范文一：【doc】两性霉素B的新型制剂及其作用机制

两性霉素B的新型制剂及其作用机制

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国外医药抗生紊分册1996年9月第17卷第5期?363?

1,I/

?一两性霉素B的新型制剂及其作用机制 综述

(中国前科大学抗生素教研室,南京210009) 1前言

真菌感染是临床上较顽固的一类疾病, 常见的皮肤病如体股癣,手足癣等就是真菌 感染体表造成的.一般情况下,真菌不侵入机 体组织,但长期大剂量广谱抗生素,激素,免 疫抑制剂和抗癌抗生素的广泛使用,由此而 引起的条件致病的内脏真菌感染更趋严重, 特别是当机体免疫力下降时(如罹患艾滋 病),真菌就能侵入体内组织引起严重疾病, 尤其是新型隐球菌(Cryptoccus?,H5) 和念珠菌(Candida)的感染,是艾滋病等免 疫缺陷患者死亡的重要原因之一].目前艾 滋病患者的增多,使这一问题更加激化,人们 急切需要高教低毒的抗真菌药.与治疗细菌 病的抗生素比较,抗真菌的化学治疗药还非 常缺乏.迄今对内脏真菌病有效的,即能全身 投用的抗真菌抗生素只有两性霉素B(am— photericinB,AmB),它由结节链霉菌产生, 是唯一可作静脉滴注的多烯类抗生素,对念

珠菌,隐球菌,毛霉,曲霉,组织胞浆菌,芽生 菌,球孢子菌等有强烈的抗菌作用. AmB是抗深部真菌感染的首选药,从结 构上讲,它属于多烯类抗生素.1955年Gold 等发现了AmB,并用于深度和浅表真菌的治 疗,具有广的杀真菌谱和有效性,其耐药性获

,Arab尚存在某些缺点, 得也非常缓慢.然而

对肾有毒性,难溶于水,口服时很少进入血 液,对小鼠静注时ED为11,15mg/kg,急 性毒性相当高.其毒副作用常见的有寒战,高 热,恶心,呕吐,长期使用还会导致肾及循环 系统损害,表现为蛋白尿,氮质血症,低钾血, 贫血等.因此在治疗过程中过程中需密切注 意心电图,肝肾功能及血象等,以便及时调整 R7,

广;

剂量,这就极大地限制了它的应用.为了减少 它的毒副作用,人们采取了一系列措施,其中 之一就是采用新制剂,改变AmB在体内的 代谢和分布,期望达到减小毒性的目的,近几 年出现了一些AmB新型制剂,如两性霉素B 的脂质体(LAMB),胶态分散体(ABcD),混 合微团(AmB-mixMs),这些新型制剂在增 大两性霉素B血药浓度,减慢代谢,降低毒 性方面取得了一定效果,本文就两性霉素B 各种新型制剂及其降毒作用机制作一介绍 2两性霉素B脂质体

脂质体是新型药物载体,由单层或多层 脂质双分子膜包被水相构成,结构如图1水

溶性药物可分散在其中的水相中,脂溶性药 物则可分散于脂质双分子层中:通过脂质体 的携带,改变药物在体内的分布和代谢.脂质 体在20世纪60年代初由英国学者Bang— ham等发现,但当时只作为研究生物膜功能 的近似模型20世纪70年代初,Rahman及 Gergoriadis等开始尝试将其用作药物载体. LAmB的研究起步较早,Vester和Liposome 公司都致力于LAmB的开发.1990年,Ver— ter公司生产的LAmB,命名为两性体 (AmBisome-),曾在爱尔兰上市]. AmBisome是由单层脂质双分子层构成 的两性霉素B脂质体,其中含53.3氢化大 豆磷脂酰胆碱,131胆固醇,21.1二磷脂 酰甘油和125AmB,同AmB传统制剂 DAmB(一种AmB与去氧胆酸钠的混合制 剂)相比,AmBisome可达较高的血药浓度并 具有较大的生物利用度;在毒性实验中, AmBisome显示出比DAmB更低的毒性J. 临床实验中AmBisome也呈现出较好的疗

?364?国外医荮抗生索分册1996年9月第17卷第5期

单屡

表面调节蛋白

脂浩性药物

水浩性药物

围1脂质体结构

效".这种将药物包在脂质体中,利用 AmB与磷脂亲和性高的特点,制成的含

AmB的脂质体,在动物体内的分布及药代动 力学与游离的AmB明显不同.LAmB比 DAmB有较大的治疗指数,就会使那些难治 的深部真菌病患者耐受较高的AmB剂量而 只出现较轻的肾毒性,利于增大剂量达到治 愈效果.

另外,将LAmB气雾化,通过呼吸道给 药也已有报道.比利时的研究者们给粒性 白细胞减少症患者鼻喷雾作预防用药,他们 发现LAmB气雾剂能降低危重病人侵入的 曲霉病的危险.对于深部念珠菌感染小鼠, 以此给药方式给予LAmB后,小鼠的平均存 活时问显着延长,存活率也明显增大. LAmB鼻喷雾给药减小了传统AmB静注给 药方式给医生,病人带来的种种不便,值得人 们进一步研究.

3两性霉素B胶态分散体

两性霉索B胶态分散体(ABCD)由Li— posome公司研制生产.其中含胆固醇和 Arab的摩尔比为lt1.它的稳定性较好,在 50"C可保存6个月而不被破坏.给鼠注射 lmgtkgABCD,血浆峰浓度(c)为102rig/ ml,半衰期(丁1n)平均为27.1h,不象DAmB 那样血药浓度随时间变化幅度较大(c,一 275ng/ml;丁m一10.4h)".人体内药代动 力学实验也显示出类似结果-给健康志愿者 一

次注射1.5mg/kgABCD,半数清除时间平 均为235h,血药浓度维持在0.1mg/L以上

达168h.ABCD在体内代谢比DAmB平 稳而持缓,连续注射时血药浓度波动较小,便 于?临床上控制剂量使血药浓度能持续维持在 有效浓度内,达到较好的治疗效果.

ABCD在体内的分布也有不同于DAmB 的特点.ABCD主要分布于肝脏,而在AmB 的主要毒性部位肾脏则积累较少,只有同剂 量DAmB在肾中浓度的1/3,]/7",于是 肾毒性也相应降低.在治疗方面,ABCD具有 剂量依赖性,对曲毒感染的实验兔,每天给予 最佳剂量5mg/kg的平均存活率明显高于注 射lmg/kgDAmB的另一组实验免0. 4两性霉素B混台微团

两性霉索B混合微团(AmB-mixMs)是 Brajtburg等人在Son~-Allan制备脂质体的 方法上改进制得的.他们将卵磷脂38.7mg

国外医药抗生亲分册1996年9月第17卷第5斯-365?

溶于氯仿387~1中,加入甘氨胆酸钠20.5mg 或脱氧胆酸钠7.?5rag,然后加入两性霉索B O,15rag通氮气流蒸去氯仿,制成含AmB 的复合物称为A111mixMs体外实验表明, 这种制剂对人的红细胞和成纤维细胞的破坏 作用远远小于DAmB,但抗念珠菌及新型隐 球菌的活性仍与DAmB相当.体内实验 也表明AmB—mixMs的毒性小于DAmB.对 白色念球菌感染小鼠注射80mg/kgAmB- mixMs仍然无明显毒性,对新型隐球菌感染 小鼠给药剂量更可高达100mg/kg,而与之

相对比DAmB的最大耐受剂量只有1.5, 2.5mg/kg.用高于DAmB剂量的AmB— mixMs治疗两种真菌感染的疗效均优于 DAmB,但在同等剂量下,Arab—mixMs对念 球菌感染治疗效果较好,而DAmB对新型隐 球菌治疗效果较好""

为了便于比较,现将上述几种AmB新 型制剂及DAmB的一些性质综台列于表1. 5作用机制

确定物质的化学结构及其药理作用的关 系是研制具有高效和高选择性药物的关键. 已经发现包括抗生素在内的许多类有机化合 物的理化参数与生物活性问精确的统计相关 性".多烯大环内酯类抗生素两性霉素B其 作用机制一般可用Dekuijff&Demel的两性 霉素一甾醇类复合体模型来解释,即8分子两 性霉素B与真菌细胞膜的麦角甾醇结合,构 成的小圆筒连成二列,形成贯通细胞膜的管 状小孔,K等细胞内容物渗漏,与之交换, H流入增多".其毒副作用则源自与某些 哺乳动物细胞膜上的胆固醇相结合,破坏了 动物细胞的细胞膜".如前所述,各AmB新 型制荆均能较好的降低AmB的毒副作用, 对其降毒机制,人们做了大量研究,目前较统 一

的看法如下.

5.1各类制剂降低毒副作用的机制

AmB对含有胆固醇的哺乳动物细胞膜 的作用取决于以下两点:(1)游离的AmB浓

度,因为与载体结合的Arab对这些细胞毒 性较小}(2)游离型Arab的聚合状态. AmB有3种存在状态:可溶性单体?可溶性 低聚体,不溶性多聚体,其中以可溶性低聚体 对哺乳动物细胞的毒性最大".值得注意 的是在各类制剂组成中均含有脂类物质, Joly等人认为脂类物质的存在能影响AmB 的存在状态,尤其当脂类与AmB比值 (Lipid/AraB)较大时能促进AmB与脂类物 质结合,游离于载体外的AmB及低聚态存 在的AmB都相应减少,对哺乳动物细胞的 毒性也降低.而对含麦角甾醇的真菌细胞 则不论是AmB单体还是AmB低聚体都有 衰1两性毒素B各种制剂比较

+l有效{++I量散.

?

366?国外医药抗生索分册1996年9月第l7卷第5期

较强的杀伤作用.

5.2两性霉素B脂质体的作用机制 脂质体作为新型药物载体,将药物包入 脂质双分子微囊中,因而具备一些其它制剂 所没有的特点.目前人们对脂质体的研制开 发非常感必趣,应用于抗生素,抗癌药物载体 及免疫佐剂等各个方面0,对其作用机制的 研究也较为深入.LAmB的降毒机制大致有 以下三点:(1)脂质体在体内分布特异性,比 如易被网状内皮系统(RES)内的巨噬细胞所 吞噬而较多地分布在肝,脾等组织,在肾组织

中分布较少,这就减少了两性霉素B对肾脏 的作用"}(2)AmB包被于脂质体之中后,从 肾小球滤过到达肾小管的AmB数量减少, 在肾小管上皮细胞膜上的积聚也相应减少, 肾毒性下降;(3)LAMB进入体内后与高密 度脂蛋白(HDLs)结合占优势.体外实验 表明,这种结合不改变AmB对真菌细胞的 作用,但对人工培养的哺乳动物肾细胞,结合 HDLs的AmB及LAmB的毒性作用均降 低.Wasan等认为哺乳动物肾细胞表达较少 的HDLs受体,脂质体在体内与HDLs结合 后,与这些细胞间相互作用减少,AmB在这 些细胞周围的积累也减少,而在真菌细胞周 围由于受真菌细胞脂酶的影响,游离Arab 的释放不因结合HDLs发生较大改变,抗菌 活性也改变不大.

以上简单介绍了AmB各类新型制剂降 低AmB毒副作用的机制,但由于各类制剂 在组成,结构上存在较大差别,药物进入体内 后又受各方面因素影响,故其作用机制尚待 作深入研究

6结语

在细菌感染性疾病方面的化学疗法取得 了显着进展.相比之下,真菌病,特别是深部 真菌病的化疗方法则明显落后.时至今日,副 作用较大的AmB仍是唯一治疗深部真菌感 染的化疗药物.现在,在实际中使用的抗真菌 抗生素的数量比抗细菌抗生素的数量少得 多.特别是对付日益增加的由条件致病真菌

引起的内脏真菌病.开发低毒性的抗真菌药

物已成为当务之急的研究课题.

为了减轻Arab的毒副作用,人们采用

了一系列手段,包括新型制剂的研究,不但不

降低抗真菌作用,还可能减轻其毒副作用.因

此,制剂研究是药学工作者十分重视的一个

领域,不同剂型对药物在体内的代谢,分布有

很大影响.综上所述,近年来国外对AmB进

行新制剂研究取得了可喜进展,也向人们展

示了多烯类抗生素临床应用的更广阔前景.

在此方面,值得人们进一步努力的方向包括:

(1)继续寻找新载体,新工艺以便大幅度减小

AmB的毒性,降低其生产成本及增加制剂的

稳定性等;(2)力图改变AmB传统的静注给

药方式.创造出可供口服或其它方式给药的

剂型,以便于更有效地,更方便地治疗严重威

胁人们生命的一大难症——深部真菌感染.

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(下转第387页)

国外医药抗生索分册1996年9月第17卷第5期?387?

毒副作用小,安全性大以及良好的药代动力

学性质[.因此.可广泛应用于呼吸道感染,

妇科感染,皮肤和软组织感染,外科感染,胆

道感染,性传播疾病以及耳鼻口腔科感染等

多种细菌感染的一种口服或肠胃外用的广谱

氟喹诺酮抗菌药物.

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范文二：两性霉素B及其脂质体的抗真菌机制

?312??综述?

两性霉素B 及其脂质体的抗真菌机制

陈裕充　温海

(第二军医大学附属长征医院皮肤科, 上海200003)

【摘要】　自20世纪60年代发现两性霉素B 以来, 至今仍是最有效的抗真菌药物; 但由于其对人体的毒副作用大而在临床上的应用受限。近年来, 随着化疗、A I D S 及器官移植患者的增多, 临床真菌感染的病例呈上升趋势。相应的两性霉素B 脂质体的出现也给临床提供了新的治疗手段。所以对两性霉素B 及其脂质体作用机制的研究、探讨有着重要的临床意义。【关键词】　两性霉素B; 真菌; 两性霉素B 脂质体

【中图分类号】　R 379　　【文献标识码】　B 　　【文章编号】　167323827(2006) 0520312203

　　两性霉素B (Amphotericin B ) 是结节性链丝菌(S trepto m yces nodosus ) 生素, 分子式为C 46H 73NO 20。, 但由于其毒副作用较大, 。两性霉素B 的抗真菌机制主要包括:①使真菌细胞膜通透性

, 由于胆固醇分, 平板状结构仅为其多种结。Janina Barajtburg 等认为麦角固醇的平板状结构使其与两性霉素B 的分子间的接触更容易, 即可产生更强的范德华力。因此, 范德华力在决定两性霉素B 与麦角固醇抑或胆固醇间的特

[1]

异性中起更为重要的作用。

固醇分子对调节膜的流动性, 维持膜的正常功能起着非常重要的作用; 两性霉素B 与麦角固醇结合, 使麦角固醇从细胞膜亲脂层中分离出而与两性霉素B 形成二聚体结构, 这些二聚体聚集在一起, 形成中间为亲水性而外侧为疏水性的孔状结构, 且中间亲阳离子, 直径约为0. 4nm 。但两性霉素B 与胆固醇作用的结构使其与两性霉素B 之间的作用较弱, 结合在仅含有胆固醇的膜上的两性霉素B 自身经过头2尾聚合形成二聚体结构, 而胆固醇并

[5]

(见不参与该二聚体结构仍留在膜的亲脂层中

图2) , 仍起调节膜流动性的作用。

两性霉素B 与膜上固醇分子的相互作用结果不但使膜的通透性增高, 引起细胞代谢紊乱(见图3) , 而且其还与两性霉素B 的氧化作用有关。有实验表明:两性霉素B 破坏细胞的能力可被胞外自

[1, 6, 7]

由基清除剂、低氧状态等所抑制, 而胞外前氧化剂等的存在能提高其杀灭白念珠菌及原生质体

[8, 9]

的能力。该实验表明可能是由于膜的通透性增高而自由基等更易渗入细胞内所致。另外, 结合在膜上的两性霉素B 分子可自身氧化形成自由基。1. 2　作用

[10]

B rajtburg 等根据两性霉素B 与L 型细胞的

增高。②氧化作用。其毒副作用也主要由于两性霉素B 能与人体细胞膜上的胆固醇结合而产生与上述相似的作用有关。1　传统的两性霉素B 制剂1. 1　分子基础

两性霉素B 是含37个碳原子组成的大环内酯乳糖七烯类的抗生素, 在其C 218上带有一羧基基团。两性霉素B 与细胞膜上固醇的相互作用主要与其分子结构有关, 包括

[1]

:①氢键:通过H 2O 分

子, 在固醇的3位羟基与两性霉素B 的C 218位上

的羧基形成氢键, 其作用因乳糖中含有氨基基团而加强。有实验表明

[2, 3]

, 若使该处的氨基乙酰化则

两性霉素B 的抗真菌及破坏红细胞的能力均下降, 而实际上氨基基团也参与形成氢键(见图1) 。②范德华力:具有由7个共轭双键组成了其刚性结构的两性霉素B 与固醇分子间存在范德华力的作用; Hever 等实验表明, 两性霉素B 对含麦角固醇膜

[4]

的敏感性较含胆固醇膜的敏感性高与在C 222处有双键结构的麦角固醇的碱性侧链有关。范德华力的强弱与相互作用的2个分子间的距离有关。从

作者简介:陈裕充(19752) , 男(汉族) , 博士, 主治医师.

?313?

相互作用, 将两性霉素B 的作用分为剂量依赖性的三个阶段:①刺激性阶段:在此阶段, 两性霉素B 对

[10][11]

所有类型的细胞, 如L 型细胞、巨噬细胞等的作用效应均为双相性, 即在刺激的浓度下(此浓度要比后2个阶段所需的浓度低) , 随着两性霉素B 的浓度升高, 细胞内的DNA 或RNA 的产量先增

②穿孔化阶段:当两性霉素B 浓度增高时, 就在真菌细胞膜上的麦角固醇形成二聚体, 多个二聚体聚集形成“孔道”结构, 从而导致真菌细胞膜的通透性增高, 阳离子外漏等。两性霉素B 及其胶状分散剂的作用如图4所示。③致死性阶段:当两性霉素B 浓度进一步增高时, 两性霉素B 可杀死真菌细

[1]

胞。Ja m ia B rajtburg 等认为两性霉素B 使细胞死亡并非单纯由于膜通透性增高所致。可能是由于膜通透性增高而使胞内离子紊乱及其他成分丢失等因素, 从而导致细胞代谢紊乱; 而胞外自由基的进入加剧了细胞内代谢紊乱, 并可使细胞内结构破坏

。

强, 随后下降。因此, 此阶段不反映细胞的损伤程度, AKR 小鼠的巨噬细胞较C57BL /6小鼠的巨噬细胞具更强的抵抗两性霉素B 的能力, 而两性霉素B 能刺激前者产生更强的呼吸, 这说明细胞的反应

[1]

受其内源性抗氧化应激能力的影响。在新生隐

[12]

球菌, 这种影响可能与菌体产生的黑素有关。

图1　两性霉素B 与固醇分子间的氢键作用(摘自参考文献1) 　图2　两性霉素B 与细胞膜相互作用模型(摘自参考文献5) a . AmB 与麦角固醇的作用b . AmB 与胆固醇的作用　图3　两性霉性B 的作用机制(摘自参考文献14) 　图4　两性霉素B 及其胶状分散剂(Aphocil ) 与细胞膜相互作用结果(摘自参考文献14)

F i g . 1　The bond bet w een the AmB and ster oid (fr om ref 1) 　F i g . 2　The model of interacti on bet w een AmB and cell me mbrance (fr om ref 5) 　F i g . 3　The antifungal mechanis m of AmB (fr om ref 14) 　F i g . 4　The antifungal effect of AmB and Aphocil (fr om ref 14)

　　当然上述的三个阶段是人为的划分, 但也说明了两性霉素B 在低浓度下有抑菌的作用, 而在高浓度下有杀菌的作用。2　两性霉素B 的脂质体

霉素B 脂质体(AmB is ome ) :将两性霉素B 包裹在

含带饱和脂肪酸侧链的磷脂和胆固醇的脂质微粒中。②两性霉素B 脂质体复合物(Abelcet, ABLC ) :两性霉素B 与磷脂复合物构成带状结构。③两性霉素B 胶状分散剂(Amphocil, Amphotec, ABCD ) :两性霉素B 与胆固醇硫酸酯结合形成小

两性霉素B 的脂质体主要有3种

[13]

:①两性

?314?脂质片状物。这些制剂由于改变了药理学的分布

而比通常应用的两性霉素B 胶质颗粒悬液毒性作用小。由此临床上将越来越常用两性霉素B 的脂质体。

两性霉素B 的脂质体是用双嗜性(亲水性及亲脂性) 的氢化豆磷脂胆碱(HSPC ) 、双脂醇磷酸甘油(DSPG ) 及胆固醇分子等组成双层结构的脂质体, 中央为亲水性, 因而两性霉素B 可存在于其中央。由于两性霉素B 具有亲脂性, 所以它可以与磷脂及胆固醇通过非共价结合于脂质体的疏水层中。两性霉素B 还通过电荷间的作用而与脂质体连接, 如两性霉素B 氨基基团与DSPG 的磷酸根及两性霉素B 的多烯结构与DSPG 的氯喹残基等; HSPC 及DSPG 可增高脂质体的稳定和坚固性, 而胆固醇主要用于稳定脂质体并使两性霉素B 相关的副作用减少, 胆固醇的作用与其浓度有关; []

素B 两性霉素。B 脂质体可在真菌感染部位聚集并发挥抗真菌作用; 体外研究表明不含两性霉素B 的脂质体对真菌无效。总之, 两性霉素B 脂质体的主要有效的抗真菌成分还是两性霉素B; 其抗真菌的机制还是与两性霉素B 相关。两性霉素B 脂质体的作用机制可归结为以下几个

[14]

方面:①两性霉素B 结合于两性霉素B 脂质体内, 所以其不易扩散入水溶性介质中。②两性霉素B 脂质体可在血液中存在较长的时间。③两性霉素B 脂质体主要聚集于感染的组织及细胞。④两性霉素B 脂质体直接作用于真菌细胞而起杀菌的作用。⑤在两性霉素B 脂质体中的两性霉素B 对哺乳动物细胞的作用极小。3　临床意义

实验表明:制霉菌素在诱导真菌细胞K 离子外

漏的能力与两性霉素B 相当或稍弱, 而诱导红细胞

+

中的K 离子外漏要比两性霉素B 弱的多, 因此制霉菌素可作为未来有效的治疗系统性真菌感染而被研究。总之, 对两性霉素B 抗真菌机制等的研究有助于临床上攻克真菌感染, 减轻药物的副作用而使患者受益。

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(下转第307页)

[3]+

对两性霉素B 抗真菌作用机制的研究有助于

人们改进其制剂, 甚至选择出新的多烯类抗生素, 提高抗真菌效能, 减少副作用。如两性霉素B 脂质体, 在对小鼠的静脉注射两性霉素B 的研究中, 两性霉素B 脂质体的急性毒性作用至少较传统的制剂低75倍。再如, Jania B rajtburg 认为具有一个自由羧基及氨基基团的七烯类抗生素均可与膜上的固醇分子起到与两性霉素B 相似的作用, 如Vacedin A , 这为筛选新的抗生素提供了可能。制霉菌素较两性霉素B 少一个双键而结构相类似, 有

[14, 15]

[1]

?307?

图8　尿涂片P AS 染色(×400倍) 　图9　白念珠菌培养的镜下特征(×400倍) 　图10　(×400倍) 　图11克柔念珠菌培养的镜下特征(×400倍) 　图12　(×倍) (×400倍) 　图14　新生隐球菌在S DA 培养基上的形态　图15　() F i g . 8　U rine 2s mear (P AS ×400) 　F i g . ic of C. (×. 10oscop ic feature of C. tropica lis (×400) 　F i g . 11　M icr oscop ic feature (. 12　M ic of C pa rapsilosis (×400) 　F i g . 13　I ndia ink p reparati on (×400) 　F i g . 14　The C ora S DA 　F i g . 15　M icr oscop ic feature of C ryptococcus neofor m ans (×400)

[收稿日期]　2006209229[本文编辑]　王　飞

(上接第314页)

[12]　W ang Y, Casadevall A. Gr owth of C ryptococcus neofor m ans in

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[收稿日期]　2006203214[本文编辑]　王丽娟

范文三：海藻酸钠两性霉素B对杜氏利什曼原虫前鞭毛体作用体外实验研究

海藻酸钠两性霉素B对杜氏利什曼原虫前

鞭毛体作用体外实验研究 6

海藻酸钠两性霉素B对杜氏利什曼原虫

前鞭毛体作用体外实验研究

王雅静曹伟民马莹

[摘要]目的治疗犬利什曼病,消灭保虫宿主.达到预防黑热病的目的.方法观察海藻酸钠两性霉素B在不同浓度

对杜氏利什曼原虫(L.d)江苏株及L.d四川人株前鞭毛体的体外作用.采用显徽镜下观察试验.结果实验组3十不

同浓度(10ug/ml,5t.~/mt,12t.~g/mt)的药物作用48h后,培养基颜色未变(红)+虫体活动变慢,虫数减少,抑制

率升高(L.d江苏株的抑制率由70%升至93%,L.d四川人株由82『{6升至96%).染色后见虫体变形,核,动基体不完

整,胞质内出现多十空泡,鞭毛脱落.对照组的培养基颜色变黄.虫体运动活跃.大部分呈长梭形,并排成菊花状.染

色后虫体呈长梭形,核,动基体,胞骥及鞭毛完整,清晰.结论海藻酸钠两性霉素B对杜氏利什曼原虫有较强的体外

抑制作用

[关键词】两性霉素B_海藻酸盐;L.d前鞭毛体;镜下观察

[中圈分类号】R382.22【文1畸标识码】A[文1畸编号】1006—4028(2帅1)06—0431—02

Stay帆theE~vet0fAl~nateAmolml~kinB帆lx4shmmlla哪?pr帆船ti畔嚣inVitro.WangYa-jing,

Welmin,MaYing.DepartmentofRIr岫蝴

WestChinaUniversityoy'MerlicalSciences.Chengdu610041,China.

Abstrjt0hI酬veInordertotr~.tcanineLeishmaniaslsforeradicationofresw廿

bestandprevention.fk8la—arazlVletlmd

WeobservedtheeffectofalhateamphoterlcinaBatdifferentconcentratkTn?

prornastlgotesofLelshmalnadonovanl;nvitm withmi~pyR~mltItwasfoundthatinthegroupswithal/late~~nphotericlnBat10t.~g/m[,5ug

/mt,1/~g/mL,the

mediumcotorshowedunchanged(red).theactivityofpromastigotessloweddownandthent

maherofprc*aaastlgotesdecreased

(InhibitionrateofLd—JangsuisolateandLd—

Sichuanhtartaniateroseform70%to93%and82%船96%respective—

ly).Afterwrightdyed.prc~aasugoteslookeddistortedwithdisintegratiortofnucleusandkin

etoplasts,aVpearance.fvacuolesin

cytophm~andexl'otiadonofflagdla.Incontrolgroup,mediumtumedydlowPr.rrIas石科

esereactive,mostofwhichwere

fuslfcemandarrangednshapeofchrysanthemunAfterWrightdyed.prcmatappeareafusifor

mwithc[earn~madinte—

grationofnucleus.klnetoplasts.Ilagetlaandceilnu~mbraneC~elnslonItw?

reportedthattheL.曲rvan(pro~goms)

wetshightyinhibltedbya[ginatemrtphotericineI3 KeywordsAmphotericinI3;A]ginate;L.d—prcrtmstigotes;Microscopicobservation 我国黑热病虽在大鄄分地区已达到基本消灭,但近年来山

丘疫区有明显回升,以陇南,川北尤为突出….如川北波川县

犬内脏利什曼病的感染率高达36.8%J.犬是杆氏利什曼原

虫的保虫宿主之一,对内脏利什曼病的传播起着重要作用,但

山区群众普遍有养犬看家.狞猪及保护农作物的习惯,一户养

犬可多达数只.犬的数量愈来愈多,大范围灭犬措施难以被群

众所接受.因此,非常需要一种治疗犬内脏利什曼病的药物,

可生物降解高分子用作药物载体具有生物相容,无毒,安全等

优点_]J.选用海藻酸钠两性霉素B对L.d前鞭毛体进行体外

实验.以初步观察该药对L.d的体外作用.

1材料与方法

1.1杜氏利什曼原虫及其培养用L.d的国际编码及所采自 然地区为?L.d江苏分离株(简称L.d江苏株):MHOM/CN/ l率西匾科太学寄生虫学甚研究(成都610041) 2中圆科学院成都有机化学研究所

84/JS1.平原疫区;?L.d四川人分离株(简称L.d四JI1人 株)}MHOM/CN/86/SC6.山丘疫区.两株前鞭毛体均在本 室NNN培养基传代保种,扩大培养时转人M199复台液体培 养基.含小牛血清15%.培养温度25,27?.

1.2药物及试剂两性霉素B,上海先锋药业公司生产;海 藻酸钠,化学纯,上海化学试剂站;氯化钙,分析纯,成都临 扛化工厂生产.

1.3方法

1.3.1阴离子多糖毫微粒的制备及两性霉素B的携载_4按 [4j的方法.进行.

1.3.1镜下观察试验将199培养基中处于对数生长期的L.d 江苏株和L.d四川人株前鞭毛体悬液调至5×i0s/rrd.然后分 别移人24孔细胞培养板内.每株设置9孔,每孔0.9rrd,每3 孔为一组,分别为实验组,阳性对照组和阴性对照组.实验组

每孔加海藻酸钠两性霉素B各0.1.浓度分别为10g/m[, 5btg/nd和lt~g/ml;阳性对照组加与实验组相应瞎度的两性霉 素B各0Iml[5];阴性对照组加海藻酸钠各0.1m【,浓度为 10/~g/m[.标本置26?培养,连续观察48h.

结果判断:a.肉跟观察培养基颜色的变化;b.倒置显微 镜下观察前鞭毛体的活动度;c光镜下观察前鞭毛体的形态, 并以自细胞计数板计数,计算增殖抑制率.增殖抑制率=(对 照组虫数一实验组虫数)例照组虫数×100%;d.瑞氏染色 后观察前鞭毛体大小和形态.

2结果

2.1海藻酸钠粒子的制备由离子凝腔作用所产生的阴离子 多糖毫微粒.其粒径约30,100nm,并且对两性霉素B具有 优良的携载性能,携载效率超过90%

2.2镜下观察L.d江苏株与l_d四川人株在海藻酸钠两性 霉素B或两性霉素B作用下,于48h呈现明显抑制作用 2.2.1培养基颜色变化实验组颜色未变,仍为红色,对照 组颤色变为淡红.最后变黄.

2.2.2活动度实验组前鞭毛体活动度差,以至几乎不动. 虫体大部分变为圆形或不完整.对照组虫体活跃,大部分呈长 梭形,排成菊花状.

2.2.3计数随着药物浓度的升高,前鞭毛体数量下降.抑 制率升高,L.d江苏株的抑制率由70%升至93%,L?d四川 人株由82%升至96%.

2.2.4染色观察实验组两株前鞭毛体变形,呈不规则,椭 圆形,鞭毛脱落,胞核及动基体不完整,胞质内有空抱出现. 对照组虫休长棱形,核,动基体,鞭毛,胞膜完整清晰,可见 虫体以纵二分裂方式繁殖.

要

510l5

浓度(~g/m1)

注:——lJ.d江苏株.?…-I|d四川人株

国l海藻酸钠两性毒素B对I.d江苏株,1..d四川人株 的抑制作用(镜下计数)

preyMM【nfDec2001,.17.No6 3讨论

从40年代起,五价锑郧为最广泛用于治疗利什曼病的药 物.但近年来,对锑剂耐药或疗效不佳的病例不断增加.而 且五价锑治疗病大效果不好.两性霉素B对治疗黑热病有较

好的疗散,但其较强的毒性限制了其在临床上的应用….我们 采用海藻酸钠作为两性霉素B的载体基质,其由正负离子作 用所产生的阴离子多糖毫微粒对两性霉素B具有优良的携载 性能,而且携载于海藻酸钠粒子上的两性霉素B可从粒子载 体上逐渐释放出来.该控释系统可延长两性霉幕B的作用时 间,对陴低两性霉索B的生物毒性也有重要作用.

海藻酸盐为从悔藻中提取的卜.4,口一D甘薅糖醛酸和 一

L右洛糖醛酸残基的共聚物.无毒,生物相窖,与脂质体 比较,对网状内皮系统具有较好的靶面作用引.本实验结果 表明海藻酸钠两性霉豢B对杜氏利什曼原虫有较强的体外抑 制作用,可进一步用于治疗实验犬内脏利什曼病,以达到消灭 保虫宿主,预肪黑热病的目的.并且可能为治疗黑热病人提供 动物实验依据.

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??舳帅帅即0

范文四：两性霉素B与鞘磷脂单分子层的相互作用

Vol. 34高 等 学 校 化 学 学 报 No. 92013年 9月 　 　 　 　 　 　 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES　 　 　 　 　 　 2125~2130　 　 doi:10. 7503/cjcu20121137

两性霉素 B 与鞘磷脂单分子层的相互作用

乔进京 , 孙润广 , 郝长春 , 杨 　 静 , 马秀梓 , 王小梅

(陕西师范大学物理学与信息技术学院 , 生物物理与生物医学工程研究室 , 西安 710062)

摘要 　 选取哺乳动物生物膜中的重要脂质分子鞘磷脂 (SM) 作为单分子膜的基本组分 , 采用 Langmuir? Blodgett(LB)膜技术研究了不同比例的两性霉素 B /鞘磷脂单层膜的表面压力 ? 平均分子面积 (π?A ) 曲线以及 基于 π?A 曲线的混合性分析 , 同时通过原子力显微镜 (AFM) 研究了其表面形态的变化 . 结果表明 , 组分间 的摩尔比和表面压力对混合单层膜稳定性 二 混合性以及分子间相互作用具有重要影响 .

关键词 　 两性霉素 B; 单层膜 ; 鞘磷脂 ; π?A 曲线 ; 原子力显微镜

中图分类号 　 O621; O641　 　 　 　 文献标志码 　 A　 　 　 　

收稿日期 :2012?12?18.

基金项目 :国家自然科学基金 (批准号 :20772077)二 教育部高等学校博士学科点专项科研基金 (批准号 :200807180001)二 陕西省 自然科学基础研究计划 (批准号 :2012JQ1002) 和中央高校基本科研业务费专项项目 (批准号 :GK201102029) 资助 .

联系人简介 :孙润广 , 男 , 博士 , 教授 , 博士生导师 , 主要从事生物物理学研究 . E?mail: sunrunguang@snnu. edu. cn 两性霉素 B(AmB)是一种手性多烯类真菌抗生素 , 是治疗侵入性感染的重要药物 [1,2], 主要通过 影响细胞膜通透性抑制真菌的生长 . 由于两性霉素 B 具有明显的肾毒性 [3,4], 会引发恶心 二 呕吐 二 食欲 不振及蛋白尿等副作用 , 所以临床主要用于治疗肺部等深部真菌感染的病情危重患者 [5]; 但对临床真 菌感染症状不明显 二 皮肤或血清试验阳性的患者不宜选用 . 出现这些症状和问题的机理尚不清楚 . 目 前 , 对两性霉素 B 的研究多集中在医药学领域中与脂质体相结合讨论其临床药剂的改善与制备 [6], 缺 少其与生物膜分子之间相互作用的实验依据和作用机理的研究 . 鞘磷脂 (SM) 与抗生素类药物作用具 有重要的生物医学意义 . 探讨两性霉素 B 与生物膜分子的相互作用机理对阐明其治疗真菌感染的机制 以及毒副作用非常重要 . 胆固醇和鞘磷脂是哺乳动物生物膜中两类重要的脂质分子 , 广泛存在于哺乳 动物的质膜中 , 是维持细胞膜结构的重要骨架分子 . 已有文献报道了不同比例或不同结构的固醇与鞘 磷脂间的相互作用 [7,8]对脂膜结构弹性及可溶性等参数的影响 [9,10], 尤其是鞘磷脂的代谢产物参与了 细胞的生长 二 分化和凋亡 [11]等重要生理活动 , 鞘磷脂与鞘磷脂酶 [12,13]以及神经酰胺 [14,15]的作用密切 相关 . 本研究组 [16]通过 LB 膜研究了两性霉素 B 与胆固醇的热力学特性 , 讨论了二者间的相互作用参 数 , 发现它们的相互作用可能与抗生素治疗真菌感染的机制有关 , 值得深入研究 . Langmuir?Blodgett(LB) 膜技术既提供了表面压力与平均分子面积 (π?A ) 曲线的基础实验数据 , 又 为单层膜转移至云母片供原子力显微镜观察提供了可能 , 是目前对有序单分子层制备和研究的最方便 有效的方法和手段 [17], 它通过精密的机械装置与电子系统的结合来精确控制薄膜厚度和表面压力等 重要参数 , 为生物膜理化特性的研究提供了重要的技术手段 . 原子力显微镜 (AFM) 是一种扫描探针显 微镜 , 它利用探针与样品分子间作用力观察样品表面形貌 [18], 被广泛应用于纳米尺度表面形貌结构的

研究 [19,20]. 本文采用 LB 膜技术与 AFM 相结合的方法 , 对两性霉素 B 与鞘磷脂单层膜的作用进行了研 究 , 利用 LB 膜技术模拟组装生物膜测得表面压力与平均分子面积 (π?A ) 曲线 , 并在该曲线的基础上计 算平均分子面积 二 过量平均分子面积 二 弹性模量和过量吉布斯自由能等参数 , 通过不同组分比例的混 合单层膜的对比来评价两种组分分子之间的可混合性和相互作用 , 并利用 AFM 观测表面形貌特征 , 从 而对其相互作用机制及理化特性进行研究 . 本研究不仅对研究两性霉素 B 与细胞膜作用机理和稳定性 有重要生物学意义 , 也为进一步降低药物毒副作用 二 指导临床治疗提供了实验参考依据 .

1　 实验部分

1. 1　 试剂与仪器

两性霉素 B(AmB)和鞘磷脂 (SM) 均购自 Sigma 化学试剂公司 ; N , N ? 二甲基甲酰胺 (DMF) 购自

Amresco 化学试剂公司 ; 氯仿和乙醇等其它试剂均为分析纯 ; 实验用水为二次蒸馏水 . LB 设备为芬兰 KSV 公司生产的 Mintrough 型膜仪 , 滤纸吊片式膜天平测量范围 0~150mN /m, 测 量精度 4μN /m; SPM?9500?J3 型原子力显微镜 (日本岛津公司 ), 压电扫描器最大扫描范围 55μm×55 μm, 扫描速率 1. 0Hz, 扫描模式为接触模式 ; NSG20型扫描探针 (俄罗斯 NT?MDT 公司 ), 三角形微悬 臂 , 共振频率 260~630KHz, 弹性系数 28~91N /m. 1. 2　 实验方法 1. 2. 1　 π?A 曲线测量 　 将 SM 溶解于 V (氯仿 ) ∶ V (甲醇 ) =3∶ 1的溶剂中 , 将 AmB 溶解于 V (DMF) ∶ V (1mol /L 盐酸 )=3∶ 1中的溶剂中形成浓度为 0. 5μmol /mL 的有机溶液 . 用微量进样器将适量的溶液 均匀滴加到纯水亚相表面 , 令其自 动 迅 速 铺 展 , 15min 后 亚 相 表 面 的 有 机 溶 剂 完 全 挥 发 , 以 10mm /min 的速度压膜 , 膜表面压力由滤纸吊片式膜天平监测 , 并用计算机自动记录数据 , 每次测量后完 全去除亚相 , 彻底清洗滑障和水槽 , 每组实验重复 3次 . 1. 2. 2AFM 表征 　 根据测得的 AmB /SM 单分子层完整 π?A 曲线 , 选定在合适的膜压下使用垂直镀膜法 镀单层膜 , 进行 AFM 观测 . 镀膜方法 :先将新解离的云母基底竖直插入亚相中 , 再均匀滴加 AmB /SM 溶液于亚相表面 , 静置 15min 待有机溶剂完全挥发后 , 压缩单分子层 , 达到选定的合适膜压后静置

10min, 待单分子层稳定后以 5mm /min 的速度用垂直提膜法将空气 /水界面上的单分子层转移到云母 基底表面 , 制得单层 LB 膜以备观测 . 2　 结果与讨论

2. 1　 表面压力 ? 平均分子面积 (仔鄄A ) 曲线的测定与相关分析 2. 1. 1　 π?A 曲线的测定 　 图 1为 AmB 和 SM 的分子结构图 , SM 由 1个亲水性头基和 2条疏水性饱和 长烃链组成 , 是典型的双亲性分子 [图 1(B)],低膜压时形成液态扩张 (LE)单分子层 , 高膜压下呈液 态压缩 (LC)相 , 在膜压为 15~20mN /m 时出现 LE?LC 共存相 , 崩塌膜压约为 63mN /m, 与文献

[21]

Fig. 1　 Molecular structures of amphotericin B (A ) and sphingomyelin (B )

Fig. 2　 Surface pressure?mean molecular area isotherms of AmB /SM monolayers

报道一致 . AmB 结构呈环状 [图 1(A)],表面活性较低 , 最终膜压约为 19mN /m.

图 2为不同摩尔比的 AmB /SM 单分子层的 π?A

曲线 , X AmB 表示 AmB 的摩尔分数 . 由图 2可见 , 当

X AmB =0. 2和 0. 4时 , 混合单分子层 π?A 曲线的形 状与纯鞘磷脂相似 , 但崩塌压略有下降 ; 当 X AmB =0. 6和 0. 8时 , π?A 曲线的形状接近纯 AmB, 最终 崩塌压明显下降 , 说明此时脂质单分子层的结构受

到严重破坏 . 随着 AmB 比例的增加 , π?A 曲线有规

律地排列在两种单一组分之间 . 纯 SM 与其它组分

单分子层 (X AmB =0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8) 的 π?A 曲线 有交点 , 在交点所对应膜压以下时 , 相同膜压的混 6212高 等 学 校 化 学 学 报 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 Vol. 34　

合单分子层的平均分子面积大于纯 SM, 表明此时 AmB 导致 SM 单分子层扩张 ; 在交点膜压以上时 , 相 同膜压下的混合单分子层的平均分子面积小于纯 SM, 表明此时 AmB 导致 SM 单分子层凝聚 . 同时 , 不 同组分的 AmB /SM 二元系统单分子层的 π?A 曲线在表面压力约为 12mN /m 时发生了翻转 , 表明 SM

和 AmB 的结合程度与表面压力有密切的关系 .

2. 1. 2　 AmB /SM 单层膜弹性模量 　 弹性模量 C -1S 是分析单层膜材料性能的重要参数 , 能反映单分子层 分子的有序程度和抗压能力 [22], 计算公式如下 :

C -1S =-A π ? ()A (1)

该式是等温条件下单层膜表面压力 π 关于分子面积 A 的偏导 , 其中下标 S 表示单层膜的横截面积 ,

A

Fig. 3　 Elastic modulus (C -1S ) vs. surface pressure (π ) dependency on AmB /SM monolayers

表示平均分子面积 , π 表示表面膜压 . C -1S 越大 , 单 分子层刚度越大 , 抗压能力越强 , 可压缩性越小 ,

有序度越高 . 图 3示出了不同摩尔比 AmB /SM 单层

膜的弹性模量的规律性变化 . 可见 , 随着 AmB 比例

的增加 , 混合单层膜的弹性模量呈规律性变化 , 按

浓度的大小依次分布在纯 SM 和 AmB 的弹性模量

曲线之间 . AmB 的含量越高 , 混合单层膜的弹性模

量越低 , 此时的膜抗压能力越弱 , 有序度越低 . 所

得数据表明 , AmB 与 SM 相结合降低了混合单层膜

的弹性 . 这与后文中混合单层膜的 AFM 图像中观

察到的结果一致 . 研究结果表明 , AmB 与细胞膜分 子 SM 作用降低了膜的弹性 . 进一步证明 AmB 主要通过影响细胞膜通透性来抑制真菌的生长 . 2. 1. 3　 AmB /SM 单层膜的平均分子面积和过量分子面积 　 在 π?A 曲线的基础上 , 可以通过单层膜的 平均分子面积和过量分子面积等混合方程研究 AmB /SM 的相互作用情况 [23]. 在理想的混合条件下 , 有如下方程 :

A id =A 1X 1+A 2X 2(2)式中 , A 1和 A 2分别为一定膜表面压力下单一组分的平均分子面积 , X 1和 X 2则分别为组分 1和 2在混合

单层膜中所占的比例分数 , A id 表示两种组分理想混合状态下的平均分子面积 . 图 4示出了 AmB /SM 混 合单层膜在表面压力分别为 5, 7. 5, 10, 12. 5, 15和 17. 5mN /m 时的平均分子面积和有效分子面积 , 其中实线部分表示有效分子面积 , 虚线部分表示理想状态下两种组分的平均分子面积 . 由图 4可见 , 有效分子面积曲线与平均分子面积曲线并未重合 , 表明混合单层膜的两组分发生了相互作用 . 随着表 面压力的增加 , 平均分子面积减小 , 有效分子面积曲线与平均分子面积曲线也越来越靠近 , 说明表面 压力越大 , 分子间越紧密 .

Fig. 4　 Mean molecular area of AmB /SM mono?

layers at certain surface pressure Fig. 5　 Excess area per molecule of AmB /SM monolayers at certain surface pressure

过量分子面积也常用于分析不同分子间的相互作用 , 计算公式如下 [24,25]:A ex =A 12-A id =A 12-A 1X 1-A 2X 2(3)7212No. 9　 乔进京等 :两性霉素 B 与鞘磷脂单分子层的相互作用

式中 , A 12表示混合单层膜的有效分子面积 , A ex 表示混合单层膜的过量分子面积 , 当组分 1和 2不发生 相互作用时 , A ex 的值为 0[26]. 如果有效分子面积与平均分子面积出现偏差 , 正偏差表明分子间作用力 为斥力 , 呈现分子扩张而不易混合 ; 负偏差则表明分子间作用力为引力 , 呈现分子收缩而易于混合 . 由图 5可见 , 当 X AmB =0. 2和 0. 4时 , 过量分子面积均呈现正偏差 , 表明此时分子间相互作用为斥

力 ; 而当 X AmB =0. 6时 , 较高表面压力 (π =15和 17. 5mN /m) 下混合单层膜的过量分子面积首先出现 了负偏差 , 表明此时分子间相互作用为引力 , 其它表面压力条件下的混合单层膜的过量分子面积仍为 正偏差 , 此时分子间相互作用仍为斥力 ; 当 X AmB =0. 8时 , 除在较低表面压力 (π =5mN /m) 下仍为正

偏差外 , 在选取的其它表面压力下 , 混合单分子层均实现了先扩张后收缩的翻转过程 . 实验结果表明 , AmB /SM 混合单层膜的分子间相互作用力的转变与表面压力和分子间距有重要联系 . 2. 1. 4　 AmB /SM 单层膜的热力学特性分析 　 混合单层膜组分间的相互作用和稳定性可以通过熵 二 焓 和自由能等相关的热力学函数进行分析 [27]. 本实验采用过量吉布斯自由能来研究 AmB /SM 混合单层 膜的相关热力学特性 . 过量吉布斯自由能表达式如下 [24,15]:ΔG ex =∫ π 0A ex dπ =∫ π 0(A 12-A 1X 1-A 2X 2)d π (4)

式中 , A ex 为过量分子面积 , π 对应选定的膜压 , 当组分 1和 2理想混合时 , Δ G ex 等于 0, 不同组分的分 子间未发生相互作用 ; 若 Δ G ex 为正值 , 表明分子间作用力为较强的斥力 , 混合单层膜出现相分离 , 稳 定性较差 ; 若 Δ G ex 为负值 , 则表明分子间作用力为较强的引力 , 混合单层膜在热力学上更加稳定 [28]. Fig. 6　 Excess Gibbs energy of AmB /SM mono? layers at certain surface pressure 图 6示出了 AmB /SM 混合单层膜在表面压力

分别为 5, 7. 5, 10, 12. 5, 15和 17. 5mN 时的过量

吉布斯自由能 . 首先 , 对于同一表面压力下不同比

例的混合单层膜 , 除在较低表面压力 (π =5mN) 以

外 , 分子间相互作用力都发生了由斥力向引力的转

变 , 翻转点在 X AmB =0. 6附近 , 这可能是由于 AmB

逐渐增加并起主导作用引起的 ; 然后 , 对于相同比 例的混合单层膜 , 不同表面压力下的过量吉布斯自

由能发生了较有规律的变化 :在 X AmB =0. 2和 0. 4时 , Δ G ex 均为正值且随着压力增加有先增加后减小 的趋势 , 在 π =10mN 出现较大值 , 然后减小 ; 在 X AmB =0. 6时 , 由于表面压力的不同 , 在较大表面压 力 (π =15和 17. 5mN) 下 , Δ G ex 出现了由正偏差向负偏差的转变 , 说明此时分子间相互作用也由斥力 变为引力 , 而在其它压力下未出现如此变化 ; 在 X AmB =0. 8时 , 除在表面压力 (π =5mN) 以外 , 所有的 Δ G ex 均表现为负偏差 , 此时分子间作用力为引力 , 单层膜比较稳定 . 表明 AmB /SM 混合单层膜的分子

间相互作用力的转变以及热力学稳定性与表面压力和组分比例有重要的关系 .

2. 2　 AFM 形态学特征分析 在 π?A 曲线及其相关分析的基础上 , 结合 AFM 对 AmB /SM 混合单分子层的分子聚集和微区域的 变化等直观特征进行了观察 [29,30]. 图 7(A)~(F)分别给出了不同摩尔比 AmB /SM 在同一膜压 (π =15mN /m) 下 LB 膜的 AFM 表面形貌图 , 可见图中微区结构呈现规律性变化且变化趋势与 π?A 曲线分析 所得过量吉布斯自由能 Δ G ex 相对应 . 由图 7(A)和图 7(B)可见 , 纯 SM(X AmB =0) 单分子层和 X AmB =0. 2时的 AmB /SM 混合单层膜具有类似的形貌 , 均为比较致密 二 分子排列较整齐的有序膜结构 , 但是图 7(B)比图 7(A)出现较大的间隙 , 说明 AmB 初步作用于 SM 并开始改变混合单分子层的结构 , 对应于 图 6中 π =15mN 的曲线可以得出此时 Δ G ex 为正值 , 分子间作用力为斥力 , 相分离有继续增大的趋势 ; 在图 7(C)中 , 随着 X AmB 增大到 0. 4, 明亮区域所对应的 SM 出现不规则的交联结构 , 此时对应的 Δ G ex 仍为正值 , 分子间作用力为斥力 , 稳定性弱 , 混合单层膜结构发生进一步变化 ; 在图 7(D) 和图 7(E) (X AmB =0. 6和 0. 8) 中 , 混合单分子层再次出现类似的形貌 , 均为不规则的 小岛 ” 微区结构 , 与 图 7(C)相比 , SM 对应的小区域之间的交联结构消失 , SM 单分子层的结构进一步受到 AmB 的影响而 8212高 等 学 校 化 学 学 报 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 Vol. 34　

Fig. 7　 AFM height images of different proportion AmB /SM monolayers

(A) (F):X AmB =0, 0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8, 1. 0.

变得更加分散和稀疏 , 但是此时对应的 Δ G ex 转变为负值 , 混合单层膜分子间作用力为引力 , 稳定性较 强 , 所以由图 7(D)到图 7(E)的变化不明显 , 形成较为稳定的混合单层膜结构 ; 而图 7(F)则显示了纯 AmB 单分子层的形貌 , 因为没有 SM 成分 , AFM 图像显示出较为均一的毛刺状形貌结构 .

原子力显微图像与 π?A 曲线的分析结果相互印证 , 同时表明在表面压力为 15mN /m 下 , 不同摩尔 比的 AmB 对 SM 单分子层的破坏作用随着 AmB 的比例呈现规律性变化 .

综上 , 通过对 AmB /SM 单分子层 π?A 曲线的测量 二 分析及 AFM 观测 , 研究了不同摩尔比的 AmB /SM 混合单分子层的有关热力学特性以及 AFM 观测图样 . 结果表明 , AmB 与 SM 发生了相互作用 , 破 坏了脂质单分子层的稳定性 , 这与 AmB 与胆固醇作用的结果一致 [16], 进一步证明了 AmB 对真菌细胞 的作用与它和细胞膜脂分子的结合有密切关系 , 表明 AmB 对真菌细胞的作用首先发生在真菌细胞膜 上 , 可能改变了真菌细胞膜骨架分子结构的稳定性和理化特性 , 从而达到治疗效果 .

由 π?A 曲线及相关分析可得 , 随着 AmB 组分含量的增加 , π?A 曲线有规律地排列在纯 SM 和纯 AmB 的曲线之间 , 膜压依次降低 , 弹性模量也依次减小 , 而且过量分子面积也与表面压力表现出密切 联系 , 随着表面压力的增加 , 分子间作用有明显的由扩张到收缩的翻转过程 . 由原子力显微镜观测图 像可见 , 在相同表面压力 (π =15mN /m) 下 , X AmB =0. 2时 AmB 开始对单分子层产生影响 , 但是与纯 SM 结构区别不大 , 仅仅是分子间隙发生轻微的扩张 , 未造成严重的破坏 ; 随着 AmB 组分含量的增加 , 混合单分子层逐渐出现交联区域和 小岛 ” 微区结构 , SM 对应的明亮部分逐渐缩小 . 这与 π?A 曲线分 析所得结果一致 , 为研究 AmB 与 SM 的相互作用提供了更直观的依据 .

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Interaction of Amphotericin B /Sphingomyelin

Monolayers at the Air /Water Interface

QIAO Jin?Jing, SUN Run?Guang *, HAO Chang?Chun, YANG Jing, MA Xiu?Zi, WANG Xiao?Mei (Laboratory of Biophysics and Biomedical , College of Physics and Information Technology ,

Shaanxi Normal University , Xi ’ an 710062, China )

Abstract 　 In this work, we chose sphingomyelin(SM) as the basic components of the monolayer, which is widespreaded in mammalian cells and takes an important role in biochemical reactions. Different proportion of amphotericin B /sphingomyelin monolayer’s surface pressure and mean molecular area(π?A ) curve was inves? tigated by the Langmuir?Blodgett (LB) films technology, thermodynamic characteristics were also analyzed based on the π?A curve and the morphological changes of the surface were observed by atomic force microscopy (AFM).The results showed that the compressibility, stability and thermodynamic characteristics of AmB /SM monolayer depended on the mole faction of AmB and the surface pressure obviously. This may be related to the inhibition of Amphotericin B.

Keywords 　 Amphotericin B; Monolayer; Sphingomyelin; π?A Curve; Atomic force microscopy

(Ed. :P , H , N , K ) 0312高 等 学 校 化 学 学 报 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 Vol. 34　

范文五：两性霉素B与鞘磷脂单分子层的相互作用

V01(34 No(9高等学校化学学报 2013年9月 UNIVERSITIES 2125—2130 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE

两性霉素B与鞘磷脂单分子层的相互作

用

乔进京，孙润广，郝长春，杨 静，马秀梓，王小梅

(陕西师范大学物理学与信息技术学院，生物物理与生物医学工程研究室，西安710062)

摘要选取哺乳动物生物膜中的重要脂质分子鞘磷脂(SM)作为单分子膜的基本组分，采用Langmuir—

Blodgett(LB)膜技术研究了不同比例的两性霉素B,鞘磷脂单层膜的表面压力(平均分子面积(不一A)曲线以及

基于7r—A曲线的混合性分析，同时通过原子力显微镜(AFM)研究了其表面形态的变化(结果表明，组分问

的摩尔比和表面压力对混合单层膜稳定性、混合性以及分子间相互作用具有重要影响( 关键词两性霉素B;

单层膜;鞘磷脂;7r—A曲线;原子力显微镜

中图分类号0621;0641 文献标志码A

两性霉素B(AmB)是一种手性多烯类真菌抗生素，是治疗侵入性感染的重要药物?'2j，主要通过 影响细胞膜通透性抑制真菌的生长(由于两性霉素B具有明显的肾毒性?，4 J，会引发恶心、呕吐、食欲 不振及蛋白尿等副作用，所以临床主要用于治疗肺部等深部真菌感染的病情危重患者?o;但对临床真 菌感染症状不明显、皮肤或血清试验阳性的患者不宜选用(出现这些症状和问题的机理尚不清楚(目 前，对两性霉素B的研究多集中在医药学领域中与脂质体相结合讨论其临床药剂的改善与制备MJ，缺 少其与生物膜分子之间相互作用的实验依据和作用机理的研究(鞘磷脂(SM)与抗生素类药物作用具 有重要的生物医学意义(探讨两性霉素B与生物膜分子的相互作用机理对阐明其治疗真菌感染的机制 以及毒副作用非常重要(胆固醇和鞘磷脂是哺乳动物生物膜中两类重要的脂质分子，广泛存在于哺乳 动物的质膜中，是维持细胞膜结构的重要骨架分子(已有文献报道了不同比例或不同结构的固醇与鞘 磷脂间的相互作用‘7’引对脂膜结构弹性及可溶性等参数的影响?'10 J，尤其是鞘磷脂的代谢产物参与了 细胞的生长、分化和凋亡【11。等重要生理活动，鞘磷脂与鞘磷脂酶。12，”o以及神经酰胺。14'151的作用密切 相关(本研究组?叫通过LB膜研究了两性霉素B与胆固醇的热力学特性，讨论了二者间的相互作用参 数，发现它们的相互作用可能与抗生素治疗真菌感染的机制有关，值得深入研究(

Langmuir—Blodgett(LB)膜技术既提供了表面压力与平均分子面积(7r—A)曲线的基础实验数据，又 为单层膜转移至云母片供原子力显微镜观察提供了可能，是目前对有序单分子层制备和研究的最方便 有效的方法和手段?7I，它通过精密的机械装置与电子系统的结合来精确控制薄膜厚度和表面压力等 重要参数，为生物膜理化特性的研究提供了重要的技术手段(原子力显微镜(AFM)是一种扫描探针显 微镜，它利用探针与样品分子间作用力观察样品表面形貌?8I，被广泛应用于纳米尺度表面形貌结构的 研究?9’2 (本文采用LB膜技术与AFM相结合的方法，对两性霉素B与鞘磷脂单层膜的作用进行了研 究，利用LB膜技术模拟组装生物膜测得表面压力与平均分子面积(7r—A)曲线，并在该曲线的基础上计 算平均分子面积、过量平均分子面积、弹性模量和过量吉布斯自由能等参数，通过不同组分比例的混 合单层膜的对比来评价两种组分分子之间的可混合性和相互作用，并利用AFM观测表面形貌特征，从 而对其相互作用机制及理化特性进行研究(本研究不仅对研究两性霉素B与细胞膜作用机理和稳定性 有重要生物学意义，也为进一步降低药物毒副作用、指导临床治疗提供了实验参考依据(

收稿日期:2012—12—18( 基金项目:国家自然科学基金(批准号:20772077)、教育部高等学校博士学科点专项科研基金(批准号:

200807180001)、陕西省

自然科学基础研究计划(批准号:2012JQl002)和中央高校基本科研业务费专项项目(批准号:GK201102029)资助( 联系

人简介:孙润广，男，博士，教授，博士生导师，主要从事生物物理学研究(E—mail:sunrunguang@snnu(edu(cn

万方数据

高等学校化学学报

1 实验部分

1(1试剂与仪器

两性霉素B(AmB)和鞘磷脂(SM)均购自Sigma化学试剂公司;N，N一二甲基甲酰胺(DMF)购自 Amresco化学试剂公司;氯仿和乙醇等其它试剂均为分析纯;实验用水为二次蒸馏水(

mN,m，测LB设备为芬兰KSV公司生产的Mintrough型膜仪，滤纸吊片式膜天平测量范围0,150 量精度4恤N,m;SPM-9500一J3型原子力显微镜(日本岛津公司)，压电扫描器最大扫描范围55 Ixmx55

Hz，扫描模式为接触模式;NSG20型扫描探针(俄罗斯NT-MDT公司)，三角形微Ixm，扫描速率1(0

N,m(悬 臂，共振频率260,630 KHz，弹性系数28—91

1(2实验方

法

1(2(1儡r-A曲线测量将SM溶解于y(氯仿):V(甲醇)=3:1的溶剂中，将AmB溶解于V(DMF): V(1 mol,L盐酸)=3:1中的溶剂中形成浓度为0(5 Ixmol,mL的有机溶液(用微量进样器

min后亚相表面的有机溶剂完均匀滴加到纯水亚相表面，令其自动迅速铺展，15 将适量的溶液

mrn,min的速度压膜，膜表面压力由滤纸吊片式膜天平监测，并用计算机自动记录数全挥发，以10

据，每次测量后完 全去除亚相，彻底清洗滑障和水槽，每组实验重复3次(

1(2(2 AFM表征根据测得的AmB,SM单分子层完整7r-A曲线，选定在合适的膜压下使用垂直镀膜法 镀单层膜，进行AFM观测(镀膜方法:先将新解离的云母基底竖直插入亚相中，再均匀滴加AmB,SM 溶液于亚相表面，静置15 min待有机溶剂完全挥发后，压缩单分子层，达到选定的合适膜压后静置

10 min，待单分子层稳定后以5 ram,rain的速度用垂直提膜法将空气,水界面上的单分子层转移到云母 基底表面，制得单层LB膜以备观测(

2结果与讨

论

2(1 表面压力-平均分子面积(树)曲线的测定与相关分析2(1(1啊r-A曲线的测定 图1为AraB和SM的分子结构图，SM由1个亲水性头基和2条疏水性饱和 长烃链组成，是典型的双亲性分子[图1(B)]，低膜压时形成液态扩张(LE)单分子层，高膜压下呈液 态压缩(LC)相，在膜压为15—20 mN,m时出现LE—LC共存相，崩塌膜压约为63 mN,m，与文献[21] (B)

0H

NH2 Molecular structures of B(A)and Fig(1 amphotericin sphingomyelin(B)

mN,报道一致(AmB结构呈环状[图1(A)]，表面活性较低，最终膜压约为19

m( 图2为不同摩尔比的AmB,SM单分子层的们r-A一

曲线，x。。。表示AmB的摩尔分数(由图2可见，当 王x 枷

=o(2和0(4时，混合单分子层伍r-A曲线的形 要状与

纯鞘磷脂相似，但崩塌压略有下降;当X。。。= i

0(6和0(8时，7r-A曲线的形状接近纯AmB，最终

导

董 崩塌压明显下降，说明此时脂质单分子层的结构受

到严重破坏(随着AmB比例的增加，7r-A曲线有规 律地

排列在两种单一组分之间(纯SM与其它组分

molecular Surface 单分子层(X^。B=0(2，0(4，0(6，0(8)的7r-A曲线 Fig(2 pressure?mean area

isotherms of AmB,SM 有交点，在交点所对应膜压以下时，相同膜压的混 monolayers 万方数据

No(9 乔进京等:两性霉素B与鞘磷脂单分子层的相互作用

合单分子层的平均分子面积大于纯SM，表明此时AmB导致SM单分子层扩张;在交点膜压以上时，相 同膜压下的混合单分子层的平均分子面积小于纯SM，表明此时AmB导致SM单分子层凝聚(同时，不 同组分的AmB,SM二元系统单分子层的7r-A曲线在表面压力约为12 mN,m时发生了翻 转，表明SM 和AmB的结合程度与表面压力有密切的关系(2(1(2 AmB,SM单层膜弹性模量弹性模量C:1是分析单层膜材料性能的重要参数，能反映单分子层

J，计算公式如下: 分子的有序程度和抗压能力m

(1)c:1:一Af塑1。 ,0A，

该式是等温条件下单层膜表面压力7r关于分子面积A的偏导，其中下标S表示单层膜的横截面

: 表示平均分子面积，仃表示表面膜压(C;1越大，单 分子层刚度越大，抗压能力越强，可积，A

;有序度越高(图 3示出了不同摩尔比AmB压缩性越小，

j 膜的弹性模量的规律性变化(可见，随着,SM单层

j 的增加，混合单层膜的弹性模量呈规律性AraB比例

j 浓度的大小依次分布在纯SM和AmB的变化，按

i 曲线之间(AmB的含量越高，混合单层膜弹性模量 的弹性模‘ 量越低，此时的膜抗压能力越弱，有序度越低(所

得数据表明，AmB与SM相结合降低了混合单层膜 w;。， Elastic modulus(C;1)坩(surface pressure的弹性(这与后文中混合单层膜的AFM图像中 观on AmB,SM (仃)dependency monolayers 察到的结果一致(研究结果表明，AmB与细胞膜分

子SM作用降低了膜的弹性(进一步证明AmB主要通过影响细胞膜通透性来抑制真菌的生

长(2(1(3 AmB,SM单层膜的平均分子面积和过量分子面积 在7r(A曲线的基础上，可以通过单层膜的 平均分子面积和过量分子面积等混合方程研究AmB,SM的相互作用情况旧3|(在理想的混合条件

有如下方程: 下， (2) A。d=A1Xl+A2X2 式中，A。和A:分别为一定膜表面压力下单一组分的平均分子面积，x。和墨则分别为组分1和2在混合 单层膜中所占的比例分数，Ai。

合单层膜在表面压力分别为5，表示两种组分理想混合状态下的平均分子面积(图4示出了AmB,SM混 7(5，10，12(5，15和17(5 mN,m时的平均分子面积和有效分子面积， 其中实线部分表示有效分子面积，虚线部分表示理想状态下两种组分的平均分子面积(由图4可见， 有效分子面积曲线与平均分子面积曲线并未重合，表明混合单层膜的两组分发生了相互作用(随着表 面压力的增加，平均分压力越大，分子间越紧子面积减小，有效分子面积曲线与平均分子面积曲线也越来越靠近，说明表面 密(

Mean molecular of AmB,SM mono? Excess area molecule of AmB,SM area Fig(4 Fig(5 per

at certain surface at certain surface layers monolayers pressurepressure

过量分子面积也常用于分析不同分子间的相互作用，计算公式tH-F?2 5|:

(3)A。，=A12一Aid=A12一AlXl一A2置

万方数据

高等学校化学学报

式中，4。:表示混合单层膜的有效分子面积，A。。表示混合单层膜的过量分子面积，当组分1和2不发生 相互作用时，A。。的值为0?J(如果有效分子面积与平均分子面积出现偏差，正偏差表明分子间作用力 为斥力，呈现分子扩张而不易混合;负偏差则表明分子问作用力为引力，呈现分子收缩而易于混

合(

由图5可见，当X?=0(2和0(4时，过量分子面积均呈现正偏差，表明此时分子问相互作用为

mN,m)下混合单层膜的过量分子面积首先斥 力;而当X郴=0(6时，较高表面压力(7r=15和17(5

出现 了负偏差，表明此时分子间相互作用为引力，其它表面压力条件下的混合单层膜的过量分子面

mN,m)积仍为 正偏差，此时分子间相互作用仍为斥力;当X?=0(8时，除在较低表面压力(7r=5 下仍为正 偏差外，在选取的其它表面压力下，混合单分子层均实现了先扩张后收缩的翻转过程(实验结 果表明， AmB,SM混合单层膜的分子间相互作用力的转变与表面压力和分子间距有重要联系(2(1(4 AmB,SM单层膜的热力学特性分析 混合单层膜组分间的相互作用和稳定性可以通过熵、焓 和自由能等相关的热力学函数进行分析心7|(本实验采用过量吉布斯自由能来研究AmB,SM混合单

膜的相关热力学特性(过量吉布斯自由能表达式如下嵋4’D1: 层 r不 r不 ?G。。=I A。，dTr=J(A，，一A，X(一A，x，)d7r(4)。 J J 0 0

式中，A。。为过量分子面积，7r对应选定的膜压，当组分1和2理想混合时，AG。。等于0，不同组分的分 子间未发生相互作用;若AG。，为正值，表明分子间作用力为较强的斥力，混合单层膜出现相分

定性较差;若AG。。为负值，则表明分子间作用力为较强的引力，混合单层膜在热力学上更加稳离，稳

定旧8I( 一 图6示出了AmB,SM}昆合单层膜在表面压力

三 分别为5，7(5，10，12(5，15和17(5 mN时的过量

吉布斯自由能(首先，对于同一表面压力下不同比 i

例的混合单层膜，除在较低表面压力(7r=5 mN)以 ;

专 外，分子间相互作用力都发生了由斥力向引力的转

三 变，翻转点在X。。。=0(6附近，这可能是由于AmB

逐渐增加并起主导作用引起的;然后，对于相同比 i “

例的混合单层膜，不同表面压力下的过量吉布斯自 ，Y矗BExcess Gibbs of AmB,SM Fig?6 energy 由能发生了较有规律的变化:在X舢=0(2和0(4

mono- at certain surface layers pressure 的趋势，在时，AG。，均为正值且随着压力增加有先增加后减小

7r=10 mN出现较大值，然后减小;在X釉=0(6时，由于表面压力的不同，在较大表面压 力(7r=15和17(5 mN)下，AG。。出现了由正偏差向负偏差的转变，说明此时分子间相互作用也由斥力 变为引力，而在其它压力下未出现如此变化;在x舢=0(8时，除在表面压力(7r=5 mN)以外，所有的 AG。，均表现为负偏差，此时分子间作用力为引力，单层膜比较稳定(表明AmB,SM混合单层膜的分子

间相互作用力的转变以及热力学稳定性与表面压力和组分比例有重要的关系(2(2 AFM形态学特征分析

在7r(A曲线及其相关分析的基础上，结合AFM对AmB,SM混合单分子层的分子聚集和微区域

变化等直观特征进行了观察旧吼30 J(图7(A),(F)分别给出了不同摩尔比AmB,SM在同一膜压的

(7r=15 mN,m)下LB膜的AFM表面形貌图，可见图中微区结构呈现规律性变化且变化趋势与7r—

所得过量吉布斯自由能AG。。相对应(由图7(A)和图7(B)可见，纯SM(X。。。--0)单分子层A曲线分析

和X。。。=0(2

时的AmB,SM混合单层膜具有类似的形貌，均为比较致密、分子排列较整齐的有序膜结构，但是图

7(B)比图7(A)出现较大的间隙，说明AmB初步作用于SM并开始改变混合单分子层的结构，对应

图6中",7----15 mN的曲线可以得出此时AG。。为正值，分子间作用力为斥力，相分离有继续增大的趋于

在图7(C)中，随着x。。。增大到0(4，明亮区域所对应的SM出现不规则的交联结构，此时对应势;

的AG。， 仍为正值，分子间作用力为斥力，稳定性弱，混合单层膜结构发生进一步变化;在图7(D)和图7(E) (x?=0(6和0(8)中，混合单分子层再次出现类似的形貌，均为不规则的“小岛”微区结构，与 图7(C)相比，SM对应的小区域之间的交联结构消失，SM单分子层的结构进一步受到 AmB的影响而

万方数据

乔进京等:两性霉素B与鞘磷脂单分子层的相互作用

3 3l llnl 3 5t)Illll 7 52 nm

阳 州 唧() (1

of AraB,SM different AFM monolayersFig(7 height images proportion

(A)--(F):X^。B=0，0(2，0 4，0(6，0(8，1(0(

变得更加分散和稀疏，但是此时对应的AG。、转变为负值，混合单层膜分子间作用力为引力，稳定性较 强，所以由图7(D)到图7(E)的变化不明显，形成较为稳定的混合单层膜结构;而图7(F)则显示了纯 AmB单分子层的形貌，因为没有SM成分，AFM图像显示出较为均一的毛刺状形貌结构(

原子力显微图像与7r—A曲线的分析结果相互印证，同时表明在表面压力为15 mN,m下，不同摩尔 比的AmB对SM单分子层的破坏作用随着AmB的比例呈现规律性变化(

综上，通过对AmB,SM单分子层7r—A曲线的测量、分析及AFM观测，研究了不同摩尔比的AmB, SM混合单分子层的有关热力学特性以及AFM观测图样(结果表明，AmB与SM发生了相互作用，破 坏了脂质单分子层的稳定性，这与AmB与胆固醇作用的结果一致?6|，进一步证明了AmB对真菌细胞 的作用与它和细胞膜脂分子的结合有密切关系，表明AmB对真菌细胞的作用首先发生在真菌细胞膜 上，可能改变了真菌细胞膜骨架分子结构的稳定性和理化特性，从而达到治疗效果(

由7r(A曲线及相关分析可得，随着AmB组分含量的增加，7r—A曲线有规律地排列在纯SM和纯 AmB的曲线之间，膜压依次降低，弹性模量也依次减小，而且过量分子面积也与表面压力表现出密切 联系，随着表面压力的增加，分子间作用有明显的由扩张到收缩的翻转过程(由原子力显微镜观测图 像可见，在相同表面压力(仃=15 mN,m)下，X?=0(2时AmB开始对单分子层产生影响，但是与纯 SM结构区别不大，仅仅是分子间隙发生轻微的扩张，未造成严重的破坏;随着AmB组分含量的增加， 混合单分子层逐渐出现交联区域和“小岛”微区结构，SM对应的明亮部分逐渐缩小(这与仃一A曲线分 析所得结果一致，为研究AmB与SM的相互作用提供了更直观的依据(

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Interaction of Amphotericin B,Sphingomyelin

at the Air,Water Interface Monolayers

Xiao-MeiQIAO Jin-Jing，SUN Run—Guang+，HAO Chang—Chun，YANG Jing，MA Xiu-Zi，WANG

and and (Laboratory of Biomedical，College of Biophysics Physics Information Technology，

Shaanxi Normal 7 10062，China)University，瓜’art chose Abstract In this the basic of the is work，we sphingomyelin(SM)as components monolayer，which

in mammalian role in biochemical cells and takes an reactions(Different of widespreaded important proportion

surface and mean molecular was inves- amphotericin B,sphingomyelin monolayer’s pressure area(仃-A)curve

the characteristics were also tigated by Langmuir-Blodgett(LB)films technology，thermodynamic analyzed

the on the zr-A curve and the of surface were observed atomic force morphological changes microscopy by based

results showed that the and characteristics of AmB,SM (AFM)(The compressibility，stability thermodynamic

on the mole faction of AraB and the surface be related to the monolayer depended pressure obviously(This may

inhibition of B( Amphotericin

force Curve;Atomic Keywords Amphotericin B;Monolayer;Sphingomyelin;7r—A microscopy

(Ed(:P，H，N，K)

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