分析等计算。所有计算均采用

程序进行【,收敛精度为内定值。

.苹果酸几何构型

.苹果酸几何构型研究

在几何结构优化方面,基组中增加极化函数使分子中单键键长增加,双键键长缩短;基组中增加弥散函数与增加极化函数对键长的影响刚好相反,只不

过其第二章苹果酸结构研究

影响程度要小得多,即基组中增加弥散函数并不会使键长发生明显的变化。在能量的计算方面,增加基函数的数量,会使分子的总能量降低;基函数的数

量

越多,其能量就越低;基组中增加弥散函数和极化函数宰会使分子的总能量降低,其中增加极化函数宰对总能量的影响比增加弥散函数的影响大得多。在振动频率计算方面,则尽可能地采用大基组进行计算,且振动频率的计算

应在

与几何优化在相同的基组下进行才合理、可靠【刀。考虑到计算精度与效率

两个

方面,本章主要采用.

抖,基组对苹果酸的几何构型、能量、振动频率等

进行优化计算。

运用密度饭后理论/方法结合为了寻找.苹果酸最稳定的构象,

卜十基组对.苹果酸可能的分子构型进行优化计算,获得了种稳定构象,并进行频率计算,其构象如图.所示,各种构象进行能量校正,结果如表.所示。

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图. .苹果酸种分子构型仰 ?

硕士学位论文

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/.下种苹果酸构型的能量比较 . /

丰总能、零点振动能单位为,碳链二面角单位为。:下司

通过计算表明,.苹果酸的分子构型可以根据其碳链构型分成类:碳链二面角在..之间,具体构型见图..?,其中构型总能量最低,且零点振动能最低;碳链二面~角在..~..,具体构型见图. .?,其中构型?总能量最低,构型?的零点能振动最低;碳链二面角在.~., 具体构型见图.?.?,其中构型?总能量最低,且零点振动能最低。而种分子构型构型的总能量最低,为..,构型?零点振动能最低,为 .,这表明在.苹果酸不同温度下其最稳定的结构可能不一样。然而这种.苹果酸分子构型中,其能量差别非常小,其零点振动能的差别最大的构型与构型?仅在.%以内。通过热力学分析发现,构型?自由能最低,故常温常压下其结构最稳定。

为了研究不同.苹果酸苹果酸构型对其物理、化学性质的影响,表.列出

了最高占据轨道能量、最低空轨道能量、前沿轨道能量差?、偶极矩及其在各个方向的分量。

由表.可知,不同构型的前沿轨道能量差和偶极矩有所不同。种.苹果酸构型中前沿轨道能量差最大的构型?,最小的是构型,两者前沿轨道能

量

差达.%。构型对偶极矩的影响比较大,其中偶极矩最大的构型,偶极矩最小的是构型?。第二章苹果酸结构研究

表? /

种苹果酸构象的偶极矩、、和 .,

限于篇幅,仅将构型?的键长、键角和二面角列出来,并对其原子进行新的编号见图.,结果见表.。

图苹果酸最稳定构型编码分别采用

、、基组进行全

、、

优化的计算结果列于表中。与基组计算结果相比,、

、、键长最大偏差分别为.、.、.、.,

键角最大偏差分别为.、.、.、.,二面角最大偏差分别为.、 .、.、.。。故水平下就能产生较为精确的计算结果,增加极化函数对总能量的影响比增加弥散函数的影响大得多。由于精确的结构参数是

其性

质计算的基础,因此有必要采用较高水平的基组,并对其进行扩展。硕士学位

论文

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一苹果酸最稳定构型几何参数/

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. . . . .第二章苹果酸结构研究

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... .苹果酸电荷集居分析电荷集居分析是将分子轨道波函数与化学图像联系起来,将波函数转化为直

观的化学信息,可用于解释分子波函数,研究分子中电子的转移,分子的极

性、

化学键的类型、强度等。表.列出了不同基组下/得到的一苹果酸

分子的原子净电荷分布情况。

表. .苹果酸气态最稳定构型电荷分布?

由表可知,羧基的和均带正电,亚甲基的带负电,而手硕士学位论文

性原子的电荷受计算方法和基组的影响较大。电负性较强,其中电

负性最强,其次为与 ,与电负性相对较小。与相连的、

、所带的正电荷相当,明显高于亚甲基上的、,其中所

带正电荷稍高于和。

由表还可知,不同计算方法和基组下的计算结果差别较大,同种原子上

的电荷数值差别较大。这是由于集居将重叠电荷平分给两个原子,对

两个电负性相近的原子结果比较合理,但对于电负性悬殊的原子则不合适。尽管

有很多的不同的集居分析方法,但由于该方法计算方便,长期使用,目前仍是最

通用的方法。由于该方法计算得到的电荷不稳定,分析成键等情况可能会给出不

可靠得结果。

苹果酸分子轨道研究

有些有机酸能形成分子内氢键,从而使其构型更稳定。一般来说,要形成

?内氢键必须要电负性大的原则,且两个原子的距离在其范德华半径之和

之内原子为

,同时还要求三个原子的夹角不宜太小,以为宜。通过计算可知,之间的距离为

,略小于两个原子的范德华半径,

三个原子的夹角为 .,有可能存在氢键轨道。为了考察该构型是否存在氢键

轨道,本文对.苹果酸分子的分子轨道进行分析,得到了.苹果酸的分子轨道图,结果见图.。.苹果酸分子轨道共有个,其中占据轨道有个,非占据轨道个。分析结果表明,个电子中,内层轨道占个电子。轨道.为双中心键,轨道为单中心核键,轨道.为单中心价键,其中并没有出现、、者相关的轨道,故不存在氢键轨道。

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轨道轨道轨道第二章苹果酸结构研究

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第二章苹果酸结构研究

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图 .苹果酸分子轨道

...

苹果酸红外光谱

分子的运动能量可分为平动能、电子能、振动能和转动能,均与分子吸收光

谱有关。分子的简正振动基本上可分为伸缩振动和弯曲振动。伸缩振动主要是键

长变化,可分为对称伸缩和不对称伸缩。弯曲振动主要是键角发生变化,可分为

面内和面外弯曲振动,前者可分为对称弯曲振动和平面内摇摆振动,后者可分为

面外扭曲振动和面外摇摆振动。谐振频率的计算主要用来确定分子构型是否处于

位能面上的稳定点或过渡态。若谐振频率均为正,则为局部最低点,该分子构型

在热力学上稳定;若有且仅有一个虚频,则改结构为分子过渡态。通过正则谐振

频率的计算还可获得分子各种热化学性质,以及红外光谱等信息。本文运用

方法对.苹果酸做频率计算,结果表明,.苹果酸振动频率

均为正,无虚频存在,即优化的构型是能量曲面上极小点,为稳定构型。对频

率

采用进行校正【,结果见表.。表 /.

方法下苹果酸红外频率 / 频率计算值频率计算值频率校正置篙频率校正嚣蒜 .

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硕士学位论文

分子振动能级间距远小于电子能级,且大于转动能级。被红外光照射物质的

分子就可吸收光子从振动低能级跃迁到高能级,同时伴随一系列分子的转动能级

的跃迁,因此红外光谱能较好的表征分子振动,是分析和鉴定物质的有力手段。

按照光谱和分子结构特征,可将红外光谱分为官能团区. ‘和指

纹区. ’。官能团特征吸收频率受分子其他部分的影响较小,一般

有比较稳定的吸收频率。指纹区特异性强,分子结构的微小变化就可引起光谱强

度和大小的变化,该区吸收带一般对应分子中不带得单键收缩振动以及各种

键的弯曲振动,同时还对应不同基团各种振动的较强耦合作用、分子骨架振动等。

在量子化学理论计算中,小于 ‘的红外光谱一般由转动能级的跃迁引起, 与多个基团有关。

在.苹果酸的红外光谱中,.为.伸缩振动,.为.

伸缩振动和..弯曲振动,.为的伸缩振动、..弯

曲振动以及.摇摆振动,主要为内剪切振动,.主要为.

弯曲振动、..伸缩振动和..摇摆振动以及其他复杂振动。校正后的. 苹果酸红外光谱图见图.。

第二章苹果酸结构研究

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频率

图 ?平果酸的红外光谱 ?

.苹果酸几何构型

...

.苹果酸几何构型研究

为了寻找.苹果酸最稳定的构象,运用密度泛函理论忸方法结合基组对苹果酸可能的分子构型进行优化计算,获得了种稳定一苹果酸构象,其构象如图.所示。为获得.苹果酸在气态中的最稳定结构, 对种分子构型的能量进行计算,并进行了能量校正,结果如表所示。如一如

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型分成.?、 ?、和?.?类。由表可知,构型.?中,构型?能量最低,且零点振

动能最低;构型.?中,构型?能量最低,而构型?零点振动能最低;构型?.

中,构型能量最低,且零点振动能最低。而种分子构型总能最低的是构型 ,零点能最低的分子构型为构型?,但两者差别较小,而常温差压下自由能最低的是?,即在.苹果酸不同温度下其最稳定的结构可能不一样。表

/件嘞下种苹果酸构象的能量比较 /.

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。苹果酸构象

碳链二面角总能零点振动能一曼?一

为了比较不同.苹果酸构型对其物理、化学性质的影响,表.列出了最。~?高占据轨道能量、最低空轨道能量、前沿轨道能量差?、偶极矩及其在各个方向的分量。

表?

下种.苹果酸构型的前沿轨道能量及偶极矩?

偶极矩构型

??????可??????而面

由表.可知,不同构型的前沿轨道能量差和偶极矩有所不同。种.苹果酸构型中前沿轨道能量差最大的构型?,最小的是构型,两者前沿轨道能

量

差达.%。构型对偶极矩的影响比较大,其中偶极矩最大的构型,偶极矩最小的是构型?。

在这种.苹果酸分子构型中,常温常压下构型的自由能最低,其结构最稳定,限于篇幅,仅将构型的键长、键角和二面角列出来,各原子编码见图 .,结果见表.。

分别采用、、、、?基组进行全

优化的计算结果列于表?中。与?基组计算结果相比,、

、? 、键长最大偏差分别为.、.、.、.,

键角最大偏差分别为.、.、.、.。,二面角最大偏差分别为.、 .、.、.。。由此可见,水平下就能产生较为精确的计算结果。由于精确的结构参数是其性质计算的基础,因此有必要采用较高水平的基组,

并

对其进行扩展。硕士学位论文

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.苹果酸最稳定构型编码

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.苹果酸的分子几何构型/ .

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. . . . . .第二章苹果酸结构研究

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范文二：苹果酸脱氢酶的结构及功能

第26卷第4期2009年8月生物学杂志JOURNALOFBIOLOGYVol126　No14

Aug,2009

doi:10.3969/j.issn.1008-9632,2009.04.069

苹果酸脱氢酶的结构及功能

汪新颖,王　波,侯松涛,朱国萍

1,2

(1.安徽师范大学生物大分子进化重点实验室;2.安徽师范大学分子生物学及生物技术研究所,芜湖241000)

摘　要:苹果酸脱氢酶(MDH)可以催化苹果酸与草酰乙酸间的可逆转换,主要参与TC、C4循环

等代谢途径。苹果酸脱氢酶可分为NAD2依赖性的MDH(NAD)2MDH)。在所有真核生物和大部分细菌中,MDH通常形成同源二聚体,催化机制和它们的动力学性质十分类似,,包括线粒体中的能量提供和植物的活性氧代谢等。,并针对其生化特性、空间结构特点、。关键词:;;功能中图分类号:.文献标识码:B

文章编号:1008-9632(2009)04-0069-04

苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase,MDH)普遍存在于动物,植物,细菌等各种生物体中,是生物糖代谢的关键酶之一,能催化苹果酸与草酰乙酸之间的可逆转换。MDHs在细胞的多种生理活动中起着重要的作用,包括线粒体的能量代谢以及植物的活性氧代谢等。根据不同的辅酶特异性,MDHs分为NAD2依赖性的MDHs(NAD2MDHs)和NADP2依赖性的MDHs(NADP2MDHs)。细菌中通常只含有NAD2MDHs,存在于细胞膜上。在真核细胞中,NAD2MDHs分布于细胞质和线粒体中,NADP2MDHs位于叶绿体。近些年来由于MDHs的工业应用价值,其受关注的程度日益上升。1　苹果酸脱氢酶的生化特性1.1最适pH值和最适温度

MDHs的最适pH值偏碱性,约在8.0左右,如链霉菌(Streptomycesaureofaciens)和大肠杆菌的MDH(E.coliMDH,EcMDH)都在pH值8.1的时候酶活性最高。MDHs的最适反应温度为40～65℃。如枯草杆菌MDH和猪心肌MDH的最适温度约50℃,嗜热脂肪芽孢杆菌(BacillusstearothermophilusMDH,BsMDH)在65℃有较好的稳定性。在温度趋向两极的情况下,大多数种属的MDHs活力不高,但来自嗜寒细菌(Aquaspilliumarcticum)的MDH(AaMDH)在4℃左右仍然保持较高的活性,嗜热细菌(Thermophilicbacterium)的MDH在

收发日期:2008-10-10;修回日期:2008-11-13

90℃仍然可以保持1h左右的活力,这种差异可能是由

于活性位点某种残基的偏爱、底物和辅因子电荷的分

布以及亚基间离子对的相互作用等原因造成的。1.2热稳定性

EcMDH和枯草杆菌MDH的热稳定性较差。嗜热脂肪芽孢杆菌BsMDH在高温下相当稳定。嗜寒细菌AaMDH不耐热,推测与氢键数目、脯氨酸或甘氨酶分子的数量、位置、及它们的相互作用有关。有分析表明醇类物质对MDHs的热稳定有一定影响。在低温环境下,甘油是维持MDHs活性的最好稳定剂,而环多醇和山梨醇能在高温下维持MDHs的活性。这种稳定原理可能是羟基基团和酶分子的相互作用或是醇类减少了介质的介电常数而加强了酶分子的疏水作用,使酶蛋

[1,2]

受水分子的影响减少。还有的研究表明,增加二硫键或氢键可以改善MDHs的热稳定性。如嗜热细菌(Chlorobiumtepidum)和嗜温细菌(Chlorobiumvibrio2forme)的MDHs热稳定差异,是由于嗜热细菌MDH的极性残基在亚基之间形成更多的氢键。另外嗜热细菌(Chloroflexusaurantiacus)的MDH含有更多的脯氨酸和丙氨酸残基,能更好的稳定蛋白质骨架结构,同时在二聚体之间,一些带电荷的氨基酸所形成的离子间相

[3]

互作用有助于蛋白质的热稳定性。1.3金属离子的影响

作者简介:汪新颖(1984-),女,硕士研究生,专业方向,分子生物学,E2mail:154824459@qq.com;

通讯作者:朱国萍,博士,教授,博士生导师,主要从事蛋白质功能进化与分子生物学研究,E2mail:gpz1996@yahoo.com。

(NCET2基金项目:国家自然科学基金(30500300);教育部“新世纪优秀人才支持计划”0620558);教育部回国留学人员启动基金;安徽省优

秀青年科技基金(06043089);安徽省引进海外留学人才基金(2005Z032);安徽省教育厅自然科学基金重点项目(2006KJ061A)

第26卷第4期2009年8月生物学杂志JOURNALOFBIOLOGYVol126　No14

Aug,2009

带各种电荷的离子对MDHs的活性及蛋白质的稳定性影响不同,通过不同金属离子对绿豆MDH的研究

+2+2+

表明:K有激活作用;Mg和Ca对酶活影响不大;2+2+2+Zn、Pb和Cu对酶活有不同程度的抑制作用,其

中Cu抑制程度最强,当其浓度为1M时,97%的酶活

[4]

被抑制。还有来自嗜盐古菌的MDH(HaloarculamarismortuiMDH,HmMDH),其稳定性受多种离子的影响,当电荷密度高时,阴离子能有效的稳定酶的折叠结构,而阳离子需在低盐浓度下时才能发挥相同的作[5]

用。

2苹果酸脱氢酶的空间结构特点2.1序列比较

MDHs些细菌的MDHs(m,如EcMDH与猪mitMDH和酵DH级结构的一致性为5813%及4719%;其它细菌的MDHs,如嗜温细菌MDH(ThermusflavusMDH,TfMDH)则与真核细胞叶绿体MDHs(chlMDH)和细胞质MDHs(cyMDH)的氨基酸序列更加相似,归为另一个亚类。

MDHs存在各种形式的同工酶,不同来源的MDHs氨基酸序列关系很复杂。氨基酸序列对比显示动植物细胞质MDH和细菌MDH的氨基酸序列相似性为48%～67%。而且同一细胞器的MDHs在物种间的相似性超过了不同细胞器来源的MDHs在物种内的相似性,如大米的cyMDH与人、细菌的cyMDH的氨基酸序列同源性分别是59%和52%,但是大米的cyMDH和大米乙醛酸体MDH(gMDH)的氨基酸序列相似性只有24%,而猪mitMDH和猪cyMDH的序列相似性只有约20%。这表明在物种分化之前已经形成了不同种类的MDH同工酶。

十分有趣的是古菌(archaeal)MDH与乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenases,LDH)有着高度的氨基酸序列一致性,暗示MDHs与LDHs在进化过程中有很近的亲缘关系,嗜盐古菌HmMDH的晶体结构也有力的支持了这一观点,因为HmMDH的三维结构更接近四聚体的LDHs而不是二聚体的MDHs。基于氨基酸序列的系统进化树表明MDHs与LDHs起源于两次祖先共生同源(paralogous)的基因倍增(geneduplication),形成了结构和生化性质迥然不同的3个进化枝(clade):首次基因倍增形成了在结构上有差异的酶,主要分为二聚体酶和四聚体酶,二聚体酶主要包括mitMDHs和cyMDHs;随后在四聚体酶中,又发生了一次伴随着功能改变的基因倍增,将该进化枝上的酶分为了LDHs和类-乳酸脱氢酶型MDHs(LDH-likeMDH)。LDHs70

和MDHs的功能差异主要是与底物特异性相关的第102位氨基酸,在MDHs中是带正电荷的Arg,而LDHs中通常是不带电荷的Glu。2.2亚基组成及活性中心

MDHs为同源二聚体或四聚体,目前发现的真核生物MDHs都是二聚体,如猪心cyMDH和大米的cyM2DH。大肠杆菌的MDH是二聚体,但芽孢杆菌类MDHs多为四聚体,如枯草杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的MDH。NAD2MDHs32～37kDa之间,2。

,尽管其氨基酸,辅酶结合位点、起催化作MDHs的每个亚基包含结构性和功能性的两个结构域,NAD结合结构域占据着N2端,覆盖了分子的一半,包含着一个平行的β2折叠结构(Rossman折叠模体)。核心的二核苷酸结合结构由4个β2折叠和一个α2螺旋组成。MDHs的C2端结构域包含底物结合部位和催化必须的氨基酸残基。酶的活性中心位于两个结构域之间的裂缝中。

小鼠cyMDH的结构显示,NAD2MDHs通常包含N2端的NAD结合区、催化区及C-端尾区三个结构域,前两者构成MDH的活性中心。在NAD2MDHs的催化区中,Asp和His残基是核心氨基酸,如Asp2150和His2177是构成EcMDH活性位点的重要氨基酸;Asp2152和His2180是猪心cyMDH催化区中的关键氨基酸。它们通过氢键形成His2Asp离子对,在催化过程中作为质子中转系统,这也在一定程度上解释了MDHs与NADH的结合比其与NAD的结合更稳定些。而且His中的咪唑环、烟酰胺环以及Asp的羧基部分的相对位置对于MDHs的催化起着关键性作用。研究表明包括MDHs在内的所有的2-羟酸脱氢酶中都存在一个His2Asp离子对,它作为质子中转系统,催化时要求与22羟基集团正确定位,形成活性区域的阴离子空穴,以容纳柠檬酸盐、小的带电阴离子如硫酸盐。2.3辅酶特异性及底物特异性

NAD2MDHs和NADP2MDHs的催化部位及辅酶结合部位的同源性很高。Asp253对于MDH的辅酶特异性至关重要,它在NAD2MDHs中高度保守,而在玉米等植物叶绿体NADP-MDH中,该位置的氨基酸都为Gly。基因突变实验表明,MDHs的辅酶特异性仅由几个高度保守的氨基酸决定。Takeo等人构建了嗜温细菌TfMDH的两种突变体酶EX3和EX7。EX3是将TfMDH中的第41、42、45位氨基酸突变为叶绿体NADP2MDH中的对应氨基酸Gly、Ser和Ser。EX7是

第26卷第4期2009年8月生物学杂志JOURNALOFBIOLOGYVol126　No14

Aug,2009

将41到47位氨基酸Glu2Ile2Pro2Gln2Ala2Met2Lys突变为叶绿体NADP2MDH中对应的Gly2Ser2Glu2Arg2Ser2

Phe2Gln。结构两种突变体酶都实现了NAD向

NADP辅酶特异性的转变。同理将高粱叶绿体NADP2MDH的第84、85、87、88位氨基酸替换成TfMDH中对应的Glu2Ile2Glu2Ala,突变体酶的动力学参数也发生了不同程度的改变。

来自嗜热脂肪芽胞杆菌的LDH(Bacillusstearo2thermophilusLDH,BsLDH)和EcMDH仅有25%的氨基酸序列一致性,但是两种酶的蛋白质折叠惊人的相似,只是在二级结构上略有微小的差异。在两者的活性中心,只有第102位的关键性残基不同,在BsLDHGln,而在EcMDH中是Arg。WilkssLDH的Gln2102突变为Arg2102,Bs的Arg2102突变为Gln2102后,为底物,但是催化效率很低。3苹果酸脱氢酶的催化机制

MDHs催化苹果酸羟基的氢离子定向地转移到

NAD(P)上,实现苹果酸与草酰乙酸之间的可逆转换。MDHs活性部位由一个疏水的空泡组成,它包含了底物和辅酶的结合位点。当形成酶2辅酶2底物三聚体复合物时,蛋白质构象发生改变。在这个变化过程中,复合体外部的一个环掩盖住活性中心以保护底物和重要氨基酸不受溶剂的干扰,而其余的一些起催化作用的氨基酸向底物靠近,同时位于活性中心的His2Asp离子对在反应过程中提供质子(如图1所示)

。

图1　苹果酸脱氢酶的催化机制

Fig1　ReactionmechanismofMDH,schemeofNAD2dependent

dehydrogenationof22hydroxyacids

研究表明MDHs活性区域高度保守的3个Arg决

定其催化反应的特异性。当酶与底物接触时,位于移动环侧链的2个Arg与底物相互作用,另一个Arg在底物转化时与其羧基基团的配位键结合,从而稳定新形成的羟基和酮基产物。

如猪心cyMDH与底物结合时,酶的Arg291和Arg297先固定在活性区的环中,His2186首先与底物C2的羰基氧原子结合,接着Arg2161的氢键直接结合到底

物C1的羧基上,后Arg297也结合到底物C2的羰基氧

原子,从而完成了与底物结合的主要过程。在整个反应中,第一步提供还原底物所需要的质子,第二步协助底物定向和定位,最后一步是极化底物的羰基基团而使C2上产生阳性电荷,从而激发NADH产生带一对电子的质子。同样在EcMDH催化反应时,Arg281、Arg287、Arg2153在稳定和定位底物中发挥重要作用。首先Arg281和Arg287定位在一个环上,向活性区域弯曲并形成氢键与底物的4-羧基和,Arg-12羧基上,从而完成4(malatedehydrogenase,MDH)存在,是生物糖代谢的关键酶之一,能催化苹果酸与草酰乙酸之间的可逆转换。MDH在细胞的多种生理活动中起着重要的作用,包括线粒体的能量代谢以及植物的活性氧代谢等,具有较高的理论研究和经济利用意义。如MDH同工酶参与不同的细胞生理代谢途径:cyMDH与丙酮酸羧化支路相联,与非自养性的二氧化碳固定有关;mitMDH是TCA循环中的关键酶,提供能量;微体MDH与光呼吸或乙醛酸循环有关;叶绿体MDH主要在光合作用中固定二氧化碳。

在农业生产中,酸性土壤中的铝毒是农作物生长的主要限制因子。研究发现,为了提高植物对土壤中磷元素的吸收,通过遗传工程进行植物分子改良育种,如在苜蓿中超量表达MDH基因后,增强转基因苜蓿对有机酸的吸收,从而提高适应酸性土壤和对付铝毒的

[6,7〗

耐受性。然而当MDH高表达的时候,植物有机酸含量的增多可以增加细胞的渗透压并且可以螯合除去部分离子,从而改善植物对盐的耐受性。最近有人提出,利用嗜盐细菌MDH的转基因技术来提高农作物的耐盐性,如盐生杜氏藻D.salina和D.bardwil是迄今为止发现的最耐盐真核生物,通过对它们的MDH基因克隆和序列的分析,可以为植物的耐盐性研究奠定基[8]

础。

除此之外,在番茄F1杂交种中,利用电泳检测MDH同工酶酶谱之间的差异来鉴定的杂交种的纯度,成为种子生产中一种新的省时省力的检测方法,有利于鉴别高产,抗病,抗逆优势的杂交种,这为农业生产带来较大的经济效益。浙江大学刘艳荷等人通过对西方蜜蜂10个蜂种的MDHII等位基因频率和蜂蜜、蜂王浆、蜂花粉、蜂蜡、蜂毒产量的研究,分析3个等位基因频率与这5个经济性状的相关性,认为MDHII等位基因频率将可能成为蜜蜂生产品质的生化遗传标

第26卷第4期2009年8月记

[9]

生物学杂志JOURNALOFBIOLOGYVol126　No14

Aug,2009

。

MDH在医学方面也引起越来越多的关注,如利用

基因工程疫苗预防人体带绦虫病已是备受关注的研究方向,通过牛带绦虫亚洲亚种MDH基因的生物信息学分析,预测到胞浆型MDH是一个潜在的诊断抗原,这为带绦虫在诊断、药物及疫苗研究中的应用前景提供了重要的线索。后又实验证明其可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达,这为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。同时通过多种重组疫苗联合免疫以求增大疫苗保护效果也成为今后研制绦虫疫苗

[10]

的主要方向。另外徐劲等人对华虫睾吸虫cyMDH活性位点的氨基酸突变研究,(nococcusgranulosus)it,,[11]

能。

利用MDH底物专一性,还可将其用于拆分D,L2苹果酸得到D-苹果酸。D-苹果酸是一种非天然有机酸,是一种极其重要的4-碳有机手性源,主要应用于手性药物、手性添加剂、手性助剂等领域。近年来全世界对D-苹果酸的需求量增加,从而引起了一些国家对D-苹果酸的研究兴趣。利用这种微生物转化法生产的苹果酸,耗能低,清洁环保,是制药行业合成泛酸、信息素及生物碱等手性物质的手性源。

总之,MDHs作为生物体中枢代谢途径的关键酶,国内外对其已进行了较为广泛的研究。目前各种MDHs同工酶正应用于生物分类、物种分化、遗传变异、物种杂交和个体发育等研究。因此深入了解MDHs的生理生化特性、结构及功能、催化机制,对于探讨生物体中MDHs的代谢作用以及一些疾病的分子

致病机制有着重要的意义。同时MDH的应用研究也将会推动MDHs转基因植物及手性药物的进一步发展。

参考文献:

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dehydrogenaseagainstheatinduceddeactivationandthermaldenatur2ation[J].BiochemBiophysResCommun,2006,345:761～765.[2]龚　韧,张大伟.[J].

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酶重组蛋白的表达、纯化及免疫特性分析[J].中国病原生物学杂志,2006,1(4):249～252.

Structureandfunctionofmalatedehydrogenases

WANGXin2ying,WANGBo,HOUSong2tao,ZHUGuo2ping

(1.TheKeyLaboratoryofMolecularEvolution;

2.theInstituteofMolecularBiologyandBiotechnology,AnhuiNormalUniversity,Wuhu241000,China)

Abstract:Malatedehydrogenases(MDHs)maycatalyzethereversibleconversionbetweenmalateandoxaloacetate,whichplayakeyroleinmanymetabolicpathwayssuchasTCAcycle,photosynthesis,C4cycleandsoon.MDHsaredividedintoNAD2dependentMDHsandNADP2dependentMDHs,whichusuallyarehomodimericmoleculesinmostorganisms,includingalleukaryotesandthemostbacterialspecies(somebacterialMDHsaretetramer).Theenzymesshareacommoncatalyticmechanismandtheirkineticprop2ertiesaresimilar,whichdemonstrateahighdegreeofstructuralsimilarity.ThefunctionsofMDHsarebiologicaldiversity,includingenergygenerationinmitochondrial,reactiveoxygenspeciesmetabolisminplants,etc.Basedonthebiochemistry,stereoconformationandcatalysismechanism,theadvancesofMDHsinmolecularbiology,physiology,medicineandagriculturearediscussed.

Keywords:malatedehydrogenase;NAD;NADP;catalysismechanism;function

范文三：苹果酸苹果酸的作用苹果酸片枸橼酸苹果酸钙片肌酸苹果酸dl-苹果酸

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范文四：苹果酸含量的测定苹果酸含量

学生姓名:

学号:

专业: 应用化学

年级班级: 12级C班

课程名称: 现代仪器分析实验

实验时间: 2015年4月24日

实验设计题目用HPLC对苹果中苹果酸含量和研究方法的测定

设计者姓名所属系、年级、专业化学系12级分析检测

指导老师预计字数: 开题日期:

实验目的

(1):进一步了解高效液相色谱仪的组成及各组件的功能。

(2):加深了解外标法的定量原理以及外标法校正曲线的制作。

(3):熟悉紫外检测器的特点和使用方法。

实验方案的设计;

高效液相色谱分析法:

今年来，随着高效液相色谱分析法的广泛应用，最近也已应用于有机物质的分离与测定，此法只需对样品进行离心或简单预处理，而不需要太多的分离处理手续，操作十分简单，其他组分的干扰少。高效液相色谱法最初用于有机物质分析时，采用强阴，阳离子交换色谱树脂的通离子排斥和分配色谱分离有机物质，以示差折光检测器或紫外分光检测器检测。最近由键料在HPLC上的应用，使得采用C18等反相柱分离食品中有机物质。高效液相色谱法

A原理:

称校正曲线法。色谱分析中，在相同的操作下，用已知纯样品配成不同浓度的标准溶液进行试验，测量各种浓度下对应的峰高和峰面积，用峰高或峰面积对浓度做出标准曲线。样品分析时，将相同体积的分析样品进样，从色谱图上求出待测组分的峰高或峰面积，根据标准曲线查出样品中待测组分的含量。

B试剂:

市售的苹果、苹果酸为标准品、甲醇和磷酸为色谱纯、磷酸二氢钾为分析纯、实验室用水为二次蒸馏水。

C仪器:

日本岛津公司的高效液相色谱仪，并与之配置的高压梯度泵、手动进样器、柱温箱、检测器、离心机。

D果实中有机酸的提起:

将果实样品破碎除籽后研磨成粉状，之后准确称取1.000g样品，加入含0.008mol,L磷酸的蒸馏水25ml,在25摄氏度的水浴中震荡浸泡10min，然后在800r,min、4摄氏度的条件下离心20min，取上清液，用0.45pm的水系滤膜过滤后用与HPLC分析。

色谱条件:

C18色谱柱、紫外检测器

有机酸定量方法:

定量:采用峰面积外标法。

讨论与分析:

A流动相成分的选择:

磷酸盐—磷酸体系是反相高效液相色谱法中常用的缓冲盐，常用的磷酸盐有KHPO，24NHHPO和NaHPO.本实验比较了流动相0.01mol,L(Ph=2.75)的KHPO和NHHPO对有4242424424机酸色谱分离效果的影响，发现它们均可将各种有机酸有效分开，然而全波长扫描显示在紫外区KHPO。溶液本身的吸收值要比NHHPO低，检测结果干扰较小，在210nm处，它24424

们的吸收值分别为0.025和0.047，因此本实验选择KHPO。缓冲盐作为流动相。由于过24

高的缓冲盐对于泵和色谱柱容易造成损害，影响柱子的使用寿命，在本实验中流速为1ml/min，温度为25?,用全波分析,采用0.02mol,L,PH=2.75(用盐酸调节至PH为2.75)的 KHPO低浓度(所占体积95%)的缓冲盐，并加以适量的纯甲醇(所占体积5%)，以改24

善有机酸分离效果和峰形。

研究方法:

目前，检测有机酸的方法有分光光度法，薄层色谱法，气相色谱法，液相色谱法。分光光度法以有机酸和一些特定物质的反应机理，能够生成在一定波长下的最大吸收峰的有色物质。但该法易受其他物质的干扰，通常需要将提取液进行沉淀，离子交换树脂等前处理纯化，因此步骤繁琐。气相色谱法的灵敏度和选择性相对较好，但是由于主要的短链有机酸是非挥发性酸，需要将有机酸衍生化，步骤较为繁琐，且常因为发生生化反应不易定量而直接影响检测结果的准确性，因而使气相色谱法的应用受到限制。高效液相色谱法是目前普遍采用的分析有机酸的方法，常用的反相高效液相色谱法(RT-HPLC)和离子交换色谱法。这两种方法中前者是用C18色谱柱，后者是用离子交换树脂柱。高效液相色谱法现广泛应用于蔬及其制品中有机酸含量的测定。

数据处理

1.溶液配制:

0.008mol,L 磷酸(HPOM=98) 34.

磷酸的蒸馏将磷酸溶液用蒸馏水稀释到1000ml的容量瓶中，是其浓度变为0.008mol,L磷酸的蒸水馏水。

的配制: 计算:磷酸分析纯的浓度C=500*1.69*85%/98=7.32mol,L H3PO4

有公式CV=CV得0.008mol,L*1L=7.32mol,L*V 21122

需要磷酸分析纯的体积V=1ML 2

苹果酸苹果酸(CHOM=134) ，465

表液通过计算知配制10ug/ml的标准溶液需准确称量0.0674g苹果酸标准品，用蒸馏水溶解到50的配毫升容量瓶中定容。

制: 计算:由m=CVM得m=0.0674g配制10ug/ml的标准溶液所需苹果酸标准品的质量

配制2ug/ml的标准溶液:有公式CV=CV得2ug/ml*25ml=10ug/ml*v 11222

需要10ug/ml的标准溶液 V=5ml 2

以此类推得出4ug/ml，6ug/ml，8ug/ml需要标准溶液的体积为10ml，15ml，20ml

0.02mo磷酸二氢钾(KHPOM=136) 24，

l/L 将磷酸二氢钾溶液用蒸馏水稀释到1000ml的容量瓶中，是其浓度变为0.02mol,L，

KHPO24PH=2.75(用盐酸调节至PH为2.75)的 KHPO溶液。 24

溶液计算:有公式m=cv*M=(0.02mol,L*1000ml/1000)*136

的配

需要磷酸二氢钾的质量m=2.72g 制:

苹果酸将果实样品破碎除籽后研磨成粉状，之后准确称取1.000g样品，加入含0.008mol,L磷酸

的蒸馏水25ml,在25摄氏度的水浴中震荡浸泡10min，然后在800r,min、4摄氏度的条件样品

下离心20min，取上清液，用0.45pm的水系滤膜过滤后用与HPLC分析。的配

制:

纯甲醇 CHOH(M=34) 3

2实验所得高效液相谱图:

高效液相图泵B浓度95.0%(KHPO低浓度的缓冲盐)泵A浓度5.0%(纯甲醇) 24

特殊实验条件

标准谱图

山西谱图

山东谱图

甘肃谱图

浓度

泵B浓度90.0%(KHPO低浓度的缓冲盐)，泵A浓度10.0%(纯甲醇) 24

高效液相图

特殊实验条件

标准图谱

山西谱图

山东图谱

甘肃图谱

3苹果酸含量计算

实验1: 实验2:

苹果山西样品 1.0903 容量瓶 25 苹果山西样品 1.0903 容量瓶 25 产地: 称取量: g 体积: ml 产地: 称取量: g 体积: ml

流速为1ml/min，温度为 25?, 用全波流速为1ml/min，温度为 25?, 用全波分实实

分析, 采用0.02mol,L,PH=2.75(用盐析, 采用0.02mol,L,PH=2.75(用盐酸调验验酸调节至PH为2.75)的 KHPO低浓度缓节至PH为2.75)的 KHPO低浓度缓冲盐，2424

冲盐，并加以适量的纯甲醇，限制最大压并加以适量的纯甲醇，限制最大压力条条

力17.0MPa最小压力0.0MPa。 17.0MPa最小压力0.0MPa。件: 件:

LC停止时间10min，PDA停止时间10min，LC停止时间10min，PDA停止时间10min，

模式为二元高压梯度。模式为二元高压梯度。特殊泵B浓度95.0%(KHPO低浓度的缓冲盐)，特殊泵B浓度90.0%(KHPO低浓度的缓冲盐)，2424实验泵A浓度5.0%(纯甲醇) 实验泵A浓度10.0%(纯甲醇) 条件: 条件:

苹果酸含量计算苹果酸含量计算

标准曲线: 标准曲线

正常出峰

在保留时间4.357，峰面积10835时测得苹果酸浓度为2.334ug/ml

由于峰往后移了，检测出来的含量为零。所以用

用外标法计算保留时间5.604，峰面积为69562计算得出浓度为

13.96ug/ml。函数为F(X)=5123.99*X-1125.04

用外标法计算。函数为F(x)=4975.23*X+123.23 =CVM/m 苹果酸含量为W苹果酸

得X=13.96ug/ml =2.334*25*134/1.0903

苹果酸含量为W=CVM/m =7171ug/g 苹果酸

=13.96*25*134/1.0903

=42892ug/g

实验1: 实验2:

苹果山东样品 1.2084 容量瓶 25 苹果山东样品 1.2084 容量瓶 25 产地: 称取量: g 体积: ml 产地: 称取量: g 体积: ml

流速为1ml/min，温度为 25?, 用全波流速为1ml/min，温度为 25?, 用全波分实实

分析, 采用0.02mol,L,PH=2.75(用盐析, 采用0.02mol,L,PH=2.75(用盐酸调验验酸调节至PH为2.75)的 KHPO低浓度缓节至PH为2.75)的 KHPO低浓度缓冲盐，2424

冲盐，并加以适量的纯甲醇，限制最大压并加以适量的纯甲醇，限制最大压力条条

力17.0MPa最小压力0.0MPa。 17.0MPa最小压力0.0MPa。件: 件: LC停止时间10min，PDA停止时间10min，LC停止时间10min，PDA停止时间10min，

苹果酸含量苹果酸含量

标准曲线: 标准曲线

正常出峰

在保留时间4.410，峰面积6672时测得苹果酸浓度

为1.522ug/ml

由于峰往后移了，检测出来的含量为零。所以用用外标法计算

保留时间5.593，峰面积为20080计算得出浓度为

函数为F(X)=5123.99*X-1125.04 4.011ug/ml。

苹果酸含量为W=CVM/m 苹果酸用外标法计算。函数为F(x)=4975.23*X+123.23

=1.522*25*134/1.2084 苹果酸含量为W=CVM/m 苹果酸

=4219ug/g =4.011*25*134/1.2084

=11120ug/g

实验1: 实验2:

苹果甘肃样品 1.0123 容量瓶 25 苹果甘肃样品 1.0123 容量瓶 25 产地: 称取量: g 体积: ml 产地: 称取量: g 体积: ml

流速为1ml/min，温度为 25?, 用全波流速为1ml/min，温度为 25?, 用全波分实实

分析, 采用0.02mol,L,PH=2.75(用盐酸析, 采用0.02mol,L,PH=2.75(用盐酸调验验调节至PH为2.75)的 KHPO低浓度缓冲节至PH为2.75)的 KHPO低浓度缓冲盐，2424

盐，并加以适量的纯甲醇，限制最大压力并加以适量的纯甲醇，限制最大压力条条

17.0MPa最小压力0.0MPa。 17.0MPa最小压力0.0MPa。件: 件:

LC停止时间10min，PDA停止时间10min，LC停止时间10min，PDA停止时间10min，

苹果酸含量苹果酸含量

标准曲线: 标准曲线

正常出峰

在保留时间4.410，峰面积5657时测得苹果酸浓度

为1.324ug/ml

用外标法计算

函数为F(X)=5123.99*X-1125.04 由于峰往后移了，检测出来的含量为零。所以用=CVM/m 苹果酸含量为W苹果酸保留时间5.599，峰面积为69577计算得出浓度为

=1.324*25*134/1.0123 13.36ug/ml。

=4381ug/g 用外标法计算。函数为F(x)=4975.23*X+123.23

苹果酸含量为W=CVM/m 苹果酸

=13.36*25*134/1.0123

=44874ug/g

3数据讨论

3.0特殊实验条件泵B浓度95.0%(KHPO低浓度的缓冲盐)，泵A浓度5.0%(纯甲醇)时色谱峰后移的原24

因可能是因为样品注入的时间与表样注入的时间间隔很长的缘故，导致样品的色谱峰后移。 3.1通过苹果酸含量和高效液相色谱图比较得知:特殊实验条件泵B浓度95.0%(KHPO低浓度的缓冲盐)，24泵A浓度5.0%(纯甲醇)与泵B浓度90.0%(KHPO低浓度的缓冲盐)，泵A浓度10.0%(纯甲醇)相互比24

较。在泵B浓度95.0%(KHPO低浓度的缓冲盐)，泵A浓度5.0%(纯甲醇)时苹果酸含量较高，且色谱24

峰较佳。

3.2通过苹果酸含量和高效液相色谱图比较得知:苹果酸含量最多的是甘肃苹果，含量高达44874ug/g 3.3苹果酸对人体的好处:苹果中所含的苹果酸，对人体有七大好处:增强消化功能;降低有害胆固醇的水平;增强心脏功能;降低血压(维持正常的血压);维持正常的血糖水平;使皮肤增白，保持皮肤的光滑滋润;清除体内重金属。

3.4、苹果酸的好处与应用:苹果酸为天然果汁之重要成份，与柠檬酸相比具有酸度大(酸味比柠檬酸强20%)，但味道柔和(具有较高的缓冲指数)，具特殊香味，不损害口腔与牙齿，代谢上有利于氨基酸吸收，不积累脂肪，是新一代的食品酸味剂。苹果酸是人体必需的一种有机酸，也是一种低热量的理想食品添加剂.饮料(各种清凉饮料):苹果酸配制的软饮料解渴爽口，有苹果酸味，接近天然果汁。苹果酸在医药行业的应用在各种片剂、糖浆中配以苹果酸可以呈现水果味，并有利于在体内吸收、扩散。苹果酸可用于药物制剂、片剂、糖浆中，还可以配入氨基酸溶液中，能明显提高氨基酸的吸收率;苹果还可以用于治疗肝病、贫血、免疫力低下、尿毒症、高血压、肝衰竭等多种疾病，并能减轻抗癌药物对正常细胞的毒害作用，还用于制备与合成驱虫剂、抗牙垢剂等。另外苹果酸还可以作为工业清洗剂、树脂固化剂、合成材料增塑剂、饲料添加剂等。苹果酸的保健功能苹果酸为人体内三羧酸循环的重要中间产物，人体内只有苹果酸脱氢酶，所以从结构和实际生理环境来看都必须利用苹果酸。实质上是参与一个新陈代谢和能量转化过程，蛋白质、脂类、糖类等最后都要经过三羧酸循环，这是转化过程的最后一步，也是最为重要的一步，关系到人体生理机能是否正常。而苹果酸的保健功效就在于防止人体由于苹果酸的缺乏导致三羧酸循环不正常，导致代谢失调。苹果酸具有生理活性，广泛地存在于生物体内。

范文五：苹果酸的制备

苹果酸的酶法制备

一、苹果酸的酶法制备

（一）苹果酸生产

1、苹果酸生产机理

L-苹果酸在生物体中普遍存在，它作为三羧酸循环的一员而参与细胞代谢。在一般生物中它只参与循环而不会大量积累，否则会造成代谢流的阻塞。要想积累苹果酸，必须要有补充4碳酸的途径。理论上讲，补充4碳酸的途径有两条：乙醛酸循环和丙酮酸羧化支路。

2、苹果酸生产用微生物

不同的苹果酸发酵工艺要采用不同的微生物。一步法发酵工艺采用的微生物有黄曲霉、米曲霉和寄生曲菌；两步法及混合发酵法采用的有华根霉、无根根霉、短乳杆霉、膜醭毕赤酵母等；酶法转化有短乳杆菌、大肠杆菌、产氨短杆菌和黄色短杆菌等。

3、苹果酸发酵工艺

L-苹果酸的发酵工艺大体可以分为三类：一步发酵法、两步发酵法和酶法转化。一步发酵又称为直接发酵，它用糖类为原料，用霉菌直接发酵产生苹果酸。两步发酵法也是用糖类为原料，先由根霉发酵成富马酸（或富马酸-苹果酸混合物），再由酵母或细菌转化成苹果酸。酶法转化是用富马酸（盐）或马来酸为原料，用微生物酶（包括全细胞）转化成苹果酸。发酵方法利用了微生物酶的立体异构专一性，生产的都是L-苹果酸，是生物体内所存在和可以利用的构型。

（一）酶法转化工艺

酶法转化工艺相当于两步发酵工艺中的转换发酵。转换发酵是将第一步发酵生成的富马酸转化成苹果酸；而酶法转化是用富马酸盐（一般是化学合成的）为原料，利用微生物的富马酸酶转化成苹果酸（盐）。如果转化是以钙盐的形式进行的，则称为“转晶”，即富马酸钙晶体转化成苹果酸钙晶体。

延胡索酸酶

+H2O

延胡索酸（反丁烯二酸）苹果酸（2－羟基丁二酸）

富马酸酶活力短乳杆菌和德氏乳杆菌较好。短乳杆菌在等体积的麦芽汁和肉汤加l0 g/LCaCO3的培养基，于pH 6和37℃培养3天，作为富马酸酶的来源。

上述用干细胞作为酶制剂的效果虽然很好，但从实际生产观点出发，如果不需要分离细菌细胞，而将底物直接加入短乳杆菌培养液中将是更为方便和经济适用的。

（二）固定化细胞转化工艺

富马酸向L-苹果酸的转化只牵涉一步酶催化反应，因此只要把富马酸酶提取出来，固定到载体上，就可以利用固相酶反应柱连续生产L-苹果酸。但实际上酶的提纯手续复杂，

酶的回收率低，成本高。

固定细胞法与固定酶法相比，具有下述优点：

A 、不需要进行酶的抽提和纯化；

B 、与酶提纯过程相比，细胞固定过程中酶活力的保存率较高；

C 、酶的光学活性较高；

D 、成本低

但是，固定化细胞的缺点是有副反应存在，特别是易于生成琥珀酸，这在产品中很难与苹果酸分离。幸运的是，细胞固定之后采用一些化学试剂处理可以排除上述副反应。

1、产氨短杆菌细胞固定与苹果酸生产

产氨短杆菌是用于固定化细胞生产L-苹果酸的最好菌种之一，下面以产氨短杆菌为例介绍固定化细胞生产方法。

产氨短杆菌培养基（%）：

葡萄糖 2 富马酸0.5

玉米浆 1 尿素 0.2

KH 2PO 4 0.2 MgSO 4?7H 2O 0.05

pH7.0

细胞在30℃，好氧培养20～24h 后，用高速离心机收离菌体，再将细胞悬浮于生理盐水中，再用聚丙烯酰胺凝胶包埋，方法如下：

对于16mL 悬浮液，加入丙烯酰胺3g ，N ，N`-甲叉丙烯酰胺0.16g ，5%β-二甲基胺丙腈水溶液2mL 及1%过硫酸钾水溶液2.0mL ，于25℃静置10min 。将形成的凝胶切成3mm 大小的小块。

这种制备好的固定细胞直接使用会有副反应，产生琥珀酸，它在产品中很难与苹果酸分离。工业上，胆汁处理法最为适用。

将固定化产氨短杆菌凝胶块装到酶反应柱中进行连续操作的情况下，当lmo1/Ll的富马酸钠溶液（pH7.0）以0.25h -的稀释速率流过反应柱时，在37 ℃稳定状态下约有80%富马酸转化成了L-苹果酸。固定化细胞反应柱的富马酸酶稳定性与操作温度有关。采用37℃操作温度，反应柱的半衰期约为55天。

2、黄色短杆菌细胞固定与苹果酸生产

黄色短杆菌等富马酸酶活力较高。上述细菌细胞用卡拉胶固定效果更好。卡拉胶也称角叉菜胶，固定方法如下：

8g （湿重）黄色短杆菌细胞悬浮在8mL 生理盐水（45℃）中，将1.5g 卡拉胶溶在34mL 生理盐水中，两者在约50℃混合，冷至约l0℃维持30min 。为了增加凝胶强度，再将它浸在250mLl0.3mol/L的KCl 溶液中，在10℃维持4 h 。这样处理以后，用刀将形成的较坚硬凝胶切成3mm 大小的小块。为了增加富马酸酶活力和抑制琥珀酸生成，固定后的凝胶块要用含0.3%胆汁和1mol/L富马酸钠的溶液，于37℃下静浸20h 。

3、酵母细胞固定与苹果酸生产

（1）材料

活化的酵母细胞、0.05%的CaCl 2溶液、海藻酸钠溶液。

（2）操作步骤

1）海藻酸钠溶液配制

取0.7g 海藻酸钠，放入50ml 小烧杯中，加入10ml 水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全融化，用蒸馏水定容至10ml 。（注意：加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，知道海藻酸钠溶化为止。）

2）海藻酸钠溶液与酵母细胞混合

将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，在转移至注射器中。

3）固定化酵母细胞

以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配置好的CaCl 2溶液中，观察液滴在CaCl 2溶液中形成的凝胶珠的情形。将这些凝胶珠在CaCl 2溶液中浸泡30min 左右。

4）用固定化酵母细胞进行转化生产

将固定好的酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗2~3次。将转化底物配制成一定的溶液，移到三角瓶中，在加入固定好的酵母细胞，封口，转化24h 。

（三）苹果酸的提取和精制

1、苹果酸的提取

通常也采用钙盐法进行提取。

2、苹果酸的精制

苹果酸的精制一般采用离子交换和活性炭联合处理法。

3、苹果酸结晶

对于含杂质很少的高纯度苹果酸溶液：只要茬低于70℃下减压浓缩，使浓度达到65～80%，再冷却到20℃，添加晶种，就能获得高纯度苹果酸结晶。

苹果酸晶体的干燥要求在真空条件下进行，温度控制在40～50℃。干燥后要立即包装，不能长期暴露在湿空气中，否则它易于吸潮而潮解，尤其是L-苹果酸更易潮解。

二、苹果酸的检测

（一）定性检验

1、三氯化钛法

在试管中加入约5mL 待试溶液，滴入3滴15%TiCl3溶液，在几分钟内出现白色沉淀，表明有苹果酸存在。如果气温太低，可将试管握在手中温热，但不能在灯焰上加热，因为煮沸时柠檬酸溶液也有类似反应，生成白色沉淀。这种方法也可以定性草酸，因为草酸溶液在这种情况下显示典型的黄色。

这种方法苹果酸的最低检出浓度为0.5g/L。在有其他有机酸、无机酸或糖存在时，最

低检出浓度有所变化。

2、美国药典法

取样约5g ，溶解于lmL lmol/L硫酸中，加lmL0.0003%的2-萘酚硫酸溶液，混匀。溶液具有蓝色荧光，透射光呈淡黄色。

3．纸层析法

取新华5号层析滤纸，裁成15×20cm 。点样线距底边2cm ，点样间距2cm ，点样量2μL。展开剂：正丁醇：85%甲酸：水=5：5：l 。展开剂平衡3h ，然后放入点好样的滤纸，按上行法展开，展开时间约需3h 。

显色剂：0.2%溴甲酚绿喷雾，有机酸显黄色斑点。也可以用混合显色剂（0.2%溴甲酚绿：0.05%甲基红：0.5mol/1NaOH=l：1：0.15）喷雾显色，有机酸呈桔红色斑点，很明显。各种酸的Rf 值见表3-1。

控制纸层析斑点圆正度的关键除了正确选择滤纸和展开剂外，还要控制展开剂的平衡时间。采用本方法时，平衡时间以3h 为宜。时间过短斑点横向扩散，过长则纵向扩散，甚至拖尾。展开剂配制好后存放8～l0h 以上已经出现分层现象，不再能使用。

（二）定量检验

1、酸碱滴定法

取约2g 苹果酸，精密称定。在一只三角瓶中溶于40mL 新沸过的冷水中，加入酚酞指示剂，用lmol/LNaOH滴定至开始出现粉红色（持续时间不低于30s ）。lmL lmol/LNaOH溶液相当于67.04mg C4H 6O 5。

2、紫外分光光度法

试剂：（1）硫酸96%，分析纯，不含硝酸盐。

（2）2，7-萘二酚溶液：lg 2，7-萘二酚溶于l00mL96%硫酸中。

操作：取lmL 样品溶液（苹果酸浓度控制在0.05～0.8mg/L）加入6mL 试剂（1）中，加入0.1 mL 试剂（2），在100℃下水浴加热15～20rain ，冷至接近室温后，在385nm 紫外光下比色测定。同时以空白水样同法处理，作仪器调零之用。

用纸层析定性后的样品，将显色斑点剪下，用lmL 水洗脱，也可采用此法测定。根据上述在385nm 下测得的吸光度值，可以从标准曲线上查得苹果酸含量。

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