范文一:狂犬病疫苗的研制
狂犬病及其疫苗的研制过程
摘要:目的 应用Vero 细胞研制人用精制狂犬病疫苗。方法 应用Vero 细胞经转瓶或生物反应
器培养制备人用精制狂犬病疫苗。结果 各项质控指标均符合WHO 和中国生物制品规程标准, 经
Ⅰ 期临床观察疫苗是安全的。结论 用Vero 细胞生产的狂犬病疫苗产量大, 效价高, 不良反应
少, 且能进行工业化生产。
关键词:狂犬病 病毒 疫苗 Vero细胞
狂犬病是一种自然疫源性疾病, 是由狂犬病毒引起的所有温血动物都易感的人兽共患
性疾病, 一旦发病, 100%死亡。唯一有效的预防手段就是及时注射狂犬疫苗。我国每年需要600万人份左右的狂犬病疫苗。但是我国现行的原代地鼠肾细胞培养狂犬病疫苗。生产工艺落后, 生产效率低, 特别是疫苗的稳定性差, 免疫失败的例子很多, 尽管1994 年开始浓缩3~5 倍, 一定程度上解决了疫苗稳定性差的问题, 但浓缩后的副反应比较严重。所以研制和生产国际上已得到广泛承认和推广的Vero 细胞疫苗已势在必行。
狂犬病即疯狗症,又名恐水症,是一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病,所有温
血动物包括人类,都可能被感染。它多由染病的动物咬人而得。一般认为口边出白色泡沫的疯狗咬到传染,其实猫,白鼬,浣熊,臭鼬,狐狸或蝙蝠也可能患病并传染。患病的动物经常变得非常野蛮,在唾液里的病毒从咬破的伤口进入下一个病人。狂犬病从一个人传到另外一个人极为少见,患狂犬病的人类患者多数会发病身亡。
狂犬病病毒对神经系统有强大的亲和力,病毒进入人体后,主要沿神经系统传播和扩散,
病毒侵入人体后先在伤口的骨骼肌和神经中繁殖,这称为局部少量繁殖期,此期可长可短,最短为72小时,最长可达数周、数月甚至更长。病毒在局部少量繁殖后即侵入神经末梢,沿周围神经以每小时3mm 的速度向中枢神经推进,到达脊髓后即大量繁殖,24小时后遍布整个神经系统。以后病毒又沿周围神经向末梢传播,最后到达许多组织器官,如唾液腺、味蕾、角膜、肌肉、皮肤等,由于头、面、颈、手等部位神经比较丰富,病毒易于繁殖,再加上离中枢神经较近,故这些部位被咬伤后发病者较多,潜伏期也较短;伤势越严重,也越容易发病。病毒在中枢神经中主要侵犯迷走神经核、舌咽神经核和舌下神经核等。这些神经核主要支配吞咽肌和呼吸肌,受到狂犬病病毒侵犯后,就处于高度兴奋状态,当饮水时,听到流水声,受到音响、吹风和亮光等刺激时,即可使吞咽肌和呼吸肌发生痉挛,引起吞咽和呼吸困难。
导致狂犬病的病原体是弹状病毒科狂犬病病毒属的狂犬病病毒(Rabies Virus)。完整
的狂犬病病毒呈子弹形,长度大约为200纳米左右直径为70纳米左右。整个病毒由最外层的脂质双分子层外膜、结构蛋白外壳和负载遗传信息的RNA 分子构成。目前普遍认为狂犬
狂犬病说明及防治病病毒有四个不同的血清型。狂犬病病毒对不利环境的抵抗力非常
弱,在表面活性剂、消毒剂如甲醛、升汞、碘酒还有酸碱环境下会很快失去活性,并且对热和紫外线极其敏感。
人用狂犬病疫苗既往种类较多,现今国内外多使用细胞培养疫苗。我国现在使用的有精
制VERO 细胞狂犬病疫苗和精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗,浓缩地鼠肾细胞狂犬病疫苗已禁用。 狂犬病疫苗人用精制VERO 细胞狂犬病疫苗及精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗均为轻度混浊白色液体,久放形成可摇散的沉淀,含硫柳汞防腐剂。
1材料和方法
1.1细胞及其培养
Vero 细胞株: 来源于中国药品生物制品检定所, 并进行了细胞的外源因子检查、肿瘤原性检查、染色体检查, 证明该细胞无细菌、霉菌、支原体及病毒污染, 无致肿瘤性, 细胞染色体分布在58~60 之间, 符合世界卫生组织狂犬病专家委员会制定的关于应用传代细胞制备疫苗的规程要求。
1.2狂犬病病毒
狂犬病毒固定毒CTN-1珠,由中国药品生物制品检验所提供。毒种毒力≥7.5LD 50/ML,小白鼠脑内法作中和试验,中和指数大于500,无菌试验及病毒外源因子检查阴性,符合WHO 提出的疫苗生产用毒种要求,并经WHO 狂犬病专家委员第七次会议确定,可用于狂犬病疫苗的生产。
1.3病毒滴定及效力试验
按1995年版《中国生物制品规程》进行。
1.4蛋白质含量测定
采用Lowery 法。
1.5残余牛血清含量测定
采用反向间接血凝抑制剂实验,所用试剂均为中国药品生物制品鉴定所提供。
1.6Vero 细胞残余DNA 检测
采用Dig 标记点样杂交法。
1.7FPLC
购自Amersham Phamacia Biotech。
1.8超滤器
购自Millipore Co.。
1.9微载体及生物反应器
Cytodex1和Cytodex3购自Amersham Phamacia Biotech;5、15和50L 搅拌式生物反应器购自B.Braun Biotech Intermationl。
1.10原苗制备
将Vero 细胞复苏后, 按常规传代到中方瓶中, 经连续5~6次传代分种, 得到足够多的细胞, 再用12~14 个中方瓶转种到一个10L 转瓶中, 使整个转瓶表面形成单层, 转瓶培养长成单层后, 细胞经胰酶和EDTA 消化, 加入CT N-1 液体毒种, 充分吸收后, 继续在转瓶中培养, 37℃, 72h 后洗换掉生长液, 加入维持液, 以后每隔72~96h 收获, 可连续收4~5 次。生长液为含8%小牛血清的Hanks 液, 维持液不含小牛血清, 但含人白蛋白Hanks 液。将收获的原液合并, 抽样做毒力、无菌、蛋白含量测定。
1.11下游工艺
用0. 45m 滤膜澄清原苗, 截留分子量为10 万的超滤膜超滤浓缩, 再经离心和柱层析纯化, 加入-丙内酯灭活剂, 补加人白蛋白及佐剂, 调pH 至7. 2~ 7. 8, 测定DNA 残留量及灭活效果, 进行分装及成品检定。
1.12检定方法
效力、牛血清蛋白残留量、无菌试验、蛋白含量、毒性试验、理化试验均按文献, 细胞DNA 残留量测定, 按文献。
1.13I 期临床观察方案
20名健康志愿者按0、3、7、14、28d 在上臂三角肌肌肉内注射1.0ml 疫苗。观察局部反应和全身反应。
2结果与分析
2.1Vero 细胞库的建立
将Vero 细胞种子扩增传代, 制备种子细胞库和生产细胞库, 冻存于液氮中。细胞库经
细菌、霉菌、支原体及外源因子检查均为阴性。用裸鼠进行致癌性检查, 阳性对照(Hela细胞)10/10 发生肿瘤,Vero 细胞(0/10)无肿瘤发生。染色体检查证明细胞核学稳定, 计数100 个中期细胞, 其染色体分布高峰数目为56~58 条, 符合WHO 关于“ 动物细胞体外培养生产生物制品规程” 的要求。
2.2CTN-1V 株毒种库的建立
将25代CTN-1V 珠Vero 细胞上传代, 建立基础毒种库(CTN-1V 28),CTN-1V 33代为生产毒种库, 冻存于一70℃ 冰箱, 并经细菌、霉菌、外源因子、支原体检查均为阴性。毒力基本上稳定在7.0Log-LD 50/ML以上。
2.3疫苗的制备
采用100ML 方瓶→2L 方瓶→ 10L转瓶或5L →15L →50L 生物反应器扩增培养Vero 细胞, 待3~5d细胞长成单层可接种毒种, 并用0.05、0.01和0.002MOL 进行试验, 种毒后3天开始收毒, 每隔2天收获一次病毒液, 结果表明病毒感染量不同, 病毒滴度(3次平均值)也不同。
2.4疫苗的浓缩、灭活和纯化
将原苗合并后澄清, 经超滤浓缩30 一50倍, 用1/4000的丙内醋灭活病毒, 用硫酸鱼精蛋白去除Vero 细胞DNA 进行初步纯化, 再经一步柱层析法提纯抗原。收集I 峰合并, 加人人血白蛋白和Al(OH)3, 分装即成精制Vero 细胞狂犬病疫苗。
2.5疫苗的检定
用上述工艺生产的3 批Vero 细胞狂犬病疫苗, 经自检和中国生物制品检定所检定, 疫苗质量均符合WHO 规程和《中国生物制品规程》的要求。
2.6期临床观察
1999 年4 月获准I 期临床观察, 接种20 名志愿者。5 针全程免疫后, 未发现全身不良反应, 局部反应极轻微, 极少数接种者注射部位出现疼痛, 但注射后1 一2 d 疼痛消失, 此疫苗是安全的。
3结论与讨论
用Vero 细胞生产狂犬病疫苗产量大, 效价高,不良反应小, 且能进行工业化生产。目前法国巴斯德研究所生产的维尔博狂犬病疫苗就是一种Vero 细胞狂犬病疫苗, 其毒株为PM 。
国内用Vero 细胞作为基质研制的狂犬疫苗和乙型脑炎疫苗都采用了二步柱层析法步骤较为复杂。本研究先用硫酸鱼精蛋白除去VerO 细胞DNA , 再用Sepharose4FF 一步柱层析法纯化Vero 细胞狂犬病疫苗, 操作简单, 生产的疫苗质量符合W H O规程和( 中国生物制品规程) 的要求。经I 期临床观察证明此疫苗是安全的, 需进行2-3 期临床观察, 进一步评价该疫苗的安全性和免疫效果。
参考文献
[1]黄仕和, 桑爱军, 乐威等. 人用精制Vero 细胞狂犬病疫苗的研制. 武汉生物制品研究所
[2]窦志勇, 李春英, 钱 浩等. 人用纯化Vero 细胞狂犬病疫苗的研制. 辽宁省卫生防疫站
[3]于伟, 刘兆文, 钱浩等. 精制Vero 细胞狂犬病疫苗的研制及免疫学效果观察
范文二:狂犬病疫苗的发现
龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn
狂犬病疫苗的发现
作者:
来源:《军事文摘 ·科学少年》 2016年第 09期
用烧红的铁棍对付狂犬病
人和家畜被病犬咬伤后,都会患上狂犬病。狂犬病是一种可怕的传染病,即使在有了狂犬 病疫苗的今天,每年也会夺走很多人的生命。那在没有狂犬病疫苗的古代,死于狂犬病的人就 更多了。
中世纪的人们是如何对付狂犬病的呢?欧洲人常常使用烧红的铁棍 — 他们相信,火焰与 高温可以净化一切事物,包括肉眼看不见的细菌。
如果有人被狗咬伤得了狂犬病,就会被一些壮汉压送到打铁铺,请铁匠用烧红的铁棍去烙 烫伤口,想借此 “ 烧 ” 死看不见的病原体。但如此原始残酷的作法,并没有治好患者的狂犬病, 相反,常常加速了死亡的到来。
用干燥的脊髓组织制成狂犬疫苗
1880年底,一位兽医带着两只病犬来拜访巴斯德,问巴斯德能不能想想办法,制作出狂 犬病疫苗。
巴斯德和助理们冒着危险采集狂犬的唾液,然后注射到健康犬的脑中,健康犬很快发病死 亡。历经数次实验,巴斯德推论出狂犬病病毒应该集中在神经系统,因此他大胆地从病死的兔 子身上取出一小段脊髓,悬挂在一只无菌烧瓶中,使其 “ 干燥 ” 。然后,巴斯德再把干燥的脊髓 组织磨碎,加水后制成疫苗注射到健康犬脑中,再让打过疫苗的狗,接触致命的病毒。经过反 复实验,接种疫苗的狗即使脑中被注入狂犬病毒,也不会发病了!狂犬病疫苗研发成功!
狂犬病疫苗救了小男孩的命
1885年,一位绝望的母亲带着被狂犬咬伤的 9岁小男孩约瑟芬,来到巴斯德实验室门 口,哀求巴斯德救救她的孩子。不忍心眼睁睁看着男孩死去,巴斯德决定为约瑟芬打下人类的 第一针狂犬病疫苗,这时距离约瑟芬被狗咬伤已经四五天了。巴斯德在 10天中连续给少年注 射了十几针不同毒性的疫苗。每天晚上,焦虑的巴斯德彻夜不眠地等待, 5天、 10天、 1个月 过去了,男孩终于恢复健康,和妈妈高高兴兴地返回家乡。
消息传开,国内外络绎不绝的狂犬病患者蜂拥而至,从巴斯德那里重获新生。狂犬病疫苗 的出现,拯救了无数人的性命,为人类的健康做出了重大贡献。
范文三:育肥猪伪狂犬病的疫苗疗法
育肥猪伪狂犬病的疫苗疗法
猪场
部门
耳病
疫苗
场内
群进
除了
自然
治疗
上既不经济又不现实.笔者受《中兽医学杂
志))2oo5年第4期”混合型猪瘟的表症识
别与疫苗疗法”一文及文中转载的”疫苗疗
法在畜禽病毒性传染病中的应用”的启发,
在吉州区部分养猪场(户)将疫苗疗法移植
治疗育肥猪伪狂犬病,接种疫苗在4,5天
即可稳定病情,取得了较好的控制效果.现
将有关资料整理,供同仁参考.
1典型病例一
2008年9月19日,吉安市吉州区阳
明山养猪户黄XX求诊.
主诉:猪场有73头肉猪,已接种过猪
瘟,蓝耳病疫苗,伪狂犬病未免疫.其中1
栏肉猪l3头,平均体重65kg,生病10日,
后来怀疑为链球菌病,自 病初为感冒症状,
己用药治疗多次,不见疗效.今早死亡l
头,生前有站立不稳,抽搐等症状,现送来
解剖.
剖解病变:肺肿胀,有肉变区,气管出
血,溃疡;肝有灰白色斑点块;胆囊充盈;肾
病疫苗(浙江易邦公司产品),每头注射2
头份;
?再对l2患病猪接种伪狂犬病疫苗,樱
每头2头份;索
?患病猪肌注:恩诺沙星+板蓝根,左
旋咪唑针剂;
先锋(黄芪多 ?全群猪拌料服用:抗毒
糖+盐酸左旋咪唑粉,江西创导动物保健
品有限公司产品)数日后,病情稳定,无一
死亡,逐渐恢复正常.后随访畜主,该猪场
去年也发生过育肥猪伪狂犬病,当时只对
健康猪接种疫苗,而患病猪大多数医治无
效死亡.
2典型病例二
2008年9月21日,吉安市吉州区阳
明山养猪户刘XX求诊.
主诉:猪场约有100头肉猪,已接种猪
瘟,蓝耳病,链球菌病疫苗,但未接种伪狂
犬病疫苗,有一栏猪发病十多天,使用多种
药物治疗不见效果.猪场在去年曾发生过
2009年第6期(总151期)
中革透学系旗
ll高热病,用药后控制住病情,但现在按去年
Il的有效药物使用毫无起色,反而增加数栏
lI猪只发病,至今损失近30头.今早死亡4
Il头严重病猪,现送来2头病死猪解剖.通过
lI询问畜主了解到,病死猪生前站立不稳,后
lI倒地抽搐,已饲养3月余.外观病死猪体表
Il未见异状,鼻腔流泡沫状液体,体重约ll50kg.
II剖检病变:肺肿胀,间质性肺炎;心冠
lI脂肪有小出血点;肝肿大;胆囊充盈,胆汁
lI浓稠;脾有灰白色坏死小点;肾有出血小
II点;肠系膜淋巴结及腹股沟淋巴结肿大,有
lI出血点;肠道出血性炎症;胃底黏膜大面积
lI出血;气管及会厌软骨内有泡沫状液体,鼻
fJ腔卡他性炎症;脑膜充血明显.
ll诊断:猪瘟抗体快速检测呈阳性,猪蓝
骗篱幄强附胜.
买实验室细菌培养:未发现细菌性疾病.
鼠确诊:育肥猪伪狂犬病.
防治:?先对健康猪接种伪狂犬病疫
‘‘苗,每头注射2头份;
?后对患病猪接种伪狂犬疫苗,每头
2头份;
?患病猪肌注:恩诺沙星+板蓝根,左
旋咪唑针剂;
?全群猪口服;抗毒先锋.
接种疫苗后第2天除死亡4头病情严
重患病猪外,后不再发生死猪,病情逐渐稳
定,之后痊愈.
3体会与探讨
3.1猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的
猪和其他动物共患的一种急性传染病.新
生仔猪感染后表现神经症状,腹泻;妊娠母
猪感染后可引起流产,产死胎;种公猪感染
可导致不育;育肥猪感染后可表现运动失
调,惊厥及体温升高,打喷嚏,咳嗽,鼻炎,
肺炎等,通常认为不易引起猪只死亡,仅仅
表现生长迟缓和日增重下降.笔者发现,现
在有些流行地区毒株的毒力有所增强,也
能引起育肥猪死亡,并且死亡率有逐年攀
升的趋势,给养猪业带来严重威胁.
3.2对于猪伪狂犬病,目前尚无有效的治
疗方法和特效药物.防制本病的关键是购
进的仔猪要及时接种伪狂犬病疫苗,加强
猪场(栏)卫生消毒和患病猪的隔离等.笔
者对于发生育肥猪伪狂犬病的养猪场(户)
采用健康猪只,患病猪只同时接种伪狂犬
病疫苗的方法,即疫苗疗法,只注射一次,
每头猪注射2头份疫苗,取得了比较满意
的控制效果.接种疫苗时应按照先接种安
全猪群(栏),再接种受威胁猪群(栏),最后
接种患病猪群(栏)的顺序依次进行.疫苗
疗法事先就同畜主讲清楚,接种后处于本
病潜伏期的猪群(栏)中可能会有少部分猪
只快速出现本病症状;患病猪群(栏)中,病
情严重的可能会死亡.接种疫苗后,配合辅
助对症治疗以控制继发感染,患病猪很快
停止死亡.经4—5天病情即得到控制.
3.3疫苗疗法突破了传统的”已发病的猪
只和怀疑已感染疫病,精神状态不佳的猪
群千万不能注射疫苗,否则发病率和死亡
率更高”的观念.其作用机理,笔者分析可
能是猪群感染伪狂犬病病毒后,刺激机体
很快产生抗体,接种疫苗可以中和其产生
的抗体,从而达到一定的治疗效果.
3.4在兽医临床实践中,笔者举一反三,将
疫苗疗法应用到发生蓝耳病的猪群,即对
健康猪只,患病猪只同时接种蓝耳病疫苗,
也取得了较好的疗效.如2008年7月30
日对吉州区白塘五里罗XX猪场31头患
蓝耳病的猪接种蓝耳病疫苗(青岛澳兰百
特公司产品,lOOmll瓶),每头注射3头份.
除死亡3头病情严重患猪外,其他猪只均
先后痊愈.
范文四:狂犬病疫苗纯化工艺的建立
?231?
狂犬病疫苗纯化工艺的建立
张玉慧 高春润 孙秀华 赵 刚 潘广域 王忠海 胡金东 秦 贤(辽宁生物技术公司, 沈阳110131)
摘 要 应用柱层析法对地鼠肾细胞狂犬病疫苗进行纯化, 纯化后病毒收率达7714%, 杂蛋白去除率达99%以上, 连续生产3批中试样品, 所有检测项目全部合格。该纯化工艺重复性好, 稳定性高, 是切实可行的有效生产方法。
关键词 狂犬病疫苗 柱层析 纯化
我国现行浓缩地鼠肾细胞狂犬病疫苗, 免疫原性低, 注射后副反应大。解决这一问题的唯一出路是对浓缩苗进行纯化。经过几年的探索, 我们建立了浓缩苗的纯化工艺, 并在国内率先通过国家新药评审, 获得新药证书和生产文号。现将纯化工艺报告如下。
材料与方法
11毒株
采用RPH A 法, 冻干牛血清诊断试剂盒由中国药品生物制品检定所提供。
81病毒滴定
[3]
按《中国生物制品规程》1995。91效力检定
果
[3]
。
狂犬病固定毒北京株, 21根据狂犬病毒相对分子质量及E LIS A 法进行抗原定位, 确定第1峰为病毒峰, 第2峰为杂蛋白峰, 凝胶柱层析图谱见图1
。
(PHK C V ) 生产工艺进行。地鼠由本公司繁育。鼠龄12-14d , 制成的细胞悬液用3L 转瓶培养, 接种量600ml Π瓶。
31原苗制备
按现行原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗(PHK C V ) 生产工艺进行, 用于进一步纯化的病毒滴度≥5. 0Log LD 50Π0. 03ml 。
41超滤浓缩
将澄清过滤的原苗用Millipore 公司生产的盒式滤器(Pillicon casstte ) 浓缩, 滤膜截留相对分子质量300000, 超滤浓缩50~100倍备用
51纯化方法
Sepharose 凝胶层析。层析柱直径315×100cm ,
[1]
。
介质Sepharose 4FF , 由瑞典Pharmacia 公司生产。平衡液50mm ol ΠL +0115m ol ΠL NaC1,pH716。洗脱液同平衡液、流出液经过紫外检测器, 接通收液瓶, 按紫外吸收峰收集
[2]
。
图1 疫苗的凝胶柱层析图谱
61蛋白含量测定
用Lowry 微量法。主要仪器是惠普上海分析仪器有限公司出品的7512G W 分光光度计, 蛋白标准品由中国药品生物制品检定所提供。
71残留牛血清蛋白含量测定
21病毒收率
对过柱前后样品进行效力检定, 结果收率为7013%~8719%, 平均为7714%, 见表1。
?232?
表1. 样品纯化前后效价比较批号
960725961125961202961209
清含量结果见表3。
收率(%)
7314701374158719
效价(I U Π安瓿)
纯化前纯化后
1218101114151518
91471110181319
表3 3批样品检定结果
批号
961125961202961209
效力
() 71110181319
蛋白
(μ) 261934
残余牛血清
() <><><>
31杂蛋白去除率
对纯化前后样品的蛋白含量进行了考察, 结果杂蛋白的去除率平均为9917%, 见表2。
表2 纯化前后杂蛋白含量的比较批号
961004961028961125961128961202961209
讨 论
高质量的原苗是纯化成功的重要基础, 因此对
效价(I U Πml )
纯化前纯化后
4. 764. 556153511361036195
0. 0140. 01101026010120101901034
杂蛋白去除率(%)
99. 799. 89916991817995
原苗生产提出了较高的要求。首先, 要求毒种毒力高, 繁殖能力强。细胞要求密度大, 这样才能保证原苗质量。
, , 有待进一步摸索试验。
4FF 胶纯化病毒, 收率高达77%, 杂蛋白去除率高达9917%, 且流速快, 介质使用寿命长, 如果正确使用和处理, 该介质的使用寿命可长达数千次。
参 考 文 献
1 Atanasiu P , Tsiang H , Lavergne M ,et al. Purification parcentrifugation
z onaled unvaccin antirahique humainobtenu sur cellules renales defoetus bovins , Ann M icrobiol (Inst. Pasteur ) 1977,128B ,297~302.
2 H orodniceanu F , G enevieve PR. Purification of poliovirus obtained from
human diploid cell by means of DE AE -Sepharose 2nd G eneral meeting of ES ACT ,Paris. Develop biol standard ,1978,42:75~80.
3 中华人民共和国卫生部. 中国生物制品规程. 北京:中国人口出
41411 :用直径315×100cm Sepharose 凝胶柱对样品961125批进行多次过柱纯化。当上样量超过柱床体积10%时, 首峰变宽, 峰的降线变短, 该峰流出液减少, 而蛋白含量与纯化前比较, 去除率仅为9114%。而上样量在10%以下时, 色谱峰形完全一致。蛋白去除率均在99%以上。因此, 上样量在柱床体积的10%以下时, 病毒的分离效果好, 蛋白去除均在99%以上, 层析的重现性好。
412 中试3批样品的质量:3批样品经无菌、安全、毒性、过敏、热原检定均合格, 效力、残余牛血
版社,1995.
(1999-02-08收稿,1999-04-21修回)
《医学科学家汤飞凡》一书出版
刘隽湘著《医学科学家汤飞凡》已由人民卫生出版社出版发行。这本书是科学家为科学家撰写的传记。刘先生为撰写这本书专程到湖南、上海等地调查访问收集资料, 历时十年完成书稿, 此书全面翔实地介绍了汤飞凡的一生, 反映了汤先生高尚的爱国主义情操, 为科学自我献身的精神。张
文康部长为此书作序, 序中指出“:希望我国广大医务工作者都能读一读这本传记”。此书每本9元, 欲购者可与中华微生物学和免疫学杂志编辑部联系。地址:北京100024朝阳区三间房南里4号微免杂志编辑部。
范文五:1、世界上最早的狂犬病疫苗是什么材料制备的?
“延申生物”杯全国狂犬病防治知识竞赛问答
材料5
1882年巴斯德(Pasteur)自牛脑分离到一株狂犬病病毒,并将其在家兔脑内
连续传代,建立了最早的疫苗用病毒。将这种病毒感染兔脊髓取出,在室温空气中
干燥后,发现病毒的毒力很快降低。巴斯德用干燥减毒的脊髓悬液给狗进行皮下免
疫,结果50多头经免疫的狗均能抵抗狂犬病病毒的感染。1885年巴斯德首次对一名被疯狗严重咬伤60小时后的9岁男孩,皮下注射干燥的狂犬病家兔脊髓液,结
果该小孩获得了保护没有发生狂犬病。这种兔脊髓液疫苗成为了世界上最早的狂犬
病疫苗。
接种脑组织疫苗后主要引起神经性麻痹病例,一般在接种后13至15天出现,其原因与动物脑组织中所含的髓磷酯和其他物质有关,这些物质可引起变态反应性
脑脊髓炎。主要表现为:病人突然发烧,背部疼痛,下肢肌肉弛缓性麻痹,随即上
肢麻痹,以后扩大到面部、舌头以及其他肌肉。病死率约30%,其余的可迅速恢复。但这种脑组织疫苗我国已在上世纪80年代初已停止使用。
我国目前使用的狂犬病疫苗全部为细胞培养疫苗,细胞培养疫苗(尤其是纯化
疫苗)是当今最安全的人用狂犬病疫苗,现在上市销售的人用狂犬病疫苗有二种:
一为地鼠肾原代细胞培养疫苗,二为Vero传代细胞培养疫苗。
我国目前有两种进口的狂犬病疫苗,一种是由法国的赛诺费.巴斯德公司生产并在中国注册上市销售,这种疫苗是由Vero细胞培养病毒经灭活和纯化,最后配制
冻干而成。另一种是由德国凯龙公司生产并在中国注册上市销售,这种疫苗是由鸡
胚原代细胞培养病毒经灭活和纯化,最后配制冻干而成。这两种疫苗均为冻干剂型,
质量比较稳定,但相对于国产疫苗价格较贵。
我国目前的国产疫苗和两种进口疫苗都符合世界卫生组织倡议人用疫苗必须细
胞培养的要求,虽然所有这些疫苗有细胞、病毒种子、灭活剂、剂型和有效期的不
同,但制定的质量标准是一样的。只要疫苗从正规渠道获得并在有效期内使用,疫
苗的效果是一样的。
法国赛诺费.巴斯德公司的疫苗是由PM株狂犬病病毒为生产毒种;德国凯龙公司的疫苗使用Flury LEP株狂犬病病毒为生产毒种;我国的地鼠肾原代细胞疫苗由aG株为毒种;Vero细胞疫苗有三种毒种生产疫苗,它们分别为aG株、CTN株、和PV株狂犬病病毒。
不同的狂犬病病毒株只是从不同的材料分离,如我国的aG 株病毒分离自一只疯犬,CTN株分离自一狂犬病病人脑组织;而PV和PM则由巴斯德1882年分离自一只疯牛,只是后来在不同的实验室分别传代而用不同的名字;Flury LEP株由美国分离自狂犬病病人。这些病毒株都是同一血清型,使用后都能得到良好的保护。
用于人暴露前或暴露后程序的狂犬病疫苗全部是灭活疫苗,由于狂犬病是致死
性疾病,在疫苗中有任何极小的活病毒存在的机会,对疫苗使用者就有感染狂犬病
风险。1960年在巴西使用Fermi酚处理疫苗,就是由于病毒未彻底灭活导致66人接种该疫苗的18人发生狂犬病死亡;由此,WHO规定人用疫苗不得含有任何活病毒,
所有灭活疫苗必须经灭活验证试验合格方可出厂使用。因此,一切人用狂犬病疫苗
均为灭活疫苗,也不使用减毒活疫苗。
生产灭活狂犬病疫苗的病毒灭活剂目前有两种,一种是甲醛,另一种为β-丙内酯。后一种灭活剂优点更多一些,目前大多数种类的狂犬病疫苗使用后一种灭活
剂。在我国,地鼠肾原代细胞疫苗使用甲醛灭活剂以外,其他疫苗和国外进口疫苗
均使用β-丙内酯。
地鼠肾原代细胞培养疫苗在生产疫苗时,先获取健康地鼠(俗称金丝熊)的肾
脏,将其剪碎并用胰蛋白酶消化成细胞,经培养后将狂犬病毒接种到细胞上让病毒
在细胞中繁殖,到病毒的产量增高后,收获病毒经病毒灭活、纯化、处方配制和按
国家批准的标准检定合格后成为疫苗。该疫苗的特点是地鼠肾细胞直接取自正常健
康地鼠,比较天然,具有很好的安全性。但该疫苗需要饲养和宰杀大量动物,对环
保造成不良影响。
Vero细胞是从一只非洲绿猴的肾脏获取的细胞,该细胞已在实验室中传代110代次,该细胞可以在工厂中连续的传代扩大细胞产量,经培养后将狂犬病毒接种到
细胞上让病毒在细胞中繁殖,到病毒的产量增高后,收获病毒经病毒灭活、纯化、
处方配制和按国家批准的标准检定合格后成为疫苗。生产这种疫苗不需要饲养动
物,对环境比较友好。但该疫苗由于是传代细胞,需要将细胞中的基因物质清除,
该清除工艺比较复杂。
液体剂型的狂犬病疫苗是按处方配制成疫苗后立即灌装到小瓶中,直到患者使
用疫苗都呈液体状态。这种剂型的疫苗生产成本较低,但有效期较短,一般为1-1.5年。运输、储存要求更高,从出厂到使用必须全程臵于2-8?条件下。否则特别容易失效。尤其患者到医院、门诊部或诊所注射疫苗时,一定要注意医生是否从
冰箱中取疫苗,还要观测冰箱的温度是否在2-8?。确保注射的疫苗有效。
冻干剂型的狂犬病疫苗是按处方配制成疫苗后立即灌装到小瓶中,再在工业化
的大型冻干机中冻干,将疫苗中的液体去除直至水分含量低于3%。该疫苗的稳定性较好,效期长,一般可达3-4年,运输、储存要求相对于液体疫苗而言较容易。
但从出厂到使用也应该全程臵于2-8?条件下。患者到医院、门诊部或诊所注射疫
苗时,观测疫苗在小瓶中呈白色疏松体,注射的当时用稀释剂现场将疫苗恢复成液
体注射。冻干疫苗由于工艺比液体疫苗复杂,因此价格较贵一些。
狂犬病疫苗中除狂犬病病毒灭活的抗原外,为了疫苗的有效和稳定,一般液体
疫苗中添加人白蛋白和极少量的防腐剂硫柳汞。冻干疫苗中除人白蛋白和极少量的
防腐剂硫柳汞外,还有为了能达到冻干效果的明胶和糖。这些物质都是在疫苗配制
时加入的,加入的量进行严格控制,一般不会对人体产生影响。但个别人尤其是个
别儿童注射含有明胶的冻干疫苗可能会发生过敏反应。因此,对于使用果冻类食品
会过敏的人不要注射含有明胶的冻干疫苗。除此外,由于疫苗成分主要是各类蛋白,
在少部分人群中引起各种轻重不等的不良反应是不可避免的。
我国目前国家批准的狂犬病疫苗暴露后免疫程序只有一种,即被可疑疯动物咬
伤后的0、3、7、14和28天各注射一剂疫苗。注射的疫苗不分液体剂型或冻干剂
型。国外已批准的免疫程序还有2-1-1法,即被可疑疯动物咬伤后的0天注射两剂疫苗,然后在7和21天各注射一剂疫苗,这种注射方法不但效果好,而且患者
可以少去两次医院注射疫苗和少用一剂疫苗,可以减轻经济负担和去医院的麻烦,
这种免疫程序疫苗生产企业目前正在进行临床试验,不远的将来即可批准应用。
暴露前免疫程序为0、7和28天各接种一剂,共接种3剂疫苗即可。注射过暴露前程序疫苗的人,今后如再遭疯动物咬伤,只要彻底清洗伤口和按规定注射疫苗
即可,再不必使用抗血清或免疫球蛋白。
狂犬病疫苗的接种,不管是幼儿、儿童、或成年人,也不分男女和是否是孕妇,
免疫程序和疫苗剂量都一样;对于有下列情形之一的人员,建议第一针注射两剂疫
苗:
?注射疫苗前1个月内注射过免疫球蛋白或抗血清者
?先天性或获得性免疫缺陷病人
?接受免疫抑制剂(包括抗疟疾药物)治疗的病人
?老年人及患慢性病者
?于暴露后48小时或更长时间后才开始注射狂犬病疫苗的人员。
狂犬病疫苗的免疫要求在上臂三角肌肌肉注射,因为上臂三角肌对疫苗的吸收
好、快,离具有免疫功能的淋巴系统近,产生抗体和建立免疫迅速。但如果年幼小
儿由于上臂三角肌过于弱小,无法全部将疫苗注射到三角肌内,则建议注射到大腿
前外则肌肉,因为大腿前外则肌肉可以具有与上臂三角肌一样的疫苗吸收和免疫效
果,同时外测没有大血管和神经,注射比较安全。
应为臀部脂肪丰富,不宜疫苗吸收和快速产生抗体,所以狂犬病疫苗绝对不
能接种在臀部。
现在使用的狂犬病疫苗都是细胞培养生产的,在细胞培养过程中使用的培养基
特别会引起细菌污染。为控制细菌污染在生产时都会加入一定量的抗生素,我国企
业往往加卡那霉素或庆大霉素。虽然在后续的工艺中已基本去除了加入的抗菌素,
但不可避免地会残留一些。所以,对卡那霉素或庆大霉素已知会过敏的患者,注射
狂犬病疫苗时应告知医生,更换没有引起过敏反应抗生素的疫苗,避免由于微量抗
菌素引起的过敏反应。
狂犬病疫苗中含有人白蛋白,有的疫苗使用者担心,由于人血白蛋白是有人的
血浆中提取的,可能会污染爱滋病病毒,乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等血源性传
染病。但目前在疫苗中使用的人白蛋白是在血液制品工厂中按不同浓度的低温酒
精、不同步骤反复沉淀,需要经过5次沉淀制备所得,由于爱滋病病毒,乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒都比白蛋白要大得多,这些病毒已经在第一第二次沉淀时几乎
都已去除,而且白蛋白在生产工艺的最后还要使用专门的巴氏高温消毒法进行消
毒。所以,人血白蛋白是安全的,不会污染爱滋病病毒,乙型肝炎病毒、丙型肝炎
病毒。使用狂犬病疫苗更不会传染了。
目前我国使用的被动免疫产品主要有两大类,一为马血浆来源的抗血清,另一
类是人血浆来源的人免疫球蛋白。
马来源的抗血清是用灭活的狂犬病病毒免疫马以后使马产生抗体,抽取马的血
浆并用硫酸铵沉淀,过滤和离心等手段提取纯化抗体,再经胰蛋白酶处理后去除最
容易引起人过敏反应的FC部分,经按国家规定的标准检定合格后的产品即为人用马抗血清,供临床使用。但由于去除了FC部分,虽然降低了使用后引起过敏反应
的机会,但也因为这种抗体不是完整的抗体分子,它注射人体后的半衰期只有完整
抗体分子的一半左右,约14天。
人免疫球蛋白是用狂犬病疫苗免疫供血员,待供血员产生足够高的抗体时供出
血浆,在血液制品生产企业车间内按低温酒精沉淀法生产,提取免疫球蛋白――抗
体,由于是人来源的抗体,注射人体时不会引发过敏反应。同时由于是完整的抗体
分子,它的效果和半衰期也较马来源的抗血清好和长,人免疫球蛋白的半衰期可达
21天。但这种产品如处理不当,存在潜在的污染血源病毒的风险。
马来源的抗血清由于半衰期短,按每公斤体重40IU计算出总量后一次性使用。人免疫球蛋白按每公斤体重20IU计算出总量后一次性使用。
因为马抗血清或人免疫球蛋白是狂犬病疫苗免疫马或人产生抗体后提取的产
品,依据抗原抗体结合中和的原理,马抗血清或人免疫球蛋白可以中和掉疫苗的功
能,因此,当人被动物咬伤后应立即使用马抗血清或人免疫球蛋白,中和杀灭伤口
周围的狂犬病病毒,同时注射疫苗。待疫苗免疫10天左右的时间后机体即可产生抗体。此时,早先使用的马抗血清或人免疫球蛋白也即将消失,如此可以使机体始
终维持一个有效抗体水平,如果反复使用马抗血清或人免疫球蛋白,将影响疫苗的
效果。因此,使用马抗血清或人免疫球蛋白应足量一次使用。
不同厂家生产的狂犬病疫苗基本质量是一样的,也就是说只要是国家批准的厂
家生产的疫苗,通过正常销售渠道并在正规医院或门诊部注射的疫苗都是安全有效
的,原则上可以交替使用。
应当避免不必要的交错使用,因为一旦发生不良反应或免疫失败时就无法判定
是哪种疫苗或哪一批疫苗所致。
当一种疫苗注射一针或第二针后出现过敏反应时,可以更换另一种疫苗使用,
可能不会发生过敏反应,因为不同厂家生产的疫苗所使用的细胞不同,在疫苗中的
添加附料也略有不同,对不同使用的个体也有差异。因此,更换疫苗后可降低不良
反应的可能,但要有经验的医生根据病情和各疫苗的特性判断后实施。
首先由于狂犬病是致死性疾病,不管任何情况下都应该注射狂犬病疫苗。另外,
依据目前的药物药理学和药物毒理学研究的资料显示,在怀孕期接受药物会导致胎
儿畸形、致突变的药物大约有120多种,但在狂犬病疫苗中所有成分均无这120多
种药物。所以,使用狂犬病疫苗一般不会引起胎儿的影响;同时,国际权威医学杂
志(Mayo Clin Proc) 2004年载文显示:
1997年法国人J . Lang 等学者在医学顶尖杂志Lancet(柳叶刀)上发表文章显示:他们观测到2-4个月大的婴幼儿正在进行“百、白、破”三联疫苗和小儿
麻痹疫苗的计划免疫,同时进行狂犬病疫苗的暴露前联合应用,结果发现两剂狂犬
病疫苗注射后100%婴幼儿特异性抗狂犬病抗体阳转,而对其他的疫苗也无干扰的
证据。因此认为正在进行正常计划免疫的儿童注射狂犬病疫苗相互间不会有影响。