1. MDA 的提取 称取植物材料 1g ，剪碎，加入50mmol/L的磷酸缓冲液(PH7.8),研磨,4?,10000g离心10min,上清液定容为10ml为样品提取液.(取部分上清液立即分装于4?保存,用于POD和蛋白质含量的测定.) 2. 丙二醛含量测定: 吸取离心的上清液 1.5 ml(对照加 1.5 mL 蒸馏水)，加入 2.5ml 0.5% TBA 溶液，摇匀。将试管放入沸水浴中煮沸30 min (自试管内溶液中出现小气泡开始计时) ，取出试管并冷却，4000g 离心 10 min ，取上清液测定 532 nm 、 600 nm 和 450 nm 处的吸光度值。

3.结果计算:

MDA的浓度: C(μmol/L) = 6.45×( A 532 , A 600 ), 0.56× A 450 MDA 含量( μmol/g)= [MDA浓度(umol/L)×提取液体积(mL)]/[样品重量(g)×1000]

实验2 过氧化物酶活性(POD)的测定(比色法) 反应混合液: 100 mmol , L 磷酸缓冲液( pH6.0 ) 50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚 28 μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢 19 μl ，混合均匀，保存于冰箱中。

1.POD的制备:上一实验中提取并分装的上清液1ml (若浓度高用磷酸缓冲液稀释)

2. 酶活性的测定:取反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL，立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值，每隔 1min 读数一次,共记录5次。以反应混合液 3 mL 和磷酸缓冲液 1mL为对照。 3.以没加酶液的反应体系混合液为对照，于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值，每隔 1min 读数一次，立即开启秒表记录时间) 3(结果计算

也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位( u )表示。

过氧化物酶活性 [u/ ( g ? min ) ]= (Δ A 470× V) ×n/(w×V T

s×0.01×t)

式中: Δ A 470 —反应时间内吸光度的变化。 W —植物鲜重， g 。

V —提取酶液总体积Ml; V s —测定时取用酶液体积mL; T

t —反应时间min ; n—稀释倍数

实验3 植物体内可溶性蛋白质含量的测定

一、考马斯亮蓝法

1. 标准曲线的绘制: 取6支试管，按表1数据配制0,100μg/ml血清

白蛋白液各1ml。

表1 配制0,100μg/ml血清白蛋白液

管 号 1 2 3 4 5 6

100μg/ml牛血清蛋白量(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

蒸馏水量(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0

蛋白质含量(mg) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10

准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入4.9ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min后，在595nm下比色，绘制标准曲线。

1

2.提取液中蛋白质浓度的测定

取上实验一中提取并分装的上清液0.1ml，放入具塞刻度试管中，加入4.9ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2 min后在595 nm下比色，记录吸光度值.

3.计算:

根据吸光度值,通过标准曲线查得蛋白质含量:计算公式见(实验指导P78)

实验4 叶绿素含量的测定

1. 取新鲜植物叶片(或其它绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，剪碎(去

掉中脉)，混匀。

2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，加5 ml 95,乙醇，避光静置24h至组织变白。 3. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内,以95,乙醇为空白对照，分别测定波长665nm、649nm、470 nm下吸光度。

4.计算------见实验指导P35公式

实验5 细胞膜透性的测定

1. 选取植物在一定部位上生长叶龄相似的叶子剪下后，先用纱布拭净,剪成长约

1cm的小段，各处理称取2份,每份1g,将其放入试管中或小烧杯中,准确加入

蒸馏水15ml,浸没叶片.

2. 将烧杯或试管放入真空干燥器中,抽气10min左右,至叶片下沉. 3. 将抽过气的烧杯或试管取出,静止20min,然后用玻璃棒轻轻搅动叶片,用电导

率仪测定溶液的初始电导率(S)。 1

4. 测毕，将各试管盖塞封口，置沸水浴中10min，以杀死植物组织。取出试管后用自来水冷却至室温，并在室温下平衡10min，摇匀，测其终电导值(S)。 25.按下式计算相对电导度:

S1

S2相对电导度(L)=

相对电导度的大小表示细胞膜受伤害的程度。

由于室温对照也有少量电解质外渗，故可按下式计算由于低温或高温胁迫而产生的外渗，称为伤害度(或伤害性外渗)。

LL,tCK，100L1,CK 伤害度(%)=

式中 L—处理叶片的相对电导度; t

L—对照叶片的相对电导度。 ck

在电导度测定中一般应用去离子水，若制备困难可用普通蒸馏水代替，但需要设一空白试管(蒸馏水作空白)，测定样品时同时测定空白电导值，按下式计算相对电导度:

S,空白电导度1

S,空白电导度2相对电导度(L)=

实验6植物根系活力的测定(P69)

2

植物组织中丙二醛含量的测定

植物组织中丙二醛含量的测定

作者：佚名 文章来源：吉林农业大学 点击数：595 更新时间：2006-10-22

0:21:23

一、原理

植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（ MDA ）是膜脂过氧化作用的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。

丙二醛在酸性和高温条件，可以与硫代巴比妥酸（ TBA ）反应生成红棕色的三

甲川（ 3,5,5 —三甲基恶唑 2,4- 二酮），在 532 nm 处有最大光吸收，在 600 nm 处有最小光吸收，该复合物的吸光系数为 155 [mmol/ （ L ? cm ） ] ，可按公式： A 532 － A 600 = 155000 × C × L 算出 MDA 浓度 C （ μmol/L ），进一步算出单位重量鲜组织中 MDA 含量（ μmol/g ）。式中， A 532 和 A 600 分别表示 532 nm 和 600 nm 处的吸光度值。 L 为比色杯厚度（ cm ）。 需要指出的是，植物组织中糖类物质对 MDA-TBA 反应有干扰作用。为消除这种

干扰，经试验，可用下列公式消除由蔗糖引起的误差。

C （ μmol/L ） = 6.45 （ A 532 － A 600 ）－ 0.56A 450 式中： A 450 、 A 532 和 A 600 分别表示 450 nm 、 532 nm 和 600 nm 处的吸光度值。算出植物样品提取液中 MDA 的浓度后，可进一步算出其在植物组

织中的含量。

二、实验材料、试剂与仪器设备

（一）实验材料

植物的根或叶片。

（二）试剂

1 ． 5 % 三氯乙酸（ TCA ）。

2 ． 0.6 % 硫代巴比妥酸（ TBA ）溶液：称取硫代巴比妥酸 0.6 g 溶于 5 ％ TCA 溶解并用其定容至 l00 mL 。

（三）仪器设备

研钵，恒温水浴锅，分光光度计，离心机，天平，刻度试管，移液管 三、实验步骤

1. MDA 的提取 称取植物材料 1 g ，剪碎，加入 2 mL 5% TCA 和少量石英砂，研磨至匀浆，再加 8 mL TCA 进一步研磨，匀浆在 4000 r/min 离心 10 min ，上清液为样品提取液。

2. 显色反应和测定 吸取离心的上清液 2 mL （对照加 2 mL 蒸馏水），加入 2 mL 0.6 % TBA 溶液，摇匀。将试管放入沸水浴中煮沸 10 min （自试管内溶液中出现小气泡开始计时） ，取出试管并冷却， 3000 r/min 离心 15 min ，取上清液并量其体积。以 0.6 ％ TBA 溶液为空白测定 532 nm 、 600 nm 和 450 nm 处的吸光度值。

四、结果计算

MDA 含量 ( μmol/g)=

植物组织中丙二醛含量的测定

植物组织中丙二醛含量的测定

一、原理

植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(malondialdehydeMDA)是膜脂过氧化作用的产物之一，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。

丙二醛在酸性和高温条件，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应,形成在532nm波长处有最大光吸收的有色三甲基复合物，该复合物的吸光系数为155

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