内涵界大师兄
专业 号 姓
实验一、蛋
(考马斯亮蓝法)
一．实验目的：
植物内的可溶性蛋白质大多数是参与种代谢的酶类，测其含量是了解物体总代谢一个重要指标。在研究每一种的作用，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯。因此，测定植物体内溶性蛋白质是研
二、原理
考马亮蓝G-250（Coomassit brilliant blue G-250）定蛋白质含量属于染料结合法的一。在一蛋质浓度范围内（5～100μg/ml），蛋白质－色素复合物在595nm波长下的光吸收与白质含量成正比，故
特点：蛋白质与考马亮蓝G-250结合在2min左右的时间达到平衡，完成反应十分迅速，结合物在温下1h
该反应非常灵敏，测微克级蛋白质含量(范围为5～100μg蛋白质）,，所以是一种比较的蛋
三、材料、试
植物材料：绣球
实验试剂：考马斯亮蓝试剂；磷
实验器具：分光光度计；比色皿；离机；研钵；离心管；移管；
四、实验步骤
样品含量测定：
（1）称取绣球0.2g，剪碎放入钵中pH7.0 PBS 3ml研磨提,再加2次2ml缓冲液清洗钵和,倒入离心管中，8000rpm/min离心15分钟,上清液倒入一10ml刻度试管中,记
（2）用移液管（或移液）取上清液1ml ，加入到另一10ml刻度试中，加入5ml考马亮蓝试剂，充分摇匀，静置至少2钟，倒入皿中（另将考马斯亮蓝试剂加入另一比色皿，用于校零），在分光光度计595nm 处比色。(按照0～100μg/ml
五、结果计算
预实验所得标准曲线方程为：A=0.0036C+0.1091
实验所得595nm
样品蛋白质含量(μg /g
= (172.47×7.1/1)/0.2=6122.685μg /g
式中： C－查标准曲线所得每
V－提取液总
a－测定所取提
W－取样量（g）。
六、注意事项
1.在研磨叶片时要充分的研磨，不然会使叶片的蛋白质无法研磨出来，最终致实
2.在使用离心器前要找一个离心质量差不多的才能一进
蛋白质含量的测定
蛋白含量的测定
一．目的
学习和掌握考马斯亮蓝G-250测蛋白质含量的原理和方。
考马斯亮G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定白质含量属染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态呈红色，最大吸收在488 nm；当它与蛋白结合后变青色，蛋白质-色结合物在595 nm波长下最大光吸收。其收值与蛋白含量正比，此可用于蛋白的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2 min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持定。灵敏比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含，定蛋质浓度范围为0～1 000μg/mL，是种
1. 试剂：牛血清蛋白，考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，磷酸，蒸馏水 2. 标
（1） 蛋白
25mg牛血清蛋加入90ml蒸馏水定容到100ml，吸取40ml定容到100ml，浓
（2）
G-250：100mg，95%乙醇：50ml，85% H3PO4：100ml，加入蒸馏水700ml后震荡溶解，最后容至1L，过后分装，
四．步骤
1. 制作标准曲
2. 样品
a) 称取0.1g样品，加蒸馏水研磨匀浆，转移定容至10ml量
倒入2ml离心管中离心（5000g，10min）
b) 吸取离心管中上清液0.1ml，加入0.9ml蒸馏水，加入5ml考马
2-3min后在A595nm处比色。
三．注意事项：1.零时，比色皿上分别装上0号调零，以消杯差 2.比色皿
食物中的蛋白质含量
蛋白质
蛋白质来源
蛋白质是长条的氨酸所构成。人体身可以产生的基酸叫非必需氨基酸。有八种氨基酸，叫做必需氨基酸，是人体所不能产生的，必须由
很多高蛋的物都来源于动，像猪肉、鸡肉、鱼、牛奶、酪、酸奶和鸡蛋，这些提供人体必的全部氨基酸。当然，这并不是给其他来自植物的蛋白质食品打折扣，我们所获取的蛋白质大概有三分之一自谷类(例面包、米饭)、豆类、水果和
有些植物可能某些须基酸的含量比较低。多种植物食品的结合才能提供每餐所必须营养，谷物类所含的必须的氨酸很低，而类含的氨基蛋氨酸则很低。通过结合豆类食品和谷物食品(例如面包片上放豆子，小扁豆和米饭一起吃)，或者种子坚果和谷物(例如豌豆、油、三明治)，身体便在餐饭中获了足够数量的种氨
每天摄入充足的白质并不困，事实运动员经常锻炼的人通过规律的饮食和甜点可以获得他们所需
蛋白质
牲畜的奶，牛、奶、马奶等;畜，牛、羊、猪、狗肉等;禽肉，鸡、、鹅、鹌鹑、驼鸟等;蛋类，蛋、鸭蛋、鹌蛋及鱼、虾、蟹等;还有大豆类，黄豆、大青豆和黑豆等，其中黄豆的营养价值最高，它是婴幼儿食品中优质的蛋白质来源;此外芝、瓜子、核桃、 杏仁、松子等干类蛋白质的量均
高蛋白质食物分类
含蛋白质最多食物
含蛋白质最多动物
食物中以豆类、生、肉类、乳类、蛋、鱼虾类含蛋白质较高，而谷类含量少，蔬菜水果中更少。人蛋白质的需要取决于蛋白质的含量，而且还取决于蛋白质中所含必需氨基酸的种类及比例。由于动物蛋白质所含氨基酸的种类和比例较符人体需要，所动物性蛋白质比植性蛋白质养价
在植物性食物中，、面所含蛋白质缺少赖酸，豆类蛋白质则缺少蛋氨酸和胱氨酸，食混合性食物可互相取长补，大提高混合蛋质利用率，若再适量补充动物性蛋白质，可大大提高膳食中蛋白质的营养价值。虽然人乳、牛乳、鸡蛋中的蛋白质含量较低，但它们所含的必需基酸量基本上与体相符，以营养价较高，是膳中最
蛋白质是构成人体重要
经等都含有蛋白质。长的质
丰富的食品。更多饮健康规、
蛋白质含量的测定
衡量食品的营养成时，测
复杂性，在食品分析，通用
要形式，每一蛋白质有其定
通过一定的换系
般食品蛋白含氮量为l0％如肉、蛋、豌豆、玉等，其换系数为6.25，小麦取5.70，大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17，动
掌握微凯氏法测定白质总氮的原及操作技术。包括样品的消 化，蒸馏吸收及滴定与含氮
凯氏定氮法：食品加硫
铵。然后加碱蒸馏使游离，用
耗量，再乘以一的
( 1 ) 2NH(CH)COOH+13HS0 (NH)2S0+6C0+12S0+ 16H 2222444222
(2)(NH)SO+2NAOH-----2NH+2HO+NASO 4242224
(3)2NH+4HBO----(NH)BO+5HO 33342472
(4) (NH)B0+HS0+5H0-(NH)SO+4HBO 424724249422
1、硫酸钾
2、硫
3、硫酸
4、2％硼酸溶液
5、40％氢氧化钠溶液
6、混合指示剂：把溶解于95％乙醇的0.l％溴酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升
7、0.OINHCL标准溶液或0．01N硫酸标准溶液．
8、凯氏
9、定氮瓶100m1或50ml一只。
10、三角
11、量筒50ml、lOml、lOOml。
12、吸
13、酸
14、容量
15、
1、 样品理：精密
液体样品（约相当氮30-40mg），入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20毫升硫酸，稍匀后于瓶
将瓶以45度角斜于有孔
泡沫完全停止后，强火，
透明后，再继续加热0.5小时。取下冷，小心加20ml，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并容量瓶
度，混匀备用。取处理品
做试剂空白试验。
2、 按图装好定装置，于水蒸气生器内装水2/3加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃以防暴
制，加热煮沸
3、 想接收瓶内加
插入液面下，吸取10.0ml
水洗涤小烧杯使流入应室，
氢氧化钠溶液倒入玻璃，
璃盖塞紧，并加水小玻杯
入反应室使氨通过凝管进
凝管下端离开液皿，再蒸
下接收瓶，以0.01N硫酸
同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。
（V1-V2）*N*0.014
X =------------------------------ +F*100
m*（10/100） 计算：
X：样品中
V1：样品消硫
V2：试剂空消耗
N：硫酸或盐
0.014：1N硫
m：样品的质
F：氮换算
注：
（1） 样品是均
或搅拌均匀。
（2） 样品入定
下，以免被检
（3） 化时不
过氧化氢2-3ml，促使氧化。
（4） 在整消化
中在凯氏瓶底部，以免
使氮有损失。
（5） 如硫
氢钾，而不与氨用，
过高时，
（6） 加入酸钾
铜在蒸馏时
（7） 混合示剂
性溶液中呈红色。果有
溶液。
（8） 是否完全蒸馏出来，可用PH试纸馏出液是为碱性。 （9） 吸收叶也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的
碱液滴定，计算，A
数，N为碱
（10） 以硼为氨吸
求并不严格，亦免去用移液管，操作比较便。 （11） 向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这
进碱与加入的硫铜反
化铜的沉淀。时
++[Cu(NH)] 34
蛋白质含量的测定
蛋白质含量的测定
蛋白质浓度测定采用马斯蓝
一定浓度的乙醇及酸溶液为
方法非常简单，只要蛋白样品
增加量可知
考马斯亮
100mg考
磷酸，用蒸馏定容至1000mL，
蓝G-250，4.7%(V/V)乙醇，8.5%(V/V)磷酸。
测定方法：
取1.0mL样品液，5.0mL
595nm下测吸光。根OD
表4-1 蛋
Table 4－1 Standard cure of protein
试管编
1
号
标准蛋
白溶液
1.0
蒸馏水
考马斯
亮蓝
G-250
OD595 0 0.130 0.199 0.260 0.310 0.367 0.432 0.436 0.492 0.542 0.542 5ml 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Concentration of protein(mg/ml)
图4-5 蛋白质标准曲线
Table 4-5 Standard cure of protein
其标准曲线回归方程
y为595mn的
