范文一:基因治疗的策略不包括 新基因功能研究的整体策略_张岚
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中国畜牧兽医 2011年第38卷第5期生物技术?109?
新基因功能研究的整体策略
张岚,李庆章
(东北农业大学,乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)
摘要:随着生命科学的发展及研究领域的不断开拓,越来越多的未知新基因和基因的新功能被发现,这些基因功能的研究成为了后基因组时代的首要任务。作者对新基因的研究策略作了一个较为系统全面的综述。
关键词:新基因功能研究;功能预测;基因转导;蛋白质相互作用
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中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2011)05-0109-05
随着人类基因组计划(HGP)和其它模式生物
基因组计划的相继完成,生命科学已经进入了后基因组学时代(postgenomics)。在对基因组结构进一步了解的同时,功能基因组学逐渐成为核心内容(徐子勤,2007)。基因组序列测定的完成仅仅是基因组计划的第一步,更大的挑战在于如何确定基因的功能和阐述其调控的机制与表达规律。因而,基因功能研究已成为生命科学领域中的重大课题,它将是21世纪生命科学研究的重要领域(李新枝等,2007)。那么,对于一个未知的新基因,如何对它制定基因功能的研究方案从而进行全面、系统的研究是每个基因功能研究者面临的首要问题。目前基因功能的基本策略包括:通过生物信息学的方法对新基因进行结构和功能的预测;通过试验方法进行基因功能的验证,包括功能获得策略和功能失活策略;基因编码产物相互作用蛋白的研究。作者结合国内外基因功能研究方法的新进展,对基因功能研究的策略进行了一个系统的综述。1 新基因全长cDNA的克隆策略
在研究新基因的功能之前,首先要通过基因克隆试验得到新基因全长cDNA序列。所有的基因克隆都包括4个步骤,依次为产生DNA片段、连接至载体、转化到受体细胞中扩增和目的序列的筛选鉴别。如果一个基因的完整序列已经
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被报道,可以
收稿日期:2010-10-18
作者简介:张岚(1980-),女,黑龙江人,硕士,研究方向:乳腺发
育功能基因功能。
通信作者:李庆章(1953-),男,河北人,教授,博士生导师,研究
方向:泌乳生物学与乳腺功能调控。
E-mail:qing-zhangLi@hotmail.com;Tel:0451-55190999
基金项目:国家重点基础研究发展(973)计划(2011CB100800);
东北农业大学创新团队项目(CXT005-1-1/CXT005--根据已知序列设计特异引物,通过PCR技术获得目
标DNA片段。如果一个或多个物种的某种基因已经被分离,可以根据同源性比对找到的保守性序列合成探针或简并引物,通过文库筛选或PCR反应从另一个新物种中分离功能相似的基因。如果只知道某个基因的一段碱基序列,可以采用RACE(cDNA末端快速扩增)或反向PCR和锚定PCR方法克隆该基因的cDNA全长序列;也可以将已知序列制备成探针对cDNA文库进行筛选,获得cDNA克隆后利用载体上的引物进行序列分析。此外,转座子示踪技术可用于酵母和植物的克隆;基于图谱的基因克隆方法(map-basedcloning)依赖于遗传图谱和物理图谱,可用来分离与已知分子标记紧密连锁的基因,包括染色体跳查和染色体歩查;硅片克隆
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(silicocloning),即不经过实验室工作,将网络中的数据资料进行整理分析和拼接,得到新基因的全长序列(樊红等,2002)。基因的克隆有多种不同策略,研究者应根据自己的实际情况,采取适合的方法。2 通过生物信息学预测新基因的功能
目前,生物信息学分析已成为新基因功能研究的首选和必用方法,具有方便、快捷、经济等优点。研究者往往可以从中得到与新基因功能有关的重要信息,初步推测基因的可能功能,进而制定出进一步的实验室研究方案
(Kim,2004;Mount,2004)。2.1 编码产物预测分析 研究者往往最开始得到有价值的EST序列,进而通过电子延伸或和相关试验方法获取其全长cDNA。在这种情况下,首先要进行全长cDNA序列的开放阅读框查找,推导其编码蛋白质的氨基酸序列。然后,进行信号肽序列预测分析(http://genome.cbs.dtu.dk/services/SingnalP/),初步判定其亚细胞定位(Bendtsen等,2004)。再进行蛋白质的基本理化性质分析,包括氨、、亲,
?110?生物技术中国畜牧兽医 2011年第38卷第5期
以已知的氨基酸序列基础,分析预测其高级结构(http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictProtei
n.html)(Hamno等,2004)。2.2 序列同源性分析 序列同源性分析包括核苷酸序列同源性分析和氨基酸序列同源性分析,这也是目前生物信息学技术中应用最为广泛的基本技术
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之一。序列同源性分析主要采用BLAST和FLAS-RT程序进行,即从已知的各种核酸和蛋白质序列数据库搜索与新基因对应的功能已知的高度同源基因和蛋白质,从这些已知基因和蛋白质的功能信息中来初步推测和判断新基因的功能。同时,因为人类全基因组测序已经完成,所以以新基因cDNA的序列来对基因组数据库进行同源性比对,则可很方便地获得与其完全同源的基因组DNA序列及其染色体定位信息,而无需进行荧光原位杂交等基因染色体定位技术,进而还可通过分析其内含子、外显子序列及其调节位点,推测其可能的基因表达调控方式。如Hamano等(2004)即通过此法确定了富含亮氨酸重复序列蛋白新基因的基因组DNA序列及其染色体定位。此外,如果从同源性分析中可以初步确定新基因属于某一基因家族或超家族的一个新成员,则可进一步分别运用ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html)和Tree-View(http://taxonomy.zoolozy.gla.ac.uk/rod/treeview.ht
ml)软件来进行多重序列比对和分子进化分析,以获取更多提示信息(Mount,2004)。2.3 蛋白质功能域分析 蛋白质的功能域分析,主要是通过联网到
SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)或PROSITE(http://www.ex-pasy.org/prosite)数据库来进行。蛋白质是基因功能的体现者和施行者,而蛋白质的结构则是蛋白质执行生物学功能的基础,因此对新基因所编码蛋白质的
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功能域分析将对推测新基因功能提供极其有价值的信息。目前,已经有大量被发现的蕴藏于蛋白质结构中的与特定生物学活性相关的所谓保守模体(consensusmotif)(Mount,2004)。3 新基因的表达谱分析 基因的表达在个体发育的不同阶段及在个体的不同组织和细胞类型中均不相同,即基因表达的时空性。因此,在研究一个基因的功能时,首先要对基因的时空表达谱进行分析,包括mRNA和蛋白质两个水平上的基因表达谱分析。3.1 mRNA水平的表达谱分析 研究mRNA水平的基因表达谱分析常用的方法有Northernblot-
对基因进行特异性和定量检测,但测定效率不高,灵
敏度也低,不能检出微小的基因表达量,同时试验中使用的放射性物质对人和环境也有危害。作为一种经典的基因表达量分析方法,Northernblotting依然被广泛地应用。原位杂交技术由美国耶鲁大学Gall和Pardue于1969年首先创立,广泛用于检测一个特异的mRNA在某一种生物体或组织、细胞里的具体表达位置,对待测核酸分子进行定性、定量及定位分析。RT-PCR主要有半定量RT-PCR、实时定量RT-PCR及竞争性定量RT-PCR:半定量RT-PCR操作简便、快捷,但精确度不高,多用于快速初步分析;实时定量RT-PCR是近年来新发展起来的,特异性强、自动化程度高;竞争性RT-PCR则是将特异性目的序列同已知浓度的内标RNA一起扩增,通过比较由内标获得的信号和目的模板所获得的信号,确定目
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的模板的相对含量。 近年来,发展了一些新方法,如表达序列标签串联排列连接
(tandemarrayedligationofexpressedsequeneetags,TALEST)
和GeneCalling。TALEST是应用含有HS型限制酶位点的寡核苷酸引物,产生在mRNA上固定的短(16bp)ESTs。这些ESTs与热变性有关的GC-锁状标点序列相邻,因此可串联成长阵列,然后通过高通量DNA测序识别、分析(Spinella等,1999)。Genecalling法研究的对象是用两种不同限制酶消化的cDNA样品。用荧光标记的引物扩增、毛细管电泳分离这些标记的片段,然后同时测定每个片段的精确长度。通过电泳比较两个样品中每个点的强度,自动识别不同表达基因的cDNA片段。用大小精确的片段和片段旁侧序列查询特定物种的数据库,得出片段信息,而旁侧序列由限制酶消化而来。查询数据库包括转录子的“insilico”消化片段及所有预测的基因片段。这种预测称为“GeneCalling”,可瞬时显示基因表达差异的临时列表(Shimkets等,1999)。3.2 蛋白质水平的表达谱分析 确定新基因在哪些组织细胞被转录后,进一步的工作则是制备相应的抗体来检测其蛋白质终产物的表达情况,如该蛋白质表达的亚细胞定位、分子质量大小、聚体形式等。这种在蛋白质水平上的表达分析涉及到的常用技术主要是Westernblotting、免疫组化等。其中,Westernblotting与Northernblotting类似,不仅可以进行定量分析,且还能够检
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测蛋白质的分子质量大小及其聚体形式。而免疫组化技术的优势则在于其能够确定蛋白质是在特定组织中的哪些细胞及在特定细胞的哪个部位中表达(Sambrook等,,
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范文二:用于基因治疗的基因包括三大类
用于基因治疗的基因包括三大类
。第一类是正常基因,它是从健康人体内分离得到的,它可通过同源重组方式置换病变基因或依靠其表达产物弥补病变基因的生理功能,这些基因常用于治疗各种基因缺陷型遗传疾病如血友病、地中海贫血病等。第二类是反义基因,它主要用于治疗获得性分子疾病,通过反义基因体内表达产物(RNA)或与病毒激活因子编码基因互补,或与肿瘤基因mRNA互补,从而阻断其表达。第三类是自杀基因,这是一类编码能杀伤癌变细胞的酶蛋白基因,它们存在于病毒、细菌和真菌中,能将无毒的细胞代谢产物转变为有毒的化学物。表达载体的构建是基因治疗成功与否的关键,理想的载体应该是滴度高、能感染大量的细胞、制备方便且重复性好、能定向进入目的细胞并整合到宿主染色体特异位点、能以附加体的形式稳定存在、转录单元有可调控的操纵元件、不含有能激发免疫反应的组分。目前在基因治疗中使用的载体包括病毒型载体和非病毒型载体两类,病毒型载体包括腺病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体和反转录病毒载体等,它是基因治疗中使用的主要载体;非病毒型载体包括脂质体载体和多聚阳离子载体等。目前已建立多种适合基因治疗的基因转移方法。常见的体内疗法中包括病毒颗粒直接注射法、重组DNA分子直接注射法、呼吸道吸入法、基因枪转移法和电穿孔法等。体外疗法一般采用病毒转染法。 (1)肿瘤的基因治疗。
肿瘤的发生与细胞中染色体DNA结构的变化密切相关。随着经济和环境等各种因素的影响,恶性肿瘤的发生率不断升高,而传统治疗方法的治愈率低、复发率和死亡率高。随着对肿瘤发病机制的研究,越来越多的肿瘤相关基因被克隆。因此,利用基因治疗的方法对肿瘤进行治疗已成为一种重要的选择。目前对肿瘤的基因治疗主要采取以下策略,即抑癌基因治疗法、基因修饰瘤苗法、免疫基因治疗法和自杀基因治疗法。
反义癌基因治疗是通过封闭癌基因、抑制癌基因的过度表达而实现的。利用反义癌基因与肿瘤细胞内癌基因mRNA等结合,减少癌基因的表达或调整癌基因表达的比例。过度表达BCL-2会导致细胞程序性死亡耐受和促进肿瘤生长,Webb等(1997)临床试验观察9例BCL-2高表达的非何杰金淋巴瘤病人接受反义BCL-2寡核苷酸治疗情况,发现有两例患者血液中淋巴瘤细胞减少,流式检测5例中有两例的BCL-2蛋白水平降低。MYC基因在细胞增殖与分化过程起着十分重要的调控作用,MYC过量表达与肿瘤发生密切相关,是肿瘤形成的重要原因之一。目前已发现MYC在多种恶性肿瘤细胞中扩增和高表达的例子。MYC基因由3个外显子和两个内含子组成,编码区位于外显子2和3处。叶昕等(1992)构建了MYC基因外显子3及其3`旁侧序列(1.4kb)的重组反转录病毒,证明它具有明显抑制食管癌
细胞系EC8712细胞生长的作用。隗钥等(1999)用1.53 kb的反义MYC片段构建了重组腺病毒载体Ad-AS-MYC,研究表明该重组载体能高效转染体外培养细胞,显著抑制人肺癌GLC-82和SPC-A-1细胞生长和形成克隆的能力,并诱导其细胞的凋亡。其他的一些研究也表明,反义MYC反转录病毒的导入能抑制MYC mRNA和蛋白质的表达,并降低BCL-2的表达。因此,利用反义癌基因治疗癌症具有广阔的前景。
肿瘤的免疫基因治疗:肿瘤的免疫基因治疗是指利用免疫基因对肿瘤进行治疗的方法。目前免疫基因治疗肿瘤的研究主要包括肿瘤的细胞因子基因治疗、肿瘤的MHC基因治疗、肿瘤抗原靶向的基因治疗、肿瘤的共刺激分子基因治疗、抗体介导的肿瘤免疫基因治疗和综合性肿瘤免疫基因治疗等。
肿瘤抗原靶向的基因治疗。利用一定的方法将特异性强的TSA或TAA基因转入体内,并通过其表达打破机体对肿瘤抗原的免疫耐受性,刺激机体产生抗肿瘤免疫功能。目前比较成功地用于体内表达肿瘤抗原的途径有通过重组病毒载体介导、利用成纤维细胞介导、直接注射DNA或RNA基因免疫等方法。
肿瘤的共刺激分子基因治疗。激活T细胞是肿瘤免疫基因治疗的关键步骤,而T细胞的激活至少需要两种信号分子,第一种信号介导T细胞表面特异性抗原识别受体与抗原提呈细胞上MHC复合物结合的抗原多肽的相互作用,第二种信号介导抗原提呈细胞上的共刺激分子与T细胞上相应的共刺激分子的受体的结合作用。缺乏共刺激信号则体内的T细胞不会对肿瘤抗原产生有效的反应而出现免疫耐受,机体也就易于形成肿瘤,介导这一共刺激作用过程的是共刺激分子及其配体。将共刺激信号基因导入肿瘤细胞 并使之有效表达,诱导T细胞产生强抗肿瘤免疫反应。目前已发现多种共刺激分子,如B7-1(CD80》、B7-2(CD86)、ICAM-1(CD54)等。Gilligan等(1998)通过腺病毒的介入,将人B7-1基因转染至人卵巢癌及宫颈腺癌细胞后,该基因能有效表达,转染细胞的免疫原性明显增强。 (2)艾滋病的基因治疗。
艾滋病又称获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS),它是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染而引起的。迄今已造成1600多万人死亡,病毒感染者超过4000万。HIV是反转录病毒中慢性病毒属的成员,病毒颗粒呈球形,外壳由嵌有膜蛋白的脂质双层膜构成,其内层为蛋白质,内核也由结构蛋白组成,其中含有病毒基因组RNA和反转录酶。根据病毒在基因组结构和抗原性方面的差异,可将HIV分为HIV-1和HIV-2两种类型,这两型病毒都能引起相同的临床症状,但HIV-2的致病率较低。
HIV-1的基因组由双拷贝的单链RNA组成,每条RNA长9.2—9.7kb,两端为长末端重复序列(LTR),在LTR序列中含有多腺苷酸poly(A)信号序列、TATA盒启动子序列以及调节病毒基因组转录的顺式激活调节序列。HIV-1基因组含有三个结构蛋白基因:编码核心蛋白的gag基因,编码外壳糖蛋白的env基因和编码病毒复制所需逆转录酶、整合酶和蛋白酶的poi基因。gag基因编码一种分子质量为55 kDa的蛋白质分子,它可被pol基因编码的病毒蛋白酶降解为p24、p17和p15等多肽链,这些多肽链是病毒颗粒组装所必需的。env基因编码的产物是一分子质量为160kDa的糖蛋白,在宿主细胞的内质网中被降解为病毒外膜表面蛋白gpl20和跨膜糖蛋白gp41,这两种蛋臼对病毒的感染非常重要。poi基因编码的前体蛋白能被依次切割形成逆转录酶、蛋白酶和整合酶,这些转录酶和整合酶对产生HIV的前病毒形式很重要。HIV-1中的6个调节基因对病毒复制起关键作用。其中tat基因编码一种分子质量14 kDa的蛋白(Tat),它是典型的转录激活蛋白,通过与CycT和Cdk9结合形成复合物,再结合到病毒mRNA的5'端,使临近RNA聚合酶II的羧基端结构域磷酸化,促进新生mRNA链的合成和延伸。rev基因编码一种分子质量18 kDa的蛋白质(Rev),其主要功能是从细胞核中将转录的病毒RNA输送出来、增强病毒的复制。vpu和nef基因产物的主要功能是下调宿主细胞表面CD4分子的表达,增强病毒的感染能力。vpr基因编码一种分子量为14kDa的蛋白(Vpr),其主要功能是使病毒DNA进入细胞核,增强病毒的复制。vif基因的产物是分子质量23kDa的Vif蛋白,它能调整病毒颗粒的装配,增强病毒的感染能力。
HIV的基因治疗是利用物理或化学的方法,将目的基因导入机体适当的靶细胞内,间接或直接抑制病毒的复制,或提高机体对艾滋病病毒的免疫能力。基因治疗的靶细胞二般
+是HIV敏感细胞,如人的T淋巴细胞或其他CD4的细胞。目的基因一般是通过病毒导入靶细胞内,多数研究中使用了一种重组的Moloney小鼠白血病病毒(MoMLV),这是一种应用广泛的反 转录病毒,通过改造包装细胞,使病毒包装时掺入HIV的被膜糖蛋白,形成假
+型病毒,使之能特异性地感染CD4的细胞。也可用重组的HIV病毒将目的基因导入靶细胞。HIV感染的基因治疗有多种途径:
?利用反义核酸来互补病毒RNA或DNA,达到抑制相应基因表达的目的。Veres等(1998)利用pol、vif、env及3' 端LTR的反义RNA,对HIV的复制进行抑制,结果表明它们都能起到抑制作用,其中以env反义RNA的抑制效率最高。核酶是具有切割活性的反义RNA,利用核酶(ribozyme)切割病毒RNA可达到更好的效果。目前应用于HIV基因治疗中
的核酶包括锤头状核酶和发夹式核酶两种类型,核酶选择的靶序列包括nef、env、RRE和5'端引导序列等。已有多项ribozyme技术应用于HIV基因治疗的临床试验。
?利用RRE和TAR的类似物竞争性地结合病毒调节蛋白Tat和Rev,阻止调节蛋白与病毒mRNA上相应的序列结合,抑制HIVmRNA的合成和运输。
(1993)将HIV被膜糖gpl20?利用细胞内抗体(intrabody)清除HIV外壳蛋白。Marasco等
蛋白的单链抗体基因导入HIV感染细胞,表达的单链抗体滞留于内质网,可将与此单链抗体结合的被膜蛋白扣留在内质网上,减少其表达。
?将突变的病毒基因导入HIV感染细胞,表达出相应的突变蛋白,抑制HIV的复制。Malim等(1989)通过定点突变将调节区的第78位亮氨酸置换为天冬氨酸,将79位的谷氨酸置换为亮氨酸,使Rev蛋白丧失运输功能,但仍保留与RRE结合的功能,在细胞内突变的Rev可与野生型Rev结合形成多聚体,使野生型Rev功能丧失,从而表现对HIV感染的抵抗能力。
?利用细胞内趋化因子,针对HIV-1的辅受体,关闭病毒进入细胞的通道,使病毒无法进行复制和繁殖。Yang等(1997)把趋化因子RANTES和SDF-1的基因加上内质网滞留信号序列导入T淋巴细胞,使其在细胞内表达后滞留在细胞的内质网中,并在此结合趋化因子相应的新合成的受体,使受体不能呈现在细胞表面而在细胞内降解,细胞表面失去HIV的辅受体,从而抵抗HIV-1的感染。到目前为止,HIV感染的基因治疗方案大多数处于基础研究阶段,少数进入临床I期试验。
范文三:中枢神经系统疾病的基因治疗
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200222(3)
文章编号:100126325(2002)0320206207
中枢神经系统疾病的基因治疗
张旺明
1,2
,牛东滨,徐如祥,王晓民
1213
(11北京大学神经科学研究所,北京100083;21第一军医大学珠江医院神经外科,广州510282)
摘要:基因治疗正在成为常规方法难以治愈的中枢神经系统疾病的新的治疗手段。本文概要介绍了中枢神经系
统疾病基因治疗的方法和途径;的状况。
关键词:基因治疗;中枢神经系统;病毒载体
中图分类号:R741105 文献标识码:A
基因治疗(因,使其表达而达到治疗疾病的方法。中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)作为一个高度独立化器官,因其独特的生理特征及细胞之间相互作用的复杂性,不易进行基因操作。近年来,由于神经遗传学研究的进展、CNS疾病发病机制的进一步阐明、导入外源性基因载体的改进及其基因转移技术的进步,使基因介导CNS疾病的治疗越来越趋近现实,CNS作为基因治疗的靶器官正逐步实现
[1]
要易于获得、容易转染及稳定表达,又要避免发生免疫反应。应遵循以下原则:①基因转导的细胞必须能长期在宿主脑内存活,且无侵袭性;②修饰后的靶细胞应具有稳定表达治疗性产物的能力;③可体外控制治疗性产物有效、适量的表达;④能预设某一安全机制,
在必要时可激活以阻止修饰细胞在体内有害的生长和Π或有害功能的发挥,以避免肿瘤发生。目前,应用于C
NS基因治疗研究的靶细胞主要有成纤维细胞、原代骨骼肌细胞、胶质细胞、胚胎中脑细胞、条件永生性神经细胞(conditionallyimmortal2izedneuralcell)及神经干细胞。112 invivo途径
invivo途径即体内直接转染法,是体内基因治疗的直接途径。包括:①非病毒介导途径即通过物理法、化学法或融合法直接将目的基因导入体内。具有安全、操作简单、插入容量不受限制及可通过物理方法实现靶向性转移(如基因枪)等优点。但是直接导入的DNA通常难以整合入基因组,基因表达存在不稳定性,且在非分裂细胞中基因的转染效率不高,使其应用受到限制。②病毒载体介导途径即通过构建复制缺陷的重组病毒将靶基因引入体内。迄今为止,病毒载体用于CNS细胞基因传递取得了许多进展,尽管其安全性及效率仍有
。
1 CNS疾病基因治疗的方法和途径
111 exvivo途径
exvivo途径即体外细胞介导法,通过移植携带
靶基因的工程细胞完成,是基因转移技术和脑内移植技术的结合。首先将目的基因转入体外培养的靶细胞内,进行筛选、鉴定后,行体外扩增,然后将其移植入脑内治疗靶区,使其在脑内充当分泌营养因子、神经递质和代谢酶等基因产物的生物学“微泵”(minipump),此细胞称为基因修饰细胞或工程细胞。这种方法比较经典、安全,效果较易控制,但是存在操作步骤多、技术复杂、难度大及若采用人类胚胎细胞则涉及伦理学问题,故不易推广。
exvivo途径中靶细胞的筛选是至关重要的,既
收稿日期:2002-03-06
基金项目:国家重点基础研究规划(G1999054008)
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通讯联系人
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待提高,但invivo方法已成为目前CNS基因转移
的主要研究方向,只有invivo方法取得成功,CNS基因治疗才能走向临床。
2 CNS基因治疗的病毒载体
211 RNA病毒载体
21111 逆转录病毒载体:逆转录病毒载体是目前
有重组子载体(HSV2RV)和扩增子载体两大类型。
HSV2RV含有全部病毒基因组,其中一个或多个基因已突变,以降低其毒性和提供转基因空间。最新版本HSV2RV删除了多个含转录激活因子的即刻早期基因,基本消除了病毒基因的表达。HSV扩增子载体由一个含有HSVDNA复制起点序列oris和包装信号pac的质粒组成。在HSV辅助病毒作用下被允许以串联体形式包装入HSV病毒,无HSV辅助病毒时,这些载体可以通过与一组已删除HSV基因组保留pacBAC质粒共转染。:基本上无毒性或,通常可达22kb,;对神经细胞的高,在非分裂细胞中潜伏达数月。此外,HSV载体感染神经元时,可沿着神经元突起向其胞体快速逆向运输,故可提供一种间接的靶向性基因转移途径。但HSV存在神经细胞毒性作用和免疫反应,可引起较明显的局部炎症和坏死,故HSV作为CNS转基因载体还有待于进一步研究和改进。21212 腺病毒载体:腺病毒(adenovirus,Ad)是目前被较广泛使用的一类DNA病毒载体,其基因组长约36kb,从左至右可分为4个基因功能区即E12E4区。第一代复制缺陷型Ad因存在较强的宿主免疫反应,使其应用受到限制。改进后的新型Ad载体删除了表达病毒蛋白的E2a和E4基因或E4基因上特殊的开放性阅读框,故具有长期的转
研究最成熟的一类RNA病毒载体。常用的逆转录病毒载体主要来自Moloney小鼠白血病病毒。它具有以下优点:宿主范围广,能感染包括胶质细胞、神经前体细胞在内的各种分裂细胞,感染效率高;在正常生理状态下可以单拷贝的形式整合入宿主细胞基因组,并随宿主细胞的分裂而增殖;胞结合后,受体,,色体上的随机整合可能引起插入突变;载体在辅助细胞中有可能发生同源重组,产生具有致瘤性的野生型病毒;此外逆转录病毒载体不能感染分裂后细胞,故不能直接用于神经细胞的转导。21112 慢病毒载体:慢病毒(lentivirus)属逆转录病毒亚属,是一类非鼠源性逆转录病毒,以人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)为代表。慢病毒源性载体(lentivirus2basedvector,LV)最主要的优点是它能将外源基因整合入非分裂细胞的基因组内,对有丝分裂后神经元转基因治疗提供了一个潜在的传递系统。但其严格的宿主范围、滴度低及HIV21独特的致病性,限制了它作为转基因载体的应用。为了最大限度降低其通过重组产生有复制能力野生病毒的可能性,重组病毒的产生采用三质粒包装系统,为了进一步增强这一系统的安全性,一种自我失活(self2inactivating,SIN)慢病毒载体最近已被构建成功。应用LV向脑内引入基因已取得了诱人的结果,转染细胞(主要为神经元)在所有时间点上均明显高于腺相关病毒载体和逆转录病毒载体,而且这种载体存在长期的转基因表达,无明显免疫反应。因此LV有可能成为未
[2,3]
来CNS基因治疗的最佳载体。212 DNA病毒载体
21211 单纯疱疹病毒载体:I型单纯疱疹病毒(herpessimplexvirustype1,HSV21)含有152kb双链DNA,基因组包含80个以上基因。HSV来源载体
基因表达和较低的炎症反应。最近产生了一种“无内核”(gutless)、高容量的Ad载体,删除了病毒基因组所有的结构基因,仅保留了复制和包装的必需序列。这种“无内核”Ad载体具有转基因容量大、滴度高、宿主范围广,可感染分裂和非分裂细胞、感染效率高、无野生腺病毒污染等优点,在体研究已显示其长期的转基因表达活性和较低的宿主炎症反应。
其另一个特点是具有随机整合人类或非人类染色体的能力,但整合效率较低,多数仍以附加子形式存在,而且已整合的载体序列容易发生重新组合。21213 腺相关病毒载体:腺相关病毒(adeno2asso2ciatedvirus,AAV)是一种缺陷型非病原性人类细小病毒,是目前发现的最小、结构最简单的DNA病毒,含有一条线状单链DNA,其复制依赖于辅助病毒(腺病毒或单纯疱疹病毒)。野生型AAV能
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200222(3)
选择性整合入人类19号染色体的特定部位,建立
溶源性感染。与其它基因载体系统相比较,AAV载体的主要优点有:①它是一种非病原性的人类病毒,与人类疾病无关,②AAV能感染的细胞类型范围较广,可感染分裂后细胞,转染效率极高;③载体中仅保存AAV的ITRs,而ITRs基本上又是转录中性的,不干扰外源基因的表达和调控;④rAAV缺乏病毒基因,对超感染没有免疫原性,故可以向同一细胞引入两种不同的基因,或对同一细胞反复感染;⑤转基因可获得长期稳定的表达。新的包装技术已明显提高rAAV载体滴度,而且可排
[4]
除辅助腺病毒的污染。此外,可调控基因表达载,应用前景更加广泛。213 ,无法达到稳定的CNS转基因表达,而反复向脑内注射载体会给患者带来较高的危险。为了使CNS转基因获得长期、稳定的表达,根据现有病毒载体的优点,将其不同的病毒元件组合而产生的杂交型病毒载体,目前正在研究、开发,主要包括HSVΠAAV杂交型扩增子载体、AdΠEBV和HSVΠEBVΠ逆病毒杂交型扩增子载体、AdΠAAV杂交型载体、AdΠ逆病毒杂交型载体等几种类型。
不同载体系统优缺点的客观比较少见文献报道,目前尚没有一种载体可以作为所有疾病类型转基因研究的通用工具,而且在以后的数年内也不可能出现这种万能的载体。在现阶段Ad仍可能是以短期表达为治疗目标invivo途径基因研究最合适的载体,特别是那些单次剂量就能达到临床治疗效果的方案。如能实现Ad靶向性细胞摄取及表达,降低免疫原性,无疑将扩展其用途,但不适合慢性疾病的长期治疗。在未来的几年里,AAV可能是
[5]
功能缺陷蛋白长期替代治疗最常用的载体。
类疾病相同遗传病因的转基因动物模型已成为现实。CNS疾病的基因治疗主要有三种策略:①应用反义技术或核酶降低非显性突变蛋白的活性。针对CNS疾病基因缺陷引起的非显性突变蛋白表达,需要选择性阻断其生物合成,可采取反义核苷酸技术或核酶,阻断特异性mRNA转录而达到。②应用转基因产物替代脑内缺陷的酶或功能蛋白。③应用保护性蛋白对神经元的存活提供支持,包括营养因
[6,7]
子、抗氧化酶、热休克蛋白和抗凋亡因子等。311 遗传性神经疾病
311 病(Huntington’s),主要临床特征是慢。目前研究表明HD与IT15基因的单一型突变有关,Huntington蛋白中的多聚谷氨酰胺纤维大量增加,使纹状体GABA能输出神经元细胞群对兴奋性毒性、氧化应激和线粒体功能障碍的敏感性增加。几种HD基因治疗方案已分别在DNA、RNA和蛋白水平上探索,包括移植能分泌保护或替代因子的工程细胞,例如产生神经生长因子(NGF)的成纤维细胞或神经前体细胞。
[8]
Bemelmans等将克隆脑源性神经生长因子(BD2NF)基因的Ad注射至Huntington病模型鼠的纹状体内,发现BDNF的存在能促进纹状体神经元的存活。
31112 溶酶体蓄积病:溶酶体蓄积病(lysosomalstoragedisease,LSD)是一种以溶酶体酶缺陷为特征的非显性遗传病。目前认为编码β2葡萄糖醛酸甙
β酶(2glucuronidase,GUS)基因突变是引起该病的主要原因,这种缺陷导致该酶的初级底物在溶酶体内蓄积,从而引起细胞功能障碍和死亡。治疗干预需在周围组织和脑内同时进行。将克隆GUS基因
[9]
的Ad载体直接注射至皮层或纹状体后,证实脑内GUS活性得到恢复。也有实验将体外转染GUS基因的永生性神经前体细胞移植入新生LSD小鼠的侧脑室中,免疫组化表明许多脑区存在GUS活性,
溶酶体内蓄积底物明显减少,这些细胞可整合
[10]
至脑实质中,并能分化为神经元和胶质细胞。31113 Leshch2Nyhan病:Leshch2Nyhan病(Lesch2Nyhandisease,LND)是一种以肌张力障碍、手足徐动症、高尿酸血症和伴有自残行为为特征的神经发育功能障碍疾病,为X连锁隐性遗传病,基因定
3 CNS疾病基因治疗概况
许多实验动物模型已应用于CNS疾病基因治疗研究,包括神经系统遗传病、神经退变性疾病、脑缺血、脑创伤及脑肿瘤等。这些模型均可通过药物诱导或损伤诱发,脑肿瘤模型可通过体外培养的肿瘤细胞移植动物脑内而产生。随着许多神经系统疾病致病基因的明确,应用转基因小鼠复制具有人
()209
位于Xq26227。其主要病因是次黄嘌呤2鸟嘌呤磷酸
核糖转移酶(hypoxanthine2guaninephosphoribosyl2transferase,HPRT)的缺乏。编码HPRT的基因已被克隆,是神经遗传病中最早被确认和克隆的致病基因,因而LND亦是最先被提出的CNS基因治疗侯选疾病之一。Palella等应用HSV载体介导人的HPRT基因转染体外培养的神经细胞,并将其注入小鼠脑室内,可检测到HPRT的表达。近年来,LND转基因小鼠取得成功,使LND的转基因研究更加深入。
312 神经系统退变性疾病
31211 帕金森病:帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)是中老年人常见的CNS[11]
质神经元免受62羟多巴胺的损害。31212 阿尔茨海默病:阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是一种常见的由于神经系统退行性病变而引起的老年性痴呆病。该病以广泛的认知障碍和人格改变为特征。其主要病理改变表现为大脑
β皮层神经元细胞内外β2淀粉样蛋白(2amyloidpro2
tein,β2AP)沉积,形成老年斑和神经原纤维缠结,大量神经元变性死亡,以基底前脑和海马新皮层区胆碱能神经元最为严重。AD基因治疗的早期策略NGF的自体同,AD,(cholineacetylase,ChA)是脑内,AD患者脑内存在ChA活性下降,乙酰胆碱合成减少。转导ChA基因,提高乙酰胆碱合成,可治疗AD。最近,Saille等研究发现,表达人类抗凋亡基因bcl22的转基因小鼠皮层神经元,可明显抵抗β2淀粉样蛋白的神经毒性损害,提示以抑制神经元凋亡为目的的AD神经保护基因治疗具有研究潜力。
31213 肌萎缩侧索硬化症:肌萎缩侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis,ALS)是一种发生于成
[16]
,CNS,因为它的病变部位
较明确,病变范围局限,变性细胞单一,相关基因已被克隆,并有适当的动物模型,移植方法也比较成熟。PD基因治疗主要有两条途径:通过引入多巴胺(dopamine,DA)合成酶,提高纹状体内DA含量;通过引入潜在的神经保护分子,阻止DA神经元死亡,促进受损的黑质纹状体系统重建和功能恢复,可从根本上治愈该病。
酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH)是脑内DA生物合成的限速酶,通过在纹状体内表达外源性TH,可显著提高DA含量。但TH的活性功能离不开辅助因子BH4的作用,在纹状体失神经支配时这种辅助因子的水平也下降,TH和BH4合成酶GTP2cyclohydrolase1的联合移植,对获得足够的
[13]
L2dopa产物是需要的。
通过对黑质DA能神经元的保护使黑质纹状体DA系统得以完整保存是PD治疗最佳目标。近年来细胞凋亡在PD发病机制中的作用已被认识,自由基、某些神经递质及神经营养因子缺乏等因素均可诱导DA神经元凋亡。胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)是目前发现的一种对DA神经元具有相对特异营养活性的神经营养因子,GDNF基因的有效表达,可以减缓、阻止甚至逆转DA能神经元的退行性病变过程。bcl22转基因治疗可保护DA神经元免受凋亡,从而从根本上遏制PD的病程进展。Yamada等将携带bcl22基因的HSV载体注射至大鼠脑内黑质区,证实bcl22的表达能保护黑
[14]
[12]
年人的致命性神经退变性疾病,以进行性运动神经元变性为特征。现已证实编码超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)的基因突变与家族性ALS发病有关。研究表明多种神经营养因子,如睫状神经节神经营养因子(CNTF)、GDNF、脑源性
神经营养因子(
BDNF)、胰岛素样神经营养因子(IGF21)等可不同程度保护运动神经元。Haase等
[17]
通过肌肉和静脉内注射Ad介导的CNTF到
[18]
ALS突变小鼠,可延长其生存期和降低神经元变
性,而脑脊液内给药被证实无效。Mohajeri等将逆转录病毒介导的GDNF的成肌细胞,注射至6周龄家族性ALS转基因小鼠后肢肌肉中,18周龄时检测发现接受GDNF成肌细胞的小鼠较对照组体内存在较高数目的运动神经元。最近,Azzouz等将rAAV介导的抗凋亡基因bcl22注射至SOD突变转基因小鼠脊髓内,观察到bcl22蛋白在脊髓运动神经元中表达,并能显著增加疾病晚期运动神经元的数[19]
目。
313 脑肿瘤治疗
CNS肿瘤细胞分型较复杂,主要包括星形细胞
210
200222(3)
瘤、胶质母细胞瘤、脑膜瘤和垂体瘤等,其中前两
者约占50%,是CNS最常见的恶性肿瘤。尽管依据现有诊疗水平,对CNS肿瘤不难确诊,但由于其浸润性生长特性及肿瘤细胞基因的异质性,血液中药物进入脑内困难和CNS较差的免疫监视作用,使得目前的外科治疗、药物及放射治疗均不能根治。通过基因治疗手段可弥补当前临床治疗的缺陷,增加其效力,拓宽治疗范围,包括增加治疗基因或传递途径的范围,已成为目前CNS基因治疗最主要的研究课题。CNS肿瘤的基因治疗,其主要策略包括病毒载体对肿瘤细胞的直接裂解、抗癌药
[20][21]
物的激活、抗血管生成、肿瘤细胞分裂和转移的抑制、免疫增强和诱导凋亡、,314 其他CNS31411 脑缺血:缺血性脑损害可引起兴奋性氨基
β脑脊液中注入克隆了内源性阿片肽—2内啡肽基因
的重组腺病毒,转基因脑膜细胞可直接释放β2内啡肽进入脑脊液,使得这种神经肽更容易接近阿片受
[25]
体,能明显减轻炎性过敏痛。31413 癫痫:随着癫痫发病机制中多基因因素的证实,许多探索已开始着眼于基因治疗研究。包括:应用HSV扩增子载体传递热休克蛋白(HSP72),保护海马神经元免受海藻酸的毒性损害。应用Ad介导谷氨酸脱氢酶基因转移,增加
[26]
抑制性神经递质GABA。应用脂质体介,,脑室
。:在不同的神经内分泌通路中,
Βrattleboro。
鼠缺乏血管活性加压素—一种抗利尿激素,正常合成于下丘脑并释放入垂体后叶血液循环中,缺乏后
[28]
可引起多尿和烦渴。Geddes应用Ad载体介导血管加压素基因转染Brattleboro鼠下丘脑特殊核团后,一周后可观察到其功能恢复,疗效可持续2个月。应用AAV介导神经肽Leptin基因到obΠob肥胖小鼠模型脑内,产生的长期减肥效果正在研究。
可以预见,随着人类基因组计划的完成,CNS疾病的发病机制的进一步阐明,有效的治疗靶基因的发现,导入外源性基因载体的改进及其基因转移技术的进步,靶基因表达调控的不断成熟,基因治疗必将成为治疗CNS疾病的一种新的强有力的手段。
[29]
[24]
酸释放、Ca和Na过度超载、内环境改变和自由基损害,导致迟发性神经元凋亡。在缺血发生之前或之后,通过rAAV载体介导bcl22基因转移,可保护神经元免受缺血性损害引起的迟发性死亡。Ad介导神经元凋亡抑制蛋白(neuronalapoptosisin2hibitoryprotein,NAIP)可缩小大鼠海马缺血损伤的
[23]
范围。应用HSV载体表达72KD热休克蛋白,
[24]
也可暂时提高局部缺血区神经元的存活。31412 疼痛:鞘内和脑内病毒载体介导的基因注
[22]
2++
射是一种有希望的疼痛治疗方法。在大鼠模型中,
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cells
WANGXuan,WANGKun,WANGXiao2min
(NeuroscienceResearchInstitute,PekingUniversity,Beijing100083,China)
Abstract:Recently,theresearchmethodsforstemcellsfromcentralnervoussystemandtheclinicalapplicationhaveat2tractedattentionofCNSstudy.Inthisreview,thefindingofneuralstemcells,newresearchtechniquesandtherapeuticeffectsontheCNSdisorderssuchasneurodegenerationdiseases,ischemainjuryandtumorsbyapplyingneuralstemcellsareintroduced.
Keywords:neuralstemcells;neuroregeneration;celltransplantation
(上接211页)
Thegenetherapyofcentralnervoussystemdisorders
ZHANGWang2ming,NIUDong2bin,XURu2xiang,etal
(NeuroscienceResearchInstitute,PekingUniversity,Beijing100083,China)
Abstract:Genetherapyisapotentialandnewmethodsoftreatingmanyneurologicaldiseasesthatwereconsideredre2fractorytocurrentconventionaltreatments.Byinjectionofviralvectorsortransplantationofgeneticallyengineeredcellsintospecificsitesofthebrain,thedevelopmentoftechnologiesfordeliveryofforeigngenesintobrainopenedthefieldtopromisingtreatmentsforCNSdisorders.Butthedevelopmentofgenetherapyforneurologicaldiseasesrepresentsamorecomplexproblemthanthatforothersystemicdisorders.Incompletecharacterizationoftargetorgans(brainandspinal
cord)andadditionalchallenges,suchaspost2mitoticcells,heterogeneityofcelltypesandcircuits,andlimitedaccess,allcontributetothedifficulties.Forthisreason,thisreportprovidesanupdateoutlineofgenetherapyinCNSandre2viewscurrentresearchesinthisfiled.
Keywords:genetherapy;centralnervoussystem;viralvectors
Correspondingauthor:WangXiao2min
范文四:基因治疗用于人类疾病的现状
基因治疗用于人类疾病的现状
[摘要] 基因治疗的策略包括基因替代、基因修正、基因增强、基因抑制和基因失活。基因转移的方法有物理、化学和生物3大类。其中生物转移在人类细胞中应用最为广泛。生物法主要是指病毒介导的基因转移, 是通过病毒为载体,将外源基因通过重组技术与病毒重组,然后去感染受体细胞。研究最为系统深入的、应用最多、最成功的是逆转录病毒,用于人体细胞实验的逆转录病毒以慢病毒为佳。
基因治疗(gene therapy )是指将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病而实施的相应策略。目前国际上对人类基因治疗还处于探索阶段,虽然不可避免的会产生伦理方面的争议,但其独特的优点和美好的前景已经展示在世人的面前,现就人类基因治疗的现状及伦理争议作一综述。
1基因治疗的发展及现状
早在20世纪60年代初就有人提出了基因治疗的设想,70年代早期有科学家开始尝试将遗传物质导入人体细胞中以治疗疾病, 但试验以失败而告终。20世纪80年代初,Anderson 首先阐述了基因治疗的理念[1]。1980年美国的Cline 教授第1次进行了人类真正意义的基因治疗。他向美国国立卫生研究院(NIH )提出人类基因治疗草案,可惜未获批准。但他还是铤而走险,在以色列对1例β-地中海贫血的患者进行了基因治疗,但由于事先未征得批准, 结果是以其自身在临床研究领域销声匿迹而告终[2]。20世纪80年代以后, 从小鼠到灵长类等一系列转基因动物试验获得了空前的成功, 人类基因治疗的话题再次被提出,而有关人类基因治疗的原则因此得以在美国及欧洲及时制定或修订。基因治疗之父An -derson 就一直从事人类基因转移和治疗的研究, 他们慎重地进行疾病的选择,对将目的基因转移到靶细胞的载体也重新进行了设计、改进和评价,取得了令人瞩目的成绩[3]。1989年Rosenberg 正式动手临床操作, 采用免疫-基因治疗, 给第1批晚期黑色素瘤患者输注NeoR/TIL,患者治疗后肿瘤均不同程度缩小, 其中1例存活2年以上,1例存活近1年。提示人体基因治疗,至少是在短期,对患者不仅无明显副作用和损害且有明显获益。这是世界上首次获得批准的临床基因标记性试验,虽然不能说是严格意义上的临床基因治疗, 但其成功的意义重大。不仅使人类基因治疗的科学性和可行性得以逐步阐明, 而且使社会大众逐渐理解和了解了这一划时代的新技术,人体基因治疗的时机因而趋于成熟[4]。1992年起美国国立卫生研究院批准了一系列人肿瘤-免疫基因治疗试用方案,见表1。1991年我国首例基因治疗B 型血友病也获得成功。B 型血友病是一种因缺乏凝血因子IX 而导致的遗传性出血性疾病。复旦大学的医学科技工作者将携带有IX 因子的逆转录病毒载体转染B 型血友病患者的成纤维细胞, 再将转染后的患者成纤维细胞悬液注射到患者皮下。结果患者血浆中IX 抗原和IX 因子活性升高了1~2倍且持续2年以上,患者全身出血症状有所好转, 每年所需IX 因子替代治疗次数逐渐减少。此后跟踪4~7年未发现与基因治疗相关的毒副作用。这是迄今为止世界上唯一进行基因治疗的血友病病例,此项研究成果已获国家发明二等奖[5]。
2基因治疗的方法及应用
目前基因治疗的主要方法有2种:一是直接疗法:纠正突变基因即在原位修复缺陷的基因,以达到治疗目的。具体做法是取出患者体细胞,对不正常的基因进行修饰, 使之成为正常的基因, 然后将改造后的细胞送回患者体内。这是理论上较理想的基因治疗策略,但实际应用中还存在不少问题。二是间接疗法,即以正常基因替代致病基因,导入外源正常基因,代替有缺陷的基因。对靶细胞而言,没有去除或修复有缺陷的基因。我国对B 型血友病患者的治疗就是采取的后一种方法。直接和间接法均是用DNA 重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因,使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。与基因转移的受体细胞不同,基因治疗有2种途径:体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗。体细胞基因治疗是指将正常基因转移到体细胞, 使之表达基因产物以达到治疗目的。该治疗不必矫正所有的体细胞, 只涉及体细胞的遗传改变并不影响下一代, 故已被广泛用于严重疾病的治疗。生殖细胞基因治疗是指将正常细胞基因转移到患者的生殖细胞(精细胞,卵细胞早期胚胎)使其发育成正常个体。这是理想的治疗方法,从根本上治疗遗传病,使其有害基因不能在人群中播散。但实际上这种靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展。原因是其基因转移效率不高,只能用显微注射方法,且仅适用于排卵周期短而次数多的动物, 所以很难适用于人类。加之由于受精卵或早期胚胎细胞的遗传改变势必会影响后代, 伦理学上的分歧也使生殖细胞基因治疗举步维艰。
目前基因治疗的策略包括基因替代、基因修正、基因增强、基因抑制和基因失活, 这些无一例外的均需要基因转移。目前基因转移的方法有物理、化学和生物三大类,其中生物转移在人类细胞中应用最为广泛。生物法主要是指病毒介导的基因转移, 是通过病毒为载体,将外源基因通过重组技术与病毒重组,然后去感染受体细胞。目前研究最为系统深入的应用最多最成功的是逆转录病毒,病毒感染细胞后其基因组RNA 经逆转录产生双链DNA 拷贝。插入宿主染色体形成前病毒,前病毒转录产生的正链既是病毒RNA ,再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。完整的病毒颗粒具有插入宿主染色体必需的全套酶系统,适用于介导基因转移。而用于人体细胞实验的以慢病毒为佳。慢病毒也属于逆转录病毒,像其它逆转录病毒一样,慢病毒基因组经逆转录后能整合在宿主DNA 上,也可以在正常细胞中进行操作,因此可将它改建为有用的外源基因的转移载体[6]。与非慢病毒逆转录病毒载体不同的是,慢病毒载体还具有以下特征:宿主范围广泛,既能有效感染分裂期细胞,又能有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。病毒载体经改构后不在宿主细胞繁殖,不会导致寄主细胞的死亡,因此被它感染的或转化的动物细胞能够连续传代。因为慢病毒所构建的siRNA 达载体是由RNA 聚合酶Ш启动子来指导RNA 合成的,构成siRNA 的正义与反义链可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA 。也可由载体直接表达小发卡状RNA 在细胞里进一步加工成siRNA 。众所周知体外合成的siRNA 对基因的表达的抑制作用通常是短暂的,而应用慢病毒载体转移到细胞内的策略,对基因表达的抑制效果非常稳定。在长期稳定表达载体的细胞中,可长期发挥阻断基因表达的作用,因而目前已广泛用于RNA 干 扰研究中[7-9]。
3基因治疗的伦理学争议
基因治疗, 尤其是生殖细胞基因治疗不可避免会引起一场旷日持久的伦理之争。从伦理学角度看, 因体细胞基因不对其后代产生影响,体细胞的基因治疗符合伦理道德争议较少。人只需关注其对个体是否安全即可,对某些病情严重且无有效治疗方法的患者而言,大多乐于接受这种治疗。体细胞基因治疗的主要缺点是只使缺陷的基因在治疗的个体得到纠正,其下一代仍可能产生同样的遗传性疾病或缺陷,这就使得科学家们不得不寻求生殖细胞基因治疗。实际上,生殖细胞的基因治疗正是体细胞基因治疗的扩展与延伸,理论上可以从根本上
消除某一疾病的垂直传播。但其最大的缺点是受目前医学科研技术和知识水平的限制, 其对后代可能造成的损害存在各种不确定因素, 其后果也无法明确把握和预测。例如接受转基因受体的生殖细胞可能发生随机整合,并垂直传播给下一代, 使后代变成癌易感者及其它疾病易感者,甚至有可能产生非人类的一些特征和性状,这在伦理学上是绝对不能允许的。
此外,每个个体均有自己的生命权且有权利保护自己的基因不被人工操纵,而生殖细胞基因治疗的后果将影响到许多代人, 他们将会成为未知情、未同意的受试者,这在伦理学上无法解决。因此目前各国政府对基因治疗均采取慎之又慎的态度,在少量批准应用体细胞基因治疗外,禁止将生殖细胞基因治疗用于临床,我国也不例外。1993年卫生部制订了《人的体细胞治疗和基因治疗临床研究质控要点》, 只批复同意体细胞的基因治疗。可以相信,一旦基因治疗技术发展到了足以消除对后代可能造成的损害时,或至少是这种损害和后果可以明确把握和预测, 且有相应的有效的预防措施时, 生殖细胞基因治疗就会有实质性进展。
总之,基因治疗作为一项全新的疾病治疗手段,已经显现出强大的发展势头和美好的发展前景。尤其是近20多年来, 人类在体细胞基因及宫内造血干细胞移植和基因治疗领域均取得了很大的进步, 因而可相信即使面临极大的挑战,但随着人类基因组计划的顺利实施和完成, 新的人类疾病基因的发现和克隆, 基因治疗将会成为众多疑难疾病治疗的重要组成部分, 其临床应用将不断取得突破性进展。
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11906339 冯悦
范文五:癌症的基因治疗
癌症的基因治疗
文章来源:有问必答健康社区2005-1-17 11:18:53
自20世纪中期起,分子生物学理论与技术飞速发展,Watson等(1953年)发现DNA双螺旋结构,60年代遗传密码被破译;70年代建立DNA重组和测序技术以及癌基因与抑癌基因研究的突破;80年代对珠蛋白生成障碍性贫血(地中海贫血)基因治疗的研究和逆转录病毒载体的开发,为基因诊断和治疗提供了理论依据与技术方法。
基因治疗是指运用DNA转移来治疗甚至预防人类疾患。确切地说,它指的是遗传信息相关的特异性DNA序列的转移,是一项高度集成、综合性高难度的生物技术。基因治疗是最初是以治疗单基因遗传病为主,而现已广泛应用于肿瘤等疾病的治疗研究。
一、基因治疗的原理和方法
肿瘤基因治疗的原理是将目的基因用基因转移技术导入靶细胞,使期表达此基因而获得 得特定的功能,继而执行或介导对肿瘤的杀伤和抑制作用,从而达到治疗之目的。基因治疗涉及目的基因、载体及受体细胞三方面。有效的基因治疗依赖于外源基因高效而稳定的表达。利用病毒载体介导基因转移,以其高转染率和良好的靶向性而成为肿瘤基因治疗中应用最广泛的方法,其中包括逆转录病毒、腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VV)等载体。受体细胞分为生殖细胞细胞两类,目前仅限于体细胞、成纤维细胞、肝细胞及内皮细胞等。目前常用的基因治疗方法,可以归纳为以下两种(图19-1):一种方法是体细胞基因治疗或称“二步基因治疗”,即将受体细胞在体外培养转移入外源基因,经过适当的选择系统,把重组的受体细胞回输患者体内,让外源基因表达以改善患者症状。这种方法是目
,提指不需前基因治疗普遍采用的方法,又称为体外法(ex vivo)。另一种方法称为“直接法基因治疗”要细胞移植而直接将外源DNA注射至机体内,DNA可以单纯注射,也可以与辅助物如脂质体一起注射,使其在体内转录、表达而发挥治疗作用,故又称为体内法(in vivo)。体内法的基因治疗方式比体外法简单、直接、经济,疗效也比较确切,常邮的体内基因直接转移手段有病毒介导、寡核苷酸直接注射、受体介导、脂质体介导和体内基因直接注射等。此外尚有原位法(in situ)。
图19-1 基因治疗策略
左:体外法基因治疗需要从患者体内取出细胞,并以治疗基因修饰,回输表达治疗基国的修饰细胞于患者;右:体内法基因治疗是直接注射含治疗基因的载体于患者
二、基因治疗的基因策略
从理论上讲,基因治疗应有两个基本目的:一是恢复异常表达或缺失的体细胞基因的功能;另一个是引入有治疗价值的其他来源的基因。第一个目的包含的内容较广泛,如恢复肿瘤局部的抗肿瘤免疫功能,阻止异常表达的癌基因,恢复肿瘤抑制基因功能,恢复细胞周期调节基因和恢复机体对肿瘤转移的抑制等。第二个目的包括引入前药转换基因,却除或转移多药耐药基因等。因此,肿瘤的基因治疗除了干扰肿瘤细胞的生长规律,纠正其恶性表型外,尚恢复和加强肿瘤局部微环境和全身濒痪的抗肿瘤系统的功能。针对以上目的,基因治疗目前主要集中在免疫基因治疗、肿瘤抑制基因治疗和药物敏感基因治疗等方面。
图19-2 研究中的主要基因治疗途径
包括转导编码前药活化酶基因进入肿瘤细胞(HSV-TK),将野生型p53基因引入肿瘤细胞,使正常造血干细胞表达药物抵抗蛋白(MDR),转导细胞因子基因进入宿主细胞(IL-X),制备表达免疫制激分子(GM-CSF)的肿瘤细胞疫苗
免疫基因治疗
将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织,以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫。
基因修饰肿瘤细胞“疫苗”疗法
将某些细胞因子基因如IL-2、IL-4、TNF-α、INF-γ、GM-CSF等转染肿瘤细胞,可使肿瘤细胞表达活性细胞因子。转染细胞因子基因的肿瘤细胞基体内致瘤性丧失,耐动物预接肿这种转基因肿瘤细胞后,该动物对再接种的同种肿瘤有抵抗作用。能分泌细胞因子的转基因肿瘤细胞具有肿瘤疫苗作用,成为新型的肿瘤“疫苗”。这种肿瘤疫苗的作用机制是由于细胞因子表达后,一方面促进肿瘤表达特异抗原并诱发宿 主抗肿瘤细胞毒性淋巴细胞(CTL)反应;另一方面分泌的细胞因子增强CTL和其他抗癌效应细胞的作用。
基因修饰TIL的过继免疫疗法
将细胞因子导入TIL细胞中,活化后的TIL具有显著抗自身肿瘤的作用,回输体仙后有聚集于肿瘤部位的倾向,携带的抗癌免疫增强性细胞因子基因在肿瘤局部表达量增加,同时还避免全身大剂量投用IL-2、
α等细胞因子所引起的严重毒副反应。目前已将TNF-α基因导入TIL,并在癌症患者中进行临床试验。 TNF-
免疫增强基因疗法
是将MHC1类抗原基因经体内导入肿瘤细胞内,增加其免疫原性,有效地激活机体抗癌免疫反应,降低肿瘤细胞的致瘤性。
原位修饰肿瘤免疫原性的基因疗法
直接在体内原位修饰肿瘤免疫原性,诱导肿瘤特异性细胞毒反应,同时肿瘤组织的CTL可产生一种“旁观者效应”(bystander effect),即CTL不仅可以杀伤转导基因阳性肿瘤细胞,还可以杀伤转导基因阴性肿瘤细胞,使受基因治疗的瘤灶消退时,其他未治疗的瘤灶也会消退。
免疫基基治疗是很有前途的一种治疗途径。因为它可以用体外方式,从而避免目前缺乏体内有效导入系统的局限性;同时,由于它可调动机体的免疫反应,因此具有“旁观者效应”。建立瘤苗库和利用原递呈细胞系统等也是有希望的治疗途径。
癌基因拮抗疗法
肿瘤的发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关,可以通地阻断癌基因的表达或恢复抑癌基因的功能来抑制肿瘤的发展或恢复其正常表型。
阻断癌基因的功能
将反义癌基因导入癌细胞中、癌基因缺失突变、引入非等位基因rev等方法阻断癌基因功能。反义癌基因实际上是人工合成的与与癌基因mRNA互补的寡核苷酸,即反义寡核苷酸(ODNs)。反义核酸在转录和翻
译水平阻断某些异常的基因的表达,以阻断癌细胞内的异常信号传导,使癌细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡。从理论上讲,由15个核苷酸构成的反义寡核苷酸导入细胞后,即可通过碱基互补原则,封闭一个特定基因的表达。实验表明,反义的ODNs可以抑制多种癌基因,如c-myb、c-myc、c-H-ras基因等。此外还可以用反义核酸抑制某些肿瘤的自分泌生长因子,以期阻断其恶性生物学行为以达到治疗目的,如在实验研究中已得到证实的TGF-α、IGF-1等反义基因。由肿瘤发生、发展的机制十分复杂,涉及多种癌基因和抑癌基因的多步骤改变,因而难以通过拮抗某一种癌基因而完全控制肿瘤的恶性行为;其次,现有的基因转移技术尚不可能百分之百地将反义ODNs或抑制基因导入体内的每一个肿瘤细胞。
用基因替代等方法恢复和增中肿瘤抑制基因的功能
如将克隆的抑癌基因Rb、p53、p16等导入肿瘤细胞,可以逆转其恶性行为,诱导细胞“凋亡”。这类研究已从实验研究过液压到临床试验阶段,其中对p53基因的部分临床试验结果显示了其潜力。Roth等直接在瘤体内注射携公平野生型p53基因的重组腺病毒(Adp53)治疗头颈部鳞癌和非小细胞肺癌,结果绝大多数肿瘤组织可表达p53基因,肿瘤体积缩小,瘤体坏死和调亡等。由英国、法国和意大利组织的国际临床合作小组直接将野生型p53基因表达质粒注射放肝癌瘤体内,未见明显毒副反应,8例患者中有1例完全
wafl缓解达19个月,3例肿瘤体明显缩小,此外还有报道称,将细胞周期抑制基因p21导入p53缺失的肿瘤,效果比转导野生型p53更好。
自杀基因疗法
一些来自病毒或细菌的基因具有某些特殊的功有,其表达产物可将原先对哺乳动物经细胞增毒或极低毒
性的药物转换成毒性产物,导致这些细胞死亡。将这类基因转入靶细胞,使之对某些药物具有特别的功能,可以利用这些药物使靶细胞“自杀”。因此人们将这些基因称为“自杀基因”。这些“自杀基因”表牵产物多是能将无毒性药物前体代谢为毒性产物的酶,它们又被称为“前药转换酶基因”。
常见的“自杀基因”包括胸苷激酶基因(tk基因)和胞嘧啶脱氨酶基因(CD基因)等。将这些基因导入某一细胞,通过基因重组织这些基本获得内源性表达,生长特定的酶类,这些酶可以使无素毒或低毒性前药转换成毒性产物,阻断核代谢途径,使表达这些基因的细胞对某此传真物具有特别的敏感性,最终导致这些细胞死亡。极有意义的是,此类基因更可以通过“旁观者效应”杀伤未导入基因的邻近分裂细胞,扩大其杀伤效应。如将单线纯疹病毒胞苷激酶基本(HSV-TK)导入肿瘤细胞并同时使用Acyclovir或Ganci-clovir,Acyclovir和Ganciclovir本身没有细胞毒作用,而HSV-TK产物可将Acycovir和Ganciclovir磷酸化,这些磷酸化产物具有明显的细胞毒性,能抑制细胞内DNA聚合酶的作用,从而干扰肿瘤细胞DNA合成,导致肿瘤的细胞内DNA聚合酶的作用,从而干扰肿瘤细胞DNA合成,导致肿瘤细胞死亡,正常细胞则不被伤害。这种疗法主要针对由非增殖细胞构成的肿瘤如脑细胞瘤等。人们已设计出应用HSV-TK基因治疗肿瘤的较成熟的临床试验方案,美国NIH已批准HSV-TK基因转染疗法试用于脑瘤等的临床治疗,但由于对癌旁细胞讹言春他组织(如造血细胞)的另作用以及旁观者效应,自杀基因一类的细胞毒基因如HSV-TK、CK等看来不甚理想,而且民有耐药部题,因而其适用的瘤谱是很局限的,对肝癌和造血系肿瘤必须十分慎重。脑肿瘤“自杀”基因治疗疣是目前七国唯一被正式批准的肿瘤基因治疗试验。
基因修饰配合大剂量化疗
癌症患者的癌细胞中存在着能耐受多种化疗药物的高活性多药耐药基因(MDR1),这些患者往往抵抗多种人疗药的治疗。用反义RNA或DNA灭活MDR1是提高该类患者化疗效果的有效途径。此外,将MDR1基因通过载体转移至骨髓造血干细胞,使造血系统具有抵抗化疗药物的骨髓抑制作用,提高机体对大剂量化疗的耐受力是另一种有效途径。此类研究目前还仅限于实验室。
三、基因治疗存在的关键问题
至1996年5月止,美国FDA已批准基因治疗方案130个,治疗患者900余例。其中恶性肿瘤51个方案,仅M.Bleaser的HSV-1TK/GCV治疗恶性脑瘤和Roth的p53治疗头颈部鳞癌尚有部分效果。和其他基因治疗一样,肿瘤基因治疗在实际应用过程中最大的障碍是高效、导向的载体系统和基因导入后的有效调控等。
基因导入的载体系统问题
目前所采用的载体主要分为两大类,即转染性和转导性苦载体。转染性载体是利用化学或物理方法增加细胞膜的通透性而将DNA转染入细胞内,这种方法包括脂质体和基因枪等。转导性载体则是利用病毒对细胞的天然亲和力把遗传物质引入宿主细胞。转染的方法相对简易行,抗原性弱但效率较低,而且基因表达的持久性不够。因此它在肿瘤基因治疗中的使用受到限制,也难以取得理想效果。转导法则高效、持久,但抗原性较强,目前大多数基因治疗程序仍以病毒介导。
逆转录病毒是迄今为止最为成熟、运用最广的进行基因转移的载体系统,在美国FDA批准的基因治疗计划中,超过半数是 传信息整合到细胞染色体中的能力,因而能够长期表达,而且载体可以通过建立生产细胞株大量产生。逆转录病毒载体的主要局限在于特异性低、滴度不易过浓缩提高等。近年来,国外学者力求通过新型靶向性载体及包装细胞的设计来克服其缺陷。在靶向型载体方面,包括:(1)采用带有组织特异性内部启动子,如甲胎蛋白启动子、癌胚抗原(CEA)启动子及酪到激酶启动子等构建靶向型逆转录病毒辣载体;(2)利用反式激栈活因子调节LTR启动子;(3)利用双特异分子桥,这种分子桥既可与病毒颗粒相结合,也可与特异性的细胞表面受体结合的,指导病毒粒相结合,也可与特异性的细胞表面受体结合的,指导病毒感染特异笥的靶细胞。新型包装细胞则包括靶向性载体包装细胞的设计和减少RCV的设计等。
腺病毒载体也是目前常用的载体,它具有转寻效率高,容易生产等多项优点,但它的抗原性较强,体内应用高滴度腺病毒重组体会经起对转导细胞免疫排斥及炎症反应等。为了克服腺病毒辣载体的上述缺陷,在“第二代”、“第三代”载体的基础上,“第四代”载体下在在研制中。以腺病毒相关病毒辣(AAV)为基础的载体已引起基因治疗界的重视。AAV载体具有长期稳定整合、低水平表牵 特点,且适用于表达生物活性物质的基因,在高滴度情况下也未发现引起炎症反应的副作用。它有可能弥补逆转录病毒及腺病毒的缺点而在基因治疗中起到特有的作用。AAV的主要局限是难以大量生产和载体容量有限,但新的复制模型有望解决这些问题。
基因治疗的“靶细胞”或“靶组织”
带有目的基因的载体如何到达“靶细胞”是肿瘤基因治疗的关键。只有提高基因转导的靶向性,才能实现治疗的针对性和安全性,目前国际上解决基因的靶向转移及表达有三种策略:第一种方法是以基因工程手段改造基因载体,如改造逆转录病毒包装细胞中的原病毒env序列,使所包装的重组病毒特异地识别位于靶细胞表面的抗原或受体决定簇;第二种方法是在体内基因传递系统中共价连接抗瘤抗体和肿瘤细胞特异受体的配基,使基因在类似“生物导弹”作用下被送到肿瘤细胞表面;第三种方法是应用肿瘤细胞特异蛋白“管家基因”的基因表面调控元件,在转录水平调控目的基因在靶细胞中特异表达。此外,肿瘤新生血管的内皮细胞也是一个很好的“靶”细胞及组织,国外已开始针对VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2设计反义基因或调控VEGF的基因作为目的基因,可能是一个有前景的思路。
关于外源基因在体内表达的可控性
外源基因导入后,在体人的表达若能人为调控,将对恶性肿瘤及诸多疾病的基因治疗有所突破。目前已经发现了和第一个可诱导的调控系统---TAXI/UAS系统。该系统应用一个酵母GAL4的顺式元件作为外源基因的上游,另组建一个激素受体(孕酮)及一段GAL4的反调控基因子的嵌何 体,将两个载体共转染靶细胞后,只有当诱导物(孕酮)或其拮抗物(RU486)存在时,目的基因才能表达。这是迄今唯一可诱导的调控系统,值得重视。
四、展望
目前吸瘤基因治疗的研究大多是在观察毒副反应为主的?期临一色试验,少数地入?/?期临床试验,结果有待进一步驼观察。有人认为虽然目前的临床研空进程过慢,但动物实验的结果并不能完全代表人类,而临床试验具有决定性的作用。就目前的研究成果来看,基因治疗可能会在手术、放疗和化疗以外,成为一种新的肿瘤治疗手段,特别可能对提高化疗、放疗的敏感性,减少肿瘤复发和转移等方面有一定的、甚至更为重要的作用,成为肿瘤综合治疗中的一个较为重要的组成部分。
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