我是段花花花花花花
范文一：体外磷酸化实验
In vitro? phosp?horyl?ation? of HsSgo?1 by NEK2A? The GST-tagge?d wild-type HsSgo?1 and non-phosp?horyl?atabl?e (HsSgo?1S14A?, HsSgo?1S507?A and HsSgo?1S14/507A) mutan?ts were expre?ssed in Esche?richi?a coli strai?n BL21 (DE3) and purif?ied by using?
gluta?thi-one-agaro?se beads? (Sigma?) as previ?ously? descr?ibed [13]. Brief?ly, 1lite?r of LB media? was inocu?lated? with bacte?ria trans?forme?d with GST-HsSgo?1. The expre?ssion? of prote?in was induc?ed by addit?ion of 0.5 mM isopr?opyl-β-d-thiog?alact?opyra?nosid?e at 30 ?C for 3 h. After? the induc?tion, bacte?ria were harve?sted by centr?ifuga?tion and re-suspe?nded in phosp?hate-buffe?red salin?e (PBS) conta?ining? prote?inase? inhib?itors? (leupe?ptin, pepst?atin, and chymo?stati?n; 5 μg/ml), and sonic?ated for four burst?s of 10 s each by using? a probe?-tip sonic?ator. The lysis? solut?ion was clear?ed by centr?ifuga?tion for 20 min at 10 000 × g. The solub?le fract?ion
was appli?ed to a colum?n packe?d with gluta?thion?e-agaro?se beads?, follo?wed by exten?sive washe?s with PBS.
For in vitro? phosp?horyl?ation? assay?, aliqu?ots of wild-type GST-HsSgo?1 and mutan?t HsSgo?1 prote?ins (20 μg each) were incub?ated with 200 ng of activ?e NEK2A? in kinas?e buffe?r (25 mM HEPES?, pH 7.2, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 2 mM EGTA, 5 mM MgSO4?) with 50 μM ATP and 0.5 μCi of [32P]-ATP. The react?ion mixtu?res (50 μl) were incub?ated at 30 ?C for 30 min and termi?nated? by add-ing SDS-PAGE sampl?e buffe?r. Prote?ins
were then fract?ionat?ed on SDS-PAGE. The gel was stain?ed with Cooma?ssie Brill?iant Blue and quant?ified? by a Phosp?hoIma?ger (Amers?ham Biosc?ience?s) as previ?ously? descr?ibed [Zhou R, Cao X, Watso?n C, et al. Chara?cteri?zatio?n of prote?in kinas?e A-media?ted phosp?horyl?ation? of ezrin? in gastr?ic parie?tal cell activ?ation?. J Biol Chem 2003; 278:35651?-35659?.].
范文二：蛋白质体外磷酸化方法的建立
?112?生物化学与生物物理进展 Prog. Biochem. Biophys. 2003; 30(1)
蛋白质体外磷酸化方法的建立
刘 斌 宋 宜 董 燕 孙志贤3
(军事医学科学院放射医学研究所, 北京100850)
摘要 的可靠方法具有重要意义. (, TM ) 是直接感受DNA 双链断裂损伤, 并起始诸多DNA . (IR ) 细胞学反应中,
A TM 激酶可通过磷酸化活化p53蛋白, 原核表达IR 活化的野生型A TM 蛋白, 进行蛋
白质的体外磷酸化反应. 实验验证了A p53. 这一方法的建立可为研究细胞信号转导途.
关键词 (A TM ) , p53, 蛋白质体外磷酸化, 电离辐射 蛋白质的磷酸化修饰与去磷酸化过程是生物体内存在的一种普遍的调节方式, 几乎涉及所有的生理及病理过程, 如糖代谢、光合作用、基因表达等. 对这一过程的研究是目前细胞信号转导研究领域中极为重要的课题之一. 因此, 建立鉴定蛋白质磷酸化的可靠方法具有重要意义.
本实验以毛细血管扩张共济失调症突变蛋白激酶(ataxia 2telangiectasia mutated , A TM ) 对p53蛋白的磷酸化反应为例. A TM 是人常染色体单基因隐性遗传病毛细血管扩张共济失调症(ataxia telangiectasia , A T ) 的致病基因, 其编码蛋白C 端
验利用细胞免疫沉淀得到A TM 蛋白, 原核表达得到p53融合蛋白, 建立蛋白质体外磷酸化系统, 实验验证了A TM 免疫复合物对p53融合蛋白的体外磷酸化作用.
1 材料与方法
111 材料
原核表达载体p GEX 26P 21, 菌株BL21及蛋白质亲和层析柱(GSTrap TM FF , Cat NO. 1725130202) 购自Amersham Pharmacia 公司. Trizol 试剂(Cat NO. 155962026) , 反转录酶(M 2MLV Reverse Transcriptase , Cat NO. 280252013) , 回收
含有磷脂酰肌醇232磷酸激酶(PI3K ) 结构域, 其活性可被PI3K 激酶家族抑制剂Wortmannin 所抑制, 被认为是PI3K 激酶家族的重要成员. 在细胞的DNA 损伤识别监视网络中, A TM 蛋白主要参与DNA 双链断裂(DSB S ) 损伤的识别与修复, 并通过磷酸化下游多种具有重要细胞学功能的底物分子调控细胞损伤的生物学反应. 而被誉为“分子警察”的p53蛋白则是A TM 激酶催化其磷酸化的效应分子. 电离辐射可引起细胞周期G 1期和G 2期的阻滞反应. 辐射引起细胞周期G 1期阻滞依赖于磷酸化p53蛋白的稳定表达. 研究发现γ射线诱导的G 1期阻滞伴有p53蛋白的核内积聚. A T 纯合子缺乏辐射诱导p53蛋白的聚集. 同时, 辐射诱导p53下游分子p21WAF1及G add45的能力也明显下
试剂盒(Concert TM Rapid G el Extraction System , Cat NO. 114562019) 均购自G ibcoBRL 公司. PCR 反应试剂盒购
自Sangon 公司. 连接酶(ligase ) 、质粒提取试剂盒购自Promega 公司. A TM 抗体购自Santa Cruz 公司(sc 27128) . Protein A/G PL US 2Agarose (sc 22003) 购自Santa Cruz Biotechnology. HeLa 细胞系购自中国医学科学院细
胞库. 凝胶成像仪, AlphaImager TM 1220. 112 方法
11211 原核表达载体的构建:从p53野生型细胞MCF 27中提取RNA , 反转录获得cDNA. 针对p53N 端1～303碱基对设计特异性引物, 上游引物为5′2CG GG ATCC A TGG A GG A GCCGCA GTCA G A T 2
3通讯联系人.
Tel :010266931218, E 2mail :sunzx @nic.bmi. ac. cn 收稿日期:2002207215, 接受日期:2002209212
降, 受照后不发生G 1期阻滞. 由此推测A TM 为p53上游DNA 损伤感受分子, 它通过磷酸化p53
蛋白及转录活化p21分子调控G 1/S 期进程. 本实
2003; 30(1) 生物化学与生物物理进展 Prog. Biochem. Biophys. ?113?
3′, 其中包括B am H Ⅰ酶切位点, 下游引物为5′2CCG CT CG AG TTTCTGGG AAGGG ACAG AAG A 23′,
2 结 果
211 原核表达载体构建
其中包括X ho Ⅰ酶切位点. 取cDNA 为模板进行PCR , 回收扩增得到的片段, 并对引物中含有的限
制性酶切位点进行双酶切, 电泳并回收. 将回收的目的片段连接到p GEX 26P 21质粒. 测序正确后, 转化BL21菌株.
11212 p53融合蛋白的诱导表达及纯化:用IPTG
由图1可见, 重组载体p GEX 2p53经B am H Ⅰ
和X ho Ⅰ双酶切, 得到了与目的片段大小相符的片段. 测序后, 证明序列无误. 由此证明我们正确构建了p GEX 2p53载体.
对转化了p GEX 2p53质粒的BL21进行常规诱导表达. 收集细菌, 超声破碎, 离心, 分别收集上清与沉淀, 进行SDS 2聚丙烯酰胺凝胶电泳(PA GE ) , 确定p53.
. 2PA GE . p5311213 A TM 蛋白的免疫沉淀:培养A TM 野生型
的HeLa 细胞. 实验前一天对细胞进行传代. 对细胞进行照射(60Co , 10Gy ) 1h 后, 用012%ED TA/PBS 消化细胞, 收集细胞并用PBS 洗一次,
Fig 11 R estriction analysis of pGEX 2p53
1:p GEX
2p53; 2:DL2000DNA marker ;
) . 3:p GEX 2p53/(Bam H Ⅰ+Xho Ⅰ
得到2×10个细胞. 用裂解缓冲液(Lysis 缓冲液, 50mmol/L Tris , p H 715, 150mmol/L NaCl , 1%Tween 20, 012%NP 240, 1mmol/L
NaF ,
1mmol/L Na 3VO 4, 10%甘油, 1mmol/L 苯甲基磺
212 p53融合蛋白的诱导表达及纯化
6
酰氟, 1mmol/L D TT ) 在冰浴中裂解细胞, 并进行超声破碎, 离心, 12000g , 10min , 4℃. 保存
上清. 加入6μl A TM 抗体, 4℃混悬4h. 加入20μl Protein A/G PL US 2Agarose , 4℃混悬过夜. 离心, 5000g , 5min , 用裂解液洗3次, 用015mol/L LiCl/Lysis 缓冲液洗1次, 用激酶缓冲
转化了p GEX 2p53质粒的BL21, 用1mmol 异
β丙基硫代22D 2半乳糖苷(IPTG ) 进行诱导表达,
37℃, 3h. 对全菌体及细菌裂解液的上清进行SDS 2PA GE 的结果显示(图2) , p53融合蛋白的表
液(kinase buffer , 50mmol/L HEPES , p H 715, 150mmol/L NaCl , 1%Tween 20, 012%NP 240, 1mmol/L NaF , 1mmol/L Na 3VO 4, 1mmol/L D TT , 10mmol/L MnCl 2) 洗3次. 弃去上清后保
存沉淀. 对此免疫沉淀物进行蛋白质印迹检测. 11214 体外磷酸化反应:在A TM 蛋白免疫沉淀
复合物中加入50μl (22μg ) p53融合蛋白以及2159×105Bq [γ232P ]A TP (比活度约为1185×1017Bq/mol ) , 混匀, 30℃孵育20min , 其间需多
次振匀.
11215 磷酸化结果检测:蛋白质体外磷酸化产物
Fig 12 SDS 2PAGE analysis of fusion protein of
G ST 2p53
1:the induced total bacterial proteins with induced
中加入
70μl 2×蛋白质电泳上样缓冲液, 取40μl 进行SDS 2PA GE. 电泳结束后直接用凝胶进行X 片的曝光, 显色, 观察目的蛋白的磷酸化结果.
expression of GST 2p53; 2:low 2range protein molecular standard ; 3:purified fusion protein of GST 2p53marked
by the arrow.
?114?生物化学与生物物理进展 Prog. Biochem. Biophys. 2003; 30(1)
达形式为非包涵体形式, 其理论分子质量为39ku. 采用亲和层析对诱导后的细菌裂解液上清进行纯化, 每100ml 菌液可得214mg 蛋白质.
213 ATM 蛋白免疫沉淀复合物的蛋白质印迹分析
的体外磷酸化结果为阴性, 这进一步有理由使我们
相信p53融合蛋白体外磷酸化作用是A TM 蛋白相关的.
从HeLa 细胞中得到A TM 抗体免疫沉淀复合物, 对其进行蛋白质免疫印迹, 检测到350ku 的特异性A TM 蛋白(图3)
.
3 讨 论
现代分子生物学倾向于认为生物大分子间的相. 蛋境, , 具有激酶与底物.
Fig 13 Western blotting protein p53融合蛋白包括了p53N 端
的Ser9、Ser15、Ser46磷酸化位点, 实验结果验证了A TM 对p53蛋白的磷酸化作用. 而用PI3K 特异性抑制剂Wortmannin 处理后的细胞, 免疫沉淀得到的A TM 蛋白对p53的磷酸化作用明显减弱, 则更进一步证明此种磷酸化作用是PI3K 类激酶所特异的.
体外磷酸化反应中, 激酶与底物及同位素之间量的对比对于不同的情况有所差异, 因为这与激酶的活性、底物的纯度等因素有关. 本实验正是摸索了各种因素, 确定了各成分的最佳量. 各成分尤其不能过量. 底物也需要达到一定的纯度, 以免在磷酸化的结果中出现与底物分子质量接近的条带, 影响结果的判定.
本实验验证了A TM 免疫沉淀复合物对p53融合蛋白的体外磷酸化作用, 建立了蛋白质体外磷酸化的实验方法, 为研究细胞信号转导网络中其他蛋白质之间的相互作用提供了有力的工具.
参 考 文 献
214 ATM 对
由图4中1及图5中1可以看到, ATM 免疫沉淀复合物对p53融合蛋白磷酸化的结果为阳性,
此结果与理论相符. 如图5所示, 经PI3K 特异性抑制剂W ortmannin 处理的HeLa 细胞, 其ATM 免疫沉淀复合物对p53融合蛋白体外磷酸化作用减弱. 在W ortmannin 浓度达到10-5mol/L 时, 对激酶的抑制效果明显, 这一浓度与报道相符.
由此我们可以判定, 对p53融合蛋白进行体外磷酸化的激酶是W ortmannin 敏感的. 用与A TM 抗体相同种属的无关抗体得到的免疫沉淀复合物对p53融合蛋白进行
Fig 14 Phosphorylation of G ST 2p53by irradiation
activated ATM in H eLa cell
1:
GST 2p53phosphorylated by immunoprecipitates
with ATM (sc 27128) antibody ; 2:GST 2p53phosphorylated
by immunoprecipitates with rabbit purified IgG.
Fig 15 Phosphorylation of G ST 2p53by ATM in
H eLa cell w as inhibited by Wortm annin
1:Control , no Wortmannin added ;
2:10-5-6
Wortmannin treated 1h before 10Gy IR ; 3:10Wortmannin treated 1h before 10Gy irradiation.
mol/L mol/L
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The Standardization of p53In vitro
G , G Yan , SUN Zhi 2Xian 3
(Instit ne of Military Medical Sciences , Beiji ng 100850, China )
Abstract and dephosphorylation were key regulatory mechanisms in signal transduction as well as in catabolisim of carbohydrates , photosynthesis , the growth of the cell and expression of the gene , etc. Therefore , to establish a sound method of protein phosphorylation assay is of much importance. Ataxia 2telangiectasia mutated (A TM ) was the product of the gene mutated in the human genetic disorder ataxia 2telangeictasia (A T ) , which regulated the cell πs biology response of DNA damage by phosphorylating a series of proteins involved in cell cycle checkpoints , DNA repair and apoptosis. It seemed that A TM played a central role in radiation 2induced activation of the tumour suppressor gene product p53. The recombinant protein GST 2p53was expressed in E. coli and purifed by affinity chromatography. Then , A TM was immunoprecipitated from HeLa cells exposed to 10Gy γ2ray ; and the purified GST 2p53was incubated with immunoprecipitated A TM and
γ[232P ]A TP. It turned out that the immunoprecipitated complex of A TM could phosphorylate GST 2p53i n
vit ro . Moreover , the standardization of this method facilitated delineating protein phosphorylation by protein
kinase and screening substitutes of other protein kinases.
K ey w ords ataxia telangiectasia mutated (A TM ) , protein phosphorylation i n vit ro , p53, ionizing radiation
3Corresponding author. Tel :86210266931218, E 2mail :sunzx @nic.bmi. ac. cn Received :J uly 15, 2002 Accepted :September 12, 2002
范文三：体外激酶实验筛选p21活化激酶6对雄激素受体的磷酸化位点_刘彤
161
·论著·
体外激酶实验筛选p21活化激酶6对雄激素受体
的磷酸化位点
刘
彤，
李
洋，
耿楠希，
李
丰
（中国医科大学基础医学院细胞生物教研室／／教育部医学细胞生物学重点实验室，辽宁沈阳110001）
【摘要】
目的
构建雄激素受体（AR ）的点突变原核表达质粒，以体外激酶实验分析筛选p21活化激酶6（PAK6）对雄
利用体外激酶实验分析PAK6对
激素受体的磷酸化位点，更好的研究PAK6对AR 的磷酸化所发挥的生物学功能。方法体蛋白，及体外激酶实验筛选PAK6对AR 的磷酸化位点。结果
AR 的较小磷酸化区域，并利用重叠延伸PCR 的方法构建可能的磷酸化定点突变体；然后，体外纯化带有GST 标签的突变
证明质粒构建成功，构建雄激素受体定点突变体，确定定点突变体；
磷酸化
PAK6磷酸化雄激素受体位点。结论
【关键词】
体外激酶实验；
成功筛选PAK6对AR 的磷酸化位点是578位丝氨酸。
雄激素变体；
p21活化激酶6；
The screening of PAK6-mediated phosphorylated sites of AR by in vitro kinase assay Medical University ，Shenyang 110001，China
Corresponding author ：LI Feng ，E-mail ：lifengphd15＠gmail．com
【Abstract 】
LIU Tong ，LI Yang ，GENG Nan-Xi ，LI
Feng．The Research Center for Cell Biology ，Key Laboratory of Medical Cell Biology Ministry of Public Education of China ，China
Objective To learn more biological function of PAK6-mediated phosphorylation of AR ，in vitro kinase assay was
Firstly ，in vitro kinase assay was used to map the shorter
In vitro kinase assay was used to screen out the Phosphorylation
used to screen out the phosphorylated sites of AR by PAK6．Methods
region of PAK6-mediated phosphorylation of AR．Secondly ，overlapping PCR was used to construct the potential phosphorylated sites of AR by PAK6．Next ，we purified the proteins of GST tagged AR mutant．Results phosphorylated sites of AR by PAK6．Conclusion
【Key words 】
The phosphorylated sites of AR by PAK6is Ser 578．AR ；
Site-directed mutant ；
In vitro kinase assay ；PAK6；
PAK （P21-activated kinase ）为一类保守的丝氨
酸／苏氨酸蛋白激酶，是Rho 家族小鸟苷三磷酸酶（Rho-GTPase ）Cdc42／Rac1下游重要的靶因子。
能与雌激素受体相互作用［7］，显示PAK6与激素类受体的生理学功能相关联。PAK6在前列腺癌中呈现高表达，尤其是在去势治疗后的复发性前列腺癌中PAK6的过表达尤为明显［8］，说明PAK6在前列腺癌的恶性进程中具有重要的作用。而且PAK6能够磷酸化雄激素受体的DNA 结合结构域，并以激酶依赖性的方式抑制雄激素受体的转录激活作用［9］。PAK6对AR 磷酸化位点的确定有助于PAK6抑制雄激素受体的机制研究。本实验根据重叠延伸
PAKs 参与许多重要的细胞活动，如细胞骨架重建、
细胞运动、细胞凋亡与生存、细胞周期与有丝分裂，而且与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关［1－3］。PAK 家族有6个成员，第一亚类包括PAK1-3，第二亚类包括PAK4-6。第一亚类成员含有自我抑制域，其激活依赖于上游Rho-GTPase ，而第二亚类成员不含有自我抑制域，表达后拥有持续的激酶活性［4－5］。
PCR 的方法，构建了PAK6对雄激素受体发生磷酸
化作用的可能突变体，并利用体外激酶分析实验确定了PAK6对雄激素受体的确切磷酸化位点。
PAK6为二类PAK 家族的成员之一，它最初是通
过酵母双杂交识别筛选出来的雄激素受体关联蛋白被发现的，主要表达于前列腺、睾丸和大脑等器官［6］。根据文献报道，PAK6既能够与雄激素受体也
1
1．1
材料与方法
材料与试剂
大肠杆菌BL-21感受态细胞，GST 标签原核表
基金项目：国家自然科学基金（31171360）通信作者：李丰，E-mail ：fli＠mail．cmu．edu．cn
达载体pGEX-5X-2购于美国Amersham Biosciences
162
公司。PAK6商品化激酶购自Invitrogen 公司。［γ-32P ］购于北京福瑞生物工程公司。Glutathione
化雄激素受体AR 的DNA 结合结构域，即AR
505-676位氨基酸。为了进一步筛选PAK6对AR
的磷酸化位点，首先将AR 505-676位氨基酸分成
Sepharose TM 4B 购于美国GE Healthcare 公司。各种
限制性内切酶、Pyrobest TM DNA 多聚酶、电泳凝胶回收试剂盒均购自TakaRa 公司；蛋白分子质量标准购自MBI 公司，DNA 分子量标准购自TaKaRa 公司。T4DNA 连接酶购自NEB 公司，引物序列合成及DNA 序列测定由南京金斯瑞有限公司完成。其他试剂均为国产分析纯。
3个较小的区域，即AR 505-559、559-624以及624-676位氨基酸。利用PCR 构建了这3个截短
区域的原核表达质粒，并命名为pGEX-5X-2-AR
505-559、pGEX-5X-2-559-624以及pGEX-5X-2-624-676。这3个表达质粒经EcoR I ／Xho I 酶切后
得到与预期大小相符的条带，证明质粒构建成功（图1）。
1．2雄激素受体截短及定点突变体的构建以野生型pGEX-5X-1-AR 505-676质粒为模
板，利用PyrobestTM DNA polymerase 进行相应部分的PCR 扩增获得AR 的截短片段，分别是505-
559、559-624和624-676位氨基酸。将扩增的片段
利用EcoRI ／XhoI 酶切后连接到经同样酶切的
pGEX-5X-2原核表达载体中。
以野生型AR 质粒为模板，在拟突变位点两侧设计重叠突变引物，进行三轮重叠延伸PCR 完成定点突变，将此片段利用EcoRI ／XhoI 酶切后连接到经同样酶切的pGEX-5X-2原核表达载体中。质粒经测序鉴定突变成功。
1．3体外纯化GST 标签原核表达蛋白
将PGEX-5X-2-AR 截短及突变体转化BL21
图1AR DNA 结合结构域三个截短区域的原核表达质粒
1．DL2000DNA marker ；2．EcoRI ／HindIII DNA marker ；3．pGEX-5X-2-AR 505-559；4．pGEX-5X-2-AR 559-624；5．pGEX-5X-2-AR
624-676
大肠杆菌中，1mmol ／L 的IPTG ，30℃条件下振荡培养3h 诱导GST-AR 突变体蛋白的表达。诱导后的细菌在4℃、6000×g 离心15min 沉淀细菌，加入1mL 细菌裂解液悬浮细菌，超声破碎30s ；
将构建成功的pGEX-5X-2-AR 505-559pGEX-
4℃、10000×g 离心15min ；上清中加入50％的GST Sepharose beads 30μL ，孵育3h 后500×g 离
心1min ；用NP-40buffer 洗beads 3次，每次10
5X-2-AR 559-624以及pGEX-5X-2-AR 624-676质
粒转化大肠杆菌BL21并进行体外GST 融合蛋白的纯化。将等量的GST-AR 截短蛋白与加入γ-32P 标记的PAK6激酶共同孵育后，以SDS-PAGE 电泳分析。放射自显影的结果显示，PAK6可以磷酸化
min ；SDS-PAGE 电泳检测纯化结果。1．4
激酶分析实验筛选PAK6磷酸化AR 的较小用组蛋白H4或GST-AR 截短及定点突变体蛋白做底物，加入含有100活性单位的商品化区域和位点
AR 的DNA 结合结构域（505-676aa ），这与文献报
道的一致。在3个较小的结构域中，PAK6能够明显的磷酸化GST-AR （559-624aa ），其他两个结构域与阴性对照GST 蛋白一样都未能被PAK6磷酸化，证明PAK6对AR 的磷酸化区域缩小至AR
PAK6激酶的HEPEs buffer 中，加入10Ci 的［γ-32
P ］，301体系，在30℃反应30min ，加入1014×
SDS buffer 终止反应。进行SDS-PAGE 电泳并放射
自显影。丽春红染色显示底物蛋白的加样量。
559-624位氨基酸（图2）。2．2
雄激素受体定点突变体的构建
由于PAK6属于丝／苏氨酸蛋白激酶家族，在已经确定的PAK6对AR 的磷酸化区域中，共有6个丝／苏氨酸。它们分别为AR S567、AR T575、AR
2
2．1
结果
PAK6磷酸化AR 区域的筛选
根据文献报道，PAK6作为蛋白激酶可以磷酸
S578、AR S597、AR T602以及AR S613（图3）。
163
图2PAK6对AR 的磷酸化区域的确定图4AR 559-624位氨基酸区域中可能的磷酸化位点突变体
1．TST ；2．GST-AR （505-676）；3．GST-AR （505-559）；4．GST-AR （559-624）；5．GST-AR （624-676）
1．EcoRI ／HindIII DNA marker ；2．pGEX-5X-2-ARS567A ；3．pGEX-5X-2-AR T575A ；4．pGEX-5X-2-AR S578A ；5．pGEX-5X-2-AR S597A ；6．pGEX-5X-2-AR T602A ；7．pGEX-5X-2-AR S613A
突变体中，只有AR S578A 不能被PAK6磷酸化，其他的5个突变体与野生型都可以被PAK6磷酸化，证明PAK6磷酸化AR 的位点为丝氨酸578位（图5）。
图3AR 559-624位氨基酸区域中可能的磷酸化位点
为筛选PAK6对AR 的磷酸化位点，拟将这些位点的氨基酸突变为丙氨酸（Ala ，A ）以拮抗PAK6对AR 的磷酸化作用。利用重叠延伸PCR 的方法，以野生型pGEX-5X-2-AR 505-676为模板，构建了这些丝／苏氨酸突变为丙氨酸的突变体。经EcoRI ／
XhoI 酶切后得到与预期大小相符的条带，证明质
粒构建成功（图4）。分别将它们命名为pGEX-5X-
2-AR S567A 、pGEX-5X-2-AR T575A 、pGEX-5X-2-AR S578A 、pGEX-5X-2-AR S597A 、pGEX-5X-2-AR T602A 以及pGEX-5X-2-AR S613A 。2．3
PAK6磷酸化雄激素受体位点的确定
将野生型pGEX-5X-2-AR 505-676与构建成功的pGEX-5X-2-AR S567A ，pGEX-5X-2-AR T575A ，
图5
AR 578位氨基酸为PAK6
的磷酸化位点
3讨论
PAK6是PAK 家族中最晚发现的一个成员，
其生物学功能并未像家族其他成员一样研究的比较详尽。目前，PAK6的主要功能是与雄激素受体相互作用并通过磷酸化调节AR 的转录活性［6－10］。本文根据之前的文献报道，首先利用体外激酶实验筛选出PAK6对AR 磷酸化的较小区域为AR 559～624位氨基酸序列。在这个区域内，
pGEX-5X-2-AR S578A ，pGEX-5X-2-AR S597A ，
pGEX-5X-2-AR T602A 以及pGEX-5X-2-AR S613A
质粒转化大肠杆菌BL21并进行体外GST 融合蛋白的纯化。将等量的GST-AR 野生型和突变体与加入γ-32P 标记的PAK6激酶共同孵育后，以SDS-
PAGE 电泳分析。放射自显影的结果显示，在6个
164
六个丝／苏氨酸位点被突变为丙氨酸，以此拮抗
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PAK6的磷酸化作用［11］。最终，体外激酶实验筛选
出PAK6对AR 磷酸化位点为第578位丝氨酸。雄激素受体长度为919氨基酸，蛋白相对分子质量较大，缩小可能的磷酸化区域为寻找可能的磷酸化位点提供了方便。在AR 559～624位氨基酸序列区域内，共有6个丝／苏氨酸位点，构建突变体的工作量较大，但成本较低。通过生物信息学方法可预测可能的磷酸化位点，丝／苏氨酸蛋白激酶磷酸化底物时，底物序列通常为KRXXXS ／T ［12］。本实验中
S578、S602以及S613比较符合这个特点，而AR S578正是PAK6的磷酸化位点。这种生物学预测
的方法在今后的研究中也可为预测磷酸化位点提供依据。目前还可通过质谱分析的方法寻找磷酸化位点，但成本较高，而且最后还是需要构建突变体质粒以最终确定磷酸化位点。
雄激素受体丝氨酸578位也是蛋白激酶C （PKC ）对雄激素受体的磷酸化位点
［13］
。在表皮生长
因子的刺激下，PKC 通过磷酸化此位点阻滞雄激素受体的核转位，以此调节雄激素受体的转录活性。因此，在后续探讨PAK6通过磷酸化雄激素受体而发挥生物学作用时，应抑制体系中PKC 激酶的活性。同时也提示我们PAK6可能通过阻滞雄激素受体的细胞核内定位而影响雄激素受体的转录活性。
参
考
文
献
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（收稿日期：2012-12-08）
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作者编者·
·读者··
关于正文中参考文献的标注方法
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直接标引在姓名后，如王英杰等［2］报道…。
3．如遇连续序号，可标注起讫号“－”。
4．多次引用同一著者的同一文献，只须编一个首次引用时的序号。文献表中不再重复著录。
范文四：质粒载体去磷酸化的原理
对单酶切后的产物去磷酸化是指5‘端的磷酸基团，（3’端是-OH ）。
用CIAP 去磷酸化，它能将5‘端突出的磷酸基团消化掉，使质粒载体自身不能形成闭合的环状结构。单酶切的末端能够发生载体自连。
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase，简称CIAP ，中文名称为小牛肠碱性磷酸酶，是一种可以催化DNA 、RNA 、核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸水解释放5′末端或3′末端磷酸基团的酶。Calf Intestinal Alkaline Phosphatase也可以脱去蛋白质丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上的磷酸基团。经限制性内切酶酶切的质粒5' 端带有磷酸基团，在进行基因克隆时为避免质粒发生自连，可以使用Calf Intestinal Alkaline Phosphatase 去除5' 末端磷酸基团。脱去5′末端磷酸基团的质粒不能发生自连。
用途：去除DNA 、RNA 5′或3′末端的磷酸基团；通过去除载体或DNA 片断5′末端的磷酸基团，防止载体或DNA 片断自连；通过5′末端脱磷，为5′末端磷酸化放射性标记准备模板；用于蛋白质丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的去磷酸化。
范文五：大鼠脑缺血后可逆性蛋白磷酸化水平变化的实验研究
大鼠脑缺血后可逆性蛋白磷酸化水平变化
的实验研究
国际脑血管病杂志2007年4月第l5卷第4期JCerebrovoscDis,April2007,Vol15,No.4
大鼠脑缺血后可逆性蛋白磷酸化水平
变化的实验研究
胡俊,李玲,高筱雅,邵玉凤,李杨,张海鸥
摘要目的:研究大鼠脑缺血后可逆性蛋白磷酸化水平的变化.方法:采用线栓法制作大鼠永久性大
脑中动脉闭塞模型,免疫荧光染色法检测神经颗粒素(Ng),磷酸化Ng(p—Ng)和钙调神经磷酸酶
(CaN)在脑缺血不同时间的变化情况.结果:脑缺血3hp-Ng开始增加,1d后达高峰(P<0.05),随
着缺血刚问的延长,p-Ng水平逐渐下降且不再恢复;缺血6hNg总蛋白无明显变化,缺血1d后呈下
降趋势;脑缺血6hCaN开始发挥去磷酸化作用,3d时达到高峰(P<0.05),以后随着缺血时问的延
长,CaN的去磷酸化作用逐渐丧失.结论:急性脑缺血后神经元内的可逆性蛋白磷酸化水平发生失
衡,蛋白磷酸化/去磷酸化作用参与了缺血性神经元损伤过程.
关键词脑缺血;可逆性蛋白磷酸化;神经颗粒素;钙调神经磷酸酶;大
鼠
Stuayon1lChangesofReversibleProteinPhosphorylationAfter
FocalCerebralIschemiainRats
OuZhang JunHu,LingLi,Xiao—YaGao,YangLi,Hai—
DepartmentofNeurology,PeKingUniversityShenzhenHospital,Shenzhen518036,China,”
DepartmentofNeurology,theb3rstAffiliatedHospitalofSunYet—senUniv
ersity,Guangzhou
510080,China
CorrespondngAuthor.”LingLi
AbslraetObjective:Tostudythechangesofreversiblephosphorylationofproteinafterfocal
cerebralischemiainrats.MethodsAmode1Ofpermanentmiddlecerebralarteryocclusion
(MCAO)wasestablishedbyLonga’smethod.1hechangesofneurogranin(N
g),phosphorylated
Ng(p—Ng),andcalcinetrin(CAN),eremeasuredatdifferenttimepointsduringcerebraliscbemiaby
immunofluorescentstainingmethod.Results:1eexpressionofP—Ngbegan
toincrease3hours
aftercerebralischemia,anditreachedthepeakafteronedayfP<0.05.1heex
pressionof
P—Nggraduallydecreasedwiththeprolongedtimeofiscbemia,anddidnotincreaseanymore.
1herewasnosignificantchangesinNgtotalproteinatsixhoursafterischemia>0.05),and
therewasadowntrendonedayafteriscbemia.CaNbegantoexertitsdephosphorylationatsix
hoursaftercerebralischemia,anditreachedthepeakatday3<0.05),andthenwiththe
prolongedtimeofiscbemiathedephosphorylationofCaNwaslostgradually.Conclusions:
Reversibleproteinphosphorylationinneuronshasunbalancedafteracutecerebralischemia.1e
proteinphosphoation/dephosphoationmayparticipateintheprocessesofischemicneuron
mnjury.
KeyWordsbrainischemia;reversibleproteinphosphorylation;neurogranin;calcineurin;rat
传统观点认为,脑缺血后各种离子通道和受体
基金项目:广东省科委计划项目(2004B33801020)
作者单位:518036深圳,北京大学深圳医院神经内科(胡俊,张
海鸥);510080广州,中山大学附属第一医院神经内科(李玲,高筱
雅,邵玉风,李杨)
通讯作者:李玲
?
269?
?
论着?
被激活,引起缺血神经元内ca2超载并导致神经元
死亡l1J.然而,随着缺血神经元损伤机制研究的不
断深入,现在认为ca2本身并无活性,但可参与调
节并激活一系列复杂的神经递质释放,从而启动神
经元损伤的病理生理学过程.可逆性蛋白磷酸化的
稳态是维持细胞内代谢平衡最重要的因素之一,本
?
270?国际脑血管病杂志2007年4月第15卷第4期
IntJCerebrovascDis.April2007,Vol15,No.4
实验应用大鼠大脑中动脉闭塞(middlecerebralartery
occlusion,MCAO)模型,通过免疫荧光染色法检测
神经颗粒素(neurogr~min,Ng)蛋白磷酸化和钙调神
经磷酸酶(calcineurin,CaN)去磷酸化水平,探讨急性
脑缺血后神经元损伤过程中可逆性蛋白磷酸化水平
的变化.
1材料和方法
1.1动物分组和模型制作
健康雄性Spraque—Dawley(SD)大鼠(由广东省
卫生厅医用动物实验中心提供),体质量250,280
g.动物随机分为对照组(n=30),假手术组(n=
30)和缺血组(n:60),各组按不同缺血时限(3h,
6h,1d,3d,7d和14d)再随机分成6组,缺血组每
组各10只,其余组各5只.采用改良Longa法制
作大鼠MCAO模型,术中大鼠肛温保持在(37?
0.3).
1.2检测标本制备
10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,快速心脏灌
注固定约3min,断头取脑,置入4%多聚甲醛后固
定2h,然后应用30%蔗糖溶液脱水,待脑组织沉淀
后取出,连续冠状冰冻切片,脑片厚约6m,贴于
APES处理过的载玻片上,晾干,铝箔纸包裹,一70%
保存.
1.3免疫荧光染色(间接法)
参照每例动物模型的HE染色和Bregma立体
定位图谱,以前囟冠状切面前后各0.2mm为取材
区间,从连续冰冻切片中每隔10张切片取1张,对
照组和假手术组取相应部位.冰冻切片恢复至室
温,0.01mol/LPBS漂洗5min.山羊血清室温封闭
15min.分别滴加稀释的一抗:Yg(1:250),磷酸化
Ng(p-Yg)(1:300),CaN-A亚基(1:200),阴性对照
组不加一抗,以0.01mol/LPBS代替,37%水浴箱
孵育2h.0.01mol/LPBS漂洗5min×3次,滴加
FITC或Cy3标记的二抗,37%孵育1.5h,
0.01mol/LPBS漂洗5min×3次.5%碳酸盐甘油
缓冲液封片.采用相应波长的荧光激发F1TC或
Cy3标记的标本,并进行数码摄影.
1.4细胞计数
荧光显微镜下(×400)随机选MCAO侧大脑半
球病灶周围区5个不同视野,利用网格计数器计算
阳性细胞数.
1.5统计学处理
应用SPSS10.0软件包进行统计学处理,正态
分布数据用均数?标准差(?s)表示,多组数据间
比较用方差分析,两组数据间比较用t检验或秩和
检验.P<0.05有统计学意义.
2结果
在永久性MCAO模型制作过程中,死亡大鼠17
只,其中24h内死亡3只,24,72h内死亡10只,72h
后死亡4只,正常对照和假手术组均无大鼠死亡.
2.1脑缺血后?总蛋白水平的变化
对照组和假手术组两侧大脑皮质,基底节和海
马区神经元内均可见F1TC标记的绿色荧光信号,分
布于细胞质,细胞核未着色,细胞轮廓清晰(图1).
缺血3h和6h时,对照组,假手术组和缺血组之间
?总蛋白水平无显着差异.脑缺血1d,缺血组大
鼠Ng总蛋白水平逐渐下降且不再恢复(P<0.05,
表1)
表1脑缺血不同时间点Ng总蛋白的免疫表达(?s)
与对照组和假手术组比较,P<0.05;十缺血组间比较,P<
表2脑缺血不同时间点P-Ng的免疫表达(?s)
与对照组和假手术组比较,P<0.05;十缺血组间比较,P<
与对照组和假手术组比较,P<0.05;十缺血组间比较,P<
一组,.寸
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272?国际脑血管病杂志2007年4月第15卷第4期IraJCerebrov~cDis,
Aoril2007.V0l15,No.4
蛋白激酶,与钙调蛋白(calmodulin,CaM)结合J,主
要分布于神经突触后J.作为CaM的储库和蛋白
激酶C的作用底物,Ng在ca2介导的细胞信号转
导过程中具有重要作用.本实验表明,MCAO大
鼠在缺血3hNg磷酸化水平即呈上升趋势,随着缺
血时间的延长,Ng磷酸化水平显着升高,缺血1d
左右达到高峰,而Ng总蛋白水平在缺血6h尚未发
生显着变化.缺血1d左右,随着缺血程度的加重,
细胞内ca2浓度大量增加,离子泵衰竭,线粒体,溶
酶体等细胞器自溶,缺血神经元发生不可逆性死亡,
Ng总蛋白及其磷酸化水平显着下降,且不再恢复.
由此可见,Ng的磷酸化反应在脑缺血超早期或急性
期即出现显着变化,这对我们从细胞信号转导水平
来研究缺血神经元的损伤机制具有一定的意义.
CaN是目前已知的唯一一种细胞内依赖性丝氨
酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,在神经系统中含量丰富.中
枢神经系统内的CaN分布有明显的区域性,与神经
元对缺氧损害的敏感性有关.在缺血性脑损伤
过程中,CaN对缺血神经元具有保护作用还是毒性
作用尚存在争议.本实验发现,脑缺血6h
CaN—A亚基(主要发挥去磷酸化作用)的免疫反应逐
渐增强,在缺血3d时达到高峰,然后逐渐呈下降趋
势,随着缺血时间的延长,CaN—A免疫反应水平显着
下降且不再恢复.
Ng不仅是CaN去磷酸化的作用底物,而且二者
同属于丝氨酸/苏氨酸蛋白酶家族,均具有ca2和
(或)CaM依赖性.在脑缺血超早期或急性期,Ng
和CaN活性都发生显着变化.因此,根据本实验结
果分析,我们推测,随着缺血神经元内ca2超载,Ng
被磷酸化激活,并激活下游一系列蛋白激酶,从而引
起缺血神经元细胞跨膜信号转导的紊乱.脑缺血
6h,CaN也被激活,发挥去磷酸化作用,维持神经元
内磷酸化/去磷酸化水平的动态平衡,协调神经递质
的释放.如果脑组织的缺血缺氧状态不能改善,N垒
和CaN将失去对ca2/CaM的依赖,可逆性磷酸化
状态将逐渐失衡.脑缺血1d后CaN可能对缺血神
经元有毒性作用,可能提示CaN活性与细胞内ca2
和CaM浓度密切相关.
综上所述,Ng磷酸化反应和CaN去磷酸化反应
在脑缺血急性期均被激活并维持动态平衡,该过程
受细胞内ca2/CaM水平的调控.随着神经元缺血
时间的延长,细胞内ca2超载和酶活性丧失,该平
衡被破坏,神经元发生不可逆性损伤.因此,可逆性
蛋白磷酸化作用参与了神经元缺血损伤过程,并在
脑缺血损伤级联反应中起着重要作用.如果在蛋白
磷酸化/去磷酸化反应失衡之前及早进行药物治疗,
有可能挽救缺血神经元.
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