范文一：去除蛋白质的方法

去除蛋白质的方法

Folin—酚试剂法（Lowry 法） （一）实验原理 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。 过去此法是应用最广泛的一种方法， 由于其试剂乙 的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理 与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即 Folin—酚试剂，以增加显色量，从而 提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：?在碱性条件下，蛋白 质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪 氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深 度与蛋白的量成正比。 Folin—酚试剂法最早由 Lowry 确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得 到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长， 要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对 双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰 Lowry 反应。而且对后者的影响还要大得多。 酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris 缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿 素（0.5%）， 硫酸纳（1%），硝酸纳 （1%）， 三氯乙酸（0.5%）， 乙醇 （5%）， 乙醚（5%） ， 丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的 溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅， 则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度 1~2 倍。 进行测定时，加 F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性 pH 条件下稳定，但上 述还原反应只在 pH=10 的情况下发生，故当 Folin 一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中 时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达 5mg。通常测定范围是 20~250mg。 （二）试剂与器材 1.试剂 （1）试剂甲： （A） 10 克 Na2CO3，2 克 NaOH 和 0.25 克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6·4H2O）。溶解 于 500 毫升蒸馏水中。 （B） 0.5 克硫酸铜 （CuSO4·5H2O） 溶解于 100 毫升蒸馏水中， 每次使用前， 50 份 将 （A） 与 1 份（B）混合，即为试剂甲。 （2）试剂乙： 在 2 升磨口回流瓶中，加入 100 克钨酸钠（Na2WO4·2H2O）,25 克钼酸钠（Na2MoO4·2 H2O）及 700 毫升蒸馏水，再加 50 毫升 85%磷酸，100 毫升浓盐酸，充分混合，接上回流 管，以小火回流 10 小时，回流结束时，加入 150 克 硫 酸 锂（Li2SO4），50

毫升蒸馏水 及数滴液体溴，开口继续沸腾 15 分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿 色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至 1 升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使 用时用标准 NaOH 滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水 1 倍，使最终的酸浓度为

1N 左右。 （3）标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为 250 mg/ml 左右。牛血清 清蛋白溶于水若混浊，可改用 0.9 % NaCl 溶液。 2. 器材 （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）秒表 （4）试管 16 支 （三）操作方法 1. 标准曲线的测定：取 16 支大试管，1 支作空白，3 支留作未知样品，其余试管分成两组， 分别加入 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 毫升标准蛋白质溶液（浓度为 250mg/ml）。用 水补足到 1.0 毫升， 然后每支试管加入 5 毫升试剂甲， 在旋涡混合器上迅速混合， 于室温 （2 0～25℃）放置 10 分钟。再逐管加入 0.5 毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。 这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置 30 分钟，以未加蛋白质 溶液的第一支试管作为空白对照，于 700nm 处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量 为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。 注意：因 Lowry 反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第 1 支 试管加入 5 毫升试剂甲后，开始计时，1 分钟后，第 2 支试管加入 5 毫升试剂甲，2 分钟后 加第 3 支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过 10 分钟，则第 1 支试管可立即 加入 0.5 毫升试剂乙，1 分钟后第 2 支试管加入 0.5 毫升试剂乙，2 分钟后加第 3 支试管， 余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置 30 分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测 一个样品。 进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。 表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面 两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。 2. 样品的测定：取 1 毫升样品溶液（其中约含蛋白质 20~250 微克），按上述方法进行操 作，取 1 毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在 一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加 3 个试管。如上表中的 8、9、1 0 试管。 根据所测样品的吸光度值， 在标准曲线上查出相应的蛋白质量， 从而计算出样品溶液的蛋白 质浓度。 注意， 由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸， 显色的深

浅往往随不同的蛋白质而 变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。 Folin-酚法测定蛋白质含量 原理：磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应．蛋白质中含有代 酚基的酪氨酸，故有此反应．Folin---酚法的灵敏度是双缩脲法的 100 倍． 试剂：一：1，4%碳酸钠；2，0.2N 氢氧化钠；3，1%硫酸铜；4,2%酒石酸钾钠。1 和 2 等体积混合，3 和 4 等体积混合，然后将两液以 50：1 混合(甲)。当天使用。二：1NFolin-酚试剂(乙)。 方法：标准曲线；试管中加 0、0.2、0.40、0.60、1.00 毫升酪蛋白溶液（500 微克/毫升），

加水补足 1 毫升，平行做两份。按序各加 5 毫升试剂（甲），摇匀，室温置放 10 分钟，再 依次加入 1N（0.5 毫升）Folin----酚试剂（乙），摇匀，30 摄氏度保温 30 分钟。然后在分 光光度机上比色测定（A500）。待测样品如上反应和测定，对照标准曲线，得出含量。 注意：酚和柠檬酸对测定有干扰，低浓度尿素，胍，硫酸钠，硝酸钠，三氯乙烯，乙醇，乙 醚，丙酮对显色无影响。 蛋白质的直接定量（UV 法） 这种方法是在 280nm 波长，直接测试蛋白。选择 Warburg 公式，光度计可以直接显示出 样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常 简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除 32 0nm 的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求 A280 的吸光值至少大于 0.1 A，最佳的线性范围在 1.0-1.5 之间。实验中选择 Warburg 公式显示样品浓度时，发现读 数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察 A280 的吸光值的变化范围不超过 1%， 表明结果非常稳定。 漂移的原因是因为 Warburg 公式吸光值换算成浓度， 乘以一定的系数， 只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法， 适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操 作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如 DNA 的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度 较高。 比色法蛋白质定量 蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨 酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反 应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。 比色方法一般有 BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。 Lowry 法：以最早期的 Biuret 反应为基础，并有所改进。蛋白质与 Cu2 反应，产生蓝色 的反应物。但是

与 Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反 应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含 EDTA，Triton x-100，a mmonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。 BCA（Bicinchoninine acid assay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的 蛋白在碱性溶液里与 Cu2 反应产生 Cu ，后者与 BCA 形成螯合物，形成紫色化合物，吸 收峰在 562nm 波长。 此化合物与蛋白浓度的线性关系极强， 反应后形成的化合物非常稳定。 相对于 Lowry 法，操作简单，敏感度高。但是与 Lowry 法相似的是容易受到蛋白质之间以 及去污剂的干扰。 Bradford 法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰 595nm。其最大的特点是，敏感度好，是 Lowry 和 BCA 两种测试方法的 2 倍；操作更简 单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定 1 小时，方便结果；而且与一系列 干扰 Lowry，BCA 反应的还原剂（如 DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感 的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。 某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致， 感到迷惑， 究竟 该相信哪种方法？由于各种方法反应的基团以及显色基团不一， 所以同时使用几种方法对同

一样品得出的样品浓度无可比性。例如：Keller 等测试人奶中的蛋白，结果 Lowry，BCA 测出的浓度明显高于 Bradford，差异显著。即使是测定同一样品，同一种比色法选择的标 准样品不一致，测试后的浓度也不一致。如用 Lowry 测试细胞匀浆中的蛋白质，以 BSA 作 标准品，浓度 1.34mg/ml，以 a 球蛋白作标准品，浓度 2.64mg/ml。因此，在选择比色法之 前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外， 比色法定量蛋白质， 经常出现的问题是样品的吸光值太低， 导致测出的样品浓度与实际的浓 度差距较大。关键问题是，反应后 1011 分光光度计的重要配件—— 比色杯的颜色是有一 定的半衰期，所以每种比色法都列出了反应测试时间，所有的样品（包括标准样品），都必 须在此时间内测试。时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。除此，反应温度、 溶液 PH 值等都是影响实验的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避 免使用石英或者玻璃材质的比色杯， 因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色， 导致样品吸 光值不准确。

lan_se_you_lin 2009-02-22 18:59:30

可以通过一些物理手段比如加热，紫外线等，这样引起的蛋白质会发生性质变化

kang101jun 2009-02-22 19:00:13

Folin—酚试剂法（Lowry 法） （一）实验原理 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。 过去此法是应用最广泛的一种方法， 由于其试剂乙 的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理 与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即 Folin—酚试剂，以增加显色量，从而 提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：?在碱性条件下，蛋白 质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪 氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深 度与蛋白的量成正比。 Folin—酚试剂法最早由 Lowry 确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得 到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长， 要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对 双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰 Lowry 反应。而且对后者的影响还要大得多。 酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris 缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿 素（0.5%）， 硫酸纳（1%），硝酸纳 （1%）， 三氯乙酸（0.5%）， 乙醇 （5%）， 乙醚（5%） ， 丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的 溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅， 则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度 1~2 倍。 进行测定时，加 F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性 pH 条件下稳定，但上 述还原反应只在 pH=10 的情况下发生，故当 Folin 一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中

时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达 5mg。通常测定范围是 20~250mg。 （二）试剂与器材 1.试剂 （1）试剂甲： （A） 10 克 Na2CO3，2 克 NaOH 和 0.25 克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6·4H2O）。溶解 于 500 毫升蒸馏水中。 （B） 0.5 克硫酸铜 （CuSO4·5H2O） 溶解于 100 毫升蒸馏水中， 每次使用前， 50 份 将 （A） 与 1 份（B）混合，即为试剂甲。 （2）试剂乙： 在 2 升磨口回流瓶中，加入 100 克钨酸钠（Na2WO4·2H2O）,25 克钼酸钠（Na2MoO4·2 H2O）及 700 毫升蒸馏水，再加 50 毫升 85%磷酸，100 毫升浓盐酸，充分混合，接上回流 管，以小火回流 10 小时，回流结束时，加入 150 克 硫 酸 锂（Li2SO4

），50 毫升蒸馏水 及数滴液体溴，开口继续沸腾 15 分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿 色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至 1 升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使 用时用标准 NaOH 滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水 1 倍，使最终的酸浓度为 1N 左右。 （3）标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为 250 mg/ml 左右。牛血清 清蛋白溶于水若混浊，可改用 0.9 % NaCl 溶液。 2. 器材 （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）秒表 （4）试管 16 支 （三）操作方法 1. 标准曲线的测定：取 16 支大试管，1 支作空白，3 支留作未知样品，其余试管分成两组， 分别加入 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 毫升标准蛋白质溶液（浓度为 250mg/ml）。用 水补足到 1.0 毫升， 然后每支试管加入 5 毫升试剂甲， 在旋涡混合器上迅速混合， 于室温 （2 0～25℃）放置 10 分钟。再逐管加入 0.5 毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。 这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置 30 分钟，以未加蛋白质 溶液的第一支试管作为空白对照，于 700nm 处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量 为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。 注意：因 Lowry 反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第 1 支 试管加入 5 毫升试剂甲后，开始计时，1 分钟后，第 2 支试管加入 5 毫升试剂甲，2 分钟后 加第 3 支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过 10 分钟，则第 1 支试管可立即 加入 0.5 毫升试剂乙，1 分钟后第 2 支试管加入 0.5 毫升试剂乙，2 分钟后加第 3 支试管， 余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置 30 分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测 一个样品。 进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。

表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面 两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。 2. 样品的测定：取 1 毫升样品溶液（其中约含蛋白质 20~250 微克），按上述方法进行操 作，取 1 毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在 一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加 3 个试管。如上表中的 8、9、1 0 试管。 根据所测样品的吸光度值， 在标准曲线上查出相应的蛋白质量， 从而计算出样品溶液的蛋白 质浓度。 注意， 由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸， 显

色的深浅往往随不同的蛋白质而 变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。 Folin-酚法测定蛋白质含量 原理：磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应．蛋白质中含有代 酚基的酪氨酸，故有此反应．Folin---酚法的灵敏度是双缩脲法的 100 倍． 试剂：一：1，4%碳酸钠；2，0.2N 氢氧化钠；3，1%硫酸铜；4,2%酒石酸钾钠。1 和 2 等体积混合，3 和 4 等体积混合，然后将两液以 50：1 混合(甲)。当天使用。二：1NFolin-酚试剂(乙)。 方法：标准曲线；试管中加 0、0.2、0.40、0.60、1.00 毫升酪蛋白溶液（500 微克/毫升）， 加水补足 1 毫升，平行做两份。按序各加 5 毫升试剂（甲），摇匀，室温置放 10 分钟，再 依次加入 1N（0.5 毫升）Folin----酚试剂（乙），摇匀，30 摄氏度保温 30 分钟。然后在分 光光度机上比色测定（A500）。待测样品如上反应和测定，对照标准曲线，得出含量。 注意：酚和柠檬酸对测定有干扰，低浓度尿素，胍，硫酸钠，硝酸钠，三氯乙烯，乙醇，乙 醚，丙酮对显色无影响。 蛋白质的直接定量（UV 法） 这种方法是在 280nm 波长，直接测试蛋白。选择 Warburg 公式，光度计可以直接显示出 样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常 简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除 32 0nm 的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求 A280 的吸光值至少大于 0.1 A，最佳的线性范围在 1.0-1.5 之间。实验中选择 Warburg 公式显示样品浓度时，发现读 数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察 A280 的吸光值的变化范围不超过 1%， 表明结果非常稳定。 漂移的原因是因为 Warburg 公式吸光值换算成浓度， 乘以一定的系数， 只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法， 适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操 作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如 DNA 的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度 较高。 比色法蛋白质定量 蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨 酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反 应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。

比色方法一般有 BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。 Lowry 法：以最早期的 Biuret 反应为基础，并有所改进。蛋白质与 Cu2 反应，产生蓝色 的反应

物。但是与 Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反 应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含 EDTA，Triton x-100，a mmonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。 BCA（Bicinchoninine acid assay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的 蛋白在碱性溶液里与 Cu2 反应产生 Cu ，后者与 BCA 形成螯合物，形成紫色化合物，吸 收峰在 562nm 波长。 此化合物与蛋白浓度的线性关系极强， 反应后形成的化合物非常稳定。 相对于 Lowry 法，操作简单，敏感度高。但是与 Lowry 法相似的是容易受到蛋白质之间以 及去污剂的干扰。 Bradford 法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰 595nm。其最大的特点是，敏感度好，是 Lowry 和 BCA 两种测试方法的 2 倍；操作更简 单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定 1 小时，方便结果；而且与一系列 干扰 Lowry，BCA 反应的还原剂（如 DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感 的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。 某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致， 感到迷惑， 究竟 该相信哪种方法？由于各种方法反应的基团以及显色基团不一， 所以同时使用几种方法对同 一样品得出的样品浓度无可比性。例如：Keller 等测试人奶中的蛋白，结果 Lowry，BCA 测出的浓度明显高于 Bradford，差异显著。即使是测定同一样品，同一种比色法选择的标 准样品不一致，测试后的浓度也不一致。如用 Lowry 测试细胞匀浆中的蛋白质，以 BSA 作 标准品，浓度 1.34mg/ml，以 a 球蛋白作标准品，浓度 2.64mg/ml。因此，在选择比色法之 前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外， 比色法定量蛋白质， 经常出现的问题是样品的吸光值太低， 导致测出的样品浓度与实际的浓 度差距较大。关键问题是，反应后 1011 分光光度计的重要配件—— 比色杯的颜色是有一 定的半衰期，所以每种比色法都列出了反应测试时间，所有的样品（包括标准样品），都必 须在此时间内测试。时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。除此，反应温度、 溶液 PH 值等都是影响实验的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避 免使用石英或者玻璃材质的比色杯， 因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色， 导致样品吸 光值不准确。

shulaoda 2009-02-22 19:01:57

（一）实验原理 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。 过去此法是应用最广

范文二：去除蛋白质的好方法

去除蛋白质的好方法——安捷伦 Captiva ND

作者：Mike Chang

安捷伦样品制备应用化学家

要想使用 LC/MS/MS 分析生物基质中的化合物，首先要去除其中的蛋白质。

到目前为止，最常用的方法是先沉淀，再离心分离。然而该方法涉及很多手动操

作步骤，不能有效实现高通量。

现在，安捷伦 Captiva ND的出现改变了这一现状。它能够实现 96 孔过滤板

的自动化孔内沉淀，从而大幅节省时间、成本和人力。

隆重推出安捷伦 Captiva ND ——独特的无滴落技术简化操作

安捷伦 Captiva ND 是一种新型的蛋白质沉淀过滤板，采用无滴落技术以简化

操作。Captiva ND 采用专门设计的过滤材料，能够有效锁住用于沉淀的有机

溶剂使其不滴落，从而防止样品损失，实现可靠的自动化方法。需要您手动操作

的步骤只有加入生物样品、与有机溶剂混合使蛋白质沉淀，然后施加真空过滤掉

沉淀的蛋白质。短短几分钟内便可得到无颗粒无蛋白的样品，用时为离心分离法

的五分之一。

为了证实 Captiva ND 的优越性能，我们使用安捷伦 ZORBAX Eclipse Plus

超高压快速高分离度色谱柱（RRHD ）和安捷伦 1290 Infinity 液相色谱仪，

对 β 受体阻滞剂进行 LC/MS/MS 分析，将该方法和离心分离法进行了比较。

图 1 为使用 Captiva ND 的样品制备方法；图 2 为离心分离法。图 3 列出

了液相色谱条件。

图 1. 使用0.45 μm 、10 mg 的安捷伦 Captiva 图 2. 使用离心分离法去除蛋白质。

ND 96 孔过滤板（部件号 A5969045）去除蛋白

质。(放大 图片)

图 3. 液相色谱条件。(放大 图片)

稳定性实验表明 Captiva ND 是高通量环境的理想选择

长时间连续进样的稳定性实验（longevity experiment）是证明生物样品清洁

程度最简单有效的方法。将通过 Captiva ND 制备的样品进行 5,000 次连续

进样的稳定性实验，同时监测保留时间、质谱峰面积计数和背压 (图 4 to 6).

统背压数据。(放大 图片)

图 4. 安捷伦 Captiva ND 稳定性实验的系图 5. 安捷伦 Captiva ND 制备的样品进行 图 6. 安捷伦 Captiva ND 制备的 β 受体阻5,000 次连续进样得到的保留时间数据。(放 滞剂加标血浆样品的质谱峰面积计数数据。(放

大 图片) 大 图片)

5000 次进样的稳定性实验证实在高通量环境下，Captiva ND 的可重现的操

作流程能够提供一致的样品处理和可靠的过滤回收率，同时背压、保留时间和质

谱信号等检测参数始终保持稳定。

无可争辩的省时优势

与离心分离法相比， Captiva ND表现出了易用和省时两大优势（(表 1) . 用时

(分

钟) 用时 (分钟)

5

11

10 Captiva ND* 将 0.2 mL 加标血浆样品和 0.6 mL 乙腈 + 0.1% 甲酸加入到 Captiva ND 96 孔过滤板内 用移液枪将每个孔内的溶液混合 5 次 将进样板直接转移到色谱仪上进行分析

使用 Captiva ND 制备样品所需的总时

间 离心分离法 将 0.2 mL 加标血浆样品和 0.6 mL 乙腈 5 + 0.1% 甲酸加入到离心管或空的 96 孔板内 以 10000 rpm 离心 10 分钟 将上清液转移到 2 mL 进样样品瓶中（如果使用的是离心管）或新的空 96 孔板上（如果使用的是微孔板）进行分析 0 5 使用离心分离法制备样品所需的总时间 26

* 使用 Tomtec 或 Hamilton 等自动化系统实现自动化。

表 1. 与离心分离法相比，安捷伦 Captiva ND 能够节省宝贵时间。

Captiva ND 的用时仅为离心分离的五分之一，采用无滴落设计，能够有效保

留样品，免去了多步手动操作。因此，使用 Captiva ND 替代离心分离不仅可

以节省时间，还能大幅缩减培训以及样品成本。

自动化 Captiva ND ——最佳高通量解决方案

安捷伦 Captiva 过滤板是高通量实验室的理想解决方案。它们可以轻易实现自

动化，独特的无滴落设计在施加真空前能够有效防止有机溶剂损失。Captiva ND

双深度过滤板能够避免膜堵塞和样品损耗，去除蛋白质效果出众，所需时间仅为离心分离法的五分之一，丝毫无损质谱灵敏度。

范文三：果汁中去除蛋白质方法的探讨

食品工业科技

S cience and Technology of Food Industry

研究与探讨

果汁中去除蛋白质方法的探讨

刘　侠, 石旭东

(11陕西科技大学职业技术学院, 陕西西安710016; 21陕西省产品质量监督检验所, 陕西西安710054)

摘　要:主要论述了用活性炭吸附原理去除果汁中蛋白质的方法, 并对其影响因素、结果进行分析和探讨, 最终确定了

去除果汁中蛋白质的最佳条件为:pH 414左右, 温度20℃, 每25mL 果汁加入0125g 活性炭, 搅拌时间为20m in, 可以将果汁中大约90%的蛋白质除去。关键词:活性炭, 蛋白质, 吸附

1

2

The exp l orati on t o the method of p r otein exclusi on fr om juice

L IU X ia , SH I Xu -dong

1

2

(11Occupati onal &Technical College of Shaanxi University of Science and Technol ogy, Xi ’an 710016, China;

21Shaanxi Pr oduct Q uantity Testing I nstitute, X i ’an 710054, China )

Ab s trac t:The m e thod of p ro te in e xc lus ion from the ju ic e w a s s tud ie d b y a ns of b s p a c tive c a rb on 1A fte r the a na lys i s a nd d i s c us s ion to the influe nc ia l fa c to rs a nd ou b e s on of te i n e xc lus ion from the j u i c e w a s a s fo llow s:p H 414o r s o, the p c ti c a 0a c 25m L ju ic e a c tive c a rb on 0125g, m ixing ti m e 20m in, w h ic h rem j u i c b t te in 1

Key wo rd s:a c tive a i a b o 中图分类号::文章编号:1002-0306(2008) 02-0170-03　　、压榨、过滤而得到的汁

液, 是一种以补充人体能量、水分、维生素、微量元素为主要目的的液体食品, 它能增强免疫力、减少生病、延缓衰老。长期服用果汁, 消化系统、膀胱和呼吸道患癌症的危险降低一半, 同时还能有效防止动脉粥样硬化和冠状肌能不全的发展。各种果汁不仅让我们大饱口福, 还为身体提供健康不可缺少的天然化合物:果糖、酶、矿物质、有机酸、胡萝卜素、蛋白质和维生素。但是在果汁加工的过程中, 酚类物质与果汁中的蛋白质形成大分子的聚合物, 从而使果汁产生沉淀, 影响果汁的产品质量。所以, 我们根据活性炭吸附的原理, 对果汁中蛋白质的去除做了大量实验, 进行了研究分析, 得到了有意义的结果, 确定了果汁中去除蛋白质的方法。

112　实验方法

11211　苹果汁的制取　选果剔除腐烂、病虫害、严重

1　材料与方法

111　材料与仪器

果汁　各种果汁都可以, 本实验选用苹果汁; 活

性炭, 缓冲溶液, 217-二氯荧光粉, 盐酸, 氢氧化钠, 蒸馏水, B S A 标准溶液。

比色皿、7230G 型分光光度计　上海精密科学仪器有限公司; F L1604S 电子天平　上海亚荣生化仪器厂; 强力电动搅拌器　JB90-D 型; 不锈钢破碎机, 螺旋压榨机, 常用的理化仪器。

收稿日期:2007-07-16

作者简介:刘侠(1968-) , 女, 实验师, 研究方向:分析与检测。

机械损伤等不合格的苹果。清洗苹果, 浸泡后用流动水洗净。修整有局部病虫害、机械损伤的不合格苹果, 用不锈钢刀修削干净, 并清洗。合格的苹果切瓣去果心。如果去皮榨汁, 先削皮再修整。用不锈钢破碎机将苹果破碎成碎块, 及时把碎块的苹果送入榨汁机, 用螺旋压榨机把破碎后的苹果榨出苹果汁。11212　活性炭吸附　定量分取20mL 的果汁于100mL 的烧杯中, 改变实验条件, 加入一定量活性炭, 充分搅拌20m in, 以双层滤纸过滤, 吸取滤液2mL , 移入25mL 比色管, 加入2mL 的缓冲溶液, 摇匀, 再加入217-二氯荧光粉, 摇匀, 加蒸馏水稀释至10mL , 上7230G 型分光光度计, 以空白试样作参比, 在波长500n m 下, 测定其吸光率, 同时测定双层滤纸过滤后的纯果汁吸光率A , 计算溶液中蛋白质的残留量, 换算为活性炭的吸附率。

2　结果与讨论

211　蛋白质标准曲线的绘制

在七个比色管中, 分别依次加入缓冲溶液2mL 、0101%的217-二氯荧光粉溶液117mL 及标准溶液B S A0、110、210、310、410、510、610mL , 加水稀释至25mL 刻度线摇匀, 以缓冲溶液及217-二氯荧光粉的空白实验作参比, 在7230G 型分光光度计上, 用1c m 比色皿在500n m 处测定吸光率。回归线方程为:y

=

　1702008年第02期

研究与探讨

010094x +01017, R =019996, 标准曲线如图1

。

食品工业科技

V ol . 29, N o . 02, 2008

图3　搅拌时间与果汁的吸光率、吸附率的变化曲线

图1　蛋白质标准曲线

212　活性炭用量实验

分别称取活性炭0125、0128、0132、0135、0136、0140g 于6个100mL 烧杯中, 分别加入25mL 果汁在室温条件下, 于强力电动搅拌器下充分搅拌20m in, 用双层滤纸过滤搅拌后的苹果汁溶液, 分别用移液管取滤液2mL 移入25mL 的比色管中, 加入缓冲溶液2mL , 摇匀, 再加入217-二氯荧光素溶液117mL , 摇匀, 加蒸馏水稀释至25mL 刻度线, 充分混匀, 于分光光度计下, 以空白试样做参比, 用1c m 比色皿在波长500n m 下测定其吸光率, 同时测得用双层滤纸过滤后的纯果汁吸光率A 为01175, 实验结果如图2

。

到了足够的能量, 部分胶粒又从吸附剂表面解吸出

来, 从而使滤液的吸光度反而增大, 吸附率减小。

214　温度对吸附率的影响

分别称取0125g 活性炭于6个100mL 烧杯中, 加入25mL 果汁溶液, 在10、20、40、60、80、100℃下分别搅拌20m in, 用双层滤纸过滤搅拌后的苹果汁溶液, 分别用移液管取滤液2mL 移入25mL 的比色管中, 加入缓冲溶液2mL , 摇匀, 再加入217-二氯荧光素溶液117mL , 摇匀, 加蒸馏水稀释至25mL 刻度线, 充分混匀, 于分光光度计下, 以空白试样做参比, 用1c m 比色皿在波长500n m 下测定其吸光率, 同时测A 为01175, 实

所示图2　活性炭用量与果汁的吸光率、吸附率的变化曲线由实验结果可以看出:随着活性炭用量的增加, 果汁的吸光率逐渐减小, 果汁中蛋白质的含量逐渐减少, 吸附率逐渐提高; 等活性炭增加到一定值时, 吸附后果汁中蛋白质的含量几乎不随加入活性炭的含量而变化。由实验得出:当在25mL 苹果汁溶液中加入0125g 活性炭时, 果汁中的蛋白质几乎被完全吸附。

图4　温度与果汁的吸光率、吸附率的关系变化曲线　　从实验结果可以看出:随着温度的升高, 吸光率先减小后增大, 吸附率在20℃左右时达到了最大值。

215　溶液的pH 对吸附率的影响

分别称取活性炭0125g 于5个100mL 烧杯中, 加入25mL 果汁, 在强力电动搅拌器中搅拌, 同时用盐酸和氢氧化钠溶液调节pH 分别为210、410、610、810、1010, 继续搅拌, 直到20m in 后, 以缓冲溶液及217-二氯荧光粉的空白实验作参比, 在分光光度计上, 用1c m 比色皿在500n m 处测定吸光率, 结果如

图5所示。

213　搅拌时间对吸附率的影响

在室温下, 分别称取活性炭0125g 于5个加入25mL 果汁的100mL 烧杯中, 在磁力搅拌器上分别搅拌10、15、20、25、30m in, 用双层滤纸过滤搅拌后的苹果汁溶液, 分别用移液管取滤液2mL 移入25mL 的比色管中, 加入缓冲溶液2mL , 摇匀, 再加入217-二氯荧光素溶液117mL , 摇匀, 加蒸馏水稀释至25mL 刻度线, 充分混匀, 于分光光度计下, 以空白试样做参比, 用1c m 比色皿在波长500n m 下测定其吸光率, 同时测得用双层滤纸过滤后的纯果汁吸光率A 为01176, 实验结果如图3所示。

从实验结果看出:随着搅拌时间的增加, 溶液的吸光率先减小后增大, 吸附率却先增大后减小。当搅拌时间达到20m in 时, 溶液中的蛋白质胶粒吸附达到最大值, 吸附与解吸的速率相等, 吸附达到了饱和; 当吸附超过20m in 时,

达到了过饱和, 吸附质得

图5　溶液的pH 与果汁的吸光率、吸附率的变化曲线　　由上述实验可以得出:pH 在4～6之间消耗酸较

(下转第

174页)

2008年第02期　171

食品工业科技

S cience and Technology of Food Industry

工艺技术

理对玉米淀粉的热粘度和冷粘度稳定性影响不大。　　综上所述, 玉米淀粉在超高压微射流处理过程中发生了机械力化学效应, 淀粉颗粒被粉碎成不规则的小颗粒, 颗粒粒度减小, 且随着处理压力的增强破碎程度增大。同时超高压微射流的机械力化学效应使淀粉的糊化性质发生变化, 布拉本德粘度减小, 热粘度和冷粘度稳定性变化不大。

参考文献:

[1]久保辉一郎1无机物の 一1东京:综合

图6　不同压力超高压微射流处理玉米淀粉的布拉本德粘度曲线

不多与X 轴重合的直线。当升温到糊化温度时, 淀粉颗粒开始吸水溶胀糊化, 体系粘度快速上升, 达到峰值粘度300BU 后开始下降。温度上升到95℃并进行热保温期间粘度下降速率逐渐减缓至趋于稳定。在降温到50℃的过程中, 淀粉糊的粘度再次上升, 这符合液体随温度降低而粘度升高的规律。冷保温期间淀粉糊的粘度稍微降低, 逐渐趋于稳定。

比较40、80、120、160M Pa 超高压微射流处理的玉米淀粉布拉本德粘度曲线的变化, 可见虽然处理压力不同, 但在整个升温、热保温、降温、冷保温的过程中, 它们的布拉本德粘度曲线变化趋势与原淀粉基本相同。它们的糊化温度、粘度、的提高而降低, 的溶胀有抑制作用。超高压微射流处理的机械力化学效应一定程度上破坏了淀粉分子的原始结构, 减小了淀粉分子的相对分子质量, 表现在布拉本德粘度曲线上为淀粉糊的粘度减小。但超高压微射流处　　

(上接第171页)

技术出版社, 19871

[2

]杨诗斌, 徐凯, 张志森1高剪切及高压均质机理研究及其在食品工业中的应用[J ]1粮油加工与食品机械, 2002(4) :34～351

[3]Michael H Tunick, D iane L Van Hekken, Peter H Cooke, Phili p W S m ith, Edyth L Malin 1Effect of high p ressure m icr ofluidizati on on m icr ostructure of mozzarella cheese [J ]1Lebens m ittel -W issenschaftund -Technol ogie, 2000, 33(8) :538～5441

[4]N Lagoueyte, P Paquin 1Effects m icr ofluidizati on on the functi onal p of ]1Food hydr ocoll oids, :～]I igh p m icr ofluidizati on whey p r oteins f or i m p r oved onality [J ]1I nnovative Food Science and E merging Technol ogies, 2003(4) :367～3761

[6]涂宗财, 任维, 阮榕生, 刘成梅, 李敏1超高压技术对大米淀粉物性影响初探[J ]1食品工业科技, 2006, 27

(5) :103～1051

[7]胡飞, 陈玲1微细化马铃薯淀粉的理化性质[J ]1无锡轻工大学学报, 2002, 21(5) :452～4551

少, 且去除效果好, 重复上述操作, 调节pH 为410、414、

512、610, 重新测定, 测定结果如图6。由实验可以看出:当pH 在414时, 吸附率达到96127%, 是最适宜的。

左右。

　　通过对大量不同果汁中去除蛋白质的方法测定, 证明其测定方法是准确、可行的。该方法直观、简洁、可操作性好, 可作为果汁中去除蛋白质的测定方法。

参考文献:

[1]王积涛, 胡青眉1有机化学[M]1天津:南开大学出版社, 1993136～421

[2]陶慰孙1基础蛋白质[M]1人民教育出版社, 19691101

图6　溶液pH (4～6) 与吸附率的关系

3　结论

活性炭吸附法去除果汁中的蛋白质, 不仅要考

虑活性炭加入量的因素, 同时还要考虑溶液的pH 、搅拌时间、温度等对吸附效果的影响。经过多次实验, 最后确定去除果汁中蛋白质的最佳工艺条件为:pH 为414、温度为20℃、每25mL 果汁中加入0125g 活性炭、搅拌时间为20m in 时, 蛋白质去除率达到90%　1742008年第02

期

～1211

[3]王正烈, 李文斌1物理[M]1北京高等教育出版社, 1993, 3123～251

[4]顾汉卿, 徐国风1生物材料学[M]1天津科技翻译出版社, 19931236～2371

[5]赵光远, 纵伟, 姚二民1浑浊苹果汁储藏过程中色泽稳定性的研究[J ]1食品科学, 2006, 27(8) :95～971

[6]候建平, 罗丽萍, 张邦建1饮料生产技术[M]1北京:科学出版社, 20041961

[7]白里浩1吸附的基础与设计[M]1化学工业出版社, 2000118～261

范文四：食品中蛋白质的测定方法

食品中蛋白质的测定方法

蛋白质的测定方法分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量，肽链和折射率测定蛋白质含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量。但是食品种类很多，食品中蛋白质含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此蛋白质的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸液吸收，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出蛋白质的含量。由于食品中蛋白质含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。

一 凯氏定氮法

我们在检验食品中蛋白质时，往往只限于测定总氮量，然后乘以蛋白质核算系数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗蛋白质。

(一)、 常量凯氏定氮法

衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。

一般食品蛋白质含氮量为l6％，即1份氮素相当于6.25分蛋白质,以此为换算系数6.25，不同类的食物其蛋白质的换算系数不同.如玉米、高梁、荞麦,肉与肉制品取6.25，大米取5.95、小麦粉取5.7,乳制品取6.38、大豆及其制品取5.17，动物胶5.55。

测定原理：

食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素以氨的形式与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收形成硼酸铵，再用盐酸标准溶液或硫酸标准溶液滴定，根据盐酸消耗量计算出总氮量，再乘以一定的数值即为蛋白质含量，其化学反应式如下。

(1) 消化反应：有机物(含C、N、H、O、P、S等元素)+H2S04

-→(NH4)2S04+C02↑+S02↑+S03+H3PO4+CO2↑

(2) 蒸馏反应：(NH4)2SO4+2NAOH-→2NH3↑+2H2O+NA2SO4 2NH3+4H3BO3-→(NH4)2B4O7+5H2O

(3) 滴定反应：(NH4)2B4O7+2HCH+5H2O-→2NH4CH+4H3BO3 或

(NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2

试剂与仪器：

1、硫酸钾；

2、硫酸铜；

3、浓硫酸；

4、4％硼酸溶液(饱和溶液)；

5、40％氢氧化钠溶液；

6、混合指示剂：临用时把(溶解于95％乙醇的)0.l％甲基红溶液10毫升和(溶于95％乙醇的0).l％甲基蓝溶液5毫升混合而成；

7、0.1N盐酸标准溶液或0.1N硫酸标准溶液；

8、凯氏定氮仪一套。

9、定氮瓶500ml二只。

10、三角瓶250ml 3只。

11、量筒50ml、lOml、lOOml。

12、吸管10ml。

13、酸式滴定管1支,规格25ml。

14、小漏斗1只。

操作方法：

1、样品消化：精密称取0.200-2.00g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的500ml定氮瓶中，加入0.5g硫酸铜，10g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加100ml水，放冷。

取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸，用同一方法做试剂空白试验。

2、蒸馏、吸收：按图装好定氮装置。接收瓶内加入50ml 4%硼酸溶液及混合指示剂5滴，并使冷凝管的下端插入液面下；将70ml 40%氢氧化钠溶液慢慢通过安全漏斗进入蒸馏烧瓶中，用直火加热蒸馏30分钟，移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下接收瓶。(接收瓶内的溶液呈蓝色)。

3、滴定：以0.1N盐酸标准溶液定至溶液灰色或淡紫色为终点。同时作一试剂空白测定除不加样品外，丛消化开始操作完全相同。

计算：

蛋白质(%)=（(V1-V2)×N×0.014×F）×100/ m

V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；

V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；

N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；

0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；

m：样品的质量（体积），g（ml）；

F：氮换算为蛋白质的系数。

注：

（1）样品应是均匀的，固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。

（2）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。

（3）消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢2-3ml，促使氧化。

（4）在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下,使氮有损失。

（5）如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。

（6）加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。

（7）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。

（8）氨是否完全蒸馏出来，可用精密PH试纸试馏出液是否为碱性。

（9）以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。

（10）吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。

（11）向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物

[Cu(NH3)4]++

下面我就针对几点来说明为何影响氨化完全和速度快的因素:

（1）K氏烧瓶和取样量

如果称1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml，800~1000ml的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。

（2）分解剂

A H2SO4和K2SO4的添加量

有机无分解需要H2SO4量，H2SO4应根据有机物种类不同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加H2SO4多，为了提高分解温度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：

1g样品 K2SO4： H2SO4=7g：12ml

这种比例在国内外都使用，是公认的

还有一种比例： K2SO4：H2SO4=10：20ml

B 催化剂

用作催化剂的有Hg、HgO、Se，硒化合物，CuSO4、TiO2，对Hg，HgO有毒但结果好，Se与CuSO4得到结果是一种，TiO2，的结果偏低，采用不同的催化剂则消化时间不同， HgO消化麦子为38，Se与CuSO4消化麦子55，TiO2消化麦子70，所以在给出测定结果时要注明催化剂的类型。

（3）热源的强度

消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大，即便盐类K2SO4加得多，如果热源弱，也是没有意义的，热源过强导致H2SO4损失，使氨回收率低，另外K氏瓶的容量大小，颈部的粗细和长短等，也与热源的强度有关。

（4）氨的蒸馏和吸收及滴定

蒸馏有两种:

1 直接蒸馏（装置简便，准确性好）

2 水蒸汽蒸馏

蒸馏加NaOH是50%，加的量为H2SO4量的4倍，硫酸量为12ml，则NaOH为12×4=48ml，而且一般高于这个理论值，即加到50~55ml，如果NaOH量加的不够就变成H2S， H2S是强酸，使颜色变红。

吸收液有：

1标准H2SO4 用标准碱返滴定，甲醛红指示剂

2 硼酸 用HCl进行滴定，混合指示剂

目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，这样可省略了反滴定，H2SO4是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在3%以上可将氨完全吸收，为保险期间一般用4%。

〈6〉注意事项

a.样品应时均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要混合均匀。

b.样品放入K氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。

c.消化时，如不容易呈透明溶液，可将K氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化剂2~3ml，促使氧化。

d.在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在K氏烧瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。

e.如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。

f.混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色，如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。

g.氨是否完全蒸馏出来，PH试纸检查馏出液是否为碱性。

h.向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀无。这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成深兰色的络合物。 i.消化剂绿色后继续消化30分钟即可。

2 K氏微量定氮仪法

3 K氏半微量定氮仪法 (2 、 3原理一样)

操作方法大同小异，半微量法消化后，定容100ml，然后吸25ml蒸馏吸收液吸收。

计算总氮%=(N(V2-V1)×0.014)/(W×10/100)×100

对于微量定氮仪法，仪器有了改进，样液称样少，蒸馏消化液也少，其它基本一样。

4 K氏自动定氮法

原理与上面一样，仪器，采用K氏自动定氮仪：其装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置，消化装置：由优质玻璃制成的K氏消化瓶以及红外线装置的消化炉。

二 水扬酸比色法

1 原理： 样品中的pro经H2SO4消化转化为铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成有颜色的化合物，可以在波长660nm处比色测定，求出样品含氮量，计算蛋白质含量。

2 方法 （１）标准曲线的绘制

取6个25ml容量瓶编号 0 1 2 3 4 5 6

分别加空白酸液 2ml

分别加磷酸盐缓冲液 5ml

稀释至总体体积至15ml

分别加水扬酸钠 5ml

37C水浴 15分钟

加入次氯酸钠 2.5ml

37C水浴 15分钟

取出试液于660nm下进行比色，绘标准曲线。

（2）样品处理：

准确称样0.20~1.00g→于K氏瓶中→加15mlH2SO4和5g催化剂→电炉上加热到沸腾后→加大 火力消化→直到出现暗绿色时→摇动瓶子→K氏瓶全部消化后→冷却→加水至250ml容量 瓶。

（3）样品测定：

准确吸取上述消化溶液10ml→于100ml容量瓶中→定容→准确吸2ml→于25ml容量瓶中→加 5ml磷酸缓冲液→以下操作与标准曲线绘制的步骤相同

并以试剂空白微对照，测得样液的光密度，从标准曲线查出其含氮量。

（4）计算

C×F

含氮%= ---------------------------× 100

W×1000×1000

C---从标准曲线中查出测定样液的含氮量（Ug）

F---样品溶液的稀释倍数

W---样品重量（g）

蛋白质%=总氮%×K（K可为6.25，也可查）

3注意事项：

A 当天消化液最好当天测定，结果重现性好，如果样液改至第二天比色就有变化。

B 当在PH和试剂适当范围内加入氯源后，颜色的显色和温度有关，应严格控制反应温度。

C 这种方法测定结果基本与K氏法一致。

4 试剂

（1）氯标液：称经110℃干燥2h的硫酸铵0.4719g→于烧瓶中定容10ml→此液1ml相当于 1.0mg氮标液→使用时配制成1ml相当于2.50Ug氮标液。

（2）空白酸液：称0.50g蔗糖→加15mlH2SO4和5g催化剂→与样品一样消化→定容250ml→ 使用时吸收此液10ml→加水至100ml为工作液备用。

（3）磷酸盐缓冲液：称7.1g磷酸氢二钠→加38g磷酸三钠→加20g三九石酸钾钠→加400ml水

溶解→过滤→另称35gNaOH溶于100ml水中→冷至室温→缓缓地搅拌加入磷酸盐溶液中→加 入水稀释至1000ml备用。

（4）水扬酸钠溶液：称25g水杨酸钠和0.15g亚硝基铁氰化钠溶于200ml水中过滤，加水稀释

至500ml

（5）次氯酸钠溶液：吸4ml安替富民液，用水稀释至100ml

5 仪器

（1）分光光度计

（2）恒温水浴

三 紫外分光光度法

1 原理：

pro及其降解产物的芳香环基 ，在紫外区内对某一波长具有一定的光选择吸收，在280nm下，光吸收与pro浓度（3~8mg/ml）成直线关系，因此，通过测定pro溶液的吸光度，并参照事先用K氏定氮法分析的标准样品，从标准曲线查出蛋白质的含量。

2 试剂：

（1） 0.1mol/l柠檬酸水溶液。

（2）8mol/l脲[（NH2）2CO]的2NNaOH溶液。 脲的2N氢氧化钠液

（3） 95%乙醇

（4） 无水乙醚

3 仪器

（1）751型的紫外分光光度计

（2）离心机

4 操作方法

（1）标准曲线的绘制：准确称取样品.2.00g，置于50ml烧瓶中，加入0.1mol/l柠檬酸水溶液30ml，搅拌30分钟使其充分溶解，用四层纱布过滤于玻璃离心管中，以每秒钟3000~5000转的速度离心10分钟，分别吸出上清夜0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于6个10ml容量瓶钟，每个容量瓶，8mol/l脲的氢氧化钠溶液充分摇2分钟（如果离心再次离心），取透明液于比色皿中，在280nm下测定其吸光度。（做参比值）

以事先用K氏定氮法测定的样品中蛋白质的含量微横坐标上面的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

（2）样品测定

准确称取试样1.00g→于50ml烧杯中→加0.1mol/l柠檬酸溶液30ml→搅拌10分钟→四层纱布过滤到离心管中→用8mol/L脲的NaOH溶液定容，摇匀后于280nm下测吸光度，从标准曲线上查出pro的含量。

计算： 蛋白质= C/W× 100

C----从标准曲线上查得的pro含量（mg）

W----测定样品溶液相当于样品量（mg）

说明：

a.此法运用于糕点，牛乳和可溶性pro样品，测定糕点时，应把表皮颜色去掉。

b.温度对pro水解有影响，操作温度应控制在20~30℃。

四 双缩脲法-皮尼克法

1 原理：

双缩脲在碱性条件中，能与CuSO4结合成红紫色的络合物。pro分子中含有肽链与双缩脲结构相似，也呈此反应。本法直接用于测定像小麦粉等固体试样的pro含量。但作为铜的稳定剂，酒石酸钾钠比甘油好些。小麦粉中的pro能直接地一边抽出一边进行定量。

2 试剂

⑴甘油作为稳定剂：取10ml10N KOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈搅拌，同时加入4%CuSO450ml。

⑵酒石酸钠作稳定剂，吸10ml10N KOH溶液和20ml25%酒石酸钾钠溶液加到930ml水中，激烈搅拌，同时加入4%CuSO4液40ml。

配制以上两种溶液、试剂，必须澄清，无氢氧化铜生成，否则重配。

3 方法：样品测定

标准曲线绘制

准确称0.6g样品→使用试剂（1）

准确称0.5g样品→使用试剂（2）

假如用试剂（2）

（1）准确称样→0.5g→于80ml离心管→加1mlClC4→混合→加50ml酒石酸钾钠稳定剂→盖上盖子离心10min（4000转/分）→放置1小时→吸混合液15ml→于20ml离心管中→离心到完全透明→取上清夜5ml于→10ml容量瓶→加水定容→于550nm处测定吸光度，从标准曲线上查出pro含量。

（2）标准曲线绘制

按样品测定方法，根据样品中pro含量，取离心澄清样液0.0 2.0 4.0 8.0 10.0ml于10ml容量瓶中→分别加水定容，按照样品测定其吸光度。

事先用K氏定氮法测定样品中pro含量为横坐标，以上述吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 4 计算：蛋白质%=C/W×100

C----从标准曲线上查得得pro含量（mg）

W----测定样液时相当于样品重量（mg）

范文五：食品中蛋白质含量的测定方法

食品中蛋白质含量的测定方法（GB5009．5-1985）

1 原理

蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。

2 试剂

所有的试剂均用不含氨的蒸馏水配制。

2.1 硫酸铜

2.2 硫酸钾

2.3 硫酸

2.4 2%硼酸溶液

2.5 混合指示液:1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。

2.6 40%氢氧化钠溶液

2.7 0.05N硫酸标准溶液或0.05N盐酸标准溶液。

3 仪器

定氮蒸馏装置：如图所示

1-电炉 2-水蒸气发生器（2L平底烧瓶） 3-螺旋夹 4-小玻杯及棒状玻塞 5-反应室6-反应室外层 7-橡皮管及螺旋夹 8-冷凝管 9-蒸馏液接收瓶

4 操作方法

4.1 样品处理：精密称取0.2～2.0g固体样品或2～5g半固体样品或吸取10～20ML液体样品（约相当氮30～40mg），移入干燥的100ML或500ML定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20ML硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。取下放冷，小心加20ML水。放冷后，移入100ML容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取之与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。

4.2 按图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数亳升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

4.3 向接收瓶内加入10ML2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，

吸取10ML样品消化稀释由小玻杯流入反应室，并以10ML水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。将10ML40%氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5分钟移动接受瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1分钟。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。

同时吸取10ML试剂空白消化液按4.3操作。

4．4 计算

x = (v1-v2)*N*0.014*F*1000/M

式中：x-样品中蛋白质的含量,%

v1-样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml

v2-试剂空白消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml

N-硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度

0.014—1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数

m-样品的质量

F-氮换算为蛋白质的稀疏。蛋白质中的氮含量一般为15%~17.6%，按16%计算乘以

6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高梁为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为5.30。

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