范文一:农杆菌质粒载体系统
农杆菌质粒载体系统
质粒载体系统中最常用的质粒有:Ti质粒和Ri质粒。Ti质粒存在于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中,Ri质粒存在于发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenis)中。Ti质粒和Ri质粒在结构和功能上有许多相似之处,具有基本一致的特性。但实际工作中,绝大部分采用Ti质粒。农杆菌质粒是一种能实现DNA转移和整合的天然系统。Ti质粒有两个区域:T-DNA区(是质粒上能够转移整合入植物受体基因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘿瘤的发生,且可通过减数分裂传递给子代的区域)和Vir区(编码能够实现T-DNA转移的蛋白)。T-DNA长度为12-24 kb之间,两端各有一个含25 bp重复序列的边界序列,在整合过程中左右边界序列之间的T-DNA可以转移并整合到宿主细胞基因组中,研究发现只有边界序列对DNA的转移是必需的,而边界序列之间的T-DNA并不参与转化过程,因而可以用外源基因将其替换。Vir区位于T-DNA以外的一个35 kb内,其产物对T-DNA的转移及整合必不可少。农杆菌侵染植物首先是吸附于植物表面伤口,受伤植物分泌的酚类小分子化合物可以诱导Vir基因的表达。Vir产物能诱导Ti质粒产生一条新的T-DNA单链分子。此单链分子从Ti质粒上脱离后,可以与Vir产物VIRD2蛋白共价结合,并在VIRD4和VIRB等蛋白的帮助下从农杆菌进入植物细胞的染色体中。
由于野生型Ti质粒过于庞大,约200-800kb,为了便于重组DNA操作,研究人员对Ti质粒进行了改造从而构建一系列合适的Ti衍生载体。首先除掉了野生型Ti质粒T-DNA区的一段DNA片段。例如:参与植物生长素和细胞分裂素的基因(这些基因过度表达植物激素,从而破坏受体细胞和
激素产量)。此外需在Ti质粒上加上E. coli复制起始位点,使得插入外源基因的Ti质粒在为一个穿梭载体,不但可在农杆菌中复制,而且便于在E. coli中重组操作与保存。
植物转化载体系统(包括一元载体系统和双元载体系统)。人们在研究中发现在T-DNA转移过程中,Vir基因并不一定与T-DNA位于同一个质粒上,于是通过构建中间载体解决了Ti质粒不能直接导入目的基因的困难。
大肠杆菌具有能与农杆菌高度接合转移的特性,因此研究者可以将
T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中,并插入外源基因,最后通过接合转移把上源基因引入到农杆菌的Ti质粒上。这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T-DNA引入Ti质粒的有效方法。带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒的衍生载体称为“中间载体”(intermediate vector),而接受中间载体的Ti质粒则称为受体Ti质粒(acceptor Ti plasmid),一般是卸甲载体(disarmed vector)。所谓卸甲载体就无毒Ti质粒载体。因为利用野生型的Ti质粒作载体时影响植株再生的直接原因是T-DNA中onc基因的致瘤作用。因此为了使野生型的Ti质粒成为基因转化的载体,必须切除T-DNA的onc基因,而“解除”其“武装”,构建成所谓的“卸甲”或称“缴械”载体。在这种onc-载体中已经缺失的T-DNA部分被大肠杆菌的一种常用质粒pBR322取代。这样任何适合于克隆在pBR322质粒的外源DNA片段都可以与pBR322质粒DNA同源重组,而被其整合到onc-Ti质粒载体上。中间载体通常是多拷贝的E. coli小质粒,这一点对Ti通过体外操作导入外源基因是非常必要的。从结构特点看可分为两类中间载体:即共整合系统中间载体和双元系统中间载体。
根据两类中间载体,目前已开发出两类转化体系:一类是一元载体系统(整合载体系统),这一类载体系统由一个共整合系统中间表达载体与改造后的受体Ti质粒组成。在农杆菌内,通过同源重组将外源基因整合到修饰过的T-DNA上,形成可穿梭的共整合载体,在Vir基因产物的作用下完成目的基因向植物细胞的转移和整合。但这类方法构建困难,整合体形成率低,一般不常用。
另一类转化体系是双元载体系统,它由两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒——微型Ti质粒(mini-Ti plasmid)和辅助Ti质粒(helper Ti plasmid)构成,T-DNA和Vir基因在两个独立的质粒上,通过反式激活T-DNA转移到植物细胞基因组内。微型Ti质粒就是含有T-DNA边界但缺失Vir基因的Ti质粒,为一个广谱质粒。它含有一个广泛寄主范围质粒的复制起始位点(OriV),同时具有选择性标记基因。辅助质粒为含有Vir区段但T-DNA缺失的突变型质粒,完全丧失了致瘤的功能。因此相当于共整合载体系统中的卸甲质粒。其作用是提供Vir基因功能。激活处于反式位置上的T-DNA转移。
将微型质位转入到含有辅助性Ti质粒农杆菌的途径有两条:一条是直接用纯化的微型Ti质粒转化速冻的根癌农杆菌感受态细胞;另一条途径是采用三亲交配方法,三亲交配由含微型Ti质粒的E. coli、含有助动质粒pRK2013的E. coli和含有辅助Ti质粒的农杆菌组成。三细菌混合后产生菌间的接合转导。pRK2013可移入农杆菌,但由于不能自主复制而被丢失,其进入含有微型Ti质粒的E. coli后,可促进微型Ti质粒一起或分别转移入农杆菌中。但由于pRK2013的“自杀”特性,最终在农杆菌中剩下微型
Ti质粒和Ti质粒双元载体,此农杆菌可直接用于植物细胞转化。双元载体不需经过两个载体的共整合过程。因此构建的操作过程比较简单;由于微型Ti质粒较小,并无共整合过程,因此质粒转移到农杆菌比较容易,且构建的频率较高。另外,双元载体在外源基因的植物转化中效率高于一元载体。
农杆菌有两大类,根癌农杆菌和发根农杆菌,前者含的是Ti质粒,后者含的是Ri质粒.如果你所用的根癌农杆菌本身所带质粒有抗性,比如我用的GV3101就抗利福平和庆大,做转基因时把构建好的表达载体导入农杆菌中,那么这个菌就带有双元载体,这是目前转基因用的较多的方法,在培养这个含双元载体的农杆菌一般要加三种抗生素, 即利福平、庆大和表达载体所带的抗性,比如卡那。如果少其中的一两种也可以,比如可以不加庆大或利福平,加了当然比较好一点,能保证你的菌受污染的机会减少
范文二:农杆菌质粒快速提取
中国科学院发育生物学研究所
博士研究生学位论文
新型番茄蛋白酶抑制剂II基因的分离
及其内含子的功能研究
Isolation of a novel proteinase inhibitor II gene
from tomato (Solanum esculentum L.) and studies on
the function of its intron
姓 名: 谢先芝
专 业: 发育分子生物学
研究方向: 外源基因的表达与调控
指导教师:吴乃虎研究员
黄美娟副教授
2000年12月
3(农杆菌质粒快速提取及阳性克隆的鉴定
[1]分别挑取转化后的农杆菌单菌落,在2.0ml含有(利福平和卡那
霉素)的LB培养基中28?培养2-3天。
[2]将培养后的菌液转移到1.5ml Eppendorf管中,离心3O秒。
[3]弃去上清,用O.1 ml冰预冷的Solution I,重悬细胞,室温
1O分钟。
溶液I:4mg,m1溶菌酶;50mM葡萄糖;lOmM EDTA,25mM Tris-HCl,pH8.0,
分装后保存于-20?
[4]加入0.2ml Solution II,充分混匀,室温1O分钟。
:1,SD S;O.2N NaOH( 溶液II
[5]加入用两倍体积的Solution II平衡过的酚30ul(用前混匀),轻轻的混匀,这时溶液应该变粘。
[6]加入150 μl 3mo1,L NaAc(pH=5(2),稍微振动。
[7]-20?下放置15min。
[8]离心lOmin,转移上清至1.5ml Eppendorf管。加lml冷的无水乙醇,
颠倒混匀,一80?下放置15分钟。
[9]离心3分钟,弃上清。
[1O]用450μ1 H0中重新悬浮沉淀,加3mol,L NaAc 50 μl和lml冷的2
无水乙醇,充分颠倒混匀,-80?下放置l5分钟。
[11] 离心3分钟,缓缓倒去上清。加入lml冰预冷的70,的乙醇,混
匀后离心两分钟,倒去上清。并再离心,尽可能除去液体,室温干燥。 [1 2]用50 μl的d dH_20或TE重新溶解沉淀,-20?保存。 [1 3]取出1μ1农杆菌质粒稀释5O倍后用作PCR模板,PCR扩增体系如第二章。
利用PCR技术从番茄基因组中分离内含子TPI序列,并将其按正向和反向
两种形式各自分别插入到植物表达载体pBI121的嵌合结构35S启动子-GUS报告基
因-NOS终止区的35S启动子上游及NOS终止区下游,构成4种结构不同的重组质
粒pBTB 1、pBTB7、pBTE2和pBTE4。把上述4种表达载体以及pBI121质粒经农杆
菌介导侵染烟草叶片外植体后,然后通过荧光分析仪检测内含子对GUS报告基因瞬
时表达活性的影响。与pBI121质粒的结果相比,内含子正向插入GUS基因编码区
上游时,GUS瞬时表达活性提高了约2倍;内含子反向插入GUS基因编码区上游时,
GUS基因瞬时表达活性提高了约4倍;内含子正向插入NOS终止区下游时,GUS基
因的瞬时表达活性提高了约9倍;内含子反向插入NOS终止区下游时,GUS基因的
瞬时表达活性提高了约5倍。这些事实说明,本实验分离的新型的番茄蛋白酶抑制
剂II基因tin2i的内含子TPI序列能够有效地促进报告基因GUS的表达活性,而且这种促进作用与TPI序列的插入方向和位置均无关系,也就是说,内含子TPI
序列具有明显的增强子特性。
写 表
4-MU(4-methyl umbelliferone) 4-MUG(4-methyl umbelliferone
glucuronide)
6-BA(benzyl aminopurine)
Acr(acrylamide)
Amp(ampicillin)
AP(ammonium persulfate)
Bis(N,N'-methylene-bis acrylamide) BSA(bovine serum albumin
Cb(carbenicillin)
CIP(calf intestinal alkaline phoshpatase
CTAB(cetytriethyl ammonium bromid) ddH_20(distilled deionized water) DEPC(diethyl pyrocarbonate) DTT(dithioth reit01)
EDTA(disodium ethylenediamine tetra
acetate dihyd rate)
S(β-glucuronidase) GU
HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-
N’-2-ethanesulfonic)
IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside) Km(kanamycin)
LB(Luria-Bertani media) MOPS(3-(N-morpholine)propanesulfonic
acid)
MS(Murashige-Sk00g media) NAA(naphth alene acetic acid) PAGE(polyacrylamide gel
electrophoresis)
PCR(polymerase chain reaction) PEG(polyethylene glycol) 4-甲基伞形酮
4-甲基伞形酮葡糖苷酸
6-苄氨基嘌呤
丙烯酰胺
氨苄青霉素
过硫酸铵
N,N-甲叉丙烯酰胺
牛血清白蛋白
羧苄青霉素
小牛肠碱性磷酸酶
十六烷基三乙基溴化铵
重蒸去离子水
焦碳酸二乙脂
二硫苏糖醇
乙二氨四乙酸
β-葡糖苷酸酶
N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸
异丙基-β-D-半乳糖苷
卡那霉素
Luria-Bertani培养基
3一(N-码啉代)-丙磺酸
Murashige-Skoog培养基
萘乙酸
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚合酶链式反应
聚乙二醇
1
PMSF (phenylmethyl sulfonyl fluoride)
Rif (Rifampicin)
RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) Sarcosyl (N-lauroysarcosine sodium salt)
SDS(sodium dodeeyl sulfate) SSC (standard saline citrate) TAME (p-toluenesulphonyl-L- arginine methyl ester)
TEMED(N,N,N',N'-tetramethylethylenedia
mine)
Tet (tetracycline)
Tris (tri-hydroxymethyl aminomethane)
Xgal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galac toside)
X-gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-glucuro
hide)
苯甲基磺酰氟
利福平
逆转录PCR
十二烷基肌氨酸钠
十二烷基硫酸钠
标准柠檬酸钠盐
对甲苯磺酰-精氨酸甲苯酯 N,N,N',N’-四甲基乙二胺 四环素
三羟甲基氨基甲烷
5-溴4-氯-3-吲哆-β-D-半乳糖苷 5-溴-4-氯-3-吲哆糖醛酸 2
范文三:质粒转化农杆菌 感受态制备
感受态制备
1、农杆菌选择:LBA4404、EHA105、GV3101
2、农杆菌活化:将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线(或加或不加抗生素,LBA4404:Rif或Str;EHA105:Rif或 Str;GV3103:庆大霉素。如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失,导致农杆菌缺乏侵染性),抗生素浓度为:50μg/ml。28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备:
1)挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中,220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。
2)吸取1.5ml菌液于离心管中,冰浴10min;
3)5000(13000)rpm离心30s,弃去上清液;
4)沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min;
5)5000(13000)rpm离心30s,弃去上清液;
6)每管用100μl 20mMCaCl2悬浮,用于转化;
制备好的感受态细胞可马上使用,也可按每管200ul分装于无菌离心管中,于4℃保存48小时内使用,长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。使用时从一70℃取出,置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌:
1)50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1~1μg(5-10ul),之后冰浴30 min;
2)放入液氮中5min(或1min),然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min;
3)取出离心管,加入0.5mlLB,28℃、220rpm振荡培养3~5hr;
4)取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板,在培养箱中28℃条件下倒置培养。2天左右菌落可见。
(pEmu载体:AMP+Rif/Str;pK载体:Kan+Rif/Str;pTCK载体:Kan+Rif/Str)
范文四:农杆菌质粒DNA高效提取方法研究
农杆菌质粒 DNA 高效提取方法研究
ba 芳 丰贵鹏 ,彭
,新乡学院 a.化学与化工学院,b.公共外语部,河南 新乡 453003,
摘 要:以 EHA105 菌株为实验材料,通过优化质粒扩增条件、加大菌液使用量、改良提取纯化过程中所 用试剂等,简化了操作流程,给出了一种高效提取农杆菌中质粒 DNA 的方法。结果表明,选择 LB+KANA 为培养基、抗生素质量浓度为 50 mg/L,细菌培养至 OD=0.634,0.714 时,以 5 mL/次用量取菌液裂解, 600
以改进方法提取试剂, 得率与常规方法相当。该方法在满足 PCR 检测条件的前提下既减少了酚、氯仿等有
毒试剂的用量,又省时、经济、方便,为植物转基因工程中目的物 DNA 的检测提供了技术支持。
关键词:Ti 质粒 DNA,质粒扩增,PCR,农杆菌
–() ––中图分类号:Q781 文献标志码:A 文章编号:16743326201002004804
Research on a Method of Efficient Extraction of Plasmid DNA
from Agrobacterium abFENG Gui-peng, PENG Fang
(a. Department of Chemistry and Chemical Engineering, b. Department of Public Foreign Language,
Xinxiang University, Xinxiang 453003, China)
Abstract: The establishment of the method in which the plasmid DNA can be extracted efficiently from Agrobacterium provides technical support for the test of the target DNA in the plants’ transgenic engineering. The extraction method is acquired based on a series of experiments with EHA105 Agrobacterium as material, which is carried out by optimizing the conditions of plasmid amplification, increasing the amount of bacterial liquid, improving the reagents in the process of extraction and purification and simplifying the operational processes. The result shows that taking LB + KANA as the medium, when concentration of antibiotic is 50 mg/L, bacteria are cultured to OD=0.634,0.714; taking 5 mL bacterial liquid every time, the bacteria is cracking. The dosage of 600
reagent used in the extraction is referred to in the improved methods; yield is consistent with the conventional method. Meeting PCR detection, the improved methods not only decrease the use of toxic reagents such as phenol, chloroform etc, but also are more time-saving, more economical, and more convenient. The method establishes the foundation for its wide application to ordinary experiments.
Key words: Ti plasmid DNA; plasmid amplification; PCR; agrobacterium
0 引言
目前,农杆菌介导的植物转基因是植物基因转移中应用最普遍的方法,它具有转化效率高、成本低、
遗传稳定等优点。农杆菌质粒检测是植物基因工程中工程菌构建时必做的实验,但由于农杆菌中质粒 DNA
的基因拷贝数少,在提取质粒 DNA 时,出现产量低的问题。快速获得较多质粒 DNA 的方法,国内也有相
关报道,如湖北师范学院生物系王友如,中国农业科学院生物技术研究所基因工程实验室崔洪志、郭三堆
等利用常规碱裂解和 Mini 质粒提取相结合的方法,通过加大菌液使用量,利用 LiCl 离心沉淀 RNA,严格
[1] 限制反应的环境条件,使操作流程简化,并去除了酚、氯仿等有害试剂,但使用的 LiCl 价格昂贵,代价
收稿日期:2010-02-27 修回日期:2010-03-19
作者简介:丰贵鹏(1982,),男,河南新乡人。讲师,研究方向,生物化工。E-mail: fengguipengheda@163.com。
高,福建农林大学作物科学学院单世华、李春娟、张君诚等以农杆菌菌株 LBA4404(A?tumefaciens)质粒为 载体,以双价表达载体 pCG?(含几丁质酶基因、β-1,3-葡聚糖酶基因及卡那霉素抗性基因)为研究对象, 运用碱裂解法和 Mini 质粒提取的优点,通过提高提取试剂的纯度、增加菌液收集量,把简化操作流程与严
[2]格限制反应的环境条件相结合,使农杆菌质粒 DNA 的提取量大幅增加,但该方法在提取的过程中复性和 离心纯化等步骤用时过长。在这些研究成果的基础上,笔者根据质粒 DNA 的提取原理,给出了一种从农
杆菌中快速、有效地提取质粒 DNA 的方法,以便为目的物 DNA 检测提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
农杆菌菌种和 质粒1.1.1 Ti
1)EHA105 菌株,含口 蹄疫致病基 因的重组农 杆菌 ( 在, 70 ?、 15% 甘油冷冻条 件下保存 ) 。2)Pcambia1301 质粒,含抗 KANA(卡那)基因。3)Pbecks400 质粒,含抗壮观霉素基因,质粒用于 PCR 检测。
引物及循环条件1.1.2 PCR
1)引物 1 为 CaMV35S,5’-ATGACGCACAATCCCACTATCCTT-3’,引物 2 为 NOS,5’-CATCGCAAGACC GGCAACAGGATTC-3’。2)循环条件。取 2 L 所提质粒 DNA 进行 PCR 扩增,94 ?预变性 3 min,μ
94 ?
变性 1 min,65 ?退火 1 min,72 ?延伸 2 min,循环 39 次。最后,72 ?再延伸 6 min。取 3 μL 反应
物
做 PCR 检测,1.5%凝胶,150 V 电压电泳 15 min。1)Solution?。50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L TrisCl(pH=8.0),10 mmol/L EDTA(pH=8.0),高压灭菌, ?
试剂1.1.3 4 ?贮存备用。2)Solution?。0.2 mol/L NaOH,1%SDS,使用前现配现用,等体积加入。3)Solution?。每 100 mL 溶液中含有 5 mol/L KAc 60 mL、冰乙酸 11.5 mL、蒸馏水 28.5 mL。4)平衡酚。2 倍体积溶液?平 衡时的酚,4 ?贮存备用。5)3 mol/L 乙酸钠(pH=4.8),用冰乙酸调 pH。6)0.3 mol/L 乙酸钠(pH=7.0)。7)STE 溶液。0.1 mol/L NaCl,10 mmol/L TrisCl(pH=8.0),l mmol/L EDTA。8)95%的乙醇。9)TE 溶液。10 mmol/L TrisCl(pH=8.0),l mmol/L EDTA。10)PCI 抽提液。V(酚):V(氯仿):V 异戊醇)=25:24:1,LB 培养基,蛋白胨
10 g/L,酵母浸膏 5 g/L,NaCl10 g/L,pH=7.2,抗生素,硫酸卡那霉素,壮观霉素。
仪器 1.1.4
721 可见光分光光度计,水平电泳仪,WD-9403F 型多用途紫外仪,低温高速离心机,PCR 扩增仪,
Heλiosυ型紫外分光光度计。
1.2 方法
常规裂解法 1.2.1
1) 选取单菌落接种在 20 mL YEB(发根农杆菌)液体培养基中,在恒温摇床上 26 ?、160 r/min 条件下
培养。2)取 4 mL 菌液置于 5 mL 离心管中,4 000 r/min 离心 l0 min,收集菌体。3)用 STE 溶液洗涤菌体 2次。4)加入 0.4 mL 溶液?,漩涡悬浮细菌,室温下放置 10 min。5)加入 0.8 mL 新配制的溶液?,颠倒离心 管 10 次,室温下放置 l0 min。6)加入 0.4 mL 溶液?,轻柔颠倒离心管数次,使其混合均匀。7)加入 0.2 mL 3 mol/L 乙酸钠,轻柔颠倒离心管数次,冰浴中放置 5 min。8)10 000 r/min 离心 5 min,将上清液转入一支 新离心管中,加入 2 倍体积冰冷的 95,乙醇,,20 ?放置 1 h。9)10 000 r/min 离心 l0 min,弃上清液。10)
在沉淀物中加入 0.5 mL 0.3 mol/L 乙酸钠溶解沉淀,加入 l.0 mL 无水乙醇,颠倒离心管数次,,20 ?放置
1 h。11)1 000 r/min 离心 5 min,轻轻倒出上清液,离心管口向下,用无菌滤纸吸去管壁液滴。12)加入 l mL70,乙醇漂洗沉淀,快速吹干,得粗制备物。13)用 20 μL TE 溶液或无菌二次蒸馏水溶解沉淀物,加入 2 μL
[3]RNase 酶,过夜,用 PCI 或氯化铯/溴化乙锭平衡离心法纯化,所得样品在,20 ?下保存。
改进方法1.2.2
1)选单菌落液体活化后在 20 mL 含相应抗生素(抗生素使用量为 50 mg/L)的 LB 液体培养基中接种,在 恒温摇床上以 28 ?、160 r/min 条件过夜培养。2)取对数生长后期的菌液 2 mL 置于 2 mL 离心管中,12 000 r/min 下离心 1 min,结束后,倒去培养液(尽可能吸尽)。如此反复收集 5 mL 菌液的菌体。3)将菌体沉淀重 悬于 450 μL、4 ?预冷溶液?中,用移液枪混匀,并置于涡旋振荡仪上充分悬浮 30 s。4)向充分悬浮的菌
悬液中加入 500 μL 新配溶液?,快速颠倒 5 次,置于冰上 5 min 后,颠倒离心管,可见裂解液较刚加入溶
液?时稠。5)加入 500 μL、4 ?预冷溶液?,反复温和颠倒 5 次,可见白色絮状沉淀物产生,置于冰上 5 min。
6)13 000 r/min 下离心 5 min,取上清液置于新管中。7)分别加酚、PCI、异丙醇、无水乙醇抽提。8)吹干所
得沉淀物,加 TE 或无菌二次蒸馏水溶解,,20 ?下保存。(注,7)中加酚和 PCI 抽提后,需要再取上清液
于新管中,并用同体积 95%乙醇冲洗并沉淀质粒 DNA,后同上。)
农杆菌的生长曲线1.2.3 EHA105
表 1 OD 值与培养时间的关系保藏菌种 Tab. 1 Relationship between OD value and culture time 经活化后 , 划 培养时间/h 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 线 培 养 单 菌
OD0.076 0.104 0.185 0.257 0.395 0.498 0.634 0.684 0.714 0.735 600 落,然后 , 选
取单菌落液体活化后再扩大振荡培养。在 600 nm 波长下分别测取
不同培养时间农杆菌液的吸光度值 OD,结果见表 1。
[4]依据表 1 数据绘制农杆菌生长曲线图,见图 1。由图 1 可见, 在本实验的条件下,当农杆菌生长到 15,16 h 时,即 OD=0.634 600
,0.714 时,细菌处于对数生长后期,此时所得菌液适用于后续步骤。因 OD=cL,其中ε为吸光系数,c 是溶液浓度,L 为比ε
色皿 的厚度,故 OD 与溶液浓度成正比。溶液浓度反映了培养液中的 菌体数。
琼脂糖凝胶电泳以及 PCR 检测参照文献[5]。
2 结果与讨论
2.1 琼脂糖凝胶电泳结果
图 2 为用 4 种方法提取 5 mL 菌液所得产物的琼脂糖凝胶电泳图。泳道 1 为常规方法提取产物的电泳结果,泳道 2 为改进 方法提取产物的电泳结果,纯化所用试剂为 PCI,泳道 3 为改
进方法提取产物的电泳结果,纯化所用试剂为异丙醇,泳道 4为改进方法提取产物的电泳结果,纯化所用试剂为无水乙醇。
由图 2 知,4 种方法所得质粒 DNA 条带都较清晰,方法 1 的缺点是过程太烦琐,耗时长,纯化使用了对人体有害的酚, 酚的价格较贵,从经济角度看,纯化试剂宜采用异丙醇。方法
2 的缺点是使用了酚和氯仿等有毒试剂,用量也较大,但泳带 1 2 3 4 前端没有明显的拖尾。方法 3 和方法 4 的泳带前端较亮,为 RNA图 2 质粒 DNA 的琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 2 Agarose gel electrophoresiof splasmi dDNA 存在所致,可在电泳前加适量 RNase 降解。 2.2 不同体积菌液分别用改进方法提取效果比较
分别取菌液 1.5、3、5 和 10 mL,标号为 1、2、3 和 4,按 1.2.2
的方法实验(所用试剂量按比例增减),结果见图 3。由图 3 可知,3 号菌液量提取物的电泳条带最为清晰,4 号和 2 号次之,1 号最 差。此结果进一步证明了该质粒是低拷贝数的,可以通过增加细 菌量增加质粒的产量。此处电泳条带 4 不如 3 清晰,可能是试剂
用量以及裂解、复性时间的影响。总体而言,以 3 号菌液量为标
准在本实验室的实际条件下是比较可行的。
2.3 PCR 扩增后凝胶电泳结果比较 用 4 种方法提取 5 mL 菌液所得产物经 PCR 扩增后凝胶电泳 1 2 3 4 结果见图 4,其中 1 为异丙醇提取所得质粒 DNA 携带基因扩增后 图 3琼脂糖凝胶电泳分析
Fig. 3 Agarose gel electrophoresis analysis 的电泳泳道,2 为乙醇提取、3 为酚提取、4 为 PCI 提取产物扩增
后的电泳泳道,marker 泳带由上至下的片段大小为 2 000 b、1 000 b、750 b、500 b、250 b。由图 4 可见, 从农杆菌中提取的质粒 DNA 经 PCR 扩增后,
有明显的条带,大小约为 1 kb,与原初基因片
段大小相等,由此可证明该重组农杆菌所携目 的基因片段完好,在其体内可以稳定遗传,同
时用上述几种方法提取的农杆菌质粒 DNA 完
全满足本实验组的需要。
2.4 DNA 质粒 的定量检测结果分析
5 mL 菌液经不同方法抽提所得产物稀释 1 2 M 3 4
图 4 PCR 扩增后琼脂糖凝胶电泳分析 100 倍后,每次取样 20 L,测其 OD 值,μFig. 4 Agarose gel electrophoresis analysis after PCR amplification 结 果见表 2。由表 2 可知,各种方法所得
表 2 不同方法所提质粒 DNA 的 OD 值 ODOD/均 大于 2.0(说明有 RNA 存在),这与 260280 Ta b. 2 OD value of plasmid DNA Extracted in different methods 凝胶电泳图 3 显示的结果也是一致的,因为
ODODODOD/ODOD/OD 260230280260280260230没有加 RNase 降解,OD/OD不小于 1.8, 260280 异丙醇抽提 0.802 0.364 0.374 2.144 2.203 说明没有酚或蛋白质污染,实验结果符合纯 乙醇抽提 0.726 0.293 0.333 2.478 2.180 度要求。 酚抽提 0.542 0.200 0.244 2.712 2.221 3 结论 PCI 抽提 0.703 0.297 0.314 2.367 2.239 笔者分别用 常规的细菌 质粒提取法 和
改进的方法提取了质粒 DNA,通过分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法、PCR 合成和检测法、紫外分光光度法
对结果 做了 定性和 定量 分析。 选 择 LB+KANA 型培 养基 、抗生 素质 量浓度 50 mg/L , 细菌培 养至 OD=0.634,0.714 时,以 5 mL/次用量取菌液裂解,采用改进方法提取试剂,产物满足 PCR 检测条件, 600
既省时,又经济、方便,为一般实验的广泛应用奠定了基础。
参考文献:
[1] 王友如,崔洪志,郭三堆.农杆菌质粒 DNA 提取方法的优化[J].生物技术,2005,15(4),41-43.[2] 单世华,李春娟,张君诚,等.农杆菌质粒 DNA 提取方法的改良与鉴定[J].生物技术,2003,13(2),19-20. [3] (美)奥斯伯(Ausubel F M).精编分子生物学实验指南[M].4 版.马学军,译.北京,科学出版社,2005,54-55.
[4] (美)米克勒斯(Micklos D A). DNA 科学导论[M].陈永青,译.北京,科学出版社,2005,16-27.
[5] 张维铭.现代分子生物学实验手册[K].北京,科学出版社,2003,91-98.
【责任编辑 黄艳芹】
范文五:关于电激法做农杆菌的转化的问题(农杆菌,电激法,质粒)
农杆菌感受态细胞制备方法
1.农杆菌稀释 100倍过夜培养;
3. 5000rpm 离心 5min ,弃去上清液;
4.沉淀用 1.5 ml 25mM CaCl2悬浮 , 冰浴 20min ;
5. 5000rpm 离心 5min ,弃去上清液;
6.每管用 50μl CaCl2悬浮, 20 min 后用于转化;
7.加入质粒 DNA 0.1~1μg,之后冰浴 30 min;
8.放入液 N2中 5min ,然后立即放入 37℃水浴锅中水浴 5min ;
10.取出 10~50μl菌液涂板,在培养箱中 28℃条件下倒置培养。
转化时一般 200μl感受态细胞悬液(OD600为 0.5-0.6)中加入的质粒含量不超过 50ng, 体积不超过 10μl 。
电转化步骤如下:
1. 从 -80℃冰箱中取出感受态细胞,置于冰上解冻;
2. 取 1 μl 纯化后的质粒于一 1.5ml 的 离心管 中,将其和 0.1CM 的电极杯一起置于冰上预冷。
3. 将 40~100ul 解冻的感受态细胞转移至此 1.5ml 的 离心管 中,小心混匀,冰上放置 10min 。
4. 打开电转仪,调至 Manual ,调节电压为 2.1KV 。
5. 将此混合物转移至已预冷的电极杯中,轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部;
6. 将电极杯推入电转化仪,按一下 pulse 键,听到蜂鸣声后,向电击杯中迅速加入 1000μl的 SOC 液体培养基,重悬细胞后,转移到 1.5ml 的离心 管中。
7. 37℃, 220-250rpm 复苏 1小时。
8. 取 20ul 转化产物加 160ulSOC 涂板,放于 37℃温室,过夜培养,次日查看转化结果。其余菌液加 1:1的 30%的甘油后混匀-80℃保存。 注:每块加有 Amp 的平板上均匀涂有 X-Gal 80μl , SOC 80μl, IPTG 20 μl。
电击杯清洗流程
1. 用清水将电击杯稍冲一下。
2. 向电击杯中加入的 75%酒精浸泡 2hr 。
3. 弃去酒精,再用 蒸馏 水冲洗 2~3遍,然后用 1ml 的枪吸取超纯水反复吹打 电击杯 10遍以上。
4. 加入无水乙醇 2ml 于 电击杯 中,浸泡 30分钟。
5. 弃去无水乙醇,于通风厨内挥干乙醇。
6. 将清洗好的电击杯放入 -20 ℃冰箱内待用。
注:1.不同样品使用的电机杯应分开;
2.每周用 1%酒精浸泡 30分钟。